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Immunology and Infection

लाल बत्ती के साथ दैनिक फोटोथेरेपी Candida albicans Biofilm विकास को विनियमित करने के लिए

Published: April 23, 2019 doi: 10.3791/59326
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cariology, Operative Dentistry and Dental Public Health, Indiana University School of Dentistry, 2Department of Restorative Dentistry, Ceará Federal University, School of Dentistry

Summary

यहां, हम Candida albicans biofilm के विकास पर लाल बत्ती आवेदन के परिणाम का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक गैर-सुसंगत लाल बत्ती डिवाइस की तरंग दैर्ध्य of ६३५ एनएम and ऊर्जा घनत्व of ८७.६ जे · सेमी-2 to ४८ एच के लिए Candida albicans biofilms के विकास के दौरान लागू किया गया था ।

Abstract

यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान Candida albicans biofilm के विकास पर प्रति डिम लाल बत्ती उपचार के परिणामों का आकलन । C. albicans SN425 के प्लवकीय वृद्धि को बढ़ाने के लिए, inoculums खमीर नाइट्रोजन आधार मीडिया पर बढ़ी । Biofilm गठन के लिए, RPMI १६४० मीडिया, जो अमीनो एसिड की उच्च सांद्रता है biofilm विकास में मदद करने के लिए आवेदन किया गया । ४८ एच के biofilms एक दिन में दो बार एक गैर सुसंगत प्रकाश डिवाइस (लाल बत्ती के साथ एक मिनट की अवधि के लिए इलाज किया गया, तरंगदैर्ध्य = ६३५ एनएम; ऊर्जा घनत्व = ८७.६ J · सेमी-2) । एक सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के रूप में, ०.१२% chlorhexidine (CHX) लागू किया गया था, और एक नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) के रूप में, ०.८९% NaCl biofilms के लिए लागू किया गया था । उपचार के बाद कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (सीएफयू), शुष्क-भार, घुलनशील और अविलेय exopolysaccharides की मात्रा निर्धारित की गई थी । संक्षेप में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सरल है, reproducible और व्यवहार्यता के बारे में जवाब प्रदान करता है, शुष्क वजन और extracellular polysacचराइजर मात्रा लाल बत्ती उपचार के बाद।

Introduction

मधुमेह की वृद्धि की घटनाओं, immunosuppressive चिकित्सा अनुप्रयोगों, एचआईवी संक्रमण, एड्स महामारी, आक्रामक नैदानिक प्रक्रियाओं और व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक खपत पिछले कुछ वर्षों में Candida albicans की घटनाओं में वृद्धि हुई है संबंधित रोग1,2। C. albicans संक्रमण सामांयतः biofilm विकास से संबंधित है और कैंडिडिआसिस, या ऐसे candidiasis1,2के रूप में प्रणालीगत अभिव्यक्तियाँ, के रूप में नैदानिक अभिव्यक्तियाँ, कारण हो सकता है । Biofilm विकास के सबसे उल्लेखनीय उग्रता कारकों में से एक extracellular polysacचार्यो मैट्रिक्स स्थापना है । Biofilm गठन के लिए मौजूदा ऐंटिफंगल दवाओं, पर्यावरण तनाव, और मेजबान प्रतिरक्षा तंत्र3के प्रतिरोध को बढ़ाने के सहयोग ।

C. albicans के biofilm विकास एक सब्सट्रेट करने के लिए प्लवकीय कोशिकाओं के प्रारंभिक पालन के साथ शुरू होता है, सब्सट्रेट सतह के माध्यम से खमीर कोशिकाओं के प्रचार के बाद, और कवकज वृद्धि । Biofilm विकास के अंतिम चरण परिपक्वता चरण है, जिसमें खमीर जैसे विकास दबाया जाता है, हाइफल विकास फैलता है, और extracellular मैट्रिक्स biofilm4encloses । (ग) मैट्रिक्स में एलबीकॉन्स एक्सपॉलिसाइकैराइड (ईपीएस) द्वारा मन्नान-ग्लूकन कॉम्प्लेक्स5,6का गठन करने के लिए बातचीत की जाती है । 7ड्रग्स के खिलाफ biofilms की रक्षा के लिए exopolysaccharides की बातचीत महत्वपूर्ण है । इसलिए, सी albicans extracellular मैट्रिक्स से ईपीएस की कमी मौखिक कैंडिडिआसिस नियंत्रण के लिए नए एंटीबायटिक फिल्म प्रोटोकॉल के विकास का समर्थन कर सकता है ।

प्रकाश कई जीवों की वृद्धि, विकास और व्यवहार को नियंत्रित करता है और इसे फोटोडायनेमिक एंटीमाइक्रोबियल कीमोथेरेपी (पैक्ट) में रोगाणुरोधी के रूप में लागू किया गया है । समझौता एक विशिष्ट तरंगदैर्ध्य और एक प्रकाश को अवशोषित photosensitizer9के एक दृश्य प्रकाश लागू होता है । हालांकि, फोटोसेंसिटाइजर्स को बायोफिल्म को भेदने में दिक्कतें होती हैं, जिससे10की प्रभावकारिता कम होती है । पूरी तरह से biofilms घुसपैठ करने के लिए चिकित्सकीय एजेंटों की विफलता एक कारण है कि biofilms कभी कभार पारंपरिक रोगाणुरोधी चिकित्सा3,5का विरोध है । संलग्न माइक्रोबियल कोशिकाओं को निष्क्रिय करने के लिए, रोगाणुरोधी मैट्रिक्स के माध्यम से तर की जरूरत है; फिर भी, EPS biofilm में गाड़ी के अपने स्तर पर संकेत या मैट्रिक्स ही11के साथ रोगाणुरोधी की प्रतिक्रिया को प्रभावित करके ऐसे अणुओं के लिए एक विसरणी बाधा विशेषता ।

समझौते के नुकसान को ध्यान में रखते हुए, प्रकाश का उपयोग अपने आप में एक मूल्यवान सुधार के रूप में उभर रहा है । प्रारंभिक आंकड़ों से पता चला है कि नीले प्रकाश के साथ उपचार एक दिन में दो बार काफी ईपीएस के उत्पादन हिचकते- स्ट्रेप्टोकोकस mutans biofilm में अघुलनशील । ईपीएस की कमी से-अघुलनशील, नीली बत्ती कम biofilm विकास । फिर भी, C. albicans biofilms में लाल बत्ती का उपयोग phototherapy के परिणाम दुर्लभ हैं । इसलिए, इस जांच का उद्देश्य क्या phototherapy लाल बत्ती का उपयोग कर के विकास और C. albicans biofilm की व्यवस्था को प्रभावित करने में मूल्यांकन करने के लिए गया था । दो बार-दैनिक उपचार के लिए, हम अपने प्रयोगशाला के पिछले प्रोटोकॉल9,12 के लिए एक आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य biofilm मॉडल है कि व्यवहार्यता के बारे में जवाब उद्धार प्रदान करने के लिए, शुष्क वजन और extracellular polysaccharides अनुकूलित लाल बत्ती उपचार के बाद राशि। इसी प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य उपचारों के परीक्षण के लिए किया जा सकता है ।

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Protocol

1. संस्कृति मीडिया की तैयारी

  1. सबौराउड डेक्सट्रोस एगर (एसडीए) तैयार करें । ६५ को निलम्बित करना (५० मिग्रा/लीटर) एसडीए के साथ-साथ १,००० मिलीलीटर आसुत जल में । मध्यम पूरी तरह से भंग करने के लिए उबाल लें । 30 मिनट के लिए 15 साई (121 डिग्री सेल्सियस) पर autoclaving द्वारा जीवाणुरहित 45-50 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत । अच्छी तरह से मिलाएं और बाँझ पेट्री प्लेटों में SDA के 20 मिलीलीटर डालना (आकार: १०० मिमी x 15 मिमी) ।
  2. तैयार खमीर नाइट्रोजन बेस (ynb) मध्यम १०० mM ग्लूकोज के साथ ६.७ ग्राम ynb के मिश्रण से और 18 ग्राम डेक्सट्रोज के १,००० मिलीलीटर ultrapure पानी के लिए । मिश्रण एक विलोडक का उपयोग कर और एक ०.२२ μm वैक्यूम फ़िल्टर प्रणाली का उपयोग कर मध्यम जीवाणुरहित ।
  3. आरपीएमआई तैयार करें १०.४ ग्राम आरपीएमआई १६४० और ३४.३२ ग्राम 3-(एन-मॉर्फोलिनो) प्रोपैनेसल्फॉनिक अम्ल (MOPS) का १,००० मिलीलीटर पराशुद्ध जल । गर्मी के बिना एक विलोडक में मिक्स और 1 N NaOH जोड़कर 7 से पीएच समायोजित करें (2 NaOH के ग्राम ultrapure पानी की ५० मिलीलीटर के लिए) जोड़ें । एक ०.२२ μm वैक्यूम फ़िल्टर प्रणाली का उपयोग कर मध्यम जीवाणुरहित ।

2. पूर्व-संरोप और संरोप

  1. माइक्रोऑर्गेनिज्म c. albicans SN425 को − ८० ° c फ्रीजर से निकालें और इसे परिवेशी तापमान पर पिघलें । (५० मिलीग्राम/L) क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ पूरक sda युक्त पेट्री व्यंजन पर स्टॉक संस्कृति के बीज 10 μl. पेट्री व्यंजन को एरोनोमिक रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस पर ४८ एच के लिए सेबेट करते हैं ।
  2. इंक्यूबेशन के ४८ एच के बाद, C. albicans के 10 मिलीलीटर खमीर नाइट्रोजन बेस (ynb) के १०० मिमी ग्लूकोज के साथ पूरक माध्यम के 10 एमएल जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एरोमी के लिए 16 घंटे पूर्व-inoculum के लिए ।
  3. 16 एच के लिए इंक्यूबैटिंग के बाद, नए सिरे से ynb मध्यम में १०० मिमी ग्लूकोज के साथ पूरक 1:10 में स्टार्टर संस्कृतियों कमजोर द्वारा inoculums तैयार (स्टार्टर संस्कृति के 1 मिलीलीटर ynb के 9 मिलीलीटर में पतला) । ५४० एनएम पर आरंभिक ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें ।
  4. 8 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर एरोकुलम inoculums सेते जब तक उपभेदों मध्य प्रवेश चरण वृद्धि तक पहुँचने और ५४० एनएम पर अंतिम आयुध डिपो को मापने । यदि inoculums के आयुध डिपो के मध्य प्रवेश चरण पर हैं की जाँच करने के लिए प्रारंभिक आयुध डिपो से अंतिम OD घटाना (8 ज, चित्रा 1में वृद्धि curves के आधार पर).
  5. 107 कोशिकाओं एमएल-1के साथ एक संरोप तक पहुँचने के लिए, संरोप ५,५०० x gपर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रण, supernatant त्यागने और ट्यूबों की मात्रा के आधे करने के लिए संरोप ध्यान केंद्रित.

3. biofilm गठन और phototherapy

  1. 24-कूप पॉलीस्टाइरीन प्लेट के कुओं में 1 मिलीलीटर इंनोकुलम डालें । एरोमिकली ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९० मिनट के लिए सेक्यूबेट कुओं के तल के लिए सेल आसंजन की अनुमति के लिए ।
  2. एक गैर-सुसंगत लाल बत्ती का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में प्रकाश स्रोत के रूप में ६३५ ± 10 एनएम और एक निश्चित उत्पादन शक्ति की तरंग दैर्ध्य १,४६० मेगावाट सेमी− 2।
  3. प्रकाश की शक्ति घनत्व को मापने के लिए एक बिजली मीटर का उपयोग करें । ८७.६ J सेमी-2, एक्सपोजर के बारे में 1 मिनट के बराबर है । सूत्र ऊर्जा घनत्व का उपयोग करें (J/सेमी2) = विद्युत घनत्व (W/सेमी2) एक्स किरणन समय (s) । हल्के स्रोत और biofilm के बीच 5 मिमी की दूरी लागू करने के लिए नमूना वार्मिंग से बचने के लिए ।
  4. सकारात्मक नियंत्रण biofilms ०.१२% के साथ 1 मिनट के लिए chlorhexidine और 1 मिनट के लिए ०.८९% NaCl के साथ नकारात्मक नियंत्रण biofilms समझो ।
  5. उपचार के बाद, सभी biofilms ०.८९% NaCl समाधान के साथ दो बार धो लो ।
  6. 3 के साथ RPMI १६४० buffered के 1 मिलीलीटर जोड़ें-(N-morpholino) propanesulfonic एसिड (MOPS) 7 पीएच पर biofilms के लिए और ३७ ° c रात में प्लेटों सेते ।
  7. सुबह में, चरणों ३.२ के रूप में एक ही उपचार लागू ३.६, biofilms दो बार ०.८९% NaCl के साथ धोने, नई RPMI MOPS के साथ buffered (1 एमएल, पीएच 7) कुओं के लिए और एरोनोमिक को ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेक्यूबेट जोड़ें ।
  8. उसी दिन 6 ज के बाद बायोफिल्मस को रेड लाइट पर एक्सपोज करें । सकारात्मक नियंत्रण biofilms ०.१२% के साथ 1 मिनट के लिए chlorhexidine और 1 मिनट के लिए ०.८९% NaCl के साथ नकारात्मक नियंत्रण biofilms समझो । उपचार के बाद, biofilms ०.८९% NaCl समाधान के साथ दो बार धो लो ।
  9. दोहराएं कदम 3.2-3.8 biofilm विकास के ४८ एच प्राप्त करने तक ।
    नोट: मूलतः, एक उपचार सुबह में होगा और दूसरे एक ही दिन (6 अलग) पर दोपहर में होगा ।

4. प्रसंस्करण

  1. बाँझ ०.८९% NaCl के 1 मिलीलीटर को अच्छी तरह से एक पिपेट टिप का उपयोग कर अच्छी तरह से scratching द्वारा biofilm को दूर करने के लिए जोड़ें । हटाई गई बायोफिल्म को बाँझ नली में डालिए ।
  2. बाँझ ०.८९% NaCl के एक और 1 मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ें । इसे फिर से खरोंच और 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए एक ही ट्यूब के लिए निलंबन जोड़ें ।
  3. कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां (CFU)
    1. सख्ती से 1 मिनट के लिए biofilm निलंबन भंवर । बायोफिल्म सस्पेंशन से लेकर सीरियल तनुज के लिए ०.१ एमएल का एलिक्यूट यूज करें ।
    2. ०.८९% NaCl विलयन में जैवफिल्म निलंबन को 10-1 से 10-4 तक तनु करना ।
    3. एसडीए प्लेटों के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के बीज ५० μL और ४८ एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते ।
    4. कॉलोनियों की गणना करें और फार्मूला CFU/एमएल = कॉलोनियों की संख्या x 10n /q (n = तनुकरण; q = वरीयता प्राप्त वॉल्यूम) पर लागू होते हैं ।
  4. शुष्क भार
    1. वजन और लेबल माइक्रोअपकेंद्रित्र ट्यूबों ।
    2. Biofilm निलंबन से, सूखी वजन (बायोमास) दृढ़ संकल्प के लिए ०.१ मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    3. Biofilms के ०.१ मिलीलीटर की एक aliquot करने के लिए पूर्ण इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 18 घंटे के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर यह स्टोर । 18 एच के बाद, 10 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर केंद्रागत्र ।
    4. इस सुपरनेटंट को फेंक दें, एक डेसीकेटर पर ट्यूबों को एक सप्ताह के लिए नमूनों को सुखाने के लिए रखें और माइक्रोसेंट्रलाइज ट्यूबों को फिर से तौलें ।
  5. पानी में घुलनशील पॉलीसैकेराइड (WSPs) और क्षार-घुलनशील पॉलीसैकेराइड (ASPs)
    1. Biofilm निलंबन से, सख्ती भंवर (१.८ एमएल) मात्रा के शेष के लिए 1 मिनट और अपकेंद्रित्र में ५,५०० × g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस । एक नए ट्यूब में supernatant स्टोर और कोशिकाओं के साथ दो बार तलछट धोने, जो बाँझ ultrapure पानी (५,५०० × जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) के साथ extracellular मैट्रिक्स के अघुलनशील घटक होते हैं ।
    2. अघुलनशील सामग्री को १.८ मिलीलीटर बाँझ पराशुद्ध जल में पुनः निलंबित कर दीजिये ।
    3. पानी में घुलनशील पॉलीसैकेराइड (WSPs)
      नोट: धूआं हुड पर इस प्रयोग को निष्पादित करें ।
      1. संग्रहित supernatant से, पानी में घुलनशील पॉलिसैकेराइड (WSPs) की मात्रा के लिए 1 मिलीलीटर आरक्षित करें ।
      2. एक मिनट के लिए संग्रहीत supernatant homogenize । फिर, बाँझ ट्यूबों को हस्तांतरण और ९५% इथेनॉल के २.५ मात्रा में जोड़ें । WSPs वर्षा के लिए 18 ज पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए ट्यूबों स्टोर ।
      3. 18 घंटे के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ९,५०० एक्स जी पर ट्यूबों केंद्रा अपकेंद्रण के बाद, supernatants त्यागने.
      4. नमूने ७५% इथेनॉल और हवा सूखी छर्रों के साथ तीन बार धो लो । बाँझ ultrapure पानी के 1 मिलीलीटर के साथ गोली फिर से निलंबित, और phenol-सल्फ्यूरिक एसिड विधि का उपयोग कर WSP मात्रा का निर्धारण ।
      5. मानक वक्र (0, २.५, 5, 10, 15, 20, और ग्लूकोज प्रति ट्यूब की 25 μL) के लिए ०.१% ग्लूकोज (०.०१ ग्राम ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर करने के लिए) का उपयोग करें ।
      6. एक ग्लास ट्यूब में 5% फीनॉल (२.७ मिलीलीटर की ९०% फीनॉल से ४७.३ मिलीलीटर पराशुद्ध जल के लिए) को २०० जोड़ने के लिए (प्रति नमूना तीन प्रतियों में) नमूना या मानक वक्र बिंदु की २०० μl शामिल है और सावधानी से मिश्रण ।
      7. ट्यूब और मिश्रण करने के लिए सल्फ्यूरिक एसिड की 1 मिलीलीटर जोड़ें । प्रतिक्रिया के लिए 20 मिनट रुको और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (४९० एनएम) का उपयोग कर नमूनों को मापने ।
    4. क्षार-घुलनशील पॉलीसैकेराइड (एबीपीएस)
      नोट: धूआं हुड में इस प्रयोग को निष्पादित करें ।
      1. अघुलनशील पुन: निलंबित राशि से, ASPs के निर्धारण के लिए 1 मिलीलीटर अलग । अपकेंद्रित्र प्रत्येक biofilm निलंबन के aliquots (१३,००० x जी, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर) ।
      2. सावधानी से प्रत्येक ट्यूब के supernatant हटा दें । फिर छर्रों को सुखाने के लिए एक वैक्यूम सांद्रक पर नमूनों को रखें ।
      3. छर्रों को तौलें और 1 उ NaOH के ३०० μL जोड़ें (2 ग्राम NaOH के ५० मिलीलीटर ultrapure पानी के लिए) 1 सूखी वजन की मिलीग्राम । उन्हें 2 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते और फिर 10 मिनट के लिए १३,००० × g पर केंद्राभ ।
      4. सावधानी से एक पिपेट के साथ supernatants इकट्ठा और microcentrifuge ट्यूबों को हस्तांतरण, गोली बनाए रखने.
      5. एक बार फिर, छर्रों शामिल ट्यूबों के लिए 1 N NaOH की एक बराबर की मात्रा में जोड़ें, और एएसपी के निष्कर्षण के लिए ऊपर के रूप में एक ही कदम दोहराने ।
      6. 2 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, नमूनों (10 मिनट के लिए १३,००० x जी ), ध्यान से supernatants इकट्ठा और पहले से एकत्र supernatants को जोड़ने ।
      7. तीसरे निष्कर्षण के लिए, इसके बाद के संस्करण के रूप में एक ही कदम दोहराने, लेकिन इस बार, 2 के लिए नमूनों को सेते नहीं केंद्रायन से पहले एच ।
      8. बाद में, प्रत्येक नमूने के लिए ९५% इथेनॉल के तीन खंड जोड़ें । फिर, ASP के वर्षण के लिए 18 ज के लिए नमूनों को − 20 ° c पर स्टॉक करें ।
      9. ट्यूबों (९,५०० × जी 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए) अपकेंद्रित्र और supernatants त्यागने ।
      10. प्रत्येक गोली धोने ७५% इथेनॉल और हवा के साथ तीन बार सूखी (एक ही प्रक्रिया WSP के लिए किया था) । 1 N NaOH के साथ पहली निष्कर्षण के बराबर कुल मात्रा में छर्रों फिर से निलंबित ।
      11. को phenol-सल्फ्यूरिक (WSP विश्लेषण के लिए ही) का उपयोग कर ASP की मात्रा का निर्धारण के लिए नमूने पढ़ें ।

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Representative Results

चित्रा 2 1 मिनट के लिए लाल बत्ती के साथ डिम उपचार प्रति के बाद लॉग10 cfu/एमएल के परिणामों को प्रदर्शित करता है । रेड लाइट काफी कम10 cfu ०.००४/ चित्रा 3 दैनिक उपचार के बाद C. albicans biofilms के बायोमास (एमजी) के परिणाम प्रस्तुत करता है । सभी का इलाज समूहों की तुलना में बायोमास की कमी से पता चला नेकां (पी = ०.०००) और लाल बत्ती का इलाज समूहों बायोमास के समान कमी प्रस्तुत करने के लिए कि पीसी में मनाया । चित्रा 4 और चित्रा 5 सी albicans EPS की घटिया मात्रा प्रदर्शन-घुलनशील और EPS-पीसी में अघुलनशील नेकां की तुलना में (पी = ०.०००) । हालांकि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं है, लाल बत्ती के प्रति डिम आवेदन के लिए C. albicans biofilms के लिए 1 मिनट संख्यानुसार कम eps की मात्रा में घुलनशील और eps-अघुलनशील ।

Figure 1
चित्रा 1 . C. albicans विकृति एसएन ४२५ के विकास वक्र । Planktonic संस्कृति में बनाया गया था YNB मध्यम पूरक के साथ १०० ग्लूकोज की mM और ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड. ऑप्टिकल घनत्व (५४० एनएम पर ओडी) और Log10 CFU/एमएल समय के साथ निर्धारित किया गया । मानक विचलन दिखाया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 . C. albicansके लॉग 10 cfu/एमएल के माध्य और मानक विचलन। दिन में दो बार लाल बत्ती से उपचार और नियंत्रण-०.१२% CHX (PC) और ०.८९% NaCl (NC) के बीच आकलन किए गए थे । बराबर अक्षर समूहों (p > ०.०५) के बीच सांख्यिकीय समानता का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 . C. albicans का शुष्क-भार (mg) का माध्य और मानक विचलन । दिन में दो बार लाल बत्ती से उपचार और नियंत्रण-०.१२% CHX (PC) और ०.८९% NaCl (NC) के बीच आकलन किए गए थे । बराबर अक्षर समूहों (p > ०.०५) के बीच सांख्यिकीय समानता का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 . C. albicans BIOFILM में ईपीएस-घुलनशील राशि के माध्य और मानक विचलन (μg/ एक दिन में दो बार लाल बत्ती के साथ उपचार और नियंत्रण-०.१२% CHX (PC) और ०.८९% NaCl (NC) के बीच तुलना की गई । बराबर अक्षर समूहों (p < ०.००१) के बीच सांख्यिकीय समानता का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 . ईपीएस का माध्य और मानक विचलन- C. albicans biofilm में अघुलनशील सामग्री (सुखे-वजन की μg/ दिन में दो बार लाल बत्ती से उपचार और नियंत्रण-०.१२% CHX (PC) और ०.८९% NaCl (NC) के बीच आकलन किए गए थे । बराबर अक्षर समूहों (p < ०.००१) के बीच सांख्यिकीय समानता का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

C. albicans biofilm के सफल संवर्धन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) पूर्व संरोप और संरोप में १०० मिमी ग्लूकोज के साथ पूरित माध्यम ynb; 2) आसंजन चरण के लिए ९० मिनट प्रतीक्षा करें और ध्यान से ०.८९% NaCl के साथ दो बार कुओं को धोने के लिए गैर पालन कोशिकाओं को हटाने; और 3) पालन कोशिकाओं को rpmi मध्यम जोड़ने के लिए biofilm गठन शुरू करने के लिए, के बाद से rpmi तंतु विकास को प्रोत्साहित करेंगे । एयूप्लॉइडीज़, सी-एल्बिसियंसको पुच्छित करते समय हो सकती है । नतीजतन, सात दिन से ज्यादा पुरानी कॉलोनियों का इस्तेमाल न करना, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स को स्टोर न करना और मौजूदा प्लेटों से कोशिकाओं को री-स्ट्रीक न करना महत्वपूर्ण है । इसी तरह, उपभेदों रातोंरात13विकास के 18 घंटे से पहले इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

एक अध्ययन सीमा है कि यह विट्रो में किया गया था । Whilst में विट्रो अध्ययन बहुत biofilm के जीव विज्ञान की समझ में वृद्धि हुई है, वे ठीक vivo में14की स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं करते । तथापि, इन विट्रो परीक्षणों में नई एंटीरिदम फिल्म उपचारों के संबंध में प्रश्नों का उत्तर देने के लिए एक सस्ता और सरल पद्धति होने के अतिरिक्त उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग की व्यवस्था है । Biofilm विकास के प्रत्येक चरण के लिए सही संस्कृति मीडिया का चयन विधि की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । RPMI १६४० एक पोषक तत्व से भरपूर माध्यम है कि अमीनो एसिड होता है और मानव तरल पदार्थ की संरचना simulates15। Rpmi १६४० में विटामिन और अकार्बनिक लवण के अलावा एल-ग्लूटेमीन, एल arginine, एल ऐस्पेराजीन शामिल हैं । फिर भी, YNB मीडिया ग्लूकोज की एक ऊंचा राशि है (18 g/L) RPMI १६४० मध्यम (2 जी/एल ग्लूकोज) की तुलना में. उच्च ग्लूकोज सामग्री Candida प्रजातियों के प्लवकीय वृद्धि16को बढ़ाने के लिए वर्णित किया गया है । इसके विपरीत, एमिनो एसिड की उच्च सांद्रता के अस्तित्व को RPMI माध्यम में biofilm विकास में मदद करेगा YNB मध्यम16की तुलना में । गुणात्मक SEM micrographs लागू डेटा से पता चला है कि RPMI में C. albicans biofilms के संरचनात्मक डिजाइन एक जटिल संगठन के साथ एक ठोस विकास yeasts के साथ प्रस्तुत hyphae, नवोदित तत्वों और कली निशान के साथ एक प्रचुर मात्रा में कोशिकीय मैट्रिक्स16। इस प्रकार के परिणाम पिछले अध्ययन के अनुसार हैं जिसमें यह बताया गया है कि आरपीएमआई १६४० ने सी एल्बियंस बायोफिल्मस मेंहाइफल गठन को संवर्धित कर दी है । इन परिणामों के विभिंन biofilm विकास के चरणों में Candida द्वारा सब्सट्रेट उपयोग में मतभेदों को प्रदर्शित करता है और प्लवकीय विकास और biofilm गठन के दौरान मीडिया को बदलने के महत्व को दिखाते हैं ।

C. albicans biofilms की खेती करने के लिए सही तापमान और पीएच का चयन भी hyphae के पर्याप्त गठन के साथ विधि को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है । C. albicans उन स्थितियों की प्रतिक्रिया में blastospores से तंतु में रूपांतरण को चलाती है जो स्तनधारी मेजबान के ऊतकों के वातावरण की नकल करते हैं। इन स्थितियों में शरीर के तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) और तटस्थ पीएच17पर बढ़ रही शामिल है, और यही कारण है कि rpmi माध्यम के पीएच 7 को समायोजित किया जाता है ।

इस अध्ययन में लागू तरीकों सी. albicans एसएन ४२५ के biofilms के बाद से महत्वपूर्ण है12से पहले विशेषता थे, को EPS के महान मात्रा में है-घुलनशील और अघुलनशील है, जो यह एक विश्वसनीय तरीका रोशनी के परिणाम का विश्लेषण करता है दिखा extracellular पॉलीसैकेराइड पर. इसके अलावा, प्रयोगों में लागू एक ही गैर सुसंगत प्रकाश डिवाइस सफलतापूर्वक बैक्टीरियल प्लवकीय निलंबन18 और biofilms के लिए लागू किया गया था9, और इस उपकरण का अत्यंत लाभ उपचार के समय में कमी है, क्या बनाता है नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अधिक व्यवहार्य युक्ति18। C. albicans biofilms के लिए लागू दैनिक phototherapy के विश्लेषण महत्वपूर्ण है क्योंकि वर्तमान अध्ययन में लागू पद्धति एक इलाज है कि तेजी से है simulates और घर पर रोगी द्वारा आसानी से किया जा सकता है ।

लाल बत्ती दैनिक उपचार अर्थपूर्ण कम C. albicans व्यवहार्य कॉलोनी गिनती और biofilm biomasses । अधिक अध्ययन उपचार का एक संयोजन की कोशिश, phototherapy के साथ शुरू करने और बाद में सामयिक एंटीफंगल लागू हो सकता है । इस रणनीति extracellular मैट्रिक्स परिरक्षण c. albicans biofilm, बायोफिल्म के माध्यम से बेहतर दवा घुसपैठ की अनुमति तक पहुंचने के लिए और अंत में C. albicans कोशिकाओं को समाप्त करने में सहायता कर सकता है । इन विट्रो प्रयोग की सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, 1 मिनट के लिए लाल बत्ती का उपयोग मौखिक कैंडिडिआसिस के उपचार पर विषय एंटीफंफल्स के लिए एक सहायक के रूप में सहायता कर सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ पाउला दा Silveira, डॉ सेसिलिया Atem Gonçalves डी Araújo कोस्टा, Shawn एम मौले, शेन एम मौले, डॉ मैल्विन एन जानमल और डॉ Iriana जांन इस अध्ययन के विकास के लिए धंयवाद । हम भी डॉ अलेक्जेंडर डी जॉनसन (UCSF) इस अध्ययन में विश्लेषण तनाव दान के लिए स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Clorhexidine 20%  Sigma-Aldrich C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous Fisher Chemical D16-500
Ethanol 200 proof Decon Laboratories DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A  LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA 
NaCl  Fisher Chemical S641-500
NaOH  Fisher Bioreagents  BP 359-500
Phenol 5% Milipore Sigma 843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) Sigma R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol Acumedia 7306A
Sulfuric acid  Fisher Chemical SA200-1
Yeast nitrogen base  Difco DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS Sigma-Aldrich M1254
 24-well polystyrene plate  Falcon 353935

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण इश्यू १४६ biofilm Candida albicans फोटोथेरेपी लाल बत्ती extracellular मैट्रिक्स polyssacharides
लाल बत्ती के साथ दैनिक फोटोथेरेपी <em>Candida albicans</em> Biofilm विकास को विनियमित करने के लिए
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Panariello, B. H. D., Garcia, B. A., Duarte, S. Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth. J. Vis. Exp. (146), e59326, doi:10.3791/59326 (2019).

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