Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59329
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 1, 1,2
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Summary

כאן אנו מתארים Rev immunoprecipitation בנוכחות של שכפול HIV-1 עבור ספקטרומטריה המסה. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות לזיהוי גורמי נוקלאוולאר המעורבים במחזור הזיהומיות של HIV-1, וחלים על מודלים אחרים של מחלות לאפיון מסלולים בעלי מחקר.

Abstract

מחזור הזיהומיות HIV-1 דורש אינטראקציות חלבון ויראליות עם גורמים מארחים כדי להקל על שכפול נגיפי, אריזה ושחרור. המחזור הזיהומיות מצריך היווצרות של מכלולי חלבון מארח ויראלי עם ה-HIV-1 RNA כדי לווסת את החבור ולאפשר הובלה באמצעות נוקלאוציטוטופלסמטי. ה-HIV-1 הפוך חלבון משיגה את היצוא הגרעיני של HIV-1 mRNAs באמצעות multimerization עם מטרות משחק של האחים הנוטרוניים-אלמנט התגובה Rev (בלבד). אות הלוקליזציה של נוקלאוולאר (NoLS) קיים בתוך COOH-הטרמינוס של הrev arginine עשיר מוטיב (זרוע), המאפשר הצטברות של מתחמי Rev/בעלי-מערכות בנוקלאוולוס. גורמי הנוקלאוולאר הם העריכו לתמוך מחזור זיהומיות HIV-1 באמצעות פונקציות אחרות שונות בנוסף ל-mRNA-עצמאי היצוא הגרעיני שחבור. אנו מתארים שיטה immunoprecipitation של פראי-סוג (WT) Rev בהשוואה מוטציות הפוך נוקלאוולאר (מחיקה ונקודה אחת Rev-NoLS מוטציות) בנוכחות של HIV-1 שכפול עבור ספקטרומטריה המסה. הגורמים הנוקלאופילים מעורבים בתחבורה הנוקלאוציטוטופלסמטי (נוקלאואופלסין B23 ונוקלאוולין C23), כמו גם גורמי שחבור סלולריים, לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות Rev-NoLS. גורמים שונים של נוקלאוולאר, כגון מ58, מזוהים לאבד אינטראקציה עם מוטציות Rev, אך תפקידם במחזור השכפול של HIV-1 נותרו לא ידועים. התוצאות המוצגות כאן להפגין את השימוש בגישה זו לזיהוי של נגיפי/מארח הגורמים הנוקלאוולמאר השומרים על מחזור זיהומיות HIV-1. המושגים המשמשים בגישה זו חלים על מודלים ויראליות ומחלות אחרים המחייבים אפיון של מסלולים בעלי מחקר חסר.

Introduction

הנוקלאוולוס שוכן כשטח האינטראקציה של מגוון מארח הסלולר והגורמים הנגיפים הדרושים לשכפול נגיפי. הנוקלאוולוס הוא מבנה מורכב החולק לשלושה תאים שונים: תא fibrillar, תא fibrillar צפוף, והתא הגרגירים. החלבון HIV-1 הפוך מכיל במיוחד בתוך תאים גרגירים; עם זאת, הסיבה לתבנית הלוקליזציה אינה ידועה. בנוכחות של מוטציות חד הנקודה בתוך רצף NoLS (מוטציות Rev 4, 5, ו 6), Rev שומר על דפוס נוקלאוולאר והוכח בעבר להציל HIV-1HXB2 שכפול, עם זאת, עם יעילות מופחתת לעומת WT Rev1 . כל המוטציות של נקודה אחת אינן מאפשרות לקיים את המחזור הזיהומיות של HIV-1NL4-3 . בנוכחות מוטציות מרובות נקודה אחת בתוך הרצף NoLS (מוטציות Rev-NoLS 2 ו -9), Rev כבר נצפתה להתפזר לאורך הגרעין הציטופלסמה ולא הצליח להציל HIV-1HXB2 שכפול1. המטרה של מחקר זה פרוטאומניקס היא לפענח נוקלאוולאר, כמו גם גורמים סלולריים nonnucleolar מעורב במסלול Rev-מתווך HIV-1 מדבקת. התנאים Rev immunoprecipitation ממוטבים באמצעות אינטראקציה עם נוקלאוולאר B23 פוספופפרוטאין, אשר בעבר הוכח לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות נוקלאוקולאר.

Rev הגורמים הסלולריים נחקרו בהרחבה בעבר; עם זאת, זה נעשה בהעדר פתוגנזה נגיפית. חלבון אחד, במיוחד, כי הוא מאופיין במחקר זה באמצעות הפוך אינטראקציה במהלך שכפול HIV-1 הוא נוקלאוולאר פוספהוופפרוטאין B23-נקרא גם נואופהוסמרין (npm), numatrin, או NO38 דו חיים2,3, 4. B23 מתבטא כשלוש איזוforms (NPM1, NPM2 וNPM3)-כל חברי המשפחה הגרעינית/נואופלמיסמין משפחת מלווה בנשק גרעיני5,6. המלווה המולקולרי NPM1 פונקציות בהרכבה נאותה של נוקלאוטיזומים, בהקמת מתחמי חומצות חלבון/גרעין המעורבים במבנים מסדר גבוה כרומטין7,8, ובמניעת צבירה ו קיפול חלבונים של יעד דרך מתחם ליבה N-terminal (שאריות 1-120)9. NPM1 פונקציונליות מרחיב הריבוכמה בראשית דרך התחבורה של חלקיקים preriboזומתיים בין הגרעין לציטופלסמה10,11, עיבוד של preriboזומא ברצף החלל הפנימי של מועתק 12,13, ומעצר את צבירת הנוקלאוולאר של חלבונים במהלך מכלול הריבוזומיום14,15. NPM1 הוא מעורב עיכוב של אפופטוזיס16 ו בייצוב של הגידול דכאי arf17,18 ו p5319, חשיפת תפקידה הכפול כגורם אונגניים ומדכא הגידול. NPM1 משתתפת בפעילות התאית של יציבות הגנום, שכפול הסנטרוכמה ותמלול. NPM1 נמצא נוקלאופולי במהלך המחזור הפנימי של מחזור התא, לאורך הפריפריה הרומוזומלית במהלך mitosis, ו ב prenucleolar גופים (PNB) בתום מיטוזיס. NPM2 ו NPM3 אינם למדו כמו NPM1, אשר עובר רמות ביטוי משתנה במהלך ממאירות20.

NPM1 מתועדת המעבר נוקלאוציטופטומיק של חלבונים גרעיניים/נוקלאוולאר שונים דרך נס פנימי ו-NLS9,21 בעבר דווחה לכונן את היבוא הגרעיני של HIV-1 תאת והפוך חלבונים. בנוכחות של B23-הדומיין-β-גלטוסידאז היתוך חלבונים, תאת מאחרבתוך הציטופלסמה ומאבדת פעילות הפעלה; זה מדגים אהדה חזקה של תאת עבור B232. מחקר נוסף הקים מתחם יציב Rev/B23 בהעדר של mRNAs המכיל את הקובץ. בנוכחות של בעל mRNA, Rev הנתק מ B23 ונקשר בעדיפות ל-HIV עם, המוביל לעקירה של B2322. זה לא ידוע איפה, ברמה הגרעינית תת, תאת ההפעלה ואת תהליך המרת Rev של B23 עבור HIV mRNA להתרחש. שני החלבונים מוצדדים להיכנס לנוקלאוולוס בו זמנית באמצעות B23 אינטראקציה. מעורבות של חלבונים סלולריים אחרים מארחים בנתיב הנוקלאוולאר של HIV צפוי. השיטות המתוארות בחקירה הפרוטסטנטית הזאת תסייע להבהיר את הגומלין של הנוקלאוולוס עם גורמים סלולאריים מארחים המעורבים במהלך הפתוגנזה HIV-1.

החקירה פרוטאומיקס הופעל באמצעות הביטוי של Rev nols מוטציות חד הנקודה (M4, M5, ו M6) והחלפות ארגינין מרובים (M2 ו-M9) עבור HIV-1HXB2 הייצור. במודל זה, קו של תא של הלה ביטוי באופן מופתי Rev-1HXB2 (hlfb) הוא מנוכר עם WT rev ומוטציות הפוך הכולל תג דגל בסוף 3 '. הנוכחות של WT Rev יאפשר שכפול ויראלי להתרחש בתרבות HLfB, בהשוואה מוטציות Rev-NoLS כי לא להציל מחסור Rev (M2 ו M9), או לאפשר שכפול נגיפי להתרחש אבל לא ביעילות כמו WT Rev (M4, M5, ו M6)1. ליפוסט התא נאסף 48 h מאוחר יותר לאחר התפשטות ויראלי בנוכחות Rev הבעה ונתון immunoprecipitation עם מאגר לפירוק ממוטב עבור האינטראקציה Rev/B23. מיטוב מאגר לליזה באמצעות ריכוזי מלח משתנה מתואר, ושיטות החלבון של HIV-1 Rev מושווים ונותחו בכסף מוכתם או Coomassie מוכתם SDS-דף ג ' לים. הגישה הראשונה פרוטקוממיקס כרוכה בניתוח ישיר של דגימת שלווה מבוטא WT הפוך, M2, M6, ו M9 על-ידי טנדם ספקטרומטר מסה. הגישה השנייה שבה האלוטים של WT Rev, M4, M5, ו M6 עברו תהליך החילוץ ג'ל הוא לעומת הגישה הראשונה. פפטיד זיקה כדי Rev-NoLS מוטציות בהשוואה WT Rev מנותח ואת ההסתברות זיהוי חלבון מוצג. גישות אלה חושפים גורמים פוטנציאליים (נוקלאוקולאר ו-nonnucleolar) המשתתפים בתחבורה HIV-1 mRNA ושחבור עם Rev במהלך שכפול HIV-1. באופן כללי, פירוק התא, IP, ותנאי הימנעות מתוארים חלים על חלבונים ויראלי של עניין להבנת גורמים סלולריים מארחים המפעילים ומווסת מסלולים זיהומיות. הדבר חל גם על חקר גורמי מארח סלולריים הנדרשים להתמדה של דגמי מחלות שונות. במודל זה פרוטאומניקס, HIV-1 Rev IP ממוטב עבור B23 אינטראקציה כדי להבהיר גורמים נוקלאואוליאר מעורב בפעילות שיוט נוקלאוצילסמטי ו-HIV-1 mRNA מחייב. בנוסף, קווי התא המבטא באופן בלתי נשכח דגמי מחלות זיהומיות כי הם חסרים חלבונים מפתח של עניין ניתן לפתח, בדומה לקו התאים HLfB, כדי ללמוד מסלולים זיהומיות של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים

  1. לשמור HLfB ב בינונית שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 1 mM נתרן פירובט בתוך רקמות-תרבות מטופלים 100 מ"מ לוחות. לשמור על תרביות תאים ב 37 ° c בתוך מחולל לחות שסופקו עם 5% CO2. המעבר מקשר תאים לצפיפות תאים של 1 x 106 תאים/mL.
  2. מחק את מדיית תרבות התא. לשטוף בעדינות את התאים עם 10 מ ל של תמיסת מלח 1 x פוספט באגירה (PBS). הסר והשמט את ה-PBS 1x מבלי לשבש את שכבת התא.
  3. הוסף 2 מ ל של פתרון 1x טריפסין-EDTA לתאים. מטלטל את הצלחת כדי לחלוק את המונאולייר והדגירה ב 37 ° c בתוך חדר מחולל לחות במשך 5 דקות.
  4. הקש בחוזקה על צד המנה בכף היד כדי לנתק את התאים. השהה מחדש את התאים המנותקים ב-8 מ ל של מדיית תרבות טרייה. לסובב את התאים ב 400 x g עבור 5 דקות.
  5. התעלם ממדיית התרבות מבלי לשבש את הגלולה הסלולרית. השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של מדיית תרבות טרייה. תת-תרבות 1 מ ל של תאים מרוכזים עם 9 מ ל של מדיה תרבותית טרייה בתוך רקמה-תרבות מטופלים 100 מ"מ לוחות.
    הערה: עבור כל מוטציה של Rev-NoLS, 3x 100 מ"מ או לוחיות התרבות של הלה תניב מספיק חלבונים לניתוח כתמי אבן מערבית וספקטרומטר מסה. הוסף צלחות נוספות עבור שליטה ובקרה חיובית של הפוך WT ופקד שלילי. נפח תא תת-תרבות ידרוש אופטימיזציה עם שימוש בסוגי תאים שונים.

2. ביטוי של מוטציות של Rev-NoLS-3 דגל במהלך שכפול HIV-1

  1. הגדל את תרבות התא HLfB לצפיפות תא של 2 x 106 תאים/mL. הכינו 4 מ ל של סידן פוספט-DNA השעיית עבור כל צלחת 100 מ"מ כדלקמן.
    1. תווית 2 15 mL צינורות 1 ו 2. הוסף 2 מ ל של 2x HBS (0.05 M HEPES, 0.28 M הנאל, ו 1.5 mM Na2hbs4 [pH 7.12]) כדי צינור 1. הוסף TE 79/10 (1 mM טריס-HCl ו 0.1 mM EDTA [pH 7.9]) לצינור 2. הנפח של TE 79/10 הוא 1.760 mL-נפח של דנ א.
    2. להוסיף 20 μg של פלאמיד המכיל את מוטציה הדגל של הRev-NoLs-3 של עניין לצינור 2 ולערבב את תוכנו באמצעות resuspension. הוסף 240 μL של 2 M CaCl2 כדי צינור 2 ולערבב שוב דרך השעיה.
    3. להעביר את התערובת של צינור 2 כדי צינור 1 dropwise, בעדינות ערבוב. אפשר להשעיה לשבת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.. מערבולת המשקעים
  2. הוסף 1 מ ל של ההשעיה השעיה לכל אחד התרבות 3-תאים, 100 מ"מ לוחות תוך התערבל בעדינות את המדיה. החזר את הצלחות לחממה והשאר את תערובת האוויר למשך 6 שעות. החלף את תערובת הגידול באמצעות 10 מ ל של מדיית תרבות טרייה, והתאים החדשים ל42 h.

3. אוסף של חלבון ויראלי ליפוסט

  1. התעלם מהמדיה הסלולרית 48 h מחיקת הדואר. מניחים כל צלחת 100 מ"מ על מצע של קרח. תווית 15 מ ל צינורות עבור כל דגם Rev-NoLS מוטציה ומניחים את הצינורות על הקרח.
  2. לשטוף בעדינות את התאים עם 10 מ ל של מקורר 1x PBS מבלי לשבש את שכבת התא. התעלם מ-1x PBS. הוסף 3 מ ל של מאגר הליזה (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM הנאקל, ו 1% X-100 אבקת כביסה [לראות את הטבלה של חומרים]), מטופלים עם קוקטייל פרוטאז מעכבי, על כל אחד לוחות 100 mM.
  3. השתמש במגרד תא כדי לשבש את שכבת התא. להטות את הצלחת ולגרד בעדינות ולאסוף את התאים לתוך הבריכה. לאסוף את התא ליפוסט באמצעות מיקרופיפטה 1,000 μL ולערבב את התאים lysates מכל אחד 3 100 מ"מ לוחות בצינור המסומן 15 מ"ל.
  4. דגירה של התא ליפוסט על הקרח עבור 15 דקות, vortexing כל 5 דקות. צנטריפוגה את התא למטה ב 15,000 x g עבור 5 דקות.
  5. לאסוף את החלבון supernatant מבלי לשבש את הגלולה פסולת התא ולהעביר אותו לצינור אחר 15 מ ל סטרילי. השיגו את ריכוז החלבון הנגיפי בשיטת ברדפורד (ראו סעיף 4).
  6. שמור מדגם הקלט (20 μg) עבור ניתוח של כתמי חיסוני מערבית. הוסף מאגר לדוגמה של 2x (20% גליצרול, 0.02% ברומאופנול כחול, 125 mM טריס-Cl [pH 6.8], 5% SDS, ו-10% 2-mercaptoethanol) לנפח הסופי. מרתיחים את זה ב 95 ° c עבור 10 דקות, ולאחסן את דגימת הקלט ב-20 ° c.

4. שיטת ברדפורד

הערה: הכינו אלבומין באורך 10 x סרום (BSA) ממלאי 100x BSA לפני יצירת עקומות סטנדרטיות של חלבון.

  1. מחלקים מים לצינורות מיקרוצנטריפוגה עבור ריק ותקנים הבאים: ריק = 800 μL; סטנדרטי 1 = 2 מ"ג/mL, 798 μL; תקן 2 = mg/mL, 796 μL; סטנדרטי 3 = 6 מ"ג/mL, 794 μL; Standard 4 = 8 מ"ג/mL, 792 μL; סטנדרטי 5 = 10 מ"ג/mL, 790 μL. Aliquot 10x BSA לתוך התקנים המיועדים הבאים: תקן 1 = 2 μL; תקן 2 = 4 μL; רגיל 3 = 6 μL; סטנדרטי 4 = 8 μL; סטנדרטי 5 = 10 μL.
  2. הכינו תערובת של דגימות חלבון על ידי ערבוב 795 μL של מים עם 5 μL של דגימות חלבון. הוסף 200 μL של שיטת החלבון מגיב צבע (לראות את הטבלה של חומרים) לכל ריק, תקן, וחלבון דגימת. וורטקס הדגימות לזמן קצר לתערובת ולדגירה בטמפרטורת החדר (18-20 ° c) עבור 5 דקות.
  3. העבר את דגימות הריקות, התקנים והחלבונים לכיוון כימיקלים. למדוד את ריכוזי החלבון ב OD של 595 ננומטר.

5. Coimmunoprecipitation של Rev-NoLS-דגל 3

  1. לשטוף 25 μL של M2 מחרוזות ג'ל האהדה (לראות את הטבלה של חומרים) עם 500 μl של מאגר לפירוק, מטופלים עם קוקטייל פרוטאז מעכבי. לשטוף יותר חרוזים ג'ל אהדה עבור כל דגימת מוטציה ופקדים.
    הערה: הכינו מספיק מחרוזות ג'ל האהדה של M2 לשני ג'לים (50 μL)-אחד עבור ניתוח חיסוני מערבי והשני לצביעת חלבונים וספקטרומטר מסה.
  2. ספין ב 820 x g עבור 2 דקות ב 4 ° c. . הסר את הסופרנטאנט . שטפו עוד 2x
  3. הוסף חלבון נגיפי ליפוסט (1 מ"ג/mL ב 5 מ ל של נפח כולל) לחרוזי האהדה M2 מראש מראש. כוונן את אמצעי האחסון הכולל באמצעות מאגר הליזה.
  4. מודב את התגובה 3 שעות, מסתובבת 4 ° c. צנטריפוגה את חרוזי האהדה M2/חלבון נגיפי ליפוסט ב 820 x g עבור 1 דקות.
  5. לאסוף את supernatant ולשמור את התמונה של מדגם post-IP (20 μg) עבור ניתוח חיסוני מערבי. למדוד את ריכוז החלבון של ליפוסט IP לאחר. לאסוף 20 μg עבור החיסונית המערבית.
  6. הוסף מאגר לדוגמה של 2x לאמצעי האחסון הסופי. מרתיחים את זה ב 95 ° c עבור 10 דקות, ולאחסן את המדגם post-IP ב-20 ° c.
  7. לשטוף את חרוזי M2 עם 750 μL של מאגר הליזה ולשטוף את החרוזים על מסובבי ב 4 ° צ' עבור 5 דקות. צנטריפוגה את חרוזי M2 ב 820 x g ולהיפטר supernatant.
  8. חזור על שלבים 5.7 לשתי שטיפות נוספות על מסובבי ב -4 ° c עבור 5 דקות. לאחר השטיפה השלישית, להסיר את כל העקבות של מאגר לליזה מתוך חרוזי M2 חרוזים/co-IP באמצעות טיפ ארוך טעינת ג'ל.
    הערה: צבוט את הקצה של קצה הטעינה של ג'ל עם פינצטה שטוחה לפני הסרת כמויות המעקב של מאגר הליזה. זה ימנע את ההפרעה ואת ספיגת החרוזים M2.
  9. השהה מחדש את חרוזי M2 ב-55 μL של מאגר טעינת 2x. מרתיחים את המדגם ב 95 ° c עבור 10 דקות.
  10. טען 25 μL של משחרלי לשני SDS נפרדים-דף ג'לים (ג'ל אחד עבור מערכות חיסונית מערביות והשני עבור כתמים Coomassie אחרים).

6. הכנת כלים לעמודים

  1. Cast 2 15% SDS-אקרילאמיד לפתור ג'לים על ידי ערבוב של ריאגנטים הבאים בצינור 50 mL (בנפח הסופי של 40 mL, מספיק עבור ארבעה ג'לים): 4.16 mL של מים אולטרה-ממדי, 15 מ"ל של 40% אקרילאמיד: ביאקרילאמיד (29:1), 10 מ ל של 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8) , 400 μL של 10% SDS, 400 μL של 10% אמוניום פרסולפט, ו 40 μL של TEMED.
  2. מערבבים את ג'ל הפענוח על ידי היפוך הצינור 50 mL מספר פעמים. פיפטה את התערובת ג'ל לתוך מנגנון ג'ל מערבי לניקוי מראש (ארבעה ג'לים-שלושה עבור המערכת החיסונית המערבית ואחד עבור Coomassie כסף כתמים).
  3. בעדינות מספיק מים כדי לכסות את השכבה העליונה של תערובת ג'ל. . הניחו לג'ל הפענוח לפולימו
  4. יוצקים את שכבת המים מן ג'ל הפתרון, באמצעות מגב משימה עדין (ראה את הטבלה של חומרים) כדי לספוג את כל המים העודפים.
  5. שחקנים 5% sds-אקרילאמיד הערמה ג ' לים על ידי ערבוב של ריאגנטים הבאים בצינור 50 mL (בנפח הסופי של 20 מ"ל, מספיק עבור ארבעה ג'לים): 11.88 מ ל של מים אלקטרופורזה, 2.5 ml של 40% אקרילאמיד: bisacrylamide (29:1), 5.2 ml של 1.5 M טריס-HCl (pH 8.8) , 200 μL של 10% SDS, 200 μL של 10% אמוניום פרסולפט, ו 20 μL של TEMED.
  6. מערבבים את ג'ל הערימה על ידי היפוך צינור 50 mL מספר פעמים. פיפטה את התערובת ג'ל מעל ג'ל הפתרון לחלק העליון של המנגנון.
  7. מניחים מסרק לקלטת ג'ל המכיל את מספר הנתיבים המתאים לתוך ג'ל הערימה. לספוג כל גלישה של התערובת ג'ל באמצעות מגב משימה עדינה (לראות את הטבלה של חומרים). הניחו לג לעבור באופן מוחלט.
  8. המבול מכשיר ג'ל המערבי עם מאגר הפעלה 1x המערבי (ריכוז 5x: 250 mM טריס-Cl [pH 8.3], 1.92 M גליצין, 0.5% SDS, ו 10 מ"מ EDTA).
  9. משוך בעדינות את מסרק הקלטת ג'ל מהג'ל לערימה. אפשר למאגר ההפעלה המערבי של 1x למלא את בארות הטעינה. ריקון כל הטוב עם מאגר מערבי 1 x פועל באמצעות מזרק לפני טעינת דגימות.
  10. העמיסו את הדגימות של כתמי הנוגדנים המערבית לכל ג'ל תואם (דגימות קלט, דגימות coimmunoprecipitated ודגימות פוסט-IP). לטעון את סמני חלבון מערבי ג'ל.
  11. העמיסו את דגימות coimmunoprecipitated עבור Coomassie כסף מכתים לתוך ג'ל אחר. לטעון את סמני חלבון מערבי ג'ל.
  12. לחבר את המכשיר ג'ל פועל למקור כוח ולהפעיל את ג'לים ב 100 V עד צבע הטעינה מגיע ג'ל הפתרון. הגדילו את המתח ל-140 V עד שצבע הטעינה יגיע לתחתית הג הפתור.

7. העברת כתמי מערבית

  1. פרק את מכשיר הג המערבי. חותכים וזורקים את ג'ל הערימה, ומשאירים את ג'ל הפענוח ללא פגע.
  2. בעדינות להעביר את ג'ל הפתרון למגש נקי מלא מאגר העברה מערבית (25 מ"מ Tris, 194 mM גליצין, 0.005% SDS, 20% מתנול) ולהשרות אותם במשך 15 דקות.
  3. להרכיב את מנגנון העברת ג'ל כדלקמן.
    1. חותכים שלושה ממברנות PVDF העברה ושש פיסות נייר מסנן (לראות את הטבלה של חומרים) על גודל ג'ל הפתרון.
    2. משרים את קרום PVDF במתנול במשך 5 דקות. מימה אותו במים עבור 5 דקות. מניחים את קרום PVDF במאגר ההעברה המערבי עד שהוא מוכן לשימוש.
    3. מניחים את מחזיק הג במגש אפייה מזכוכית ממולא באופן חלקי עם מאגר העברה מערבי, עם הצד השחור בתחתית.
    4. מניחים משטח קצף ספוג עם מאגר העברה מערבית כנגד הצד השחור של הקלטת בעל הג.
    5. להרטיב פיסת נייר סינון במאגר העברה מערבית ולמקם אותו על גבי משטח קצף. הצב את הג'ל הפתור על גבי נייר הסינון.
      הערה: מניחים את ג'ל הפענוח בכיוון הטעינה הנכון שיש להעביר לקרום PVDF.
    6. מניחים קרום העברה PVDF אחד על גבי ג'ל הפתרון. להרטיב פיסת נייר סינון עם מאגר העברה מערבית ולמקם אותו מעל קרום PVDF העברה.
    7. הצב משטח קצף נוסף שנספג עם מאגר העברה מערבי על גבי נייר הסינון. קפל בזהירות את הצד הלבן של הקלטת מחזיק ג'ל על גבי משטח קצף ספוג. נעל את הקלטת בחוזקה.
    8. מניחים את מחזיק הג לתוך ההרכבה אלקטרודה מנגנון העברה. חזור על שלבים 7.3.4-7.3.8 עבור כל ג'ל שנותר לפתרון.
    9. מלא את מיכל ההעברה באמצעות מאגר העברות מערבי. מניחים מוט מעורר. לתוך מיכל המנגנון
    10. מניחים את מיכל המנגנון על גבי צלחת מהומה. כוונן את הגדרת המהומה ל-5-6, וודא שמוט המהומה אינו תקוע או פוגע בקלטות מחזיק הג'ל.
    11. לחבר את מנגנון העברת ג'ל למקור כוח ולהעביר את הג ב 100 V עבור 1 h ב 4 ° c.

8. בלוק חיסוני

  1. הסר את הקלטת מחזיק ג'ל ומניחים את הצד השחור למטה נגד מגש האפייה זכוכית נקייה. פתח את הקלטת ובזהירות מחק את משטח הקצף ונייר הסינון. סמן פינה של קרום PVDF כדי לזהות את כיוון הטעינה הנכון. . שמור על הקרום רטוב
    הערה: קרום PVDF יכול להיות מיובש באוויר ומאוחסן במיכל נקי ואטום. מימה את הקרום מחדש על ידי שלבים חוזרים 7.3.2.
  2. מניחים את הקרום ב 100 mL של פתרון חסימה (5% חלב, 1x TBS, ו 0.1% רצף 20). לחסום את הקרום על ידי הנדנדה עדין בטמפרטורת החדר (18-20 ° c) עבור 1 h.
  3. חותכים על פני הקרום מעל 25 הסמן של חלבון kDa. מניחים את החלק העליון של קרום, המכיל להקות חלבון גדול יותר 25 kDa, בפתרון חסימה המכילה B23 העכבר מונשבטים IgG1 (1:500 דילול). בלוק הלילה, מתנדנד ב -4 ° c.
  4. מניחים את החלק התחתון של קרום, המכיל להקות חלבון קטן יותר 25 kDa, בפתרון חסימת המכיל M2 העכבר מונובטיים IgG1 (1:1000 דילול, לראות את הטבלה של חומרים). בלוק הלילה, מתנדנד ב -4 ° c.
  5. לשטוף את הממברנה 3x עבור 10 דקות ב 25 מ ל של הפתרון לשטוף המערבי (1x TBS, 0.1% הרצף 20) על פלטפורמת נדנדה.
  6. מודלת את הקרומים של עז אנטי עכבר IgG1-hrp (1:5000 דילול) מדולל בפתרון חסימת עבור 1 h בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה 3x עבור 10 דקות ב 25 מ ל של פתרון שטיפת המערבי על פלטפורמת נדנדה.
  7. הכינו את המצע המערבי. השתמש p1000 מיקרופיפטה כדי להוסיף את המצע לקרום.
  8. לפתח כל ממברנה בתוך כימונסנציה המצע המערבי עבור 5 דקות. הסר את קרום מהמצע. לקלוט מצע עודף באמצעות מגב משימה עדינה ( עיין בטבלת החומרים).
  9. מניחים את הקרום לתוך מגן סדין נקי מודבק לתוך קלטת. קחו את הקלטת לחדר חשוך והציבו דף אחד של סרט בתוך הקלטת. נעל את הקלטת במקום ואת הדגירה עבור 5 – 15 דקות. הסר את הסרט מתוך הקלטת ופתח אותו.

9. כתמים coomassie

  1. פרק את מכשיר הג המערבי. חותכים וזורקים את ג'ל הערימה, ומשאירים את ג'ל הפענוח ללא פגע. העבר בעדינות את ג'ל הפתרון למגש נקי המלא ב -25 מ ל של מים באולטרטהורים.
  2. מודקון את הג על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. השתמש בנדנוד עדין כדי למנוע את ג'ל הפתרון משבירה. להשליך את המים באולטרסאונד ולחזור על שטיפת השלב 2x יותר.
    הערה: אם בועות SDS נשארות לאחר שלבי הכביסה, ניתן לשטוף את הג במים באולטרסאונד ללילה. שרידי SDS יכולים לגרום כתמים ברקע גבוה של ג'ל.
  3. מערבבים את הכתם של Coomassie גיב על ידי היפוך הבקבוק (לראות את הטבלה של חומרים). מקום 100 mL של Coomassie הכתם מגיב כדי לכסות את הג בפתרון ומודאת ג'ל על פלטפורמת נדנדה עבור 1 h. להיפטר הכתם Coomassie לשטוף את הג במים מאוהים על פלטפורמת נדנדה עבור 15 דקות.
  4. . להיפטר מהמים האלה חזור על השלב השוטף 2x יותר. המשך לשטוף את הג עד שהרזולוציה הרצויה של להקות החלבונים נצפתה.

10. מכתים כסף

  1. פרק את מכשיר הג המערבי. חותכים וזורקים את ג'ל הערימה, ומשאירים את ג'ל הפענוח ללא פגע. העבר בעדינות את ג'ל הפתרון למגש נקי המלא ב -25 מ ל של מים באולטרטהורים.
  2. מודקון את הג על פלטפורמת נדנדה במשך 15 דקות. השתמש בנדנוד עדין כדי למנוע את ג'ל הפתרון משבירה. להשליך את המים באולטרסאונד ולחזור על שטיפת השלב 2x יותר.
    הערה: אם בועות SDS נשארות לאחר שלבי הכביסה, ניתן לשטוף את הג במים באולטרסאונד ללילה. שרידי SDS יכולים לגרום כתמים ברקע גבוה של ג'ל.
  3. תקן את ג'ל ב 30% אתנול: 10% חומצה אצטית תמיסה (6:3:1 מים: אתנול: חומצה אצטית) לילה בטמפרטורת החדר. לשטוף את ג'ל בתמיסה 10% אתנול עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להחליף את הפתרון אתנול ולשטוף עוד 5 דקות.
  4. להכין פתרון לעבודה ברגישות מערכת כסף פירס כתם על ידי ערבוב של חלק אחד בצבע כסף רגישות עם 500 חלקים באלקטרופורזה מים (50 μl של רגישות עם 25 מ ל של מים אלקטרופורזה). מודאת ג'ל הפתרון בפתרון הרגישות לעבודה במשך 1 דקות. שטוף את הג במים באולטרסאונד במשך 1 דקות, החליפו את המים ושטוף את הג שוב במשך 1 דקות.
  5. הכנת פתרון עבודה כתם על ידי ערבוב משפר אחד של הצבע כסף עם כתמים 50 חלקים כסף (500 μL של משפר עם 25 מ ל של כתם כסף). הג הג בפתרון העבודה כתם במשך 30 דקות.
  6. הכנת פתרון עבודה מפתח על ידי ערבוב 1 חלק כסף משפר עם 50 חלקים כסף מפתח כתמים (500 μL של משפר עם 25 מ ל של מפתח). הכינו 5% חומצה אצטית תמיסה כפתרון עצור. רוחצים את הג במים באולטרה-טהורים למשך 1 דקות, מחליפים את המים ורוחצים את הג בתוספת של 1 דקות.
  7. החלף את המים עם פתרון העבודה המפתחים והדגירה עד העוצמה הרצויה של פס החלבון נפתרה (5 דקות). החלף את פתרון העבודה מפתח עם פתרון להפסיק את הדגירה עבור 10 דקות.

11. הפחתת בג, האלקילציה והעיכול של קומוקאסי-להקות ג'ל מוכתמות

  1. חותכים את להקות ג'ל מהג באמצעות להב גילוח נקי. חותכים כל להקה ג'ל לתוך כ 5 מ"מ קוביות ומניחים אותם בצינור המיקרו-מיקרוצנטריפוגה נקי 0.5 mL.
  2. להכתים את חתיכות ג'ל על ידי כיסוי אותם עם 100 mM אמוניום ביקרבונט ב 1:1 acetonitrile: מים בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.. להיפטר מהסופרנטאנט חזור על שלב זה.
  3. יבש את חתיכות ג'ל עבור 5 דקות בצנטריפוגה ואקום. להפחית את החלבונים על ידי כיסוי חתיכות ג'ל מיובש עם 10 מ"מ dithio, 100 מילימטר אמוניום ביקרבונט ו הדגירה אותם 1 h ב 56 ° c.
  4. . בסדר. אלאלקין החלבונים על ידי כיסוי חתיכות ג'ל עם 100 mM iodoacetamide במים, מבסת אותם עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
  5. ולכווץ את חתיכות הג על-ידי כיסוי אותם עם מכסה ומטלטל אותם בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הפיפטה מחוץ לסופרנטנט ומחברת את חתיכות ג'ל על-ידי כיסוי אותם עם 100 מילימטר אמוניום ביקרבונט ולטלטל אותם בעדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  6. חזור על שלב 11.5. יבש את חתיכות ג'ל עבור 5 דקות בצנטריפוגה ואקום.
  7. לכסות את חתיכות ג'ל עם 50 ng/μL שונה רצפי כיתה טריפסין (לראות את הטבלה של חומרים) ב 100 mM אמוניום ביקרבונט. אפשר לג להתנפח למשך 5 דקות; לאחר מכן, הפימתי את כל הפתרונות שנותרו. לכסות את חתיכות ג'ל עם 100 mM אמוניום ביקרבונט ולאפשר להם reswell לחלוטין, הוספת נוספים 100 mM אמוניום ביקרבונט כך את חתיכות ג'ל מכוסים לחלוטין.
  8. מודחה את חתיכות הג לילה ב 37 ° c. להפסיק את התגובה על ידי הוספת 1/10 של נפח של 10% חומצה פורמית במים. לאסוף את הסופרנטנט מכל צינור.
  9. לחלץ את חתיכות ג'ל על ידי כיסוי אותם עם 1% החומצה פורמית ב 60% acetonitrile ו דגירה אותם עבור 15 דקות עם טלטול עדין.
  10. הפחת את הנפח של הסופרנטטים המשולבים לפחות מ -20 μL בצנטריפוגה ואקום, תוך כדי טיפול במניעת ייבוש הסופרנטנים לחלוטין. להוסיף 1% החומצה פורמית כדי להביא את הנפח הכולל בחזרה 20 μl.

12. כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטר מסה

הערה: הדגימות נותחו באמצעות ספקטרומטר מסה המצויד במיוחד באמצעות הדיקות מסוימות, מקור ננו-ספריי וטור (ראה את טבלת החומרים). ממיסים A ו-B הם 0.1% חומצה פורמית במים ו acetonitrile, בהתאמה.

  1. לטעון את החלבונים מתעכל לתוך התאוששות גבוהה פוליפרופילן אוטומטית בבקבוקונים. העמיסו את הבקבוקונים לתוך מנהל המדגם של מערכת ה-, המערכת.
  2. הכנס 6 μL של כל דוגמה. טען כל מדגם אל עמודת ההשמנה של הננו-אריח עבור 1.5 דקות ב-8 μL/min, באמצעות 99% מממס A/1% מממס B.
  3. Elute הפפטידים לתוך ספקטרומטר מסה עם מעבר ליניארי מ 3% כדי 35% מממס B מעל 30 דקות, ואחריו הדרגתי מ 35% כדי 50% מממס B מעל 4 דקות ו 50% כדי 90% של מומס B מעל 1 דקות. לשמור על 90% acetonitrile עבור 3 דקות; לאחר מכן הפחת את ה-% B בחזרה ל-3% יותר מ-5 דקות.
  4. לרכוש חיובי פרופיל יון המסה נתונים מפרט ברזולוציה (20,000 רזולוציה) מצב. לרכוש נתונים מ 100 כדי 2,000 Da בקצב של סריקה אחת כל 0.6 s. לרכוש נתונים במצב MSE על ידי סריקות מתחלפים ללא אנרגיה התנגשות סריקות עם אנרגיה התנגשות מוגבר.
  5. עבור אנרגיה התנגשות מוגבה, כבש את האנרגיה התנגשות בתא מלכודת מ 15 V כדי 40 V. לרכוש מנעול המסה לסרוק כל 30 s, באמצעות + 2 יון של [לגלו1]-fibrinopeptide B כמסת המנעול. לרכוש קובץ נתונים באמצעות הזרקה ריקה של ממיס A, תוך שימוש באותה שיטת רכישה בין כל זוג דגימות כדי לשלוט על הנושא.

13. ניתוח נתונים לספקטרומטר מסה

  1. העתק את הקבצים המפרומטריה של תוצאות הספקטרומטר למחשב שבו פועלת פלטפורמת מחקר כמותית ואיכותית (g., פרוטטינוקס Global Server). ניתוח נתונים הוא מאוד עתיר מעבדים ויש לבצעו על מחשב נפרד בעל ביצועים גבוהים לניתוח נתונים.
  2. צור פרוייקט חדש עבור הנתונים. צור צלחת מיקרוטיטר חדשה המייצגת את הלוח האוטומטי. הקצה את הדגימות לאותו מיקום בצלחת המיקרוטיפטר כמיקום שלהם בדוגם האוטומטי.
  3. הקצה לכל אחד מפרמטרי העיבוד לדוגמה. פרמטרים לשימוש הם בעלי רוחב כרומטוגרפי אוטומטי ו-מע של רזולוציה; סף אנרגיה נמוכה, 100 ספירות; סף אנרגיה מוגבה, 5 ספירות; מסף האינטנסיביות, 500 ספירות.
  4. הקצה כל אחד מהפרמטרים של זרימת העבודה לדוגמה. פרמטרים לשימוש הם מסד נתונים, המשורשרים סוויספלרוט ו-HIV, עם רצפים הפוכים; פפטיד אוטומטי ומקטע סובלנות; יון קטעים מיני מתאים לכל פפטיד, 3; יון קטעים מיני מתאים לכל חלבון, 7; התאמות פפטיד מינימום לכל חלבון, 1; מגיב לתקציר הראשוני, טריפסין; החמיץ בקליבנים, 1; קבוע משנה ריאגנטים, carbamidomethyl C; המשתנה משתנה ריאגנטים, חמצון M; . שיעור גילוי שווא, 100
  5. בחרו בדוגמאות ובחרו ' תהליך נתונים גולמיים אחרונים'. לאחר השלמת החיפוש, בחרו בדוגמאות ובחרו ' ייצוא נתונים לגרדום ' (גרסה 3). לפתוח את הגרדום, ליצור קובץ חדש, ולייבא כל קובץ המיוצא מפלטפורמת פרוטאומניקס כמו biosample ספיק חדש באמצעות כימות יון מקודמן.
  6. כאשר כל הקבצים יובאו, המשך למסך הטעינה ולניתוח נתונים . בחר באותו מסד נתונים המשמש לחיפוש ולייבוא של נתונים באמצעות הניקוד LFDR וקיבוץ החלבונים הסטנדרטיים של הניסוי. הגדר אפשרויות תצוגה להסתברות לזיהוי חלבון, סף החלבון ל-20%, המספר המינימלי של פפטידים ל-1, ואת סף הפפטיד ל -0% במהלך הניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rev-nols יחיד ומספר נקודות מוטציות ארגינין, המתאים למגוון דפוסי לוקליזציה subcellular, נבדקו ביכולתם לתקשר עם גורמים מארחים סלולריים לעומת wt rev. wt rev-3דגל pcdna-דגל וקטור הביעו ביטוי בתרבות HLfB. מכלולי חלבון עובדו מפני התאים האולטימטיביים ומוכתמים בצבע כסף מגיב. Rev-NoLS-3דגל הוא לזיהוי (כ 18 kDa) בשלושה תנאים שונים לפירוק מאגר המכיל ריכוזים שונים של היום (137 מ"מ, 200 mM, ו 300 מ"מ) באיור 1. B23 היה ניתן לגילוי (37 kDa) במאגר לפירוק המכיל ריכוז מלח נמוך (137 מ"מ, נתיבים 2 – 4), בקושי ניתן לזיהוי במאגר לפירוק המכיל 200 mM הנאל, ו בלתי ניתן לגילוי במאגר הליזה המכיל ריכוז מלח גבוה (300 מ"מ. באיור 2, WT rev-3' דגל, Rev-Nols M1-3 ' דגל, ו pcdna-דגל וקטור היו ביטא בתרבות hlfb. מכלולי חלבון עובדו מפני לייטים של תאים מוחלטים בשני מצבים של מאגר ליליזה (137 מ"מ ו-200 מ"מ נאל). מונושבטים של עכבר M2 השתמש בזיהוי של ביטוי הדגל של Rev-3 מתא lysates. זיהוי B23 היה אופטימלי במאגר לפירוק המכיל 137 mM הנאל עם WT Rev-3' דגל (קלט ו α-דגל-Rev IP) אך איבד אהדה עם Rev-NoLS M1-3 ' דגל. B23 הזיקה של WT Rev-3flag ירד עם ריכוז מלח גבוה יותר במאגר הליזה המכיל 200 מ"מ הנאל. pCdna שליטה שלילית לא להניב זיהוי חיסוני לא ספציפי קלט ו-α-דגל-Rev IP של כל התנאים מאגר לפירוק.

תנאי הימנעות היו ממוטבים עבור Rev-NoLS-3דגל IP באיור 3. WT Rev-3' דגל ו pCdna-דגל וקטור היו ביטא בתרבות hlfb. מכלולי חלבון עובדו מפני lysates תא מוחלט, שימוש בשלושה תנאים שונים כדי למגר את האור ואת הרקע שרשרת כבד (25 ו 50 kDa)-2x מדגם טעינת מאגר ב 37 ° צ' עבור 15 דקות, 2x הטעינה לדוגמה מאגר ב 95 ° צ' עבור 3 דקות, ו-3x הדגל peptid e ב 4 ° c עבור 30 דקות. Rev NoLS-הדגל 3 (~ 18 kDa) היה לזיהוי ביותר לאחר הימנעות דרך רתיחה ב 2x מאגר טעינת לדוגמה. B23 (~ 37 kDa) היה לזיהוי תחת שני תנאים-37 הדגירה של ° c ב 2x לדוגמה מאגר טעינת עבור 15 דקות ו-95 הדגירה של ° c ב 2x מאגר טעינת לדוגמה עבור 3 דקות.

M2 (גרעיני/נוקלאואוליאר בלוקליזציה, לא פונקציונלי ב-HIV-1HXB2 הייצור), M6 (נוקלאוולאר בתבנית, פונקציונלי ב-hiv-1HXB2 הייצור), ו M9 (התפזרו ציטופלסמה/גרעין, לא פונקציונלי הייצור הנגיפי) היו תבטאת בתרבות HLfB. מכלולי חלבון עובדו מפני ליפוסט התאים הכולל, חומקת עד 95 ° c הדגירה ב 2x הטעינה לדוגמה מאגר עבור 3 דקות, ונפתר כסף מגיב כתמים (איור 4). WT הפוך לזיהוי לאחר תגובת דגל IP. Rev-NoLS M2, M6, ו M9 היו גם לזיהוי ב 18 kDa. להקות המתאימות B23 חלבון נצפו בסמן kDa 37. מתחמי חלבון נצפו עוד יותר בכל נתיב התואם תגובות IP של WT Rev, M2, M6, M9, ו pCdna בקרת רקע שלילי. ליסיטים חלבונים נותחו על ידי זיהוי חיסוני עבור α-דגל-Rev ו B23. שופע WT Rev ורמות מתונה של M6 היו ביטא (α-דגל קלט) לזיהוי לאחר הדגל IP (α-דגל-Rev IP, איור 5). M2 ו M9 לא היו ביטוי מאוד מ 20 μg של קלט ליפוסט חלבון אבל לזיהוי בעוצמה נמוכה לאחר דגל IP מ 5 מ ג של חלבון ליפוסט. pCdna שליטה שלילית לא להניב זיהוי חיסוני ספציפי קלט ו-α-דגל-Rev IP. B23 זיקה עם WT Rev נצפתה לאחר תגובת דגל ה-IP (B23 co-IP). B23 אהדה היה מעט נצפתה עם M2 (שתי מוטציות חד הנקודה R48, 50G) ו M6 (מוטציה חד נקודה אחת R50G). B23 האהדה אבדה בנוכחות שלוש מוטציות של נקודה אחת של M9 (R46, 48, 50G) בתוך Rev-NoLS.

סה כ lysates מ immunoprecipitated WT Rev ו-Rev-NoLS-מוטציות דגל 3 (4, 5, 6, ו 8) עובדו, והוכתם עם מגיב Coomassie ו דמיינו בהשוואה ל-BSA מדלל סדרתי (הלוח הימני). Rev-NoLS-3דגל הוא לזיהוי (12.5-25 μg) בנוכחות והעדר של מוטציות ב 18 kDa (איור 6). מתחמי חלבון מעובד מתגובות IP של WT Rev-3flag, נוקלאוולאר-לוקליזציה Rev-NoLS-3מוטציות דגל (M4, M5, ו M6), ו שלילי pCdna-דגל היו דמיינו sds-דף ג'ל מוכתם עם מגיב Coomassieאיור 7. WT הפוך (WT1 ו WT2) היה לזיהוי לאחר תגובת דגל ה-IP ב 18 kDa. מוטציות Rev-NoLS היו לגילוי מעט לאחר הביטוי HLfB ו-IP תגובת הדגל. pCdna שליטה שלילית לא התשואה רקע ספציפי ב 18 kda.

Immunoprecipitated lysates הכין מ WT Rev-3' דגל, M2, M6, M9, ושליטה שלילית pCdna-דגל (המוצג באיור 4) נותחו על ידי ספקטרומטריה המסה טנדם. הסתברות זיהוי חלבון (באחוזים) מוצג להשוואת אינטראקציות חלבונים המתרחשים עם כל נוקלאוולאר-לוקליזציה Rev-NoLS מוטציה נגד WT Rev (שולחן 1). חלבונים סלולריים, שחלקם נוקלאוולאר בתבנית לוקליזציה (ריבוזומביים, התרגום של איקריוטיק מקדם 48, שנחקה C/D box 58 b, ו nucleophosmin B23), זוהו כשותפים מחייב ישיר/עקיף של WT Rev. אלה נוקלאואואר גורמים איבד הזיקה מחייב M2 (שתי מוטציות חד הנקודה R48, 50G), M6 (נקודה אחת מוטציה R50G), ו M9 (שלוש נקודה אחת מוטציה R46, 48, 50G), דומה pCdna שלילי בקרה. כל נתיב של ה-Coomassie ג'ל ויטראז ' באיור 6 היה מעובד עבור ספקטרומטריה המסה טנדם (שולחן 2). זיקה פפטיד למוטציות Rev-NoLS נותחו והוצגו באמצעות הסתברות זיהוי חלבון (באחוזים). מגוון של חלבונים סלולריים, שחלקם נוקלאוולאר בתבנית לוקליזציה (נוקלאואולין C23, nucleophosmin B23, ו נוקלאוטיקצת חלבון ההרכבה), זוהו כגורמי כריכת חלבון ישירה/עקיף של WT Rev. גורמים אלה לא היו זוהה כדי לאגד עם M4, M5 ו-M6. גורמי תחבורה ARHGEF1 (rho גואנין נוקלאוטיד פקטור 1) ו TBC1D24 (TCB1 משפחה, חבר 24) אבדו אהדה בנוכחות של מוטציות Rev-nols. החדרת גורמים hnRNPC (חלבון הטרוגנית ribonuclear C) ו-PNN (pinin, desmosome הקשורים חלבון) נצפו בנוסף כדי לאגד WT Rev, אשר איבד אינטראקציה עם הrev חד נקודה אחת מוטציות נוקלאואואר.

Figure 1
איור 1 : אופטימיזציה של תנאים לפירוק תאים עבור Rev-3' דגל co-IP במהלך הפקה HIV-1. WT Rev-NoLS-3' דגל שלילי pCdna-דגל תנאי IP היו ממוטבים בשלושה ריכוזי הנאגל שונים (137 מ"מ, 200 mm, ו 300 מ"מ) במאגר לפירוק. כפי שנצפתה באמצעות כתמים מכסף, 137 מ"מ היתה ריכוז המלח האופטימלי עבור Rev immunoprecipitation ו B23 binding. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : אופטימיזציה של תנאי הפירוק עבור Rev-3' דגל co-IP וזיהוי חיסוני B23 במהלך הייצור HIV-1. WT Rev-NoLS-הדגל של 3a, M1-3 ' דגל, ו שלילי pCdna-דגל תנאי IP היו ממוטבים בשני ריכוזים שונים של כינוס (137 מ"מ ו 200 mm) במאגר לליזה. כפי שנצפה באמצעות זיהוי חיסוני, 137 mM היתה ריכוז המלח האופטימלי עבור Rev immunoprecipitation ו B23 binding. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : אופטימיזציה של הדגל Rev-3' שיתוף IP להתחמק במהלך הייצור HIV-1, דמיינו על ידי כתמים כסף. מכלולי חלבון עובדו מפני lysates תא הכין במהלך WT Rev-3' דגל pCdna-דגל IP. שלושה תנאי הימנעות שונים נבדקו-2x מאגר טעינת לדוגמה ב 37 ° c עבור 15 דקות, 2x מאגר טעינת לדוגמה ב 95 ° צ' עבור 3 דקות, ו 3x פפטיד הדגל ב 4 ° c עבור 30 דקות. התנאים המיטביים האופטימלי של WT Rev התרחש לאחר 15 דקות דגירה התקופה ב 2x הטעינה לדוגמה מאגר ב 37 ° צ' ואחרי 3 דקות דגירה הזמן ב 2x הטעינה לדוגמה מאגר ב 95 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : Immunoprecipitation Of Rev-3' דגל מוטציות 2, 6, ו 9 במהלך הייצור HIV-1. מכלולי חלבון המאוגדים ישירות/בעקיפין עם WT Rev, M2 (R48, 50G), M6 (R50G), M9 (R46, 48, 50G), ושלילי pCdna-דגל בנוכחות של שכפול HIV-1 מוצגים מוכתם כסף sds-עמוד ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : Rev-3' דגל co-IP של מוטציות 2, 6, ו 9 עבור זיהוי חיסוני B23 במהלך הייצור HIV-1. Lysates חלבון ו-IP תגובות מוכנות WT Rev, M2, M6, M9, שלילי pcdna-דגל בדמות 4 נותחו נוספת על ידי זיהוי חיסוני עבור α-דגל-Rev ו B23. WT הפוך וביטוי מוטציה, כמו גם אינטראקציה עם חלבון B23 נוקלאוטופלסמטי, הם נצפו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : קוונפיקציה של מוטציות Rev-NoLS 4, 5, 6, ו 8 אחרי הדגל תגובת IP . תגובות ה-IP מ-HLfB ביטוי WT Rev ו נוקלאוולאר-לוקליזציה M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ΔRQ), ושלילי pCdna-דגל נמדדו עבור ריכוז חלבונים באמצעות מדלל סדרתי bsa. ריכוז חלבון של 12.5-25 μg נצפתה עבור כל דוגמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7 : Immunoprecipitation של נוקלאוולאר-לוקליזציה Rev-NoLS מוטציות 4, 5, ו 6 במהלך הייצור HIV-1. Coomassie מוכתם SDS-דף ג'ל המכיל מכלולי חלבון immunoprecipitated של WT Rev (1 ו-2), M4, M5, ו M6 מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

חלבונים מזוהים מולקולרית משקל WT הפוך M2 M6 M9
חלקיק האות 14kDa (הומולוגי Alu כריכת ה-RNA חלבון) 15 הורדה 95% 0 0 0
חלבון ריבוזומלי S3A 30 הורדה 95% 0 0 0
מארז התרגום הלאומי 69 kDa 95% 0 0 0
חלבון ריבוזומלי L31 14 קק ל 91% 0 0 0
חלבון ריבוזומלי L12 מיכל בן 18 93% 0 0 0
חלבון ריבוזומלי L22 15 הורדה 91% 0 0 0
בתיבת הדו הקטנה של ה-RNA, C/D, 58 b 15 הורדה 87% 0 0 0
אצבע אבץ, מתחם CCHC המכיל 11 185 kDa 87% 0 0 0
מאגד מחייב החלבון של LIM 1 79 kDa 79% 0 0 0
חלבון ריבוזומלי S13 בת שבע עשרה 78% 0 0 0
נואופהוסמרין (נוקלאוולאר פוספופפרוטאין B23, נומטרין) 33 kDa 73% 0 0 0

טבלה 1: זיהוי של גורמים מארחים סלולריים אינטראקציה עם WT Rev במהלך הייצור HIV-1. החלבון חומק ממנה הכין מ WT Rev, M2, M6, ו M9 נותחו ישירות על ידי ספקטרומטריה המסה טנדם. אינטראקציות חלבונים הקשורות ישירות/עקיפה ל-WT Rev לעומת M2, M6 ו-M9 מסוכמים באמצעות הסתברות זיהוי חלבון (באחוזים).

חלבונים מזוהים מולקולרית משקל M4 M5 M6 WT pCDNA
חלבון מחייב פולי, cytoplasmic 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
הלם חום 70 מידי חלבון 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L7 בת 29 91% 0 100% 100% 0
היסטון אשכול 1, H1e מיכל בן 22 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L13 24 כפיר הורדה 99% 0 100% 100% 0
משלים את הרכיב 1, החלבון המחייב של רכיב משנה מיכל בן 31 100% 100% 100% 100% 0
חלבון מאגד בתיבת Y 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
נוקלאוכמה חלבון הרכבה 1-כמו 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
חלבון ריבוזומלי L8 מיכל בן 28 89% 36% 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L18 מיכל בן 22 27 0 100% 100% 0
בולמי חום 70 החלבון 8 71 kDa 5% 99% 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L19 כג בן-יהודה 10 0 81% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L27 בת 16 92% 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L7a 30 הורדה 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L24 מיכל בן 18 0 0 100% 99% 0
טובולין, מחלקת ביתא I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
בולמי חום 70kDa חלבון 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
חלבון הריבוזומלי S2 מיכל בן 31 87% 0 100% 100% 0
הקזאין קינאז 2, אלפא 1 פוליפפטיד 45 kDa 0 0 50% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L14 כג בן-יהודה 0 0 81% 100% 0
חלבון ריבוזומלי, גדול, P0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
היסטון אשכול 1, H1b כג בן-יהודה 0 0 73% 100% 0
החום 70 חלבון 70kDa 5 (חלבון מוסדר גלוקוז) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
ריבוזומיום חלבון S4, מחובר ל-X 30 הורדה 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S20 13 הורדה 98% 94% 99% 99% 0
חלבון ריבוזומלי L28 בת 16 0 0 100% 99% 0
חלבון ריבוזומלי S14 בת 16 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S3A 30 הורדה 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L21 19 קק ל 0 0 100% 100% 0
מסוג CCCH אצבע אבץ, אנטי ויראלי 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
היסטון אשכול 1, H1c בת 21 0 0 0 98% 0
חלבון ריבוזומלי L36 12 כפיר 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S18 מיכל בן 18 90% 0 100% 100% 0
מודולטור של אפופטוזיס 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
חלבון ריבוזומלי L17 בת 21 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S26 13 הורדה 91% 0 99% 98% 0
חלבון ריבוזומלי L32 מיכל בן 18 0 0 48% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L35 15 הורדה 0 0 97% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L29 מיכל בן 18 0 0 57% 94% 0
חלבון ריבוזומלי S9 כג בן-יהודה 0 0 100% 100% 0
הטרואואופלאופריפרוטאין H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S8 מיכל בן 22 0 0 78% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L10 25 קק ל 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L23a מיכל בן 18 0 0 68% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S6 בת 29 0 0 100% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L31 14 קק ל 0 0 95% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S13 בת שבע עשרה 0 0 100% 99% 0
חלבון ריבוזומלי L10a 25 קק ל 45% 0 81% 100% 0
חלבון מחייב פולי, cytoplasmic 4 (טופס inducible) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
חלבון טראנסממברנלי emp24 תחום התחבורה חלבון המכיל 1 25 קק ל 0 0 0 100% 0
חלבון מחייב EBNA1 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
שימור סליל-לולאה-סליל בכל מקום קינאז 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
חלבון ריבוזומלי L12 מיכל בן 18 0 0 57% 100% 0
חלבון ריבוזומלי S24 15 הורדה 0 0 100% 100% 0
חלבון מתחם בהלם קר A 40 kDa 0 0 0 100% 0
חלבון ריבוזומלי L27a בת שבע עשרה 0 0 89% 99% 0
מריונואופלפרוטאין גרעינית הטרוגנית 46 kDa 0 0 99% 99% 0
חלבון ריבוזומלי L11 20 הורדה 0 0 99% 100% 0
חלבון ריבוזומלי L26-כמו 1 בת שבע עשרה 0 0 100% 100% 0
קזאין קינאז 2, רב מרכזי אלפא 41 kDa 0 0 0 100% 0
טובולין, אלפא 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
חלבון ריבוזומלי L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
נוקלאוולין 77 kDa 0 0 25 100% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S21 כפיר הפרדה 0 0 93% 94% 0
KRR1, יחידת משנה קטנה (SSU) מעבד רכיב מסוים, הומולוג (שמרים) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S7 מיכל בן 28 0 0 0 100% 0
כלוריד ערוץ, נוקלאוטיד רגיש, 1A מיכל בן 22 0 0 97% 86% 0
ציקלוב B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
גואנין נוקלאוטיד מחייב חלבון-כמו 3 (נוקלאוקולאר) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S23 מיכל בן 22 0 0 100% 50% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S22 41 kDa 0 0 0 99% 0
נואופהוסמרין (נוקלאוולאר פוספופפרוטאין B23, נומטרין) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
חלבון ריבוזומלי S19 בת 16 0 0 0 99% 0
גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז 36 kDa 0 0 100% 0 0
היסטון אשכול 1, H2bg 14 קק ל 0 0 53% 72% 0
חלבון ריבוזומלי S23 בת 16 0 0 68% 0 0
רו גואנין מקדם החליפין (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
חלבון מוות משויך 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S6 14 קק ל 0 0 52% 84% 0
חלבון ריבוזומלי L39 6 היכל הפרדה 0 0 0 87% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S28 בת 21 0 0 85% 99% 0
היסטון אשכול 1, H4h כפיר הפרדה 0 0 0 93% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L43 כג בן-יהודה 0 0 0 97% 0
חלבון ריבוזומלי S15 בת שבע עשרה 0 0 0 85% 0
חלבון ריבוזומלי S12 15 הורדה 0 0 68% 39% 0
חלבון ריבוזומלי L35a 13 הורדה 0 0 0 96% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S14 15 הורדה 0 0 45% 76% 0
פוספולידיראז 5A, מיוחד cGMP 95 kDa 14 0 0 72% 0
חלבון ריבוזומלי L15 24 כפיר הורדה 0 0 0 56% 0
מבריאואופלפרוטאין גרעינית הטרוגנית C (C1/C2) מיכל בן 22 0 0 0 100% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S16 כפיר הפרדה 0 0 0 92% 0
חלבון ריבוזומלי S15a 15 הורדה 0 0 0 91% 0
מיכל השני 185 kDa 0 50% 0 0 0
הרגישות האוטיזם המועמד 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L17 20 הורדה 0 0 0 92% 0
החדרת גורם 3a, יחידת 1, 120kda 89 kDa 0 0 56% 89% 0
משפחת לה ריבונאופלפרוטאין, חברה 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
לקדם-בדומה 2 62 kDa 0 0 0 68% 0
חלבון ריבוזומלי L18a בת 21 0 0 0 86% 0
חלבון ריבוזומלי L23 15 הורדה 0 0 60% 47% 0
טרנסקרום emp24 מתחם הובלה חלבון המכיל 9 27 הורדה 0 0 0 78% 0
חלקיק זיהוי האות 72 Kda 75 kDa 0 0 0 100% 0
לקטין, גלטוסייד-מחייב, מסיסים, 3 בת 26 0 71% 28 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
משפחת H1, חבר X מיכל בן 22 0 0 0 96% 0
קזאין קינאז 2, ביתא פוליפפטיד 25 קק ל 0 0 0 89% 0
משפחה הנושאת מסיסות 4, נתרן ביקרבונט coטרנספורטר, חבר 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
שחזור התחום של WD 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
גורם התארכות שעתוק A (מכון התקנים), 3 בת שבע עשרה 0 0 0 38% 0
חלבון ריבוזומלי S16 בת 16 0 0 75% 0 0
SP140 חלבון גוף גרעיני 92 kDa 0 0 0 64% 0
מיכל ברלין 227 kDa 62% 0 0 0 0
הובלה בגולגי 1B 15 הורדה 0 0 0 33% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S34 בת 26 0 0 0 33% 0
חלבון ריבוזומלי L30 13 הורדה 0 0 0 49% 0
מאגד מחייב החלבון של LIM 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
גואנין נוקלאוטיד מחייב חלבון כמו 2 (נוקלאוקולאר) 84 kDa 40% 0 0 0 0
ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה חלבון מחייב 141 kDa 0 0 34% 0 0
אדנוזין deaminase,-RNA ספציפי, B2 81 kDa 0 0 28 0 0
cystatin E/M בת שבע עשרה 0 27 0 0 0
אצבע האבץ חלבון 786 80 kDa 0 0 23 0 0
משפחה ב', בעלת קבוצת מחשבים בתחום הומולוגיה, חבר 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
פוספוליאז חלבון מתיספטאז 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
יאנוס קינאז והחלבון המיקרוטוכדורית 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
חלקיק זיהוי אות 68 Kda 67 kDa 0 0 0 93% 0
משפחה TBC1, חבר 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L27 בת 16 0 0 0 89% 0
חלבון מיטוכונדריזומאלי פרוטאין L2 24 כפיר הורדה 0 0 0 88% 0
ריבוזומלי חלבון מיטוכונדריזה S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
שחזור מתחם מחומש 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
חלבון ריבוזומלי, גדול, P2 12 כפיר 0 0 0 76% 0
IMP (inosine 5 '-monophosphate) דהידרוגנאז 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
טובולין, ביתא 4B מחלקה IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L23 19 קק ל 0 0 0 74% 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
גלקטוז-3-או-sulfotransferase 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
משתיק קול של מ4-20 הומולוג 1 (דרוזוהילה) 99 kDa 0 72% 0 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S25 20 הורדה 0 0 0 70% 0
הריבוזומL1 תחום המכיל 1 55 kDa 0 0 0 70% 0
משפחה עם דמיון רצף 110, חבר D בת 29 69% 0 0 0 0
חלבון ריבוזומלי L36a-כמו 12 כפיר 0 0 0 66% 0
מיכל המוח 4 מיכל בן 22 0 0 0 64% 0
הועבר N-acetylglucosamine-1-פוספט, יחידות משנה אלפא וביתא 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 הומולוג B (ש. cerevisiae) 38 kDa 0 0 0 64% 0
מווסת התארכות שעתוק 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
הומבוקס A1 15 הורדה 0 0 0 62% 0
חלבון העברה פוספוליפיד 49 kDa 0 0 0 62% 0
רו מפעיל חלבון 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S18B בת 29 0 0 0 52% 0
רשתית העין aminopeptidase 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
מוטיב טריפרטיט המכיל 28 89 kDa 0 50% 0 0 0
בוגר קרצינומה של סרטן המעי הגס 1 24 כפיר הורדה 0 0 0 50% 0
בתחום אינטראקטיבי עשיר 1A (SWI-כמו) 242 kDa 0 0 49% 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון S17 15 הורדה 0 0 0 48% 0
להיכנס, לאכול חלבון משויך 82 kDa 0 0 0 48% 0
פוספספטאז חלבון, Mg2 +/Mn2 + תלוי, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
תחום תיקון G ו ankyrin חוזר 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
חלבון מיטוכונדרילי פרוטאין L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
הנצה לא מעוכבים על ידי בנדימיזמלס 3 הומולוג (שמרים) 37 kDa 0 44% 0 0 0
שידור חוזר 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
חלבון דיגופרתי איזומראז משפחה A, חבר 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
כקזן, הפריפלקין אינטראקציה חלבון 86 kDa 0 41% 0 0 0
סליל לסליל המכיל 2 בת 16 0 0 40% 0 0
חלבון הלם חום 90kDa אלפא (ציטוסולג), מחלקה חבר 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
רטיניטיס פיגמנטוזה מווסת GTPase 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (קבוצת מחשבים סופנית, RNA פולימראז II, פוליפפטיד A)
פוספספטאז, תת-יחידה 1		 104 kDa 0 39% 0 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-כמו 76 kDa 0 38% 0 0 0
Dnaj (Hsp40) הומולוג, תת C, חבר 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
ריבוזומיית מיטוכונדריאני חלבון L51 15 הורדה 0 0 0 38% 0
בייסטין 50 kDa 0 0 0 38% 0
חלבון משויך הונטינב 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
אצבע האבץ חלבון 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
מחזור חלוקת התא ומווסת אפופטוזיס 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
חלבון טירולך פוספאטואז, סוג שאינו קולטן 13
(APO-1/CD95 (מהר)-פוספספטאז הקשורים)		 256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-תחום המכיל 2 56 kDa 0 0 0 31 0
מפעיל מחברת משנה בעלת אות מורכבת 1 2 מיכל בן 28 0 0 0 31 0
חלבון מסנטרוזומא 76 קק 74 kDa 0 30 0 0 0
פולימראז (RNA) III (בימוי DNA) פוליפפטיד C (62 ק ג) 61 kDa 0 0 0 30 0
5-hydroxytryptamine (סרוטונין) קולטן 6 47 kDa 0 0 0 29 0
קולטן T התאים אלפא הצטרפות 56 2 מיכל הפרדה 0 26 0 0 0
ביואוריינטציה של כרומוזומים בחלוקת התא 1 כמו 330 kDa 0 0 0 25 0
התאחדות הקבוצות ותחומי דיל 114 kDa 0 0 25 0 0
שחזור התחום 66 של WD 130 kDa 0 0 0 24 0
כרומוזום 6 פתוח מסגרת קריאה 25 13 הורדה 0 0 22 0 0
חלבון טרנסממברנלי 177 34 kDa 0 0 0 21 0
תא הקודמן העצבי הביע, פיתוח מוסדר למטה 4-כמו 101 kDa 0 20 0 0 0

טבלה 2: זיהוי של גורמים מארחים סלולריים משלימה עם נוקלאוולאר-לוקליזציה מוטציות הפוך 4, 5, ו 6 במהלך הייצור HIV-1. Coomassie מוכתם SDS-ג'ל לעמוד באיור 6 היה מעובד עבור ספקטרומטריה המסה טנדם. אינטראקציה חלבון תוצאות של WT Rev נגד מוטציות נוקלאוולאר M4, M5, ו M6 מסוכמים על ידי הסתברות זיהוי חלבון (באחוזים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מנתח ספקטרומטר המסה השוואת מוטציות Rev-NoLS ו-WT Rev בנוכחות HIV-1 העריכו להבין גורמים נוקלאוולאר מעורב מחזור שכפול נגיפי. זה יזהה את רכיבי הנוקלאוולאר הדרושים לנגועים בנגיף. הנוקלאוולאר B23 יש זיקה גבוהה Rev-NoLS ופונקציות בלוקליזציה נוקלאואוליאר של Rev3 והובלה נוקלאוציטוטופלסמטי של מאוגד-HIV mrnas22. האהדה של B23 עם מוטציות Rev-nols, אשר הכיל יחיד או מספר החלפות ארגינין, הוערך דרך immunoprecipitation של Rev-3' דגל במהלך ייצור נגיפי (איור 2; WT ומוטציות M2, M6, ו M9). B23 אהדה לנקודה בודדת Rev-NoLS מוטציות M4, M5, ו M6 נבדקו בעבר בנוכחות של שכפול HIV-1. במחקר הקודם, האלוטים של ה-IP של M4, M5, ו M6 היו חשופים החיסונית המערבית עם נוגדן ספציפי α-דגל עבור הפוך וB23 אהדה1. ברקע של הפוך מוטציות חד נקודה אחת, הזיקה B23 binding הופחת באופן משמעותי. B23 מתוחזק אהדה עם WT Rev במהלך שכפול HIV. מוטציות בנקודה אחת המושרה בתוך Rev NoLS צפויים להקטין את הזיקה מחייבת לגורמים אחרים מארחים סלולריים הקלה על כריכת HIV mRNA והובלה. Rev-NoLS יחיד ומספר נקודות מוטציות במודל זה ביטל nucleophosmin B23 אהדה כדי Rev, המציין הפרעה במעבר נוקלאוציטוטופלסמטי ו-HIV mRNA הובלה. סביר להניח כי הגורמים נוקלאוולאר (נוקלאואולין C23 ו נוקלאוטיקצת חלבון הרכבה 1), גורמי התחבורה (ARHGEF1 ו TCB1D24), החדרת גורמים (hnRNPC ו PNN) מעורבים במחזור הזיהומיות HIV-1 דרך אינטראקציה עם מכלולי חלבון הפוך. טבלה 1 ושולחן 2 לחשוף גורמים אחרים הסלולר השונים, הן נוקלאוולאר ו nonnucleolar בתבנית, כי הם עלולים להיות מעורבים במחזור השכפול HIV-1 דרך Rev. פקטור הנוקלאוולאר-ננחנה C/D בתיבה 58, מעורב בשנת שנחתה עיבוד, שרידי התחבורה אל הנוקלאוולוס, ו 2 '-O-מתילציה של RNA ריבוזומיום-זוהה עדיין את הפונקציה של חלבון זה במחזור השכפול HIV-1 נשאר ידוע. התפקידים הספציפיים של גורמים אלה הסלולר במחזור זיהומיות HIV-1 נחקרים כעת.

התוצאות המוצגות כאן להפגין את השימוש בגישה זו לזיהוי של נגיפי/מארח הגורמים הנוקלאוולמאר השומרים על מחזור זיהומיות HIV-1. גורמים ויראלי/מארחים הנוטלים חלק במודלים של מחלות אחרות ניתן לזהות באמצעות גישה זו. סביר להניח כי גורם נוקלאוולאר אחד יכול לכלול תפקידים משולבים במודלים של מחלות שונות. לדוגמה, B23 היה מעורב בהובלה של חלבונים נגיפי נוקלאוולאר, הרכבה נגיפית, encapsidation שכפול, והשהיה במודלים אחרים ויראלי זיהומיות. B23 מאופיין באינטראקציות עם NoLS של גורמים סלולאריים עבור הובלה נוקלאוציטוטוסמטי-p120 מקדם צמיחה (חומצות אמינו 40-57)23 ו C23 Pre-rrna מעבד (חומצות אמינו 540 – 628)24. B23 הוא גם תיעד אינטראקציה עם הנגיף האנושי T-cell lymphotropic (HTLV-1) חלבון רקס (חומצות אמינו 1-22)25, hiv-1 תאת (חומצות אמינו 49 – 57)2, ו-hiv-1 Rev (חומצות אמינו 37-47)26. וירוס קרום המוח היפני (JEV) הגנום מקודד נוקלאויניום-לוקליזציה חלבון הליבה, שדרכו חומצות אמינו Gly42 ו Pro43 אינטראקציה עם אזור N-terminal של B23 במהלך זיהום JEV, וכתוצאה מכך התחבורה של חלבון ליבה ויראלי/B23 לתוך הגרעין27. הגנום היחיד שנתקע RNA של נגיף הפטיטיס B (HBV) מורכב חלקית של דנ א כפול, אשר מקודד חלבון הליבה נוקלאוולאר. החלבון הליבה HBV מקורביו עם נוקלאוולין ו B23 בנוקלאוולוס28; B23 הפגינו בהרכבת HBV באמצעות אינטראקציה עם הגרעין הליבה N-terminal התחום. באופן ספציפי, B23 חומצות אמינו 259-294 לאגד את התחום N-מסוף של חלבון הליבה HBV כדי לאפשר הנגיף הנגיפי29. הגיון שלילי, חד-הפטיטיס RNA D וירוס (HDV) מבטא אנטיגן HDVAg בשני isoforms; מסייע קטן isoform בשכפול RNA, ו isoform גדול מקלה על הרכבה נגיפית. שכפול RNA מתרחש בתוך הנוקלאוולוס ודורש אינטראקציה B23 עם hdvag30,31. הידבקות HDV גורמת לupregulation של B23, אשר מקיים אינטראקציה בעיקר עם הקטן HDVAg isoform ופחות עם הגדול HDVAg isoform. אינטראקציות מתקיימים דרך התחום הקטן של NLS HDVAg, שדרכו B23 נקשר ומשיגה הצטברות גרעינית. עם מחיקת אתר איגוד ה-HDV ל B23, שכפול RNA היה לקוי. HDVAg הוצגה לוקליזציה עם B23 ו נוקלאוולין ב נוקלאוולוס. נוקלאוולין התגלה כבעל מאפיינים היחוקים כמדכא32, וחשף את הנוקלאוולוס כתא לוויסות שכפול ה-HDV. B23 מעורב גם ההשהיה של סרקומה של קפושי הקשורים וירוס (KSHV) הגנום. KSHV נסתר חלבון-v-ציקלב-עם מארח CDK6 קינאז, זאילטים B23 ב Thr199, סיוע B23 אינטראקציה עם השהיה הקשורים אנטיגן גרעיני33. ההשהיה הקשורה אנטיגן גרעיני פועל כדי למנוע שכפול ליטיק נגיפי. דלדול של B23 מוביל ל-KSHV מהפעלה מראש, חשיפת B23 כרגולטור של השהיית KSHV. הפונקציה B23 במחזור השכפול HIV-1 מאופיין בפעילות התחבורה נוקלאוציטוטוסמטי של תאת ו Rev, וזה לא ידוע אם B23 יכול לגרום להשהיה במהלך הידבקות ב-HIV. מעורבות B23's בשכפול, התכנסות והרכבה של HIV-1 כרגע לא ידוע.

הסתגלות של שיטה זו לדגמי מחלות אחרות ידרוש הרבה מאמץ וזמן עבור הדור של עצמות אחוריות זיהומיות חלבון להיות מבוטא קווי התא המתאים. היתרון של זה Rev-HXB2 לקויה HIV-1 השדרה היא היכולת לבחון מוטציות Rev-nols בנוכחות של עמוד השדרה הנגיפי מלא, גורמים זיהומיות נגיפי, וגורמים מארחים המעורבים במחזור השכפול HIV-1. מחקרים אחרים בחנו את הפונקציה Rev נוקלאוולאר בהיעדר מערכת זיהומית מלאה של HIV-1. אפיון מעמיק של מסלולים זיהומיות ומחלות חייב לכלול סביבות נציג התומכות במסלול הטבעי של התקדמות המחלה. שני סוגים שונים של ניתוחים נערכו והושוו ביכולת לזהות גורמים נוקלאוקולאר. טבלה 1 מפרטת גורמים שנשארו מאוגדים ל-WT Rev כתוצאה מניתוח הספקטרומטר המסה הישיר של משחרלי החלבון. ניתוח זה הניב מספר גורמים ידועים של HIV-1 Rev. שיטה ישירה זו הושוו לתהליך אחר הכרוך בהפקת חלבון המופרד בתוך SDS-דף ג'לים וניתוח ספקטרומטר המסה של חלבונים כאלה. זו השיטה השנייה הניבה מגוון של גורמים ידועים ופוטנציאליים המאוגדים למתחם החלבון Rev אך חסר את החלבונים הבאים שזוהו בעבר בטבלה 1: חלקיק זיהוי אותות 14 kda, התרגום האיואוקריוטי ליזום פקטור 4B, חלבון הריבוזומL22, קטן נוקלאוולאר RNA C/D תיבת 58 b, ו-מתחם CCHC אצבע אבץ המכיל 11. בסופו של דבר, שיטה מעולה שנבחרה לניתוח ספקטרומטר המסה בפרוטוקול זה מעורב החילוץ של פפטידים מ SDS-דף ג ' לים. השיטה הישירה הראשונה כללה מאגר מדגם של 2x במאגר ללא ברורופנול כחול; הרכיבים הנותרים של מאגר המדגם של 2x עלולים להפריע לטיפול טריפסין מוחלט ולהניב פפטידים מעובדים לחלוטין לניתוח ספקטרומטר מסה. השיטה העקיפה השנייה הצליחה לטהר פפטידים מטופלים ממזהמים פוטנציאלים של SDS-PAGE.

את שיטות ההכנה המסה של הספקטרומטר המתואר כאן יכול להיות מנוצל לזיהוי התערבויות טיפוליות לבער את הזיהום HIV-1 באמצעות המיקוד Rev. All מחיקה ומוטציות הפוך-NoLS חד הנקודה ניתן לבחון עבור דומיננטי-שלילי פעילות מנוצל במעצר של פונקציה Rev. המאפיינים השליליים שליליים של עניין עבור מעצר פונקציונלי Rev הם הבאים: הזיקה Rev/בעלי כריכה; הסבה מחדש של הנוקלאווליאר WT הפוך דרך מוטציות עם Rev מוטנטים; אובדן של אהדה גורמים סלולריים מפתח מעורב HIV-1 mRNA תחבורה ושחבור. Rev מולטימאריזציה מעורבים את הביטוי של מוטציות Rev-NoLS עם WT Rev יכול להיבדק. מוטציות שליליות דומיננטי במודל זה צפויים multimerize עם WT Rev ומשמרת הנוקלאוולאר דפוסי לקראת הגרעין הציטופלסמה, המוביל מעצר פונקציונלי הפוך. ניתן להשתמש בספקטרומטר מסה כדי לזהות את אובדן הגורמים הסלולאריים המרכזיים המעורבים באיחוי ובהובלה של HIV-1 mRNA. הזיהוי של אינטראקציות חסרות עם WT Rev כתוצאה של הביטוי עם המוטציות דומיננטי-NoLS מוטציות לגלות את המעורבות של נוקלאואוליאר-מסלולים ספציפיים ב-HIV-1 פתוגנזה. לחילופין, נגיף HIV-1NL4-3 חלקיקים שנוצר ברקע של מוטציות Rev-nols יכול להיות נחקר עבור כל הגורמים הסלולריים ארוזים. ניתן לזהות את הגורמים הסלולריים והנגיליים בחלקיקים ויראליים באמצעות ספקטרומטר מסה. זה יחשוף את הנוכחות של גורמים נוקלאוקולאר בתוך חלקיקים ויראלי התפקיד של גורמים נוקלאואוליאר מזוהה זיהום נגיפי. השיטות המתוארות הינן ישימות למודלים ויראליות ומחלות אחרות לצורך זיהוי ואפיון של מסלולים בעלי מחקר חסר. זה יאפשר פיתוח התערבויות טיפוליות נגד מחלות שבהן ניתן להשיג טיפולים מוגבלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מכירים את ד ר ברברה ק. פלבר וד ר ג'ורג ' נ. פאוולקיס עבור התרבות החסיד של ה-HLfB שמספקת המכון הלאומי לבריאות (NIH) מחקר והתייחסות תוכנית מגיב, חטיבת האיידס, המכון הלאומי לאלרגיה וזיהומיות מחלות (NIAID), NIH. המחברים מכירים גם במקורות פיננסיים המסופקים על ידי NIH, מענקים AI042552 ו-AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 148 HIV-1 שכפול rev Immunoprecipitation ספקטרומטר מסה נוקלאואולוס B23
זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, … More

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter