Summary
Qui, presentiamo un protocollo per valutare il risultato dell'applicazione di luce rossa sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Un dispositivo di luce rossa non coerente con la lunghezza d'onda di 635 nm e densità di energia di 87,6 J·cm-2 è stato applicato durante la crescita di Candida albicans biofilm per 48 h.
Abstract
Qui, presentiamo un protocollo per valutare gli esiti della diaria di luce rossa trattamento sulla crescita di biofilm di Candida albicans . Per aumentare la crescita planctonica di albicans del c. SN425, gli Inoculanti è cresciuto il lievito azoto Base media. Per la formazione di biofilm, RPMI 1640 media, che hanno alte concentrazioni di aminoacidi, sono state applicate per aiutare la crescita di biofilm. Biofilm di 48 h sono stati curati due volte al giorno per un periodo di 1 min con un dispositivo di luce non coerente (luce rossa; lunghezza d'onda = 635 nm; densità di energia = 87,6 J·cm-2). Come controllo positivo (PC), 0,12% clorexidina (CHX) è stato applicato e come controllo negativo (NC), 0,89% NaCl è stato applicato il biofilm. Unità formanti colonia (UFC), a secco-peso, solubili e insolubili esopolisaccaridi sono stati quantificati dopo i trattamenti. In breve, il protocollo presentato qui è semplice, riproducibile e fornisce risposte per quanto riguarda la redditività, gli importi di polisaccaride extracellulare e di peso a secco dopo trattamento luce rossa.
Introduction
L'aumentata incidenza di diabete, terapia immunosopressiva applicazioni, l'infezione da HIV, epidemia di AIDS, procedure cliniche invasive e consumo di antibiotici ad ampio spettro, negli ultimi anni hanno aumentato l'incidenza di Candida albicans correlate a malattie1,2. Infezioni da c. albicans sono comunemente legati allo sviluppo di biofilm e può causare manifestazioni cliniche, quali la candidosi, o manifestazioni sistemiche, quali candidemia1,2. Uno dei fattori di virulenza più degno di nota della crescita di biofilm è l'istituzione di matrice polisaccaride extracellulare. Formazione di biofilm coopera per aumentare la resistenza ai farmaci antimicotici esistenti, stress ambientale e host meccanismi immuni3.
La crescita di biofilm di c. albicans inizia con l'aderenza iniziale delle cellule planctoniche su un substrato, seguita dalla propagazione di cellule di lievito attraverso la superficie del substrato e la crescita ifale. L'ultima fase di crescita di biofilm è la fase di maturazione, in cui sviluppo lievitiforme è soppresso, lo sviluppo ifale si espande e la matrice extracellulare racchiude il biofilm4. C. albicans esopolisaccaridi (EPS) nella matrice interagiscono per formare i mannano-glucano complesso5,6. L'interazione di esopolisaccaridi è fondamentale per la difesa dei biofilm contro farmaci7. Quindi, la riduzione di EPS da c. albicans extracellulare potrebbe sostenere lo sviluppo di nuovi protocolli di antibiofilm per controllo di candidosi orale.
Luce regola la crescita, sviluppo e comportamento di diversi organismi8 ed è stato applicato come un antimicrobico in chemioterapia fotodinamica antimicrobica (patto). Patto si applica una luce visibile di una specifica lunghezza d'onda e un fotosensibilizzatore luce-assorbente9. Tuttavia, i fotosensibilizzanti hanno difficoltà a penetrare il biofilm, causando più bassa efficacia10. Il fallimento degli agenti terapeutici per infiltrarsi completamente biofilm è un motivo che i biofilm resistono occasionalmente tradizionale terapia antimicrobica3,5. Per disattivare le cellule microbiche recintate, antimicrobici devono permeare attraverso la matrice extracellulare; Tuttavia, l'EPS caratterizza un ostacolo diffusionale per tali molecole spingendo il loro livello di trasporto in biofilm o di influenzare la risposta dell'antimicrobico con matrix stessa11.
Considerando gli svantaggi del patto, l'uso della luce di per sé emerge come un'importante miglioria. Dati preliminari hanno rivelato che il trattamento con luce blu due volte al giorno ha inibito significativamente la produzione di EPS insolubile nel biofilm di Streptococcus mutans . Tramite la diminuzione di insolubile in EPS, luce blu diminuita crescita di biofilm. Tuttavia, i risultati della fototerapia con luce rossa nel biofilm albicans del c. sono scarsi. Quindi, l'obiettivo di questa ricerca era di valutare in quali fototerapia modo utilizzando luce rossa influenza la crescita e la disposizione dei albicans del c. biofilm. Per il trattamento due volte al giorno, abbiamo adattato protocolli precedenti12 9,per fornire un modello semplice e riproducibile biofilm che offre risposte per quanto riguarda la redditività, del nostro laboratorio polisaccaridi extracellulari e di peso a secco importi dopo il trattamento di luce rossa. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per testare altre terapie.
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Protocol
1. preparazione di terreni di coltura
- Preparare il sabouraud agar destrosio (SDA). Sospendere 65g di SDA completato con cloramfenicolo (50 mg/L) in 1000 mL di acqua distillata. Far bollire per sciogliere completamente il mezzo. Sterilizzare in autoclave a 15 PSI (121° C) per 30 min. raffreddare a 45-50 ° C. Mescolare bene e versare 20 mL di SDA in piastre di Petri sterili (dimensioni: 100 x 15 mm).
- Preparare il lievito azoto base (YNB) supplementato con 100 millimetri di glucosio mescolando 6,7 g di YNB e 18 g di destrosio a 1.000 mL di acqua ultrapura. Mescolare con un agitatore e sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di vuoto filtro da 0,22 µm.
- Preparare RPMI mescolando 10,4 g di RPMI 1640 e 34,32 g di 3-(N-morfolino) acido propansulfonico (MOPS) a 1.000 mL di acqua ultrapura. Mescolare in un agitatore senza calore e regolare il pH a 7 aggiungendo 1 N NaOH (aggiungere 2 g di NaOH a 50 mL di acqua distillata). Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di vuoto filtro da 0,22 µm.
2. pre-inoculo e inoculo
- Togliere il microrganismo SN425 albicans del c. dal − 80 ° C congelatore e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente. 10 µ l di colture stock su piastre di Petri contenente SDA completato con cloramfenicolo (50 mg/L) del seme. Incubare le capsule di Petri aerobicamente a 37 ° C per 48 h.
- Dopo 48 h di incubazione, è necessario aggiungere 10 colonie di albicans del c. a 10 mL di azoto di lievito base (YNB) medie completati con 100 millimetri di glucosio e incubare aerobicamente a 37 ° C per 16 h per il pre-inoculo.
- Dopo incubazione per 16 ore, preparare gli Inoculanti diluendo le colture starter in mezzo fresco YNB completato con 100 millimetri di glucosio in un 01:10 proporzione (1 mL della coltura starter diluita in 9 mL di YNB). Misurare la densità ottica iniziale (OD) a 540 nm.
- Incubare gli Inoculanti aerobicamente a 37 ° C per 8 h fino a quando i ceppi di raggiungono la fase di crescita del Mid-log e misurano il finale assorbanza a 540 nm. Sottrarre il finale OD da OD iniziale per controllare se sul diametro esterno dell'Inoculanti sono la fase di crescita del Mid-log (8h, basato sulle curve di crescita nella Figura 1).
- Per raggiungere un inoculo con 107 cellule mL-1, centrifugare l'inoculo per 5 min a 5.500 x g, scartare il surnatante e concentrare l'inoculo a metà del volume dei tubi.
3. di biofilm e fototerapia
- Aggiungere 1 mL di inoculo dei pozzetti di una piastra di polistirolo 24 pozzetti. Incubare aerobicamente a 37 ° C per 90 min consentire l'adesione delle cellule per il fondo dei pozzetti.
- Utilizzare un rosso non coerente luce (vedere Tabella materiali) come fonte di luce con lunghezza d'onda di 635 ± 10 nm e una potenza di uscita fissa di 1.460 mW cm− 2.
- Utilizzare un misuratore di potenza per misurare la densità di potenza della luce. L'esposizione radiante applicato è 87,6 J cm-2, equivalente a circa 1 min di esposizione. Utilizzare la formula di densità di energia (J/cm2) = densità di potenza (W/cm2) x tempo di irraggiamento (s). Applicare una distanza di 5 mm tra la sorgente luminosa e il biofilm per evitare il riscaldamento del campione.
- Trattare il biofilm di controllo positivo con clorexidina 0,12% per 1 min e controllo negativo biofilm con 0.89% NaCl per 1 min.
- Dopo i trattamenti, lavare tutti i biofilm due volte con soluzione di NaCl 0,89%.
- Aggiungere 1 mL di RPMI 1640 tamponata con 3-(N-morfolino) acido propansulfonico (MOPS) a pH 7 per il biofilm e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
- Al mattino, si applicano gli stessi trattamenti come passaggi 3.2 a 3.6, lavare il biofilm due volte con 0.89% NaCl, aggiungere nuove RPMI tamponata con MOPS (1 mL, pH 7) ai pozzetti e incubare aerobicamente a 37 ° C.
- Lo stesso giorno, dopo 6 h, esporre il biofilm a luce rossa. Trattare il biofilm di controllo positivo con clorexidina 0,12% per 1 min e controllo negativo biofilm con 0.89% NaCl per 1 min. Dopo i trattamenti, lavare il biofilm due volte con soluzione di NaCl 0,89%.
- Ripetere i passaggi 3.2-3.8 fino al raggiungimento di 48 h di sviluppo di biofilm.
Nota: In sostanza, un trattamento avverrà la mattina e l'altro accadrà nel pomeriggio dello stesso giorno (6h apart).
4. elaborazione
- Aggiungere 1 mL di sterile 0,89% NaCl al pozzo per rimuovere il biofilm di graffiare dal bene usando un puntale. Aggiungere il biofilm rimosso in una provetta sterile.
- Aggiungere 1 mL di sterile 0,89% NaCl al pozzo. Graffiarlo nuovamente e aggiungere la sospensione al tubo stesso per un volume totale di 2 mL.
- Unità formanti colonie (CFU)
- Vortice vigorosamente la sospensione di biofilm per 1 min. Dalla sospensione biofilm, utilizzare un'aliquota di 0,1 mL per la diluizione seriale.
- Diluire la sospensione di biofilm da 10-1 fino a 10-4 in 0.89% NaCl soluzione.
- 50 μL di ogni diluizione a piastre SDA di semi e incubare le piastre a 37 ° C per 48 h.
- Contare le colonie e applicare la formula CFU/mL = numero di colonie x 10n / q (n = diluizione; q = volume di teste di serie).
- Peso a secco
- Pesare ed etichettare provette microcentrifuga.
- Dalla sospensione biofilm, utilizzare 0,1 mL per la determinazione del peso a secco (biomassa).
- Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto ad un'aliquota di 0,1 mL del biofilm e conservare a-20 ° C per 18 h. Dopo 18 h, centrifugare a 10.000 x g per 10 min.
- Eliminare il supernatante, posizionare i tubi su un essiccatore ad asciugare i campioni per una settimana e pesare nuovamente la microcentrifuga.
-
Polisaccaridi solubili in acqua (WSPs) e polisaccaridi solubili in alcali (ASPs)
- Dalla sospensione biofilm, vigorosamente vortice il resto del volume (1,8 mL) per 1 min e centrifugare a 5.500 × g per 10 min a 4 ° C. Conservare il supernatante in un nuovo tubo e lavare il precipitato due volte con le cellule, che contengono i costituenti insolubili della matrice extracellulare con acqua ultrapura sterile (5.500 × g, 10 min a 4 ° C).
- Risospendere il contenuto insolubile a 1,8 mL di acqua distillata sterile.
- Polisaccaridi solubili in acqua (WSPs)
Nota: Eseguire questo esperimento in una cappa aspirante.- Dal surnatante stored, riserva 1 mL per la quantificazione dei polisaccaridi solubili in acqua (WSPs).
- Omogeneizzare il surnatante stored per 1 min. Trasferire in provette sterili, quindi aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 95%. Conservare i capillari per 18 ore a-20 ° C per WSPs precipitazioni.
- Dopo 18 h, centrifugare le provette a 9.500 x g per 20 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, eliminare i sovranatante.
- Lavare tre volte con etanolo 75% i campioni e asciugare il pellet. Risospendere il pellet con 1 mL di acqua distillata sterile e quantificare il WSP utilizzando il metodo fenolo-solforico acido.
- Utilizzare il glucosio 0,1% (0,01 g di glucosio a 10 mL di acqua ultrapura) per la curva standard (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 e 25 µ l di glucosio per provetta).
- Aggiungere 200 µ l di fenolo al 5% (2,7 mL di fenolo al 90% a 47,3 mL di acqua ultrapura) in una provetta di vetro composto da 200 µ l di campione o curva standard scegliere (in triplice copia per campione) e mescolare con cautela.
- Aggiungere 1 mL di acido solforico al tubo e mescolare. Attendere 20 minuti per la reazione e misurare i campioni utilizzando uno spettrofotometro (490 nm).
- Polisaccaridi solubili in alcali (ASPs)
Nota: Eseguire questo esperimento in una cappa aspirante.- Da quello che ri-sospensione insolubile, separare 1 mL per la determinazione dell'ASPs. Centrifugare le aliquote di ogni sospensione di biofilm (13.000 x gper 10 min a 4 ° C).
- Rimuovere con cautela il surnatante di ogni tubo. Quindi posizionare i campioni su un concentratore a vuoto per asciugare il pellet.
- Pesare i pellet e aggiungere 300 µ l di NaOH N 1 (2 g di NaOH a 50 mL di acqua ultrapura) per 1 mg di peso a secco. Li Incubare per 2 ore a 37 ° C e poi Centrifugare a 13.000 × g per 10 min.
- Raccogliere con cautela i surnatanti con una pipetta e trasferimento per microcentrifuga, mantenendo il pellet.
- Ancora una volta, aggiungere un volume equivalente di 1 N NaOH ai tubi che comprende il pellet e ripetere la stessa procedura come sopra per l'estrazione di ASP.
- Dopo incubazione per 2 h, centrifugare i campioni (13.000 x g per 10 min), accuratamente raccogliere i surnatanti e aggiungere i surnatanti raccolti in precedenza.
- Per la terza estrazione, ripetere la stessa procedura come sopra, ma questa volta, non Incubare i campioni per 2 h prima di centrifugazione.
- In seguito, aggiungere tre volumi di etanolo al 95% per ogni campione. Quindi, d'archivio i campioni a − 20 ° C per 18 h per precipitazione di ASP.
- Centrifugare le provette (9.500 × g per 20 min a 4 ° C) ed eliminare i sovranatante.
- Lavare ogni pallina tre volte con etanolo al 75% e asciugare all'aria (stesse procedure fatto per WSP). Risospendere il pellet in uguale volume totale dell'estrazione prima con 1 N NaOH.
- Leggere i campioni per la quantificazione di ASP utilizzando il fenolo-solforico (stesso per quanto riguarda analisi WSP).
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Representative Results
Figura 2 Visualizza i risultati del registro10 CFU/mL di albicans del c. dopo trattamenti diaria con luce rossa per 1 min. luce rossa ha ridotto significativamente il Log10 UFC/mL rispetto al CN (p = 0,004). Figura 3 presenta i risultati della biomassa (mg) di c. albicans biofilms dopo trattamenti giornalieri. Tutti i gruppi hanno mostrati riduzione della biomassa rispetto al CN curati (p = 0,000) e la luce rossa curato i gruppi presentati simile riduzione della biomassa a quella osservata nel PC. Figura 4 e Figura 5 visualizzare quantità inferiori di albicans del c. EPS-solubili e insolubili in EPS in PC rispetto a NC (p = 0,000). Anche se non statisticamente significativo, diaria applicazione di luce rossa per 1 min per c. albicans biofilms numericamente diminuito gli importi di EPS-solubili e insolubili in EPS.
Figura 1 . Curva di crescita di albicans del c. ceppo SN 425. Planctonico cultura è stata effettuata in mezzo YNB completati con 100 mM di glucosio ed incubate a 37 ° C. La densità ottica (OD a 540 nm) e Log10 CFU/mL sono stati determinati nel corso del tempo. Deviazione standard è indicato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Deviazioni standard e medie di Log10 CFU/mL di albicans del c.. Le valutazioni sono state fatte tra il trattamento con luce rossa, due volte al giorno e il controls-0.12% CHX (PC) e 0,89% NaCl (NC). Lettere uguali rappresentano somiglianza statistica fra i gruppi (p > 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Deviazioni standard e medie del peso a secco (mg) di albicans del c.. Le valutazioni sono state fatte tra il trattamento con luce rossa, due volte al giorno e il controls-0.12% CHX (PC) e 0,89% NaCl (NC). Lettere uguali rappresentano somiglianza statistica fra i gruppi (p > 0.05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Deviazioni standard e medie di EPS-solubile ammontano a albicans del c. biofilm (µ g/mg di peso a secco). Confronti sono stati fatti tra il trattamento con luce rossa, due volte al giorno e il controls-0.12% CHX (PC) e 0,89% NaCl (NC). Lettere uguali rappresentano somiglianza statistica fra i gruppi (p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Deviazioni standard e medie di EPS insolubile contenuto albicans del c. biofilm (µ g/mg di peso a secco). Le valutazioni sono state fatte tra il trattamento con luce rossa, due volte al giorno e il controls-0.12% CHX (PC) e 0,89% NaCl (NC). Lettere uguali rappresentano somiglianza statistica fra i gruppi (p < 0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I passaggi più critici per la coltura di successo del biofilm di albicans del c. sono: 1) per fare il pre-inoculo e l'inoculo in mezzo YNB completato con 100 millimetri di glucosio; 2) ad aspettare 90 min per la fase di adesione e lavare accuratamente due volte i pozzetti con 0.89% NaCl per rimuovere le cellule non rispettato; e 3) per aggiungere il terreno RPMI alle cellule aderite per avviare la formazione di biofilm, poiché RPMI stimolerà la crescita di ife. Aneuploidi possono verificarsi quando la coltura di c. albicans. Di conseguenza, è importante non utilizzare colonie che sono più di sette giorni di età, di non conservare le piastre a 4° C e di non ri-striscia di cellule da placche esistenti. Allo stesso modo, ceppi dovrebbero essere utilizzati prima di 18 ore di notte crescita13.
Una limitazione di studio è che è stato effettuato in vitro. Mentre gli studi in vitro hanno incrementato notevolmente la comprensione della biologia del biofilm, precisamente non rappresentano condizioni in vivo14. Tuttavia, test in vitro forniscono high throughput screening oltre ad essere una metodologia semplice ed economico14 per rispondere a domande riguardanti nuove terapie antibiofilm. Scelta del corretto supporto di cultura per ogni fase di sviluppo di biofilm è un passo importante per il successo del metodo. RPMI 1640 è un mezzo di sostanza-ricco che ha aminoacidi e simula la composizione dei fluidi umani15. RPMI 1640 contiene L-Glutammina, L-arginina, L-asparagina oltre a vitamine e sali inorganici. Tuttavia, YNB media ha una quantità elevata di glucosio (18 g/L) rispetto al medium RPMI 1640 (glucosio 2G/L). Il contenuto di alto glucosio è stato descritto per aumentare la crescita planctonica di Candida specie16. Al contrario, l'esistenza di più alte concentrazioni di aminoacidi aiuterà la crescita di biofilm in medium RPMI rispetto a YNB medio16. Dati qualitativi applicando micrografi di SEM ha mostrato che la progettazione strutturale di c. albicans biofilm in RPMI presenta un'organizzazione complessa con una solida crescita dei lieviti con ramificati IFE, elementi in erba e bud cicatrici con un abbondante matrice extracellulare16. Tali risultati sono in conformità con un precedente studio che ha segnalato che RPMI 1640 aumentata l'ifale formazione di biofilm di albicans del c. 15. Questi risultati dimostrano le differenze nell'utilizzazione del substrato da Candida nel corso di fasi di crescita di biofilm differenti e dimostrano l'importanza della sostituzione del supporto durante la formazione di crescita e biofilm planctonica.
La selezione della corretta temperatura e pH a coltivare i biofilm albicans del c. è anche importante per realizzare il metodo con l'adeguata formazione di ife. C. albicans si impegna la conversione da blastospores a filamenti in reazione alle condizioni che simulano il milieu di mammifero ospite tessuti17. Queste condizioni comportano crescenti a temperatura corporea (37 ° C) e a pH neutro17, e questo è il motivo perché il pH del terreno RPMI viene regolato a 7.
I metodi applicati in questo studio sono significativi poiché i biofilm di albicans del c. SN 425 sono stati caratterizzati prima delle12, mostrando di avere grandi quantità di EPS-solubili e - insolubili, che lo rende un metodo affidabile per analizzare il risultato delle luci sui polisaccaridi extracellulari. Inoltre, lo stesso dispositivo di luce non coerente applicato negli esperimenti è stato applicato con successo a sospensioni batteriche planctoniche18 e biofilm9, e il beneficio massimo di questo dispositivo è la riduzione del tempo di trattamento, ciò che rende il dispositivo più fattibile per applicazioni cliniche18. L'analisi della fototerapia giornaliero applicato al biofilm albicans del c. è significativo in quanto la metodologia applicata nello studio presente simula un trattamento che è veloce e può essere fatto facilmente dal paziente a casa.
Luce rossa trattamento giornaliero ridotto chiaramente albicans del c. vitali Colonia totali e biofilm biomasse. Ulteriori studi potrebbero provare una combinazione di trattamenti, a partire con la fototerapia e dopo l'applicazione topica antimicotico. Questa strategia potrebbe aiutare a scompaginare la matrice extracellulare schermatura biofilm albicans del c. , permettendo la migliore infiltrazione di droga attraverso il biofilm di raggiungere e infine sradicare le cellule di c. albicans . Considerando le limitazioni di questo esperimento in vitro, l'uso di luce rossa per 1 min può assistere come adiuvante ai antifungals argomento sul trattamento della candidosi orale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. N. Malvin Janal e Dr. Iriana Zanin per lo sviluppo di questo studio. Riconosciamo anche il Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) per donare il ceppo analizzato in questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
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