Summary
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar el resultado de la aplicación de luz roja en el crecimiento de biofilm de Candida albicans . Un dispositivo de luz roja no coherente con la longitud de onda de 635 nm y densidad de energía de 87,6 J·cm-2 se aplicó durante todo el crecimiento de Candida albicans biofilms durante 48 h.
Abstract
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar los resultados de viáticos luz roja tratamiento sobre el crecimiento de biofilm de Candida albicans . Para aumentar el crecimiento planctónico de C. albicans SN425, el inóculo creció en medio de la Base de nitrógeno de la levadura. Para la formación de biofilm, se aplicaron medios RPMI 1640, que tienen altas concentraciones de aminoácidos, para ayudar a crecimiento de biopelícula. Biopelículas de 48 h fueron tratados dos veces al día durante un período de 1 minuto con un dispositivo de luz no coherente (luz roja, longitud de onda = 635 nm; densidad de energía = 87,6 J·cm-2). Como control positivo (PC), 0,12% de clorhexidina (CHX) fue aplicado y como control negativo (NC), 0,89% NaCl se aplicó a los biofilms. Colonias formando unidades (UFC), peso seco, solubles e insolubles exopolisacáridos se cuantificaron después de tratamientos. Brevemente, el protocolo que presentamos es simple, reproducible y proporciona respuestas con respecto a la viabilidad, cantidades de polisacárido extracelular y seco-peso después del tratamiento de la luz roja.
Introduction
El aumento de la incidencia de diabetes, usos de la terapia inmunosupresora, infección por el VIH, epidemia, procedimientos clínicos invasivos y consumo de antibióticos del amplio-espectro en los últimos años han aumentado la incidencia de Candida albicans relacionados con enfermedades1,2. Infecciones por C. albicans son comúnmente relacionados con el desarrollo de biofilm y pueden causar manifestaciones clínicas, tales como candidiasis o manifestaciones sistémicas, como la candidemia1,2. Uno de los factores de virulencia más notables del crecimiento del biofilm es el establecimiento de la matriz de polisacárido extracelular. Formación de biopelículas colabora para aumentar la resistencia a los medicamentos antimicóticos existentes, estrés ambiental y de mecanismos inmunes del huésped3.
El crecimiento de biopelículas de C. albicans se inicia con la adhesión temprana de células planctónicas a un substrato, seguida de la propagación de las células de levadura a través de la superficie del sustrato y el crecimiento hifal. La última fase de crecimiento del biofilm es la fase de maduración, en donde se suprime el desarrollo de la levadura como se expande el desarrollo hifal y la matriz extracelular incluye el biofilm4. C. albicans exopolisacáridos (EPS) en la matriz de interactúan para formar el complejo5,manan-glucan del6. La interacción de exopolisacáridos es crítica para la defensa de los biofilms contra drogas7. Por lo tanto, la reducción de la EPS de la matriz extracelular de C. albicans puede apoyar el desarrollo de nuevos protocolos de antibiofilm para el control de la candidiasis oral.
La luz regula el crecimiento, desarrollo y comportamiento de varios organismos8 y se ha aplicado como un antimicrobiano en quimioterapia fotodinámica antimicrobiana (Pacto). Pacto aplica una luz visible de una determinada longitud de onda y absorbe la luz fotosensibilizador9. Sin embargo, el photosensitizers tienen dificultades para penetrar en el biofilm, causando menor eficacia10. La falta de agentes terapéuticos totalmente infiltrarse en biofilms es una razón que biofilms resisten ocasionalmente tradicional terapia antimicrobiana3,5. Para desactivar las células microbianas cerradas, antimicrobianos deben permear a través de la matriz extracelular; sin embargo, la EPS caracteriza un obstáculo difusional para tales moléculas por lo que su nivel de transporte en el biofilm o por influir en la respuesta de los antimicrobianos con la matriz sí mismo11.
Teniendo en cuenta las desventajas del Pacto, el uso de la luz por sí misma surge como una valiosa mejora. Datos preliminares revelaron que el tratamiento con luz azul dos veces al día inhibieron significativamente la producción de EPS-insoluble en biopelículas del Streptococcus mutans . Por la disminución de EPS-insoluble, luz azul disminuye crecimiento de biopelícula. Sin embargo, los resultados de la fototerapia con luz roja en biopelículas de C. albicans son escasos. Por lo tanto, el objetivo de esta investigación fue evaluar en qué fototerapia manera usando luz roja influye en el crecimiento y disposición de biopelículas de C. albicans . Para el tratamiento dos veces al día, hemos adaptado anteriores protocolos9,12 para proporcionar un modelo de biofilm fácil y reproducible que ofrece respuestas en cuanto a viabilidad, de nuestro laboratorio polisacáridos extracelulares y peso seco cantidades después del tratamiento de la luz roja. El mismo protocolo puede utilizarse para probar otros tratamientos.
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Protocol
1. preparación de medios de cultivo
- Preparar el agar dextrosa de sabouraud (SDA). Suspender 65 g del SDA suplementado con cloranfenicol (50 mg/L) en 1.000 mL de agua destilada. Ebullición para disolver el medio completamente. Esterilizar en autoclave a 15 PSI (121° C) durante 30 minutos, enfriar a 45-50 ° C. Mezclar bien y verter 20 mL de SDA en placas de Petri estériles (tamaño: 100 x 15 mm).
- Preparar la levadura nitrógeno base (YNB) suplementado con glucosa 100 mM mezclando 6,7 g de YNB y 18 g de dextrosa en 1000 mL de agua ultrapura. Mezclar con un agitador y esterilizar el medio utilizando un sistema de vacío del filtro de 0,22 μm.
- Preparar RPMI mezclando 10,4 g de RPMI 1640 y 34,32 g de 3-(N-morfolino) ácido propanesulfonic (MOPS) a 1.000 mL de agua ultrapura. Mezcle en un agitador sin calor y ajustar el pH a 7 agregando 1 N NaOH (Añadir 2 g de NaOH en 50 mL de agua ultrapura). Esterilizar el medio utilizando un sistema de vacío del filtro de 0,22 μm.
2. inóculo previo e inóculo
- Eliminar el microorganismo C. albicans SN425 del congelador ° C −80 y dejar descongelar a temperatura ambiente. 10 μl de la cultivo en placas de Petri que contengan SDA suplementado con cloranfenicol (50 mg/L) de la semilla. Incubar las cajas Petri aeróbicamente a 37 º C durante 48 h.
- Después de 48 h de incubación, añadir 10 colonias de C. albicans a 10 mL de nitrógeno de la levadura base (YNB) suplementados con 100 mM de glucosa e incubar aeróbicamente a 37 ° C por 16 h en el inóculo previo.
- Después de incubar por 16 h, preparar el inóculo mediante la dilución de las culturas de arrancador en medio YNB fresco suplementado con 100 mM de glucosa en un 1:10 la proporción (1 mL de la cultura de arrancador diluida en 9 mL de YNB). Medir la densidad óptica inicial (OD) a 540 nm.
- Incubar el inóculo aeróbicamente a 37 º C durante 8 h hasta que las cepas alcanzan la fase de crecimiento de registro medio y medir la final do a 540 nm. Reste el OD final del OD inicial para comprobar si el OD de los inóculos estén en la fase de crecimiento de registro medio (8 h, basado en las curvas de crecimiento en la figura 1).
- Para llegar a un inóculo con 107 células mL-1, centrifugar el inóculo durante 5 min a 5.500 x g, deseche el sobrenadante y concentración del inóculo a la mitad del volumen de los tubos.
3. Biofilm formación y fototerapia
- Añadir 1 mL del inóculo en los pocillos de una placa de poliestireno de 24 pocillos. Incubar aeróbicamente a 37 º C durante 90 min permitir la adherencia de la célula hasta el fondo de los pozos.
- Uso de una red no coherente (véase Tabla de materiales) la luz como fuente de luz con longitud de onda de 635 ± 10 nm y una potencia de salida fija de 1.460 mW cm−2.
- Use un medidor de potencia para medir la densidad de energía de la luz. La exposición radiante aplicada es 87,6 J cm-2, equivalente a aproximadamente 1 min de exposición. Utilizar la fórmula de densidad de energía (J/cm2) = densidad de potencia (W/cm2) x tiempo de irradiación (s). Se aplica una distancia de 5 mm entre la fuente de luz y el biofilm para evitar el calentamiento de la muestra.
- Tratamiento de los biofilms control positivo con clorhexidina 0.12% por 1 min y control negativo biofilms con 0,89% NaCl durante 1 minuto.
- Después de tratamientos, lavar todos los biofilms dos veces con solución de NaCl 0,89%.
- Añadir 1 mL de RPMI 1640 tamponado con 3-(N-morfolino) ácido propanesulfonic (MOPS) a pH 7 para la biopelícula e incubar las placas a 37 ° C durante la noche.
- En la mañana, se aplican los mismos tratamientos como pasos 3.2 a 3.6, lave los biofilms dos veces con 0,89% NaCl, añadir nuevo RPMI tamponado con MOPS (1 mL, pH 7) en los pocillos e incubar aeróbicamente a 37 ° C.
- En el mismo día, después de 6 h, exponga las biopelículas a luz roja. Tratamiento de los biofilms control positivo con clorhexidina 0.12% por 1 min y control negativo biofilms con 0,89% NaCl durante 1 minuto. Después de tratamientos, lavar los biofilms dos veces con solución de NaCl 0,89%.
- Repita los pasos 3.2-3.8 hasta alcanzar 48 h de desarrollo de la biopelícula.
Nota: Básicamente, un tratamiento va a pasar en la mañana y el otro va a pasar en la tarde el mismo día (6 h aparte).
4. proceso
- Añadir 1 mL de estéril 0,89% NaCl al pozo para eliminar el biofilm rasguñando desde el pocillo con una pipeta. Añadir el biofilm quitado a un tubo estéril.
- Añadir otro 1 mL de estéril 0,89% NaCl al pozo. Rayar otra vez y agregar la suspensión en el mismo tubo para un volumen total de 2 mL.
- Unidades formadoras de colonias (UFC)
- Vortex vigorosamente la suspensión de biofilm durante 1 minuto. De la suspensión del biofilm, utilizar una alícuota de 0,1 mL de la dilución serial.
- Diluir la suspensión de biofilm de 10-1 10-4 en solución de NaCl 0,89%.
- 50 μL de cada dilución a placas SDA de la semilla e incubar las placas a 37 ° C durante 48 h.
- Contar las colonias y aplicar la fórmula UFC/mL = número de colonias x 10n / q (n = dilución; q = volumen sembrado).
- Peso seco
- Tubos de microcentrífuga de pesa y etiqueta.
- De la suspensión del biofilm, usar 0,1 mL para determinación de peso seco (biomasa).
- Añadir 1 mL de etanol absoluto a una alícuota de 0,1 mL de las biopelículas y almacenar a-20 ° C por 18 h. Después de 18 h, centrifugar a 10.000 x g por 10 min.
- Eliminar el sobrenadante, coloque los tubos en un desecador para secar las muestras durante una semana y pesa otra vez los tubos de microcentrífuga.
-
Polisacáridos solubles en agua (WSPs) y los polisacáridos solubles en álcali (ASP)
- De la suspensión de la biopelícula, vortex vigorosamente el resto del volumen (1,8 mL) para 1 minuto y centrifugar a 5.500 × g por 10 min a 4 ° C. Guarde el sobrenadante en un tubo nuevo y lavar el precipitado dos veces con las células, que contienen a los componentes insolubles de la matriz extracelular con agua ultrapura estéril (5.500 × g, 10 min a 4 ° C).
- Resuspender el contenido de insoluble en 1,8 mL de agua ultrapura estéril.
- Polisacáridos solubles en agua (WSPs)
Nota: Realizar este experimento en una campana de humos.- Partir del sobrenadante almacenado, reservamos 1 mL para la cuantificación de polisacáridos solubles en agua (WSPs).
- Homogeneizar el sobrenadante almacenado durante 1 minuto. A continuación, transferir a tubos estériles y añadir 2,5 volúmenes de etanol al 95%. Almacenar los tubos de 18 h a-20 ° C precipitación WSPs.
- Después de 18 h, centrifugar los tubos a 9.500 x g durante 20 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante.
- Lavar las muestras tres veces con etanol al 75% y secar el pellet. Resuspender el pellet con 1 mL de agua ultrapura estéril y cuantificar el WSP con el método ácido fenol-sulfúrico.
- Utilizar glucosa 0.1% (0,01 g de glucosa en 10 mL de agua ultrapura) para la curva estándar (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 y 25 μl de la glucosa por el tubo).
- Añadir 200 μL de fenol 5% (2,7 mL de fenol 90% a 47,3 mL de agua ultrapura) a un tubo de vidrio con 200 μL de la muestra o curva estándar de punto (en triplicado por muestra) y mezclar con cuidado.
- Añadir 1 mL de ácido sulfúrico en el tubo y mezclar. Espere 20 minutos para la reacción y medir las muestras usando un espectrofotómetro (490 nm).
- Polisacáridos solubles en álcali (ASP)
Nota: Realizar este experimento en una campana de humos.- De la cantidad nuevamente suspendida insoluble, separar 1 mL para la determinación de los ASP. Centrifugue las alícuotas de cada suspensión de biofilm (13.000 x g, durante 10 min a 4 ° C).
- Con cuidado retire el sobrenadante de cada tubo. Luego coloque las muestras en un concentrador de vacío para secar el pellet.
- Pesan las pelotillas y añadir 300 μL de 1 N NaOH (2 g de NaOH en 50 mL de agua ultrapura) por 1 mg de peso seco. Incubar por 2 h a 37 ° C y luego centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos.
- Con precaución recoger el sobrenadante con una pipeta y transferencia a tubos de microcentrífuga, mantener el pellet.
- Una vez más, añadir un volumen igual de 1 N NaOH en los tubos que comprende las pelotillas y repita los mismos pasos que el anterior para la extracción de ASP.
- Después de la incubación durante 2 h, centrifugar las muestras (13.000 x g por 10 min), cuidadosamente recoger el sobrenadante y añadir a los sobrenadantes previamente recogidos.
- Para la tercera extracción, repita los mismos pasos que anteriormente, pero esta vez, no incubar las muestras durante 2 h antes de la centrifugación.
- Luego, añadir tres volúmenes de etanol al 95% para cada muestra. Luego, almacenar las muestras a −20 ° C por 18 h para precipitación de ASP.
- Centrifugar los tubos (9.500 × g por 20 min a 4 ° C) y descartar el sobrenadante.
- Lave cada pelotilla tres veces con etanol al 75% y deje secar al aire (lo mismos procedimientos para WSP). Vuelva a suspender los pellets en igual volumen total de la primera extracción con NaOH N 1.
- Leer las muestras para la cuantificación de ASP usando fenol-sulfúrico (igual que en los análisis de PSA).
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Representative Results
La figura 2 muestra los resultados de Log10 UFC/mL de C. albicans después de dietas tratamientos con luz roja para 1min rojo redujo significativamente el Log10 UFC/mL en comparación con la NC (p = 0.004). Figura 3 presenta los resultados de la biomasa (mg) de biopelículas de C. albicans después de tratamientos diarios. Todos los grupos mostraron una reducción de la biomasa en comparación con el NC trataron (p = 0,000) y la luz roja grupos presentados similar reducción de la biomasa a lo observado en la PC. Figura 4 y figura 5 muestran cantidades inferiores de C. albicans EPS-soluble y insoluble en EPS en PC en comparación con NC (p = 0.000). Aunque no estadísticamente aplicación significativa, dietas de rojo durante 1 min a C. albicans biofilms numéricamente disminuida la cantidad de EPS-soluble y insoluble en EPS.
Figura 1 . Curva de crecimiento de C. albicans tensión 425 SN. Cultura planctónica fue hecha en medio YNB complementado con 100 mM de glucosa y se incubaron a 37 ° C. La densidad óptica (OD a 540 nm) y Log10 UFC/mL se determinó con el tiempo. Se muestra la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Desviaciones media y estándar de Log10 UFC/mL de C. albicans. Las evaluaciones se realizaron entre el tratamiento con luz roja dos veces al día y el controls-0.12% CHX (PC) y 0,89% NaCl (NC). Letras iguales representan similitud estadística entre grupos (p > 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Desviaciones estándar y promedios de peso seco (mg) de C. albicans. Las evaluaciones se realizaron entre el tratamiento con luz roja dos veces al día y el controls-0.12% CHX (PC) y 0,89% NaCl (NC). Letras iguales representan similitud estadística entre grupos (p > 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Monto de las desviaciones media y estándar de EPS-soluble en C. albicans biofilm (μg/mg de peso seco). Se hicieron comparaciones entre el tratamiento con luz roja dos veces al día y el controls-0.12% CHX (PC) y 0,89% NaCl (NC). Letras iguales representan similitud estadística entre grupos (p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Contenido de las desviaciones media y estándar de EPS-insoluble en C. albicans biofilm (μg/mg de peso seco). Las evaluaciones se realizaron entre el tratamiento con luz roja dos veces al día y el controls-0.12% CHX (PC) y 0,89% NaCl (NC). Letras iguales representan similitud estadística entre grupos (p < 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos más críticos para el cultivo exitoso de biopelículas de C. albicans son: 1) hacer el inóculo previo y el inóculo en medio YNB con 100 mM de glucosa; 2) y esperar 90 minutos para la fase de adhesión cuidadosamente lavar dos veces los pozos con 0,89% NaCl para eliminar las células no adheridas; y 3) para agregar Medio RPMI a las células adheridas para iniciar formación de biopelículas, ya que RPMI será estimular el crecimiento de hifas. Aneuploidías pueden ocurrir cuando el cultivo de C. albicans. En consecuencia, es importante no utilizar colonias que son más de siete días, no para almacenar las placas a 4° C y no a las células a raya de las placas existentes. Asimismo, las cepas deben utilizarse antes de las 18 horas de crecimiento durante la noche13.
Una limitación del estudio es que se realizó in vitro. Mientras que en estudios in vitro han aumentado considerablemente la comprensión de la biología de biofilm, no precisamente representan condiciones en vivo14. Sin embargo, los ensayos in vitro proporcionan proyección de alto rendimiento además de ser una metodología simple y barato14 para responder a preguntas sobre nuevas terapias antibiofilm. Elección de los medios de cultivo correcto para cada fase de desarrollo de biofilm es un paso importante para el éxito del método. RPMI 1640 es un medio rico en nutrientes que tiene aminoácidos y simula la composición de los fluidos humanos15. RPMI 1640 contiene L-glutamina, L-arginina, L-Asparagina además de vitaminas y sales inorgánicas. Sin embargo, el medio YNB tiene una elevada cantidad de glucosa (18 g/L) en comparación con Medio RPMI 1640 (glucosa 2 g/L). El contenido de la glucosa alta se ha descrito para aumentar el crecimiento planctónico de Candida especies16. Por el contrario, la existencia de altas concentraciones de aminoácidos ayudará crecimiento de biofilm en Medio RPMI comparado con el medio YNB16. Datos cualitativos aplicando los micrográfos de SEM demostraron que el diseño estructural de biopelículas de C. albicans en RPMI presenta una organización compleja con un sólido crecimiento de las levaduras ramifying hifas, elementos de florecimiento y bud cicatrices con una abundante 16de la matriz extracelular. Estos resultados están de acuerdo con un estudio anterior que informaba que el RPMI 1640 había aumentada la formación hifal en C. albicans biofilms15. Estos resultados demuestran las diferencias en la utilización del sustrato por Candida en las fases de crecimiento de biofilm diferentes y muestran la importancia de cambiar los medios de comunicación durante el crecimiento y biofilm formación de plancton.
La selección de la temperatura y el pH para el cultivo de C. albicans biofilms también es importante para llevar a cabo el método con la adecuada formación de las hifas. C. albicans se compromete a la conversión de pseudomicelio a filamentos en reacción a las condiciones que imitan el ambiente del huésped mamífero tejidos17. Estas condiciones implican crecimiento a la temperatura corporal (37 ° C) y en pH neutro17, y esta es la razón por qué el pH del Medio RPMI se ajusta a 7.
Los métodos aplicados en este estudio son importantes puesto que caracterizaron a biopelículas de C. albicans SN 425 antes de las12, demostrando tener gran cantidad de EPS-solubles y - insoluble, que es un método confiable para analizar el resultado de las luces en los polisacáridos extracelulares. Por otra parte, el mismo dispositivo de luz no coherente que aplicada en los experimentos se aplicó con éxito a suspensiones bacterianas planctónicas18 y biofilms9, y el máximo beneficio de este dispositivo es la reducción del tiempo de tratamiento, lo que hace que el dispositivo más factible para aplicaciones clínicas18. El análisis del diario fototerapia aplicada a C. albicans biofilms es significativo ya que la metodología aplicada en el presente estudio simula un tratamiento que es rápido y puede hacerse fácilmente por el paciente en casa.
Tratamiento diario rojo había reducido significativamente biomasas de Conde y biofilm de colonias viables de C. albicans . Más estudios podrían tratar de una combinación de tratamientos, a partir de fototerapia y más tarde aplicación de antifúngicos tópicos. Esta estrategia podría ayudar a desorganizar la matriz extracelular blindaje biopelículas de C. albicans , permitiendo mejor infiltración de drogas a través de la biopelícula y finalmente erradicar células de C. albicans . Teniendo en cuenta las limitaciones de este experimento en vitro, puede ayudar el uso de una luz roja durante 1 min como coadyuvante a antimicóticos de tema sobre el tratamiento de la candidiasis oral.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecilia Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal y Dr. Iriana Zanin para el desarrollo de este estudio. También reconocemos el Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) por donar la cepa analizada en este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
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