Summary
여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 레드 빛 응용 프로그램의 결과 평가 하는 프로토콜. 635 nm의 파장 및 87.6 J·cm-2 의 에너지 밀도와 비 코히어런트 레드 라이트 장치 48 h에 대 한 칸디 다 albicans biofilms의 성장에 걸쳐 적용 되었다.
Abstract
여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 일당 빨간 불 치료의 결과 평가 하는 프로토콜. C. albicans SN425의 planktonic 성장, 증가 하는 inoculums 효 모 질소 기지 미디어에 성장 했다. Biofilm 형성에 대 한 아미노산의 높은 농도가지고 RPMI 1640 미디어 biofilm 성장 수 있도록 적용 되었다. 48 h의 Biofilms 비 코히어런트 빛 장치로 1 분 동안 하루에 두 번을 치료 했다 (붉은 빛, 파장 = 635 nm; 에너지 밀도 = 87.6 J·cm-2). 긍정적인 통제 (PC), 0.12% 액체 (CHX) 적용, 그리고 부정적인 제어 (NC), 0.89 %NaCl biofilms에 적용 했다. 콜로 니 형성 단위 (CFU), 건조 중량, 가용성과 불용 성 exopolysaccharides 치료 후 계량 했다. 간단히, 여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 재현성 및 빨간 불 치료. 후 드라이 무게와 세포 외 다 당 류 금액, 생존 능력에 대 한 답변을 제공 합니다.
Introduction
Candida albicans 의 발생률을 증가 하는 당뇨병, 면역 억제 치료 응용 프로그램, HIV 감염, 에이즈, 침략 적 임상 절차 및 과거 년에 있는 넓 스펙트럼 항생제 소비의 발생률이 증가 관련 질병1,2. C. albicans 감염 biofilm 개발 관련 일반적으로 그리고 임상 발현, 칸디 다 증, 또는 candidemia1,2등 조직 발현 등을 일으킬 수 있습니다. Biofilm 성장의 가장 주목할 만한 독성 요인 중 하나는 세포 외 다 당 류 매트릭스 설립 이다. Biofilm 형성 기존 항진균 약물, 환경 스트레스, 그리고 호스트 면역 메커니즘3에 저항을 증가 협력.
C. albicans 의 biofilm 성장을 planktonic 셀의 초기 부착 기판, 기판 표면, 및 hyphal 성장을 통해 효 모 세포의 전파에 의해 뒤에 시작 됩니다. Biofilm 성장의 마지막 단계 성숙 단계, 어떤 점에서 효 모와 같은 개발 억제, hyphal 개발 확장 되 고 세포 외 매트릭스 포함 biofilm4입니다. C. albicans exopolysaccharides (EPS) 행렬에서 mannan-글 루 칸 복잡 한5,6를 상호 작용 합니다. Exopolysaccharides의 상호 작용은 약7에 biofilms의 방어에 대 한 중요 합니다. 따라서, C. albicans 기질에서 EPS의 감소는 구강 칸디 다 증 제어를 위한 새로운 antibiofilm 프로토콜의 개발을 지원할 수 있습니다.
빛 조절 성장, 개발, 및 여러 생물8 의 행동 그리고 photodynamic 항균 화학요법 (협정)에 항균으로 적용 되었습니다. 협정에는 특정 파장의 빛을 흡수 photosensitizer9가시 광선 적용 됩니다. 그러나,는 photosensitizers 낮은 효능10를 일으키는 biofilm, 침투에 어려움이 있다. 완전히 침투 biofilms 치료제의 실패는 biofilms 때때로 전통적인 항균 치료3,5저항 하는 이유입니다. 동봉 된 미생물 세포를 비활성화 하려면 제 기질; 통해 침투 필요 그럼에도 불구 하 고, EPS는 biofilm에 운송의 그들의 수준을 자극 하거나11자체 매트릭스와 항균의 응답에 영향을 미치는 이러한 분자에 대 한 diffusional 장애물을 특징.
협정의 단점을 고려 하면 자체적으로 빛의 사용 가치 개선으로 나온다. 예비 데이터는 하루에 두 번 블루 빛으로 치료 크게 구 mutans biofilm에 EPS-불 용해성의 생산을 저해 밝혔다. EPS-불 용해성의 감소, 블루 빛 biofilm 성장을 저하. 그럼에도 불구 하 고, C. albicans biofilms에 붉은 빛을 사용 하 여 광선 요법의 결과 부족 한. 따라서,이 조사 목표는 붉은 빛을 사용 하 여 어떤 방식으로 광선 요법 성장과 C. albicans biofilm의 영향에 평가 했다. 매일 두 번 치료를 위해 우리는 우리 실험실의 이전 프로토콜9,12 , 생존 능력에 대 한 답변을 제공 하는 간단 하 고 재현성 biofilm 모델을 제공 적응 드라이 무게와 세포 외 다 당 류 빨간 불 치료. 후 금액 다른 치료법을 테스트 하기 위해 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1입니다. 배양 기의 준비
- Sabouraud 포도 당 한 천 (SDA)를 준비 합니다. SDA 페니 (50 mg/L) 1000 ml 증류수의 보충의 65 g을 일시 중단 합니다. 매체를 완전히 분해를 끓인 다. 30 분 쿨 45-50 ° c에 대 한 15 PSI (121 ° C)에 압력가 마로 소독 하 여 소독 잘 혼합 하 고 멸 균 페 트리 접시에 SDA의 20 mL를 붓고 (크기: 100 m m x 15 m m).
- 준비 효 모 질소 기본 (YNB) 매체 100 mM 포도 당 6.7 g YNB 및 초순 물 1000 mL에 포도 당의 18 g을 혼합 하 여 보충 합니다. 교 반기를 사용 하 여 혼합 하 고 매체 0.22 μ m 진공 필터 시스템을 사용 하 여 소독.
- RPMI RPMI 1640 그리고 34.32 g 3-(N-morpholino) 10.4 g을 혼합 하 여 준비 propanesulfonic 산 (MOPS) 초순 물 1000 mL. 열 없이 교 반기에서 혼합 하 고 1 N NaOH (초순 물 50 mL에 NaOH의 추가 2 g)를 추가 하 여 7 pH를 조정. 0.22 μ m 진공 필터 시스템을 사용 하 여 매체를 소독.
2. 사전 inoculum 및 inoculum
- C. albicans SN425 미생물 −80 ° C 냉동 고에서 제거 하 고 주위 온도에 녹여 보자. SDA 페니 (50 mg/L) 보충을 포함 하는 배양 접시에 재고 문화 10 µ L 씨 48 h에 대 한 37 ° C에서 aerobically 페 트리 접시를 품 어.
- 외피의 48 h 후 C. albicans 의 10 식민지 효 질소 기본 (YNB) 매체 100 mM 포도 당 보충 aerobically 사전 inoculum 16 h 37 ° C에서 품 어의 10 mL를 추가 합니다.
- 16 h, 준비는 inoculums 1시 10분에서 100 mM 포도 당으로 보충 하는 신선한 YNB 매체에 스타터 문화를 diluting 하 여 대 한 잠복기 후 비례 (1 mL YNB 9 mL에 희석 시 동기 문화). 540에서 측정 하는 초기 광학 밀도 (OD) nm.
- 긴장과 중간 로그 성장 단계에 도달 540에서 최종 OD를 측정 될 때까지 aerobically 8 h 37 ° C에서 inoculums를 품 어 nm. 중간 로그 성장 단계 ( 그림 1의 성장 곡선에 따라 8 h)에 inoculums의 세 인지 확인 하는 초기 OD에서 최종 OD를 뺍니다.
- 107 셀 mL-1와 inoculum 도달, 5500 x g에 5 분 동안 inoculum을 원심 하 고 삭제는 상쾌한 튜브의 볼륨의 절반을 inoculum을 집중.
3. Biofilm 형성 및 광선 요법
- 24 잘 폴리스 티 렌 격판덮개의 우물에는 inoculum의 1 mL를 추가 합니다. Aerobically 우물의 바닥에 세포 접착 수 있도록 90 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 비 일관 된 레드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 635 ± 10 nm의 파장 및 1,460 mW cm−2의 고정된 출력 광원으로 빛.
- 전력 측정기를 사용 하 여 빛의 전력 밀도 측정. 눈부신 노출 적용은 87.6 J c m-2, 노출의 약 1 분에 해당입니다. 에너지 밀도 (J/c m2) 수식을 사용 하 여 = 조사 시간 (s) x 전력 밀도 (W/c m2). 광원 및 샘플 온난화 방지 하려면 biofilm 사이 5 밀리미터의 거리를 적용 합니다.
- 치료 1 분 0.12% 액체와 긍정적인 제어 biofilms 부정적인 제어 biofilms 0.89% NaCl 1 분.
- 치료 후 모든 biofilms 0.89 %NaCl 용액으로 두 번 씻는 다.
- 3-(N-morpholino) 버퍼링 RPMI 1640의 1 mL을 추가 biofilms에 pH 7에서의 propanesulfonic 산 (MOPS) 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 고.
- 3.2에서 3.6 단계 세척 0.89%로 두 번 biofilms 동일한 치료 적용 아침에, NaCl, 새로운 RPMI 우물 MOPS (1 mL, pH 7)와 버퍼를 추가 하 고 aerobically 37 ° c.에 품 어
- 같은 날, 6 h 후에 레드 빛 biofilms 노출. 치료 1 분 0.12% 액체와 긍정적인 제어 biofilms 부정적인 제어 biofilms 0.89% NaCl 1 분. 치료 후 biofilms 0.89 %NaCl 용액으로 두 번 씻는 다.
- Biofilm 개발의 48 h 달성까지 3.2-3.8 단계를 반복 합니다.
참고: 기본적으로, 1 개의 치료는 아침에 일어날 것 이다와 다른 하나 (떨어져 6 h) 같은 날 오후에 일어날 것 이다.
4입니다. 처리
- 추가 1 mL 균 0.89%의 NaCl 잘 하는 biofilm는 잘 사용 하 여 피 펫 팁에서 그것을 긁어서 제거 하. 살 균 튜브를 제거 biofilm를 추가 합니다.
- 살 균 0.89%의 또 다른 1 mL을 추가 잘 NaCl. 다시 긁 고 2 mL의 전체 볼륨에 대 한 같은 튜브에 정지를 추가 합니다.
- 콜로 니 형성 단위 (CFU)
- 적극적으로 소용돌이 1 분 biofilm 정지입니다. Biofilm 정지에서 0.1 mL의 약 수를 사용 하 여 직렬 희석에 대 한.
- 0.89 %NaCl 용액에 10-4 10-1 에서 biofilm 정지 희석.
- SDA 번호판 각 희석의 50 μ 씨 하 고 48 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 식민지를 계산 하 고 적용 하는 수식 CFU/mL = 식민지 x 10n 의 수 / q (n = 희석; q = 시드 볼륨).
- 건조 중량
- 무게 및 레이블 microcentrifuge 튜브입니다.
- Biofilm 정지에서 0.1 mL를 사용 하 여 건조 중량 (바이오 매스) 결정에 대 한.
- 절대 에타 놀의 1 mL는 biofilms의 0.1 mL의 약 수를 추가 하 고 18 h-20 ° C에서 그것을 저장. 후 18 h 10 분에 대 한 10000 x g 에서 원심.
- 상쾌한, 튜브를 1 주일에 대 한 샘플을 건조 하 고 다시 microcentrifuge 튜브 무게 desiccator에 장소.
-
수용 성 다 당 류 (WSPs)와 알칼리 수용 성 다 당 류 (Asp)
- Biofilm 서 스 펜 션, 적극적으로 소용돌이 1 분 및 4 ° c.에서 10 분 동안 5500 × g 에서 원심 분리기 (1.8 mL) 볼륨의 나머지에서 새로운 튜브에는 상쾌한을 저장 하 고 두 번 불 임 초순 (5500 × g, 4 ° C에서 10 분)와 세포 외 매트릭스의 불용 성 성분 포함 하는 셀으로 침전을 세척.
- 다시 살 균 초순의 1.8 mL에 불용 성 콘텐츠를 일시 중단 합니다.
- 수용 성 다 당 류 (WSPs)
참고: 증기 두건에서이 실험을 수행 합니다.- 저장 된 상쾌한에서 수용 성 다 당 류 (WSPs)의 정량화에 대 한 1 mL를 보유 합니다.
- 1 분 동안 저장된 상쾌한 균질 다음, 무 균 튜브에 전송 하 고 95% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. WSPs 강 수를 위해-20 ° C에 18 h에 대 한 튜브를 저장 합니다.
- 18 h 후 4 ° c.에 20 분 9500 x g 에서 튜브 원심 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다.
- 세 번 75% 에탄올과 샘플을 세척 하 고 알 약을 건조. 다시 살 균 초순 물의 1 mL와 펠 릿을 일시 중단 하 고 페 놀 황산 산 메서드를 사용 하 여 WSP 계량.
- 0.1% 포도 당 (포도 당 초순의 10 mL를의 0.01 g)을 사용 하 여 표준 곡선 (0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 및 25 µ L 튜브 당 포도 당의).
- 구성 된 샘플의 200 µ L 유리 튜브에 5% 페 놀 (초순의 47.3 mL에 페 놀 90%의 2.7 mL)의 200 µ L를 추가 또는 표준 곡선 (샘플 당 3 중)에서 조심 스럽게 섞는다.
- 관에 황산 1 mL를 추가 하 고 섞으십시오. 반응에 대 일 분 기를 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플을 측정 (490 nm).
- 알칼리 수용 성 다 당 류 (Asp)
참고: 증기 두건에서이 실험을 수행 합니다.- 불용 성 다시 일시 중단 된 금액에서 Asp의 결정에 대 한 1 mL을 구분 합니다. 각 biofilm 정지 (13000 x g, 4 ° C에서 10 분)의 aliquots 원심
- 각 튜브의 상쾌한을 조심 스럽게 제거 합니다. 다음 건조 한 펠 릿을 진공 집중 장치에 샘플을 놓습니다.
- 알 약을 무게 고 건조 중량의 1 밀리 그램 당 1 N NaOH 초순 물 50 mL에 NaOH (2 세대)의 300 µ L를 추가 합니다. 37 ° C에서 2 시간에 대 한 그들을 품 어 그리고 10 분 13000 × g 에서 원심.
- 신중 하 게 microcentrifuge 튜브, 펠 릿을 유지 하는 피 펫 및 전송 supernatants를 수집 합니다.
- 다시 한번, 펠 릿, 구성 된 튜브에 1 N NaOH의 동일한 볼륨을 추가 하 고 ASP의 추출에 대 한 동일한 단계를 위의 반복.
- 2 h에 대 한 보육, 후 원심 샘플 (13000 x g 10 분 동안) 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 이전에 수집한 supernatants에 추가.
- 세 번째 추출에 대 한 하지만이 시간, 위에 같은 단계를 반복, 원심 분리 하기 전에 2 시간에 대 한 샘플을 품 어 하지 마십시오.
- 나중에, 각 샘플에 95% 에탄올의 3 개의 볼륨을 추가 합니다. 그런 다음 −20 ° C 18 h ASP의 강수량에 대 한 샘플 재고.
- Centrifuge 튜브 (9500 × g 4 ° C에서 20 분) 하 고는 supernatants 삭제.
- 각 펠 릿 75% 에탄올으로 세 번 세척 하 고 건조 (동일한 절차는 WSP 위해 했다). 다시 1 N NaOH와 함께 첫 번째 추출의 동등한 총 볼륨에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- 페 놀 황산을 사용 하 여 ASP의 정량화에 대 한 샘플을 읽고 (WSP 분석에 관해서는 같은).
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Representative Results
그림 2 1 분 빨간 불 로그10 CFU/mL는 NC에 비해 감소에 대 한 레드 빛 당 일당 치료 후 로그10 CFU/mL C. albicans 의 결과 표시 (p = 0.004). 그림 3 은 매일 처리 후 C. albicans biofilms의 바이오 매스 (mg)의 결과 제공합니다. 모든 처리 그룹은 NC에 비해 바이오 매스의 감소를 보였다 (p = 0.000) 붉은 빛 처리는 PC에서 관찰 하는 바이오 매스의 유사한 감소를 제시 그룹. 그림 4 및 그림 5 PC NC에 비해 열 등 한 양의 C. albicans EPS 가용성과 EPS 불용 성 표시 (p = 0.000). 비록 하지 통계적으로 1 분에 대 한 레드 빛의 C. albicans biofilms에 중요 한, 당 일당 응용 숫자 감소 EPS 가용성과 EPS-불 용해성의 금액.
그림 1 . 성장 곡선 C. albicans 변형 SN 425. Planktonic 문화 YNB 중 100 m m의 포도 당으로 보충 하 고 37 ° c.에 인 큐베이 팅에 되었다 광학 밀도 (OD에서 540 nm) Log10 CFU/mL는 시간이 지남에 따라 결정 했다. 표준 편차 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 로그10 의 평균 및 표준 편차 CFU/mL의 C. albicans. 하루에 두 번 및 CHX (PC) controls-0.12% 0.89% 레드 빛 치료 사이 평가 했다 NaCl (NC). 동일한 편지 그룹 (p > 0.05) 사이 통계적 유사성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 드라이 무게 (mg)의 평균 및 표준 편차 C. albicans. 하루에 두 번 및 CHX (PC) controls-0.12% 0.89% 레드 빛 치료 사이 평가 했다 NaCl (NC). 동일한 편지 그룹 (p > 0.05) 사이 통계적 유사성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . EPS 용 해의 평균 및 표준 편차에 금액 C. albicans biofilm (건조 중량의 µ g/mg). 하루에 두 번 및 CHX (PC) controls-0.12% 0.89% 레드 빛 치료 사이 비교 되었다 NaCl (NC). 동일한 편지 그룹 (p < 0.001) 사이 통계적 유사성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . EPS-불 용해성의 평균 및 표준 편차에 콘텐츠 C. albicans biofilm (건조 중량의 µ g/mg). 하루에 두 번 및 CHX (PC) controls-0.12% 0.89% 레드 빛 치료 사이 평가 했다 NaCl (NC). 동일한 편지 그룹 (p < 0.001) 사이 통계적 유사성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
C. albicans biofilm의 성공적인 경작을 위해 가장 중요 한 단계는: 1) 사전 inoculum YNB 중 포도 당 100 mM;와 보완 inoculum을 할 2)를 접착 단계에 대 일 분을 기다려야 하 고 신중 하 게 씻어 두 번 0.89% 우물 NaCl 준수 비 세포;를 제거 하 그리고 3) RPMI 매체 RPMI 균 성장 자극 것 이후 biofilm 형성을 시작 하는 준수 셀에 추가 하려면. Aneuploidies C. albicans를 경작 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 7 일 이상 저장 판 4 ° C, 그리고 기존 판에서 다시 행진 셀을 하지 않기로 오래 된 식민지를 사용 하는 것이 중요 하다. 마찬가지로, 하룻밤 성장1318 시간 전에 종자를 사용 한다.
연구 한계가 이다 생체 외에서 수행 되었다. 생체 외에서 연구 있다 biofilm의 생물학의 이해를 크게 증가 하는 동안 그들은 정확 하 게 생체 조건 조건14을 대표 하지 않는다. 그러나, 생체 외에서 테스트 저렴 하 고 간단한 방법론14 새로운 antibiofilm 치료에 관한 질문에 답변을 덧붙여 높은 처리량 검열을 제공 합니다. Biofilm 개발의 각 단계에 대 한 올바른 문화 미디어 선택 방법의 성공 위한 중요 한 단계입니다. RPMI 1640 아미노산은 시뮬레이션 인간의 체액15의 구성 하는 영양분이 풍부한 매체입니다. RPMI 1640 L-글루타민, L-아르기닌, L-아스파라긴 비타민 및 무기 염을 포함합니다. 그럼에도 불구 하 고, YNB 미디어 RPMI 1640 매체 (포도 당 2 g/L)에 비해 포도 당 (18 g/L)의 높은 금액을가지고. 높은 포도 당 콘텐츠 Candida 종16planktonic 성장을 증가를 설명 하고있다. 대조적으로, 아미노산의 높은 농도의 존재 YNB 중16에 비해 RPMI 매체에 biofilm 성장 데 도움이 됩니다. 질적 데이터 SEM 현미경을 적용 했다 RPMI에 C. albicans biofilms의 구조 설계 ramifying 균, 신진 요소와 함께 풍부한 새싹 흉터와 효 모의 견고한 성장으로 복잡 한 조직의 선물 세포 외 기질16. 이러한 결과 RPMI 1640 C. albicans biofilms15hyphal 형성 증강을 보고 이전의 연구에 따라. 이러한 결과 다른 biofilm 성장 단계에 걸쳐 칸디 다 에 의해 기판 사용률의 차이 설명 하 고 planktonic 성장과 biofilm 형성 동안 변화 하는 미디어의 중요성을 보여줍니다.
정확한 온도 pH C. albicans biofilms 육성의 선택은 또한 균의 적절 한 대형 메서드를 수행 하는 것이 중요. C. albicans 수행 blastospores에서 모방 포유류 호스트 조직17의 환경 조건에 반응에서 필 라 멘 트로 변환 하 고. 이러한 조건을 포함 체온 (37 ° C)에서 중립 pH17, 그리고 이것은 이유 왜 RPMI 매체의 pH는 7로 조정 됩니다.
이 연구에 적용 하는 방법은 C. albicans SN 425의 biofilms12, EPS 수용 성 및 불용 성, 큰 금액을 보여주는 그것에 게 빛의 결과 분석 하는 신뢰할 수 있는 방법은 전에 특징 했다 때문에 중요 한 에 세포 외 다 당 류. 또한, 같은 비 코히어런트 빛 장치 실험에 적용 된 세균성 planktonic 정지18 및 biofilms9, 성공적으로 적용 했다 그리고이 소자의 최대 혜택은 무엇이 치료 시간에 감소는 임상 응용 프로그램18더 가능한 장치. C. albicans biofilms에 적용 하는 일일 광선 요법의 분석 현재 연구에 적용 하는 방법론 시뮬레이션 치료를 빨리 하 고 환자가 집에서 쉽게 할 수 있기 때문에 중요 하다.
레드 빛 매일 치료 의미 C. albicans 가능한 식민지 수 및 biofilm biomasses 감소. 더 연구는 치료, 광선 요법으로 시작 하 고 나중에 국 소 항진균 적용의 조합을 시도할 수 있습니다. 이 전략 disorganizing 도달 하 고 마지막으로 근절 C. albicans 셀 biofilm 통해 더 나은 약물 침투를 허용 하는 C. albicans biofilm 차폐 기질에 도움이 수 있습니다. 이 생체 외 실험의 한계, 고려 1 분에 대 한 레드 빛의 사용 주제 antifungals 구강 칸디 다 증의 치료를 보조로 지원할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리가이 연구 개발에 대 한 박사 폴라 다 실베이라, 박사 Cecília Atem Gonçalves 드 Araújo 코스타, 숀 M. Maule, 쉐 인 M. Maule, 박사 Malvin N. Janal와 박사 Iriana Zanin 감사합니다. 우리는 또한이 연구에서 분석 하는 스트레인을 기부에 대 한 박사 알렉산더 D. 존슨 (UCSF)를 인정 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
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