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Immunology and Infection

Rev इम्यूनोवेरिसेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59329
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 1, 1,2
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Summary

यहाँ हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एचआईवी-1 प्रतिकृति की उपस्थिति में रेव इम्यूनोप्रीप्शन का वर्णन करते हैं। वर्णित विधियों एचआईवी-1 संक्रामक चक्र में शामिल न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और understudied रास्ते की विशेषता के लिए अन्य रोग मॉडल के लिए लागू होते हैं.

Abstract

एचआईवी-1 संक्रामक चक्र वायरल प्रतिकृति, पैकेजिंग, और रिहाई की सुविधा के लिए मेजबान कारकों के साथ वायरल प्रोटीन बातचीत की आवश्यकता है। संक्रामक चक्र आगे splicing को विनियमित करने और न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक परिवहन को सक्षम करने के लिए एचआईवी-1 आरएनए के साथ वायरल /होस्ट प्रोटीन परिसरों के गठन की आवश्यकता है। एचआईवी-1 रेव प्रोटीन intronic cis-acting लक्ष्य - रेव प्रतिक्रिया तत्व (आरआरई) के साथ multimerization के माध्यम से एचआईवी-1 mRNAs के परमाणु निर्यात को पूरा करता है। एक न्यूक्लिओलर स्थानीयकरण संकेत (NoLS) Rev arginine समृद्ध आकृति (एआरएम) के COOH-टर्मिनस के भीतर मौजूद है, न्यूक्लिओलस में रेव / आर आर ई परिसरों के संचय की अनुमति. न्यूक्लिओलर कारकों MRNA स्वतंत्र परमाणु निर्यात और splicing मध्यस्थता के अलावा विभिन्न अन्य कार्यों के माध्यम से एचआईवी-1 संक्रामक चक्र का समर्थन करने के लिए speculated हैं. हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एचआईवी-1 प्रतिकृति की उपस्थिति में रेव न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों (हटाने और एकल-बिंदु रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों) की तुलना में जंगली-प्रकार (WT) रेव की एक प्रतिरक्षा विधि का वर्णन करते हैं। न्यूक्लिओलोलर कारकों न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक परिवहन में फंसा (न्यूक्लिओफोस्मिन B23 और न्यूक्लिओलोसिन C23), साथ ही सेलुलर splicing कारकों, रेव-NoLS उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में रेव के साथ बातचीत खो देते हैं। विभिन्न अन्य न्यूक्लिओलर कारकों, जैसे snoRNA C/D बॉक्स 58, रेव उत्परिवर्तनों के साथ बातचीत खोने के लिए पहचाने जाते हैं, फिर भी एचआईवी-1 प्रतिकृति चक्र में उनके कार्य अज्ञात रहते हैं। यहाँ प्रस्तुत परिणाम वायरल / मेजबान न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण के उपयोग को प्रदर्शित करता है जो एचआईवी-1 संक्रामक चक्र को बनाए रखते हैं। इस दृष्टिकोण में इस्तेमाल अवधारणाओं अन्य वायरल और रोग मॉडल understudied रास्ते की विशेषता की आवश्यकता के लिए लागू होते हैं.

Introduction

न्यूक्लिओलस विभिन्न सेलुलर मेजबान और वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक वायरल कारकों की बातचीत जमीन के रूप में अभिगृहीत है. न्यूक्लिओलस एक जटिल संरचना है जो तीन अलग-अलग डिब्बों में विभाजित है: फिब्रिलर डिब्बे, घने फिब्रिलर डिब्बे, और दानेदार डिब्बे। एचआईवी-1 रेव प्रोटीन विशेष रूप से दानेदार डिब्बों के भीतर स्थानीयकृत; हालांकि, इस स्थानीयकरण पैटर्न के लिए कारण अज्ञात है। NoLS अनुक्रम के भीतर एकल बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में (रेव उत्परिवर्तनों 4, 5, और 6), रेव एक न्यूक्लिओलर पैटर्न बनाए रखता है और पहले एचआईवी-1HXB2 प्रतिकृति बचाव के लिए दिखाया गया है, तथापि, कम दक्षता के साथ WT Rev 1 की तुलना में . सभी एकल बिंदु उत्परिवर्तन एचआईवी-1NL4-3 संक्रामक चक्र को बनाए रखने में असमर्थ हैं। NoLS अनुक्रम के भीतर कई एकल बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में (Rev-NoLS उत्परिवर्तन 2 और 9), रेव नाभिक और कोशिका द्रव्य भर में फैलाने के लिए मनाया गया है और एचआईवी-1HXB2 प्रतिकृति1बचाव करने में सक्षम नहीं किया गया है. इस प्रोटीओमिक्स अध्ययन का लक्ष्य न्यूक्लिओलर के साथ-साथ रेव-मध्यस्थ एचआईवी-1 संक्रामक मार्ग में शामिल गैर-न्यूक्लिओलर सेलुलर कारकों को समझने के लिए है। Rev प्रतिरक्षा की स्थिति न्यूक्लिओलर B23 फॉस्फोप्रोटीन, जो पहले न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में रेव के साथ बातचीत खोने के लिए दिखाया गया है के साथ बातचीत के माध्यम से अनुकूलित कर रहे हैं.

रेव सेलुलर कारकों बड़े पैमाने पर अतीत में अध्ययन किया गया है; हालांकि, यह वायरल रोगजनन की अनुपस्थिति में किया गया है। एक प्रोटीन, विशेष रूप से, कि एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान रेव बातचीत के माध्यम से इस अध्ययन में विशेषता है न्यूक्लिओलर फॉस्फोप्रोटीन B23 - भी न्यूक्लिओफोफॉस्मिन (एनपीएम), numatrin, या उभयचर2मेंNO38 कहा जाता है ,3, 4. बी 23 को तीन समरूपों (एनपीएम1, एनपीएम2, और एनपीएम3) के रूप में व्यक्त किया जाता है - न्यूक्लिओफोस्मिन/न्यूक्लिओप्लास्मिन न्यूक्लियर चैपरोन परिवार5,6के सभी सदस्य । NPM1 आणविक chaperone न्यूक्लिओसोम की उचित विधानसभा में कार्य करता है, क्रोमैटिन उच्च क्रम संरचनाओं में शामिल प्रोटीन / न्यूक्लिक एसिड परिसरों के गठन में7,8, और एकत्रीकरण की रोकथाम में और एन-टर्मिनल कोर डोमेन (अवशेष 1-120)9के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीनों का गलत उपयोग करना। NPM1 कार्यक्षमता नाभिक और कोशिकाद्रव्य10,11के बीच preribosomal कणों के परिवहन के माध्यम से राइबोसोम उत्पत्ति तक फैली हुई है , आंतरिक प्रतिलेखन स्पेसर अनुक्रम में preribosomal आरएनए के प्रसंस्करण 12,13, और रिबोसोमल सभा14,15के दौरान प्रोटीनों के न्यूक्लिओलर एकत्रीकरण को गिरफ्तार करना . NPM1 apoptosis के निषेध में फंसा हुआ है16 और ट्यूमर suppressors ARF17,18 और p5319के स्थिरीकरण में , एक oncogenic कारक और ट्यूमर दबानेवाला के रूप में अपनी दोहरी भूमिका का खुलासा. NPM1 जीनोम स्थिरता, सेन्ट्रोसोम प्रतिकृति, और प्रतिलेखन के सेलुलर गतिविधियों में भाग लेता है. एनपीएम1 कोशिका चक्र अंतराल के दौरान न्यूक्लिओली में पाया जाता है, माइटोसिस के दौरान गुणसूत्र परिधि के साथ, और मिटोसिस के समापन पर प्रीन्यूक्लिओलर निकायों (पीएनबी) में पाया जाता है। NPM2 और NPM3 के रूप में अच्छी तरह से NPM1 के रूप में अध्ययन नहीं कर रहे हैं, जो द्रोह20के दौरान बदल अभिव्यक्ति के स्तर से गुजरना .

NPM1 एक आंतरिक NES और NLS9,21 के माध्यम से विभिन्न परमाणु /न्यूक्लिओलर प्रोटीन के न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बंद करने में प्रलेखित किया गया है और पहले एचआईवी-1 टाट और रेव प्रोटीन के परमाणु आयात ड्राइव करने के लिए सूचित किया गया था। B23-binding-domain-]-galactosidase संलयन प्रोटीन की उपस्थिति में, Tat cytoplasm के भीतर mislocalizes और transactivation गतिविधि खो देता है; यह B232के लिए Tat की एक मजबूत संबंध को दर्शाता है . एक अन्य अध्ययन ने आरआरई युक्त एमआरनए के अभाव में एक रेव/बी 23 स्थिर परिसर की स्थापना की। RRE MRNA की उपस्थिति में, रेव B23 से अलग है और बेहतर एचआईवी RRE के लिए बांध, B2322के विस्थापन के लिए अग्रणी. यह अज्ञात है, जहां, उप-परमाणु स्तर पर, टैट ट्रांसएक्टिवेशन और एचआईवी एमआरएनए के लिए बी 23 की रेव विनिमय प्रक्रिया होती है। दोनों प्रोटीन ों को बी23 अन्योन्यक्रिया के माध्यम से एक साथ न्यूक्लिओलस में प्रवेश करने के लिए अभिगृहीत किया जाता है। एचआईवी न्यूक्लिओलर मार्ग में अन्य मेजबान सेलुलर प्रोटीन की भागीदारी की संभावना है। इस प्रोटीओमिक्स जांच में वर्णित विधियों से एचआईवी-1 रोगजनन के दौरान शामिल मेजबान सेलुलर कारकों के साथ न्यूक्लिओलस की परस्पर क्रिया को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी।

प्रोटीओमिक्स जांच एचआईवी-1HXB2 उत्पादन के लिए रेव नोल्स एकल-बिंदु उत्परिवर्तनों (एम 4, एम 5, और एम 6) और कई आर्जिनिन प्रतिस्थापन (एम 2 और एम 9) की अभिव्यक्ति के माध्यम से शुरू की गई थी। इस मॉडल में, एक HeLa सेल लाइन stably Rev-1HXB2 (HLfB) व्यक्त WT रेव और Rev न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों 3 'अंत में एक झंडा टैग युक्त के साथ transfected है. WT Rev की उपस्थिति वायरल प्रतिकृति HLfB संस्कृति में होने की अनुमति देगा, Rev-NoLS उत्परिवर्तनों कि रेव की कमी बचाव नहीं है की तुलना में (M2 और M9), या वायरल प्रतिकृति होने की अनुमति नहीं है, लेकिन के रूप में कुशलता से नहीं के रूप में WT Rev (M4, M5, और M6)1. सेल lysate 48 एच बाद में रेव अभिव्यक्ति की उपस्थिति में वायरल प्रसार के बाद एकत्र किया जाता है और Rev/B23 बातचीत के लिए अनुकूलित एक lysis बफर के साथ इम्यूनोप्रीसेंस के अधीन है। Lysis बफर अनुकूलन अलग नमक सांद्रता का उपयोग कर वर्णित है, और एचआईवी-1 रेव के लिए प्रोटीन elution तरीकों की तुलना में कर रहे हैं और चांदी से सना हुआ या Coomassi दाग एसडीएस-पेज जैल में विश्लेषण किया. पहले proteomics दृष्टिकोण व्यक्त WT रेव, M2, M6, और M9 अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा से एक eluted नमूना का प्रत्यक्ष विश्लेषण शामिल है. एक दूसरा दृष्टिकोण जिसके द्वारा WT Rev, M4, M5, और M6 के eluates एक जेल निष्कर्षण प्रक्रिया पहले दृष्टिकोण की तुलना में है. WT Rev की तुलना में रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों के लिए पेप्टाइड आत्मीयता का विश्लेषण किया जाता है और प्रोटीन पहचान संभावना प्रदर्शित की जाती है। इन दृष्टिकोणों से संभावित कारकों (न्यूक्लिओलर और nonnucleolar) प्रकट होते हैं जो एचआईवी-1 एमआरएनए परिवहन में भाग लेते हैं और एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान रेव के साथ splicing करते हैं। कुल मिलाकर, सेल lysis, आईपी, और elution शर्तों वर्णित मेजबान सेलुलर कारकों है कि सक्रिय करने और संक्रामक रास्ते को विनियमित की समझ के लिए ब्याज की वायरल प्रोटीन के लिए लागू होते हैं. यह भी सेलुलर मेजबान विभिन्न रोग मॉडल के हठ के लिए आवश्यक कारकों के अध्ययन के लिए लागू है. इस प्रोटीओमिक्स मॉडल में, एचआईवी-1 रेव आईपी को बी 23 इंटरैक्शन के लिए अनुकूलित किया जाता है ताकि न्यूक्लिओलर कारकों को स्पष्ट किया जा सके जो न्यूक्लिओटोप्लाज्मिक शटलिंग गतिविधि और एचआईवी-1 एमआरएनए बाइंडिंग में शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सेल लाइनों stably संक्रामक रोग मॉडल है कि ब्याज की प्रमुख प्रोटीन के लिए कमी कर रहे हैं व्यक्त विकसित किया जा सकता है, HLfB सेल लाइन के समान, ब्याज के संक्रामक रास्ते का अध्ययन करने के लिए.

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम में HLfB बनाए रखें (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक, और ऊतक संस्कृति के भीतर 1 मिमी सोडियम pyruvate इलाज 100 मिमी प्लेटें. 5% ब्व्2के साथ आपूर्ति किए गए आर्द्र इनक्यूबेटर में सेल संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें . 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व के लिए मार्ग संप्रवाह कोशिकाओं।
  2. सेल संस्कृति मीडिया छोड़ें. 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धीरे से कुल्ला। निकालें और सेल परत को बाधित किए बिना 1x PBS छोड़ दें.
  3. कोशिकाओं के लिए 1x trypsin-EDTA समाधान के 2 एमएल जोड़ें. 5 मिनट के लिए एक humidified कक्ष के भीतर 37 डिग्री सेल्सियस पर मोनोलेयर और इनक्यूबेट कोट करने के लिए पकवान रॉक।
  4. कोशिकाओं को अलग करने के लिए हाथ की हथेली के साथ पकवान के पक्ष को दृढ़ता से टैप करें। ताजा संस्कृति मीडिया के 8 एमएल में अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित. 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं स्पिन.
  5. कोशिका गोली को बाधित किए बिना संस्कृति मीडिया को त्यागें। ताजा संस्कृति मीडिया के 10 एमएल में सेल गोली resuspend. उपसंस्कृति 1 एमएल केंद्रित कोशिकाओं के साथ ताजा संस्कृति मीडिया के 9 एमएल ऊतक संस्कृति के भीतर इलाज 100 मिमी प्लेटें.
    नोट: प्रत्येक रेव-नोल्स उत्परिवर्तन के लिए, 3x 100 मिमी HLfB या Hela संस्कृति प्लेटें पश्चिमी धब्बा विश्लेषण और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए पर्याप्त प्रोटीन lysate उपज होगी. एक WT Rev सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण के लिए अतिरिक्त प्लेटें जोड़ें. उपकृषि कोशिका मात्रा को विभिन्न प्रकार के सेल के उपयोग के साथ ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता होगी।

2. एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान रेव-नोल्स-3'फ्लैग उत्परिवर्तनों की अभिव्यक्ति

  1. HLfB सेल संस्कृति 2 x 106 कोशिकाओं /एमएल की एक सेल घनत्व के लिए बढ़ाएँ. प्रत्येक 100 मिमी प्लेट के लिए 4 एमएल कैल्शियम फॉस्फेट-डीएनए निलंबन तैयार करें।
    1. लेबल दो 15 एमएल ट्यूबों के रूप में 1 और 2. ट्यूब 1 में 2x एचबीएस (0.05 एम हेप्स, 0.28 एम नैक्ल, और 1.5 एमएम ना2एचपीओ4 [पीएच 7.12]) के 2 एमएल जोड़ें। ट्यूब 2 में ते 79/10 (1 एमएम ट्राइस-एचसीएल और 0.1 एमएम एड्टा [पीएच 7.9]) जोड़ें। ते 79/10 की मात्रा 1.760 एमएल है - डीएनए की मात्रा।
    2. ट्यूब 2 के लिए ब्याज की रेव-नोल्स-3'फ्लैग उत्परिवर्तन युक्त प्लाज्मिड के 20 डिग्री ग्राम जोड़ें और resuspension के माध्यम से अपनी सामग्री मिश्रण। 2 एम CaCl 2 के 240 जेडएल ट्यूब 2 के लिए जोड़ें और resuspension के माध्यम से फिर से मिश्रण.
    3. ट्यूब 2 के मिश्रण को ट्यूब 1 ड्रॉपवार, धीरे मिश्रण करने के लिए स्थानांतरित करें। निलंबन 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति दें भंवर वर्षा.
  2. 3-सेल संस्कृति में से प्रत्येक के लिए निलंबन dropwise के 1 एमएल जोड़ें, 100 मिमी प्लेटें जबकि धीरे मीडिया घूमता. प्लेटों को इनक्यूबेटर पर वापस करें और ट्रांसफेक्शन मिश्रण को 6 ज के लिए छोड़ दें। ट्रांसफेक्शन मिश्रण को 10 एमएल ताजा संस्कृति मीडिया के साथ बदलें और कोशिकाओं को 42 एच के लिए इनक्यूबेट करें।

3. वायरल प्रोटीन lysate का संग्रह

  1. सेल मीडिया 48 एच posttransfection छोड़ दें. प्रत्येक 100 मिमी प्लेट को बर्फ के बिस्तर पर रखें। प्रत्येक रेव-नोल्स उत्परिवर्तन नमूने के लिए 15 एमएल ट्यूब लेबल और बर्फ पर ट्यूब जगह है.
  2. कोशिका परत को बाधित किए बिना 10 एमएल प्रीचिल्ड 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धीरे से कुल्ला करें। 1x पीबीएस छोड़ें. lysis बफर के 3 एमएल जोड़ें (50 मिमी Tris-HCl [पीएच 8.0], 137 मिमी NaCl, और 1% X-100 डिटर्जेंट [सामग्री की तालिकादेखें ]), protease अवरोधक कॉकटेल के साथ इलाज किया, 100 मिमी प्लेटों में से प्रत्येक के लिए.
  3. सेल परत को बाधित करने के लिए एक सेल खुरचनी का उपयोग करें। प्लेट को झुकाएं और धीरे-धीरे परिमार्जन करें और कोशिकाओं को एक पूल में एकत्रित करें। एक 1,000 डिग्री एल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सेल lysate लीजिए और पूर्व लेबल 15 एमएल ट्यूब में तीन 100 मिमी प्लेटों में से प्रत्येक से सेल lysates मिश्रण।
  4. 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेल lysate इनक्यूबेट, हर 5 मिनट के लिए सेल lysate 5 मिनट के लिए 15,000 x ग्राम पर सेल lysate vortexing.
  5. सेल मलबे गोली को बाधित किए बिना प्रोटीन supernatant लीजिए और यह एक और बाँझ 15 एमएल ट्यूब को स्थानांतरित. ब्रैडफोर्ड विधि का उपयोग करके वायरल प्रोटीन lysate एकाग्रता प्राप्त करें (अनुभाग 4 देखें)।
  6. पश्चिमी इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए इनपुट नमूने (20 डिग्री) के एक एलिकोट सहेजें। जोड़ें 2x नमूना बफर (20% ग्लिसरोल, 0.02% ब्रोमोफेनोल नीला, 125 एमएम Tris-Cl [पीएच 6.8], 5% एसडीएस, और 10% 2-mercaptoethanol) अंतिम मात्रा में. इसे 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, और इनपुट नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

4. ब्रैडफोर्ड परख

नोट: प्रोटीन मानक घटता पैदा करने से पहले 100x बीएसए शेयर से 10x गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) तैयार करें।

  1. निम्नलिखित रिक्त और मानकों के लिए microcentrifuge ट्यूबों में Alicot पानी: रिक्त $ 800 $L; मानक 1 ] 2 मिलीग्राम/एमएल, 798 डिग्री सेल्सियस; मानक 2 ] 4 मिलीग्राम/एमएल, 796 डिग्री सेल्सियस; मानक 3 ] 6 मिलीग्राम/एमएल, 794 डिग्री सेल्सियस; मानक 4 ] 8 मिलीग्राम/एमएल, 792 $L; मानक 5 ] 10 mg/mL, 790 [L. Alicot 10x बीएसए निम्नलिखित निर्दिष्ट मानकों में: मानक 1 ] 2 $L; मानक 2 $ 4 $L; मानक 3 ] 6 $L; मानक 4 $ 8 $L; मानक 5 $ 10 $L.
  2. प्रोटीन नमूनों के 5 डिग्री एल के साथ पानी के 795 डिग्री एल मिश्रण द्वारा प्रोटीन नमूनों का एक मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक रिक्त, मानक, और प्रोटीन नमूने के लिए प्रोटीन परख डाई अभिकर्मक के 200 डिग्री एल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)। एक भी मिश्रण के लिए संक्षेप में नमूने भंवर और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट (18-20 डिग्री सेल्सियस) 5 मिनट के लिए.
  3. खाली, मानकों, और प्रोटीन के नमूने cuvettes के लिए स्थानांतरण. 595 एनएम के एक OD में प्रोटीन सांद्रता उपाय.

5. रेव-नोल्स-3'फ्लैग की कोइमेंडिवरेशन

  1. M2 आत्मीयता जेल मोती के 25 $L कुल्ला (सामग्री की तालिकादेखें) lysis बफर के 500 $L के साथ, प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल के साथ इलाज किया. हर उत्परिवर्तन नमूना और नियंत्रण के लिए और अधिक आत्मीयता जेल मोती कुल्ला.
    नोट: दो जैल के लिए पर्याप्त M2 आत्मीयता जेल मोती तैयार (50 जेडएल) - पश्चिमी इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए एक और प्रोटीन धुंधला और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए अन्य.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 820 x g पर स्पिन। सुपरनेंट निकालें. 2x अधिक कुल्ला.
  3. वायरल प्रोटीन lysate जोड़ें (1 मिलीग्राम /एमएल कुल मात्रा के 5 एमएल में) prerinsed M2 आत्मीयता मोती के लिए. lysis बफ़र का उपयोग कर कुल वॉल्यूम समायोजित करें।
  4. 3 ज के लिए अभिक्रिया को इनक्यूबेट करें, जो 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन करते हैं। 1 मिनट के लिए 820 x ग्राम पर M2 एफ़िनिटी मोती/वायरल प्रोटीन lysate को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. supernatant ले लीजिए और पश्चिमी इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए पोस्ट-आईपी नमूना (20 डिग्री जी) के एक aliquot बचाने के लिए। पोस्ट-आईपी lysate के प्रोटीन एकाग्रता को मापने। पश्चिमी इम्यूनोब्लोटिंग के लिए 20 डिग्री लीजिए।
  6. अंतिम वॉल्यूम के लिए 2x नमूना बफ़र जोड़ें। इसे 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, और पोस्ट-आईपी नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. 750 डिग्री सेल्सियस लाइसिस बफर के साथ M2 मोती कुल्ला और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर मोती धोने 820 x ग्राम पर M2 मोती centrifuge और supernatant त्याग दें.
  8. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर दो और washes के लिए 5.7 चरणों को दोहराएँ। तीसरे धोने के बाद, एक लंबे जेल लोडिंग टिप का उपयोग कर M2 मोती /सह-आईपी परिसर से lysis बफर के किसी भी निशान निकालें।
    नोट: lysis बफर के किसी भी ट्रेस मात्रा को हटाने से पहले फ्लैट cweezers के साथ जेल लोड टिप के अंत चुटकी. यह व्यवधान और M2 मोती के तेज को रोकने जाएगा.
  9. 2x लोडिंग बफर के 55 डिग्री एल में M2 मोती को पुन: निलंबित करें। 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना उबालें।
  10. दो अलग एसडीएस-पेज जैल (पश्चिमी इम्यूनोब्लोटिंग के लिए एक जेल और Coomasie धुंधला के लिए अन्य) पर eluate के 25 $L लोड करें।

6. एसडीएस-पेज जैल की तैयारी

  1. कास्ट दो 15% एसडीएस-acrylamide एक 50 एमएल ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों मिश्रण द्वारा जैल को हल (40 एमएल के अंतिम मात्रा में, चार जैल के लिए पर्याप्त): 4.16 एमएल के ultrapure पानी, 40% acrylamide के 15 एमएल:bisacrylamide (29:1), 10 एमएल के 8 mL HCl (8 ML HL) , 10% एसडीएस के 400 $L, 10% अमोनियम persulfate के 400 $L, और TEMED के 40 $L.
  2. 50 एमएल ट्यूब कई बार उलटा द्वारा समाधान जेल मिक्स. पिपेट एक precleaned पश्चिमी जेल तंत्र में हल जेल मिश्रण (चार जैल - पश्चिमी इम्यूनोब्लोटिंग के लिए तीन और Coomasie के लिए एक /
  3. जेल मिश्रण की शीर्ष परत को कवर करने के लिए धीरे से पिपेट पर्याप्त पानी। रिहलवर जेल को बहुलक बनाने की अनुमति दें।
  4. किसी भी अतिरिक्त पानी को अवशोषित करने के लिए एक नाजुक कार्य वाइपर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके, रिसोलिंग जेल से पानी की परत डालें।
  5. कास्ट दो 5% एसडीएस-acrylamide स्टैकिंग जैल एक 50 एमएल ट्यूब में निम्नलिखित अभिकर्मकों मिश्रण द्वारा (20 एमएल के अंतिम मात्रा में, चार जैल के लिए पर्याप्त): अल्ट्राप्यूरेट पानी के 11.88 एमएल, 40% acrylamide के 2.5 एमएल:bisacrylamide (29:1), 8.mL के 5.2 mL , 10% एसडीएस के 200 $L, 10% अमोनियम persulfate के 200 $L, और TEMED के 20 $L.
  6. 50 एमएल ट्यूब कई बार उलटा द्वारा स्टैकिंग जेल मिक्स. उपकरण के शीर्ष करने के लिए समाधान जेल के ऊपर स्टैकिंग जेल मिश्रण पिपेट.
  7. स्टैकिंग जेल में गलियों की उचित संख्या से युक्त एक जेल कैसेट कंघी रखें. एक नाजुक कार्य वाइपर का उपयोग कर जेल मिश्रण के किसी भी अतिप्रवाह को अवशोषित (सामग्री की तालिकादेखें )। स्टैकिंग जेल को पूरी तरह से बहुलक होने दें.
  8. 1x पश्चिमी चल बफर (5x एकाग्रता: 250 एमएम Tris-Cl [pH 8.3], 1.92 M ग्लिसिन, 0.5% एसडीएस, और 10 एमएम EDTA के साथ पश्चिमी जेल तंत्र बाढ़।
  9. धीरे स्टैकिंग जेल से जेल कैसेट कंघी खींच. लोडिंग कुओं को भरने के लिए 1x पश्चिमी चल बफर की अनुमति दें। नमूने लोड करने से पहले एक सिरिंज का उपयोग कर 1x पश्चिमी चल बफर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से फ्लश.
  10. प्रत्येक इसी जेल में पश्चिमी इम्यूनोब्लॉट नमूने लोड (इनपुट नमूने, coimmunoprecipitated नमूने, और पोस्ट आईपी नमूने). पश्चिमी जेल प्रोटीन मार्करों लोड.
  11. एक और जेल में Coomassi/सिल्वर धुंधला के लिए coimmunoprecipitated नमूने लोड करें। पश्चिमी जेल प्रोटीन मार्करों लोड.
  12. एक शक्ति स्रोत के लिए चल रहे जेल उपकरण कनेक्ट और लोडिंग डाई समाधान जेल तक पहुँच जाता है जब तक 100 वी पर जैल चलाते हैं। लोडिंग डाई समाधान जेल के नीचे तक पहुँच जाता है जब तक 140 वी करने के लिए वोल्टेज बढ़ाएँ.

7. पश्चिमी धब्बा स्थानांतरण

  1. पश्चिमी जेल उपकरण को अलग करें। स्लाइस और स्टैकिंग जेल त्याग, हल जेल बरकरार छोड़ने.
  2. धीरे से पश्चिमी हस्तांतरण बफर (25 एमएम Tris, 194 m ग्लिसिन, 0.005% एसडीएस, 20% मेथनॉल) के साथ भरा एक साफ ट्रे के लिए हल करने जैल हस्तांतरण और उन्हें 15 मिनट के लिए लेना।
  3. जेल हस्तांतरण उपकरण के रूप में इस प्रकार इकट्ठा.
    1. तीन PVDF हस्तांतरण झिल्ली और फिल्टर कागज के छह टुकड़े कट (सामग्री की मेजदेखें) को हल करने जेल के आकार के लिए.
    2. PVDF झिल्ली को मेथनॉल में 5 मिनट के लिए भिगो दें। इसे पानी में 5 मिनट के लिए हाइड्रेट करें। पीवीडीएफ झिल्ली को पश्चिमी हस्तांतरण बफर में तब तक रखें जब तक कि उपयोग करने के लिए तैयार न हो जाए।
    3. एक गिलास बेकिंग ट्रे में जेल धारक कैसेट रखें आंशिक रूप से पश्चिमी हस्तांतरण बफर के साथ भरा, तल पर काले पक्ष के साथ.
    4. जेल धारक कैसेट के काले पक्ष के खिलाफ पश्चिमी हस्तांतरण बफर के साथ भिगो एक फोम पैड रखें.
    5. पश्चिमी हस्तांतरण बफर में फिल्टर कागज का एक टुकड़ा गीला और फोम पैड के शीर्ष पर जगह है। फिल्टर पेपर के शीर्ष पर रिवलिंग जेल रखें।
      नोट: सही लोडिंग अभिविन्यास में रिहलिंग जेल प्लेस PVDF झिल्ली को स्थानांतरित किया जा करने के लिए.
    6. समाधान जेल के शीर्ष पर एक PVDF स्थानांतरण झिल्ली रखें। पश्चिमी हस्तांतरण बफर के साथ फिल्टर कागज का एक टुकड़ा गीला और PVDF हस्तांतरण झिल्ली के शीर्ष पर जगह है.
    7. फिल्टर कागज के शीर्ष पर पश्चिमी हस्तांतरण बफर के साथ भिगो एक और फोम पैड रखें। ध्यान से भिगो फोम पैड के शीर्ष पर जेल धारक कैसेट के सफेद पक्ष गुना. कैसेट को कसकर लॉक करें।
    8. स्थानांतरण उपकरण इलेक्ट्रोड विधानसभा में जेल धारक कैसेट रखें. कदम दोहराएँ 7.3.4.7.3.8 प्रत्येक शेष समाधान जेल के लिए.
    9. पश्चिमी हस्तांतरण बफर के साथ स्थानांतरण उपकरण टैंक भरें। उपकरण टैंक में एक उत्तेजक छड़ रखें।
    10. उपकरण टैंक को हलचल प्लेट के शीर्ष पर रखें। 5-6 करने के लिए हलचल सेटिंग समायोजित करें, सुनिश्चित करें कि हलचल बार अटक या जेल धारक कैसेट मार नहीं है.
    11. जेल स्थानांतरण उपकरण को एक शक्ति स्रोत से कनेक्ट करें और जेल को 100 वी पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए स्थानांतरित करें।

8. इम्यूनोब्लोटिंग

  1. जेल धारक कैसेट निकालें और एक साफ गिलास बेकिंग ट्रे के खिलाफ काले पक्ष नीचे जगह है. कैसेट खोलें और ध्यान से फोम पैड और फिल्टर कागज त्यागदें. सही लोडिंग ओरिएंटेशन की पहचान करने के लिए PVDF झिल्ली के एक कोने को चिह्नित करें। झिल्ली को गीला रखें।
    नोट: PVDF झिल्ली हवा सूखा और एक साफ, सील कंटेनर में संग्रहीत किया जा सकता है. 7-3-2 के चरणों को दोहराकर झिल्ली को पुनः हाइड्रेट करें।
  2. समाधान अवरुद्ध के 100 एमएल में झिल्ली प्लेस (5% दूध, 1x टीबीएस, और 0.1% ट्वेन 20). 1 ज के लिए कमरे के तापमान (18-20 डिग्री सेल्सियस) पर कोमल रॉकिंग द्वारा झिल्ली को ब्लॉक करें।
  3. 25 केडीए प्रोटीन मार्कर के ऊपर झिल्ली भर में कटौती. झिल्ली के शीर्ष भाग रखें, जिसमें 25 केडीए से बड़े प्रोटीन बैंड होते हैं, बी 23 माउस मोनोक्लोनल आईजीजी1 (1:500 कमजोर पड़ने) वाले समाधान को अवरुद्ध करने में। रात भर ब्लॉक, 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल.
  4. झिल्ली के नीचे के हिस्से को रखें, जिसमें 25 केडीए से छोटे प्रोटीन बैंड होते हैं, M2 माउस मोनोक्लोनल आईजीजी1 (1:1,000 कमजोर पड़ने वाले समाधान को अवरुद्ध करने में, सामग्री की तालिकादेखें)। रात भर ब्लॉक, 4 डिग्री सेल्सियस पर कमाल.
  5. एक कमाल मंच पर पश्चिमी धोने समाधान (1x टीबीएस, 0.1% ट्वेन 20) के 25 एमएल में 10 मिनट के लिए झिल्ली 3x धो लें।
  6. बकरी-एंटी-माउस आईजीजी1-एचआरपी (1:5,000 कमजोर पड़ने) में झिल्ली को कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए समाधान को अवरुद्ध करने में पतला। एक कमाल मंच पर पश्चिमी धोने समाधान के 25 एमएल में 10 मिनट के लिए झिल्ली 3x धो लो.
  7. केमियुमिनसेनेस पश्चिमी सोख्ता सबस्ट्रेट तैयार करें। झिल्ली के लिए सब्सट्रेट जोड़ने के लिए एक p1000 micropipette का प्रयोग करें.
  8. केमियुमिनसेनेस पश्चिमी ब्लॉटिंग सब्सट्रेट में प्रत्येक झिल्ली को 5 मिनट के लिए विकसित करें। सब्सट्रेट से झिल्ली को हटा दें। एक नाजुक कार्य वाइपर का उपयोग कर अतिरिक्त सब्सट्रेट अवशोषित (सामग्री की तालिकादेखें).
  9. एक साफ चादर रक्षक एक कैसेट के अंदर करने के लिए टेप में झिल्ली प्लेस. एक अंधेरे कमरे में कैसेट ले लो और कैसेट में फिल्म की एक चादर जगह है. कैसेट को जगह में लॉक करें और 5-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिल्म को कैसेट से निकालें और इसे विकसित करें।

9. Coomasie धुंधला

  1. पश्चिमी जेल उपकरण को अलग करें। स्लाइस और स्टैकिंग जेल त्याग, हल जेल बरकरार छोड़ने. अल्ट्राप्यूरे पानी के 25 एमएल से भरी एक साफ ट्रे में रिपोलिंग जेल को धीरे से स्थानांतरित करें।
  2. 15 मिनट के लिए एक कमाल मंच पर जेल इनक्यूबेट करें, हल करने वाले जेल को तोड़ने से रोकने के लिए कोमल रॉकिंग का उपयोग करें। अल्ट्राप्योर पानी छोड़ें और धोने के चरण 2x अधिक दोहराएँ।
    नोट: यदि एसडीएस बुलबुले धोने के चरणों के बाद रहते हैं, जेल अल्ट्रापुरे पानी में रात भर धोया जा सकता है। अवशिष्ट एसडीएस जेल के उच्च पृष्ठभूमि धुंधला पैदा कर सकता है।
  3. बोतल को उलटकर Coomasie दाग अभिकर्मक मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। समाधान जेल को कवर करने के लिए Coomasi दाग अभिकर्मक के 100 एमएल प्लेस और 1 एच के लिए एक कमाल मंच पर जेल इनक्यूबेट. Coomasie दाग अभिकर्मक छोड़ें और 15 मिनट के लिए एक कमाल मंच पर deionized पानी में जेल धो लें।
  4. deionized पानी छोड़ दें. धोने कदम 2x अधिक दोहराएँ. प्रोटीन बैंड के वांछित संकल्प मनाया जाता है जब तक जेल धोने के लिए जारी रखें.

10. चांदी धुंधला

  1. पश्चिमी जेल उपकरण को अलग करें। स्लाइस और स्टैकिंग जेल त्याग, हल जेल बरकरार छोड़ने. अल्ट्राप्यूरे पानी के 25 एमएल से भरी एक साफ ट्रे में रिपोलिंग जेल को धीरे से स्थानांतरित करें।
  2. 15 मिनट के लिए एक कमाल मंच पर जेल इनक्यूबेट करें, हल करने वाले जेल को तोड़ने से रोकने के लिए कोमल रॉकिंग का उपयोग करें। अल्ट्राप्योर पानी छोड़ें और धोने के चरण 2x अधिक दोहराएँ।
    नोट: यदि एसडीएस बुलबुले धोने के चरणों के बाद रहते हैं, जेल अल्ट्रापुरे पानी में रात भर धोया जा सकता है। अवशिष्ट एसडीएस जेल के उच्च पृष्ठभूमि धुंधला पैदा कर सकता है।
  3. 30% इथेनॉल में जेल को ठीक करें:10% एसिटिक एसिड समाधान (6:3:1 पानी: इथेनॉल: एसिटिक एसिड) रात भर कमरे के तापमान पर। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक 10% इथेनॉल समाधान में जेल धो लें। इथेनॉल समाधान बदलें और एक और 5 मिनट के लिए धो लो.
  4. पियर्स रजत दाग किट से संवेदनशील समाधान तैयार 500 भागों ultrapure पानी के साथ एक हिस्सा चांदी के दाग sensitizer मिश्रण द्वारा (50 $L ultrapure पानी के 25 एमएल के साथ sensitizer के). 1 मिनट के लिए संवेदनशील कार्य समाधान में रिफोल्यूकलिंग जेल को इनक्यूबेट करें। 1 मिनट के लिए अल्ट्रापुरे पानी में जेल को धोएं, पानी की जगह लें, और जेल को 1 मिनट के लिए फिर से धो लें।
  5. 50 भागों चांदी के दाग के साथ एक हिस्सा चांदी के दाग बढ़ाने के मिश्रण से दाग काम कर समाधान तैयार (चांदी के दाग के 25 एमएल के साथ बढ़ाने के 500 $L). 30 मिनट के लिए दाग काम कर समाधान में जेल इनक्यूबेट करें।
  6. 50 भागों चांदी दाग डेवलपर (500 डेवलपर के 25 एमएल के साथ बढ़ाने के 500 जेडएल) के साथ 1 हिस्सा चांदी के दाग बढ़ाने के मिश्रण से डेवलपर काम समाधान तैयार करें। 5% एसिटिक अम्ल विलयन को विराम विलयन के रूप में निरूपित की जाइए। 1 मिनट के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ जेल धो लें, पानी की जगह, और एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए जेल धो लें।
  7. डेवलपर काम समाधान और incubate के साथ पानी की जगह जब तक वांछित प्रोटीन बैंड तीव्रता हल हो जाती है (5 मिनट). स्टॉप समाधान और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ डेवलपर कार्य समाधान को बदलें।

11. में जेल में कमी, alkylation, और Coomassi दाग जेल बैंड के पाचन

  1. एक साफ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर जेल से जेल बैंड कट. लगभग 5 मिमी क्यूब्स में प्रत्येक जेल बैंड कट और उन्हें एक साफ 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में जगह है।
  2. जेल के टुकड़ों को 1:1 एसीटोनिट्रिल में 100 एम एम अमोनियम बाइकार्बोनेट के साथ कवर करके रखें: 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पानी। सुपरनेंट को त्याग दें। इस चरण को दोहराएँ.
  3. एक वैक्यूम अपकेंद्रण में 5 मिनट के लिए जेल टुकड़े सूखी. सूखे जेल के टुकड़ों को 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट में 10 एमएम डाइथियोथ्रेटोल के साथ कवर करके प्रोटीन को कम करें और उन्हें 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. किसी भी supernatant बंद Pipette. पानी में 100 एमएम iodoacetamide के साथ जेल टुकड़े को कवर करके प्रोटीन Alkylate और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए उन्हें incubating.
  5. सुपरनेंट को पिपेट बंद करें और उन्हें एसीटोनिट्रिल के साथ कवर करके जेल के टुकड़ों को सिकोड़लें और उन्हें 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे से हिलाते हुए। सुपरनेंट को पिपेट से पिपेट करें और उन्हें 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट के साथ कवर करके जेल के टुकड़ों को फिर से भर दें और उन्हें हिलादें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धीरे.
  6. चरण 11.5 दोहराएँ. एक वैक्यूम अपकेंद्रण में 5 मिनट के लिए जेल टुकड़े सूखी.
  7. जेल के टुकड़ों को 100 एम एम अमोनियम बाइकार्बोनेट में 50 एनजी/जेडएल अनुक्रमण ग्रेड संशोधित ट्रिप्सिन (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कवर करें। जेल 5 मिनट के लिए प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति दें; तो, किसी भी शेष समाधान से pippette. जेल के टुकड़ों को 100 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट के साथ कवर करें और उन्हें पूरी तरह से फिर से शुरू करने की अनुमति दें, अतिरिक्त 100 एम एम अमोनियम बाइकार्बोनेट जोड़दें ताकि जेल के टुकड़े पूरी तरह से कवर किए जा सकें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर जेल टुकड़े इनक्यूबेट करें। पानी में 10% formic एसिड की मात्रा के 1/10 जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो. प्रत्येक ट्यूब से supernatant ले लीजिए.
  9. 60% एस्टोनिट्रिल में 1% फोरमिक एसिड के साथ उन्हें कवर करके जेल के टुकड़े निकालें और उन्हें कोमल मिलाते हुए 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट िंग करें।
  10. एक वैक्यूम अपकेंद्रण में 20 डिग्री सेल्सियस से कम संयुक्त supernatants की मात्रा को कम करें, जबकि पूरी तरह से supernatants सुखाने से बचने के लिए देखभाल कर रही है। कुल मात्रा को 20 डिग्री सेल्सियस तक वापस लाने के लिए 1% फोरमिक अम्ल जोड़ें।

12. तरल क्रोमैटोग्राफी /

नोट: नमूनों अल्ट्रा HPLC, एक नैनोस्प्रे स्रोत, और एक स्तंभ (सामग्री की तालिकादेखें) से लैस एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया. सॉल्वैंट्स ए और बी क्रमशः पानी और एसीटोनिट्रिल में 0.1% फोरमिक एसिड हैं।

  1. पचा प्रोटीन को उच्च वसूली पॉलीप्रोपीलीन ऑटो प्रतिदर्शक शीशियों में लोड करें। एक UPLC सिस्टम का नमूना प्रबंधक में शीशियों लोड करें।
  2. प्रत्येक नमूने के 6 $L इंजेक्शन. 99% विलायक A/1% विलायक B का उपयोग करते हुए, 1.5 मिनट पर 8 $L/min के लिए नैनोटाइल के ट्रैपिंग कॉलम पर प्रत्येक नमूने को लोड करें।
  3. एक रैखिक स्पेक्ट्रोमीटर में पेप्टाइड्स को 3% से 30 मिनट से अधिक विलायक बी के 35% तक, इसके बाद 4 मिनट से अधिक विलायक बी के 35% से 50% तक और विलायक बी के 90% से 90% तक 1 मिनट से अधिक बनाए रखें 90% एसीटोनिएटल के लिए 3 मिनट; तो %B वापस करने के लिए 3% से कम 5 मिनट से अधिक.
  4. रिज़ॉल्यूशन (20,000 रिज़ॉल्यूशन) मोड में धनात्मक आयन प्रोफ़ाइल द्रव्यमान डेटा प्राप्त करें. एक स्कैन की दर से 100 से 2,000 दा से डेटा प्राप्त करें हर 0.6 s. कोई टकराव ऊर्जा के साथ स्कैन बारी और ऊंचा टकराव ऊर्जा के साथ स्कैन द्वारा एमएसई मोड में डेटा प्राप्त करें।
  5. उन्नत टक्कर ऊर्जा के लिए, जाल सेल में टक्कर ऊर्जा को 15 ट से 40 ट तक बढ़ाएं, प्रत्येक 30 s को लॉक मास स्कैन करें, $Glu1के +2 आयन का उपयोग करते हुए [-फाइब्रिनोपेप्टाइड बी को लॉक द्रव्यमान के रूप में। समाधान एक के एक खाली इंजेक्शन का उपयोग कर एक डेटा फ़ाइल प्राप्त, carryover को नियंत्रित करने के लिए नमूनों की प्रत्येक जोड़ी के बीच एक ही अधिग्रहण विधि का उपयोग कर.

13. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए डेटा विश्लेषण

  1. एक मात्रात्मक और गुणात्मक proteomics अनुसंधान मंच (उदा., ProteinLynx ग्लोबल सर्वर) चल रहे कंप्यूटर के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणाम फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएँ। डेटा विश्लेषण उच्च CPU गहन है और एक अलग, उच्च प्रदर्शन डेटा विश्लेषण कंप्यूटर पर किया जाना चाहिए.
  2. डेटा के लिए कोई नया प्रोजेक्ट बनाएँ। ऑटोप्रतिदर्शी प्लेट का प्रतिनिधित्व करने वाली एक नई माइक्रोटिटर प्लेट बनाएं। नमूने autosampler में अपनी स्थिति के रूप में microtiter प्लेट में एक ही स्थिति के लिए असाइन करें.
  3. प्रत्येक नमूना संसाधन पैरामीटर असाइन करें। का उपयोग करने के लिए पैरामीटर स्वत: क्रोमैटोग्राफी पीक चौड़ाई और MSTOF संकल्प कर रहे हैं; कम ऊर्जा सीमा, 100 मायने रखता है; ऊंचा ऊर्जा सीमा, 5 मायने रखता है; तीव्रता सीमा, 500 मायने रखता है.
  4. प्रत्येक नमूना वर्कफ़्लो पैरामीटर असाइन करें. का उपयोग करने के लिए पैरामीटर डेटाबेस, concatenated मानव SwissProt और एचआईवी, उलट दृश्यों के साथ कर रहे हैं; स्वत: पेप्टाइड और टुकड़ा सहिष्णुता; न्यूनतम टुकड़ा आयन पेप्टाइड, 3 प्रति मैच; मिन टुकड़ा आयन प्रोटीन प्रति मैच, 7; मिन पेप्टाइड प्रोटीन प्रति मैच, 1; प्राथमिक डाइजेस्ट अभिकर्मक, ट्रिप्सिन; चूक दरारें, 1; नियत आपरिवर्तक अभिकर्मकों, कार्बामिडल सी; चर आपरिवर्तक अभिकर्मकों, ऑक्सीकरण एम; झूठी खोज दर, 100.
  5. नमूनों का चयन करें और प्रक्रिया नवीनतम कच्चे डेटाका चयन करें। खोज पूरी होने पर, नमूने चुनें और Scaffold (संस्करण 3) में डेटा निर्यात करें चुनें. Scaffoldखोलें, एक नई फ़ाइल बनाने के लिए, और एक नया biosample अग्रदूत आयन परिमाणकायन का उपयोग कर के रूप में proteomics मंच से निर्यात प्रत्येक फ़ाइल आयात.
  6. सभी फ़ाइलें आयात किया गया है, जब लोड करने के लिए आगे बढ़ें और डेटा स्क्रीन का विश्लेषण करें। LFDR स्कोरिंग और मानक प्रयोग-व्यापी प्रोटीन समूहीकरण का उपयोग करके खोज और आयात डेटा के लिए उपयोग किए जाने वाले समान डेटाबेस का चयन करें. प्रोटीन पहचान संभावनाके लिए प्रदर्शन विकल्प सेट करें, प्रोटीन सीमा 20% करने के लिए, पेप्टाइड्स की न्यूनतम संख्या 1 करने के लिए, और पेप्टाइड सीमा करने के लिए 0% विश्लेषण के दौरान.

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Representative Results

Rev-NoLS एकल- और एकाधिक बिंदु arginine उत्परिवर्तनों, subcellular स्थानीयकरण पैटर्न की एक किस्म के लिए इसी, WT Rev. WT Rev-3'flag और pcDNA-flag की तुलना में सेलुलर मेजबान कारकों के साथ बातचीत करने की क्षमता में जांच की गई एचएलबी संस्कृति में वेक्टर व्यक्त किए गए थे। प्रोटीन परिसरों कुल सेल lysate से संसाधित और चांदी के दाग अभिकर्मक के साथ दाग थे. Rev-NoLS-3'flag तीन अलग-अलग lysis बफर स्थितियों में पता लगाने योग्य है NaCl के विभिन्न सांद्रता युक्त (137 m, 200 m, और 300 m) चित्र 1में. B23 कम नमक एकाग्रता युक्त lysis बफर में (37 केडीए) का पता लगाने योग्य था (137 एमएम, गलियों 2-4), मुश्किल से 200 एमएम NaCl युक्त lysis बफर में पता लगाने योग्य, और एक उच्च नमक एकाग्रता युक्त lysis बफर में undetectable (300 mM NaCl). चित्रा 2में, WT Rev-3'flag, Rev-NoLS M1-3'flag, और pcDNA-flag वेक्टर HLfB संस्कृति में व्यक्त किए गए थे। प्रोटीन परिसरों को दो lysis बफर स्थितियों (137 m और 200 m NaCl) से तैयार कुल सेल lysates से संसाधित किया गया. M2 माउस monoclonal आईजीजी1 सेल lysates से रेव-3'फ्लैग अभिव्यक्ति का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया था. B23 का पता लगाने WT Rev-3'flag के साथ 137 एम एम NaCl युक्त lysis बफर में इष्टतम था (इनपुट और जेड-फ्लैग-रेव आईपी) लेकिन रेव-NoLS M1-3'flag के साथ संबंध खो दिया है। WT Rev-3'flag के साथ B23 आत्मीयता 200 m NaCl युक्त lysis बफर में एक उच्च नमक एकाग्रता के साथ कमी आई. pcDNA नकारात्मक नियंत्रण इनपुट में गैर विशिष्ट इम्यूनोडिटेक्शन और सभी lysis बफर शर्तों के जेड-फ्लैग-रेव आईपी उपज नहीं था।

Elution शर्तों चित्र 3में Rev-NoLS-3'flag आईपी के लिए अनुकूलित किया गया था। WT Rev-3'flag और pcDNA-फ्लैग वेक्टर HLfB संस्कृति में व्यक्त किए गए थे. प्रोटीन परिसरों कुल सेल lysates से संसाधित किया गया और तीन अलग अलग शर्तों का उपयोग कर प्रकाश और भारी श्रृंखला पृष्ठभूमि (25 और 50 केडीए) उन्मूलन के लिए eluted - 2x नमूना 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर लोड हो रहा है, 2x नमूना 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बफर लोड हो रहा है, और 3x flag peptid ई पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 मिनट. रेव NoLS-3'flag ($18 kDa) 2x नमूना लोडिंग बफर में उबलते के माध्यम से elution के बाद सबसे पता लगाने योग्य था. बी 23 (जेड 37 केडीए) दो शर्तों के तहत पता लगाया गया था - 2x नमूना लोडिंग बफर में 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन 15 मिनट के लिए और 2x नमूना लोडिंग बफर में 95 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन 3 मिनट के लिए।

M2 (स्थानीयकरण में परमाणु/न्यूक्लिओलर, एचआईवी-1HXB2 उत्पादन में nonfunctional), M6 (पैटर्न में न्यूक्लिओलर, एचआईवी-1HXB2 उत्पादन में कार्यात्मक), और M9 (साइटोप्लाज्म में फैला / HLfB संस्कृति में व्यक्त की. प्रोटीन परिसरों कुल सेल lysate से संसाधित किया गया, 2x नमूना 3 मिनट के लिए बफर लोड िंग बफर में 95 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के माध्यम से eluted, और चांदी के दाग अभिकर्मक में हल (चित्र 4) . WT Rev आईपी झंडा प्रतिक्रिया के बाद पता लगाने योग्य था. Rev-NoLS M2, M6, और M9 भी 18 kDa पर पता लगाने योग्य थे. 37 केडीए मार्कर पर बी 23 प्रोटीन से संबंधित बैंड देखे गए। प्रोटीन परिसरों आगे WT रेव, M2, M6, M9, और pcDNA नकारात्मक पृष्ठभूमि नियंत्रण के आईपी प्रतिक्रियाओं के लिए इसी प्रत्येक लेन में मनाया गया. प्रोटीन lysates $-फ्लैग-रेव और B23 के लिए इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा विश्लेषण किया गया। प्रचुर मात्रा में WT Rev और M6 के मध्यम स्तर व्यक्त किए गए थे (जेड-फ्लैग इनपुट) और ध्वज आईपी के बाद पता लगाने योग्य (जेड-फ्लैग-रेव आईपी, चित्र 5)। M2 और M9 अत्यधिक प्रोटीन lysate इनपुट के 20 डिग्री ग्राम से व्यक्त नहीं किया गया, लेकिन से ध्वज आईपी के बाद कम तीव्रता पर पता लगाने योग्य 5 प्रोटीन lysate की मिलीग्राम. pcDNA नकारात्मक नियंत्रण इनपुट में गैर विशिष्ट इम्यूनोडिटेक्शन और जेड-फ्लैग-रेव आईपी उपज नहीं था। WT Rev के साथ B23 संबंध आईपी झंडा प्रतिक्रिया (B23 सह आईपी) के बाद मनाया गया था. B23 आत्मीयता थोड़ा M2 के साथ मनाया गया था (दो एकल बिंदु उत्परिवर्तन R48,50G) और M6 (एकल बिंदु उत्परिवर्तन R50G). B23 आत्मीयता M9 के तीन एकल बिंदु उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में खो गया था (R46,48,50G) Rev-NoLS के भीतर.

इम्यूनोप्रिसिपेटेड डब्ल्यूटी रेव और रेव-नोल्स-3'फ्लैग उत्परिवर्तनों (4, 5, 6, और 8) से कुल lysates संसाधित किए गए, Coomassi अभिकर्मक के साथ दाग, और बीएसए सीरियल कमजोर पड़ने (सही पैनल) की तुलना में कल्पना की। रेव-नोल्स-3'फ्लैग 18 केडीए में उत्परिवर्तनों की उपस्थिति और अनुपस्थिति में (12-5-25 ग्राम) का पता लगाने योग्य है(चित्र6)। प्रोटीन परिसरों WT Rev-3'flag के आईपी प्रतिक्रियाओं से संसाधित, न्यूक्लिओलर-स्थानीयकरण रेव-NoLS-3'flag उत्परिवर्तनों (M4, M5, और M6), और नकारात्मक नियंत्रणp DNA-फ्लैग एसडीएस-पेज जैल में कल्पना की गई Coomasie अभिकर्मक के साथ दाग (चित्र ास.). WT Rev (WT1 और WT2) 18 kDa पर आईपी झंडा प्रतिक्रिया के बाद पता लगाने योग्य था. Rev-NoLS उत्परिवर्तनों HLfB और आईपी झंडा प्रतिक्रिया में अभिव्यक्ति के बाद थोड़ा डिटेक्टेबल थे. pcDNA नकारात्मक नियंत्रण 18 kDa पर nonspecific पृष्ठभूमि उपज नहीं था.

WT Rev-3'flag, M2, M6, M9, और नकारात्मक नियंत्रण pcDNA-flag से तैयार इम्यूनोप्रिसिपेटेड lysates (चित्र 4में दिखाया गया) अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया। प्रोटीन पहचान प्रायिकता (प्रतिशत में) प्रत्येक न्यूक्लिओलर-स्थानीयकरण रेव-नोल्स उत्परिवर्तन बनाम WT Rev (तालिका 1) के साथ होने वाली प्रोटीन बातचीत की तुलना के लिए प्रदर्शित किया जाता है। सेलुलर प्रोटीन, जिनमें से कुछ स्थानीयकरण पैटर्न में न्यूक्लिओलर हैं (रिबोसोमल आइसोफॉर्म्स, यूकैरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 48, snoRNA C/D बॉक्स 58B, और न्यूक्लिओफोसमबी बी 23), डब्ल्यूटी रेव के प्रत्यक्ष/अप्रत्यक्ष बाध्यकारी भागीदारों के रूप में पहचाने गए थे। ये न्यूक्लिओलर कारकों M2 के लिए बाध्यकारी संबंध खो दिया (दो एकल बिंदु उत्परिवर्तन R48,50G), M6 (एकल बिंदु उत्परिवर्तन R50G), और M9 (तीन एकल बिंदु उत्परिवर्तन R46,48,50G), pcDNA नकारात्मक नियंत्रण के समान. चित्र 6 में Coomasie-सना हुआ जेल के प्रत्येक लेन अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए संसाधित किया गया था (तालिका 2). Rev-NoLS उत्परिवर्तनों के लिए पेप्टाइड आत्मीयता का विश्लेषण किया गया था और प्रोटीन पहचान संभावना का उपयोग कर प्रदर्शित (प्रतिशत में). विभिन्न प्रकार के सेलुलर प्रोटीन, जिनमें से कुछ स्थानीयकरण पैटर्न में न्यूक्लिओलर हैं (न्यूक्लिओलोजिन सी23, न्यूक्लिओफोसम बी 23, और न्यूक्लिओसोम असेंबली प्रोटीन), डब्ल्यूटी रेव के प्रत्यक्ष/अप्रत्यक्ष प्रोटीन बाध्यकारी कारकों के रूप में पहचाने गए थे। ये न्यूक्लिओलर कारक नहीं थे M4, M5, और M6 के साथ बाध्य करने के लिए पहचान की. परिवहन कारक ARHGEF1 (रो guanine न्यूक्लिओटाइड विनिमय कारक 1) और TBC1D24 (TCB1 डोमेन परिवार, सदस्य 24) रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों की उपस्थिति में आत्मीयता में खो गए थे. छिड़काव कारक एचएनआरएनपीसी (विषम राइबोन्यूक्लियर प्रोटीन सी) और पीएन (पिनिन, डेमोसोम-संबद्ध प्रोटीन) इसके अतिरिक्त डब्ल्यूटी रेव को बाध्य करने के लिए मनाया गया, जो रेव एकल बिंदु न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों के साथ बातचीत खो दिया।

Figure 1
चित्र 1 : एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान रेव-3'फ्लैग सह-आईपी के लिए सेल lysis शर्तों का अनुकूलन। WT Rev-NoLS-3'flag और नकारात्मक नियंत्रण pcDNA-फ्लैग आईपी शर्तों तीन अलग NaCl सांद्रता (137 एमएम, 200 एमएम, और 300 एम एम) lysis बफर में अनुकूलित किया गया. के रूप में चांदी धुंधला के माध्यम से मनाया, 137 m M NaCl Rev इम्यूनोसेरिप्शन और B23 बाइंडिंग के लिए इष्टतम नमक एकाग्रता था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान रेव-3'फ्लैग सह-आईपी और बी 23 इम्यूनोडिटेक्शन के लिए lysis शर्तों का अनुकूलन। WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag, और नकारात्मक नियंत्रण pcDNA-फ्लैग आईपी शर्तों lysis बफर में दो अलग NaCl सांद्रता (137 एमएम और 200 एम) में अनुकूलित किया गया. के रूप में इम्यूनोडिटेक्शन के माध्यम से मनाया, 137 m NaCl Rev इम्यूनोवेसेक्शन और B23 बाइंडिंग के लिए इष्टतम नमक एकाग्रता था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान रेव-3'फ्लैग सह-आईपी एल्यूशन का अनुकूलन, चांदी के दाग से कल्पना की। प्रोटीन परिसरों WT Rev-3'flag और pcDNA-flag आईपी के दौरान तैयार कुल सेल lysates से संसाधित किया गया. तीन अलग-अलग elution शर्तों का परीक्षण किया गया - 2x नमूना 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बफर लोड हो रहा है, 2x नमूना 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर बफर लोड हो रहा है, और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3x झंडा पेप्टाइड। WT Rev के इष्टतम elution शर्तों 2x नमूना लोडिंग बफर में 15 मिनट की अवधि के बाद हुई 37 डिग्री सेल्सियस पर और 2x नमूना लोडिंग बफर में 3 मिनट ऊष्मायन अवधि के बाद 95 डिग्री सेल्सियस. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान रेव-3'फ्लैग उत्परिवर्तनों 2, 6, और 9 की इम्यूनोरिडिओरिफ़ेशन। प्रोटीन परिसरों कि WT Rev, M2 (R48,50G), M6 (R50G), M9 (R46,48,50G) के साथ सीधे/अप्रत्यक्ष रूप से बाध्य है, और एचआईवी-1 प्रतिकृति की उपस्थिति में नकारात्मक नियंत्रण pdDNAझंडा एक चांदी से सना हुआ SDS-पेज जेल में दिखाए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान म्यूटेशन 2, 6, और बी 23 इम्यूनोडिटेक्शन के लिए 9 रेव-3'फ्लैग सह-आईपी। डब्ल्यूटी रेव, एम 2, एम 6, एम 9 और नकारात्मक नियंत्रण pcDNA-flag से तैयार प्रोटीन lysates और आईपी प्रतिक्रियाओं को आगे जेड-फ्लैग-रेव और B23 के लिए इम्यूनोडिटेक्शन द्वारा विश्लेषण किया गया। WT रेव और उत्परिवर्ती अभिव्यक्ति, साथ ही B23 न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक प्रोटीन के साथ बातचीत, मनाया जाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : ध्वज आईपी प्रतिक्रिया के बाद रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों 4, 5, 6, और 8 का परिमाण . एचएलबी से आईपी प्रतिक्रियाओं WT रेव और न्यूक्लिओलर-स्थानीयकरण M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (R50G), और नकारात्मक नियंत्रण pcDNA-फ्लैग व्यक्त बीएसए सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता के लिए मापा गया. प्रत्येक नमूने के लिए 12-5-25 ग्राम की प्रोटीन सांद्रता देखी गई। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 : एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान न्यूक्लिओलर-स्थानीयकरण रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों 4, 5, और 6 की इम्यूनोरिफ्लेशन। Coomasie-सना हुआ एसडीएस-पेज जेल जिसमें डब्ल्यूटी रेव (1 और 2), एम 4, एम 5, और एम 6 के इम्यूनोप्रिसिपेटेड प्रोटीन कॉम्प्लेक्स होते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पहचान प्रोटीन आण्विक वजन डब्ल्यूटी रेव एम 2 एम 6 एम 9
संकेत मान्यता कण 14kDa (समजात Alu आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन) 15 केडीए 95% 0 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन S3A 30 केडीए 95% 0 0 0
यूकैरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4B 69 केडीए 95% 0 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल31 14 केडीए 91% 0 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 12 18 के.डी.ए. 93% 0 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल22 15 केडीए 91% 0 0 0
लघु न्यूक्लिओलर आरएनए, सी/ 15 केडीए 87% 0 0 0
जस्ता उंगली, CCHC डोमेन युक्त 11 185 kDa 87% 0 0 0
actin बाध्यकारी LIM प्रोटीन 1 79 kDa 79% 0 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 13 17 केडीए 78% 0 0 0
न्यूक्लिओफोस्मिन (न्यूक्लिओलर फॉस्फोप्रोटीन बी 23, न्यूमाट्रिन) 33 के.डी.ए. 73% 0 0 0

तालिका 1: सेलुलर मेजबान कारकों है कि एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान WT रेव के साथ बातचीत की पहचान. WT Rev, M2, M6, और M9 से तैयार प्रोटीन eluates सीधे अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया. प्रोटीन बातचीत है कि सीधे / अप्रत्यक्ष रूप से WT Rev बनाम M2, M6, और M9 के लिए बाध्य कर रहे हैं प्रोटीन पहचान संभावना (प्रतिशत में) द्वारा संक्षेप कर रहे हैं.

पहचान प्रोटीन आण्विक वजन एम 4 एम 5 एम 6 Wt पी सी डी ए ए
बहु (ए) बंधन प्रोटीन, साइटोप्लाज्मिक 1 61 के.डी.ए. 98% 0 100% 100% 0
गर्मी सदमे 70kDa प्रोटीन 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 7 29 के.डी.ए. 91% 0 100% 100% 0
हिस्टोन क्लस्टर 1, H1e 22 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल13 24 के.डी.ए. 99% 0 100% 100% 0
पूरक घटक 1, ु उपघटक बंधन प्रोटीन 31 के.डी.ए. 100% 100% 100% 100% 0
Y बॉक्स बाइंडिंग प्रोटीन 1 36 केडीए 0 0 100% 100% 0
न्यूक्लिओसोम असेंबली प्रोटीन 1-like 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 8 28 के.डी.ए. 89% 36% 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 18 22 के.डी.ए. 27% 0 100% 100% 0
गर्मी सदमे 70kDa प्रोटीन 8 71 के.डी.ए. 5% 99% 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल19 23 के.डी.ए. 10% 0 81% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल27 16 केडीए 92% 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल7ए 30 केडीए 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल24 18 के.डी.ए. 0 0 100% 99% 0
ट्यूबुलिन, बीटा वर्ग I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 6 33 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
गर्मी सदमे 70kDa प्रोटीन 9 (मॉर्रिन) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 2 31 के.डी.ए. 87% 0 100% 100% 0
केसिन काइनेस 2, अल्फा 1 पॉलीपेप्टाइड 45 kDa 0 0 50% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल14 23 के.डी.ए. 0 0 81% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन, बड़े, पी 0 34 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
हिस्टोन क्लस्टर 1, एच 1 बी 23 के.डी.ए. 0 0 73% 100% 0
गर्मी सदमे 70kDa प्रोटीन 5 (ग्लूकोज विनियमित प्रोटीन) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 4, एक्स-लिंक्ड 30 केडीए 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 20 13 केडीए 98% 94% 99% 99% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 28 16 केडीए 0 0 100% 99% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 14 16 केडीए 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन S3A 30 केडीए 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल21 19 केडीए 0 0 100% 100% 0
जस्ता उंगली CCCH प्रकार, एंटीवायरल 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
हिस्टोन क्लस्टर 1, एच 1 सी 21 के.डी.ए. 0 0 0 98% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल36 12 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 18 18 के.डी.ए. 90% 0 100% 100% 0
एपोटोसिस 1 न्यूनाधिक 40 के.डी.ए. 42% 88% 34% 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल17 21 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस26 13 केडीए 91% 0 99% 98% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल32 18 के.डी.ए. 0 0 48% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल35 15 केडीए 0 0 97% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल29 18 के.डी.ए. 0 0 57% 94% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 9 23 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
विषमांगी नाभिकीय राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन एच 1 (एच) 51 के.डी.ए. 98% 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन S8 22 के.डी.ए. 0 0 78% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल10 25 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल23ए 18 के.डी.ए. 0 0 68% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन S6 29 के.डी.ए. 0 0 100% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल31 14 केडीए 0 0 95% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 13 17 केडीए 0 0 100% 99% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल10ए 25 के.डी.ए. 45% 0 81% 100% 0
पॉली (ए) बाइंडिंग प्रोटीन, साइटोप्लाज्मिक 4 (अनिवार्य रूप) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
transmembrane emp24 प्रोटीन परिवहन डोमेन युक्त 1 25 के.डी.ए. 0 0 0 100% 0
EBNA1 बाध्यकारी प्रोटीन 2 35 के.डी.ए. 0 0 69% 100% 0
संरक्षित हेलिक्स-लूप-हेलिक्स सर्वव्यापी काइनेस 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 12 18 के.डी.ए. 0 0 57% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस24 15 केडीए 0 0 100% 100% 0
अतप् त प्रघात डोमेन प्रोटीन ए 40 के.डी.ए. 0 0 0 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल27ए 17 केडीए 0 0 89% 99% 0
विषमांगी नाभिकीय राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन एफ 46 केडीए 0 0 99% 99% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल11 20 के.डी.ए. 0 0 99% 100% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल26 की तरह 1 17 केडीए 0 0 100% 100% 0
केसीन काइनेस 2, अल्फा प्राइम पॉलीपेप्टाइड 41 के.डी.ए. 0 0 0 100% 0
ट्यूबुलिन, अल्फा 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 3 46 केडीए 0 0 86% 94% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल15 33 के.डी.ए. 0 0 100% 99% 0
न्यूक्लिओलिन 77 kDa 0 0 25% 100% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस 21 11 के.डी.ए. 0 0 93% 94% 0
KRR1, छोटे subunit (SSU) processome घटक, homolog (यापूर्व) 44 के.डी.ए. 89% 0 76% 99% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस7 28 के.डी.ए. 0 0 0 100% 0
क्लोराइड चैनल, न्यूक्लिओटाइड-संवेदी, 1A 22 के.डी.ए. 0 0 97% 86% 0
साइक्लिन बी 3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
ग्वानीन्यूटोलाइड बंधन प्रोटीन की तरह 3 (न्यूक्लिओलर) 61 के.डी.ए. 0 0 99% 98% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस23 22 के.डी.ए. 0 0 100% 50% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस 22 41 के.डी.ए. 0 0 0 99% 0
न्यूक्लिओफोस्मिन (न्यूक्लिओलर फॉस्फोप्रोटीन बी 23, न्यूमाट्रिन) 33 के.डी.ए. 0 0 52% 97% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 19 16 केडीए 0 0 0 99% 0
ग्लिसरऐल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजेनेज 36 केडीए 0 0 100% 0 0
हिस्टोन क्लस्टर 1, एच 2 बीज 14 केडीए 0 0 53% 72% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस23 16 केडीए 0 0 68% 0 0
रो ग्वानीन्यू न्यूक्लिओटाइड विनिमय कारक (जीईएफ) 1 104 केडीए 0 0 0 94% 0
मृत्यु संबद्ध प्रोटीन 3 46 केडीए 0 0 87% 87% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन S6 14 केडीए 0 0 52% 84% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल39 6 केडीए 0 0 0 87% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस 28 21 के.डी.ए. 0 0 85% 99% 0
हिस्टोन क्लस्टर 1, एच 4 एच 11 के.डी.ए. 0 0 0 93% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल43 23 के.डी.ए. 0 0 0 97% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 15 17 केडीए 0 0 0 85% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 12 15 केडीए 0 0 68% 39% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल35ए 13 केडीए 0 0 0 96% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस 14 15 केडीए 0 0 45% 76% 0
फॉस्फोडाइस्टेरेस 5ए, सीजीएमपी-विशिष्ट 95 kDa 14% 0 0 72% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 15 24 के.डी.ए. 0 0 0 56% 0
विषमांगी नाभिकीय राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन सी (सी 1/ 22 के.डी.ए. 0 0 0 100% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस 16 11 के.डी.ए. 0 0 0 92% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 15ए 15 केडीए 0 0 0 91% 0
न्यूरेक्सिन 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
आत्मकेंद्रित प्रवृत् ति उम्मीदवार 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल17 20 के.डी.ए. 0 0 0 92% 0
splicing कारक 3a, subunit 1, 120kDa 89 kDa 0 0 56% 89% 0
ला राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन डोमेन परिवार, सदस्य 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
लेप्रकन की तरह 2 62 के.डी.ए. 0 0 0 68% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल18ए 21 के.डी.ए. 0 0 0 86% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल23 15 केडीए 0 0 60% 47% 0
transmembrane emp24 प्रोटीन परिवहन डोमेन युक्त 9 27 केडीए 0 0 0 78% 0
संकेत अभिज्ञान कण 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
लैक्टिन, गैलेक्टोसाइड-बंधन, घुलनशील, 3 26 केडीए 0 71% 28% 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल 1 37 के.डी.ए. 0 0 0 69% 0
H1 histone परिवार, सदस्य एक्स 22 के.डी.ए. 0 0 0 96% 0
केसीन काइनेस 2, बीटा पॉलीपेप्टाइड 25 के.डी.ए. 0 0 0 89% 0
विलेय वाहक परिवार 4, सोडियम बाइकार्बोनेट कोट्रांसपोर्टर, सदस्य 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
WD दोहराएँ डोमेन 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
प्रतिलेखन दीर्घीकरण कारक A (SII), 3 17 केडीए 0 0 0 38% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एस 16 16 केडीए 0 0 75% 0 0
SP140 परमाणु शरीर प्रोटीन 92 kDa 0 0 0 64% 0
ओटोफेरलिन 227 kDa 62% 0 0 0 0
Golgi परिवहन 1B 15 केडीए 0 0 0 33% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस34 26 केडीए 0 0 0 33% 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल 30 13 केडीए 0 0 0 49% 0
actin बाध्यकारी LIM प्रोटीन 1 96 केडीए 0 0 0 43% 0
ग्वानीन्यूटोलाइड बंधन प्रोटीन की तरह 2 (न्यूक्लिओलर) 84 केडीए 40% 0 0 0 0
उच्च घनत्व लिपोप्रोटीन बंधन प्रोटीन 141 kDa 0 0 34% 0 0
एडेनोसाइन डिएमिनेस, आरएनए-विशिष्ट, बी 2 81 के.डी.ए. 0 0 28% 0 0
सिस्टाटिन ई/ 17 केडीए 0 27% 0 0 0
जस्ता उंगली प्रोटीन 786 80 kDa 0 0 23% 0 0
pleckstrin homology की तरह डोमेन, परिवार बी, सदस्य 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
प्रोटीन फॉस्फेटेज मेथिलेस्टेरेस 1 44 के.डी.ए. 0 0 94% 0 0
जेनस काइनेस और माइक्रोट्युबल इंटरैक्टिंग प्रोटीन 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
संकेत अभिज्ञान कण 68kDa 67 केडीए 0 0 0 93% 0
TBC1 डोमेन परिवार, सदस्य 24 63 के.डी.ए. 0 0 0 89% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल27 16 केडीए 0 0 0 89% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल 2 24 के.डी.ए. 0 0 0 88% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस 2 33 के.डी.ए. 0 0 0 87% 0
पेंट्रीकोपेप्टाइड दोहराने डोमेन 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
राइबोसोमल प्रोटीन, बड़े, पी 2 12 के.डी.ए. 0 0 0 76% 0
IMP (इनोसिन 5'-मोनोफॉस्फेट) डिहाइड्रोजेनेज 2 56 केडीए 0 0 76% 0 0
ट्यूबलिन, बीटा 4B वर्ग IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल23 19 केडीए 0 0 0 74% 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस31 45 kDa 0 0 0 74% 0
गैलैक्टोज-3-ओ-सल्फोट्रांसफरेस 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
वेरीगेशन का दमन 4-20 होमोलॉग 1 (ड्रोसोफिला) 99 kDa 0 72% 0 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस25 20 के.डी.ए. 0 0 0 70% 0
राइबोसोमल L1 डोमेन जिसमें 1 55 kDa 0 0 0 70% 0
अनुक्रम समानता 110 के साथ परिवार, सदस्य डी 29 के.डी.ए. 69% 0 0 0 0
राइबोसोमल प्रोटीन एल36ए-जैसे 12 के.डी.ए. 0 0 0 66% 0
सेरेबेलिन 4 अग्रदूत 22 के.डी.ए. 0 0 0 64% 0
एन-ऐसीटिलग्लूकोसामाइन-1-फॉस्फेट ट्रांसफरेस, अल्फा और बीटा सबयूनिट्स 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 होमोलॉग बी (एस सेरेविसी) 38 kDa 0 0 0 64% 0
प्रतिलेखन दीर्घीकरण नियामक 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
होमोबॉक्स ए 1 15 केडीए 0 0 0 62% 0
फॉस्फोलिपिड अंतरण प्रोटीन 49 kDa 0 0 0 62% 0
रो GTPase सक्रिय प्रोटीन 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस18बी 29 के.डी.ए. 0 0 0 52% 0
अंत:द्रव्यी जालिका एमिनोपेप्टिडेस 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
त्रिपक्षीय आकृति जिसमें 28 शामिल हैं 89 kDa 0 50% 0 0 0
अपरिपक्व बृहदान्त्र कार्सिनोमा प्रतिलिपि 1 24 के.डी.ए. 0 0 0 50% 0
पर अमीर इंटरैक्टिव डोमेन 1A (SWI की तरह) 242 kDa 0 0 49% 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एस17 15 केडीए 0 0 0 48% 0
पिनिन, डेस्मोसोम संबद्ध प्रोटीन 82 kDa 0 0 0 48% 0
प्रोटीन फॉस्फेटाज, Mg2+/Mn2 + निर्भर, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
जी पैच डोमेन और ankyrin दोहराता है 1 39 के.डी.ए. 45% 0 0 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल 3 39 के.डी.ए. 0 0 0 44% 0
नवोदित uninhibited द्वारा benzimidazoles 3 homolog (यास्ते) 37 के.डी.ए. 0 44% 0 0 0
WD और टेट्राट्राइकोपप्टाइड दोहराता है 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
प्रोटीन disulfide isomerase परिवार ए, सदस्य 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
काजरीन, पेरिप्लिकिन इंटरैक्टिंग प्रोटीन 86 केडीए 0 41% 0 0 0
कुंडलीदार-कुंडली-हेलिक्स-कोइलेड-कुंडल-हेलिक्स डोमेन जिसमें 2 16 केडीए 0 0 40% 0 0
गर्मी सदमे प्रोटीन 90kDa अल्फा (cytosolic), वर्ग एक सदस्य 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा जी.टी.पासे नियामक 83 kDa 0 0 40% 0 0
सीटीडी (कार्बोक्सी-टर्मिनल डोमेन, आरएनए पॉलिमरेज II, पॉलीपेप्टाइड ए)
फॉस्फेटस, सबयूनिट 1		 104 केडीए 0 39% 0 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन एल37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2 की तरह 76 kDa 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) homolog, उपपरिवार सी, सदस्य 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
माइटोकोंड्रिल राइबोसोमल प्रोटीन L51 15 केडीए 0 0 0 38% 0
बाइस्टिन की तरह 50 kDa 0 0 0 38% 0
हंटिंगटिन-संबद्ध प्रोटीन 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
जस्ता उंगली प्रोटीन 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
सेल विभाजन चक्र और apoptosis नियामक 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
प्रोटीन टायरोसिन फॉस्फेटाज, गैर-रिसेप्टर प्रकार 13
(एपीओ-1/सीडी95 (फास)-संबद्ध फॉस्फेटस)		 256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-A डोमेन जिसमें 2 56 केडीए 0 0 0 31% 0
सक्रियीकरण संकेत cointegrator 1 जटिल subunit 2 28 के.डी.ए. 0 0 0 31% 0
सेन्ट्रोसोमल प्रोटीन 76kDa 74 kDa 0 30% 0 0 0
पॉलिमरेज (आरएनए) III (डीएनए निर्देशित) पॉलीपेप्टाइड सी (62kD) 61 के.डी.ए. 0 0 0 30% 0
5-हाइड्रॉक्सीट्राइप्टामाइन (सेरोटोनिन) रिसेप्टर 6 47 केडीए 0 0 0 29% 0
टी सेल रिसेप्टर अल्फा में शामिल होने 56 2 के.डी.ए. 0 26% 0 0 0
कोशिका विभाजन 1-जैसे गुणसूत्रों का द्विभिमुखता 330 kDa 0 0 0 25% 0
रास एसोसिएशन और डीआईएल डोमेन 114 के.डी.ए. 0 0 25% 0 0
WD दोहराएँ डोमेन 66 130 kDa 0 0 0 24% 0
गुणसूत्र 6 खुला पढ़ने फ्रेम 25 13 केडीए 0 0 22% 0 0
ट्रान्मेम्ब्रेन प्रोटीन 177 34 के.डी.ए. 0 0 0 21% 0
तंत्रिका पूर्वाधिकारी कोशिका व्यक्त की, विकास के नीचे विनियमित 4-like 101 kDa 0 20% 0 0 0

तालिका 2: एचआईवी-1 उत्पादन के दौरान न्यूक्लिओलर-स्थानीयकरण रेव उत्परिवर्तनों 4, 5, और 6 के साथ जटिल सेलुलर मेजबान कारकों की पहचान। चित्रा 6 में Coomasie-सना हुआ एसडीएस-पेज जेल अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए संसाधित किया गया था। WT Rev बनाम न्यूक्लिओलर उत्परिवर्तनों M4, M5, और M6 के प्रोटीन बातचीत परिणाम प्रोटीन पहचान संभावना (प्रतिशत में) द्वारा संक्षेप कर रहे हैं.

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Discussion

एचआईवी-1 की उपस्थिति में रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों और डब्ल्यूटी रेव की तुलना करने वाले मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण वायरल प्रतिकृति चक्र में शामिल न्यूक्लिओलर कारकों को समझने के लिए मूल्यांकन किए गए थे। यह वायरल संक्रमितता के लिए आवश्यक न्यूक्लिओलर घटकों की पहचान करेगा। न्यूक्लिओलर B23 Rev-NoLS के लिए एक उच्च संबंध है और रेव3 के न्यूक्लिओलर स्थानीयकरण में कार्य करता है और Rev-bound एचआईवी mRNAs22के न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक परिवहन . रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों के साथ B23 की समानता, जिसमें एक या एकाधिक arginine प्रतिस्थापन शामिल थे, वायरल उत्पादन के दौरान रेव-3'फ्लैग की इम्यूनोप्रीफ्ट के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था (चित्र 2; WT और उत्परिवर्तनM2, M6, और M9). एकल बिंदु रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों M4, M5, और M6 के लिए B23 आत्मीयता पहले एचआईवी-1 प्रतिकृति की उपस्थिति में जांच की गई. पिछले अध्ययन में, M4, M5, और M6 के आईपी eluates एक एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी इम्यूनोब्लोटिंग के अधीन थे Rev और B23 आत्मीयता1के लिए $-फ्लैग के लिए विशिष्ट . रेव एकल बिंदु उत्परिवर्तनों की पृष्ठभूमि में, B23 बाध्यकारी संबंध काफी कम हो गया था. B23 एचआईवी प्रतिकृति के दौरान WT रेव के साथ संबंध बनाए रखा. रेव-नोल्स के भीतर प्रेरित एकल-बिंदु उत्परिवर्तनों से एचआईवी एमआरएनए बाध्यकारी और परिवहन को सुविधाजनक बनाने वाले अन्य सेलुलर मेजबान कारकों के लिए बाध्यकारी संबंध को कम करने की उम्मीद की गई थी। Rev-NoLS एकल और इस मॉडल में बहु बिंदु उत्परिवर्तनों Rev करने के लिए न्यूक्लिओमोस्मिन B23 आत्मीयता समाप्त कर दिया, न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक बंद करने और एचआईवी MRNA परिवहन में एक व्यवधान का संकेत. यह संभावना है कि न्यूक्लिओलर कारक (न्यूक्लिओलोलिन C23 और न्यूक्लिओसोम विधानसभा प्रोटीन 1), परिवहन कारक (ARHGEF1 और TCB1D24), और splicing कारक (hnRNPC और PNN) रेव प्रोटीन परिसरों के साथ बातचीत के माध्यम से एचआईवी-1 संक्रामक चक्र में शामिल हैं. तालिका 1 और तालिका 2 विभिन्न अन्य सेलुलर कारकों को प्रकट करते हैं, पैटर्न में न्यूक्लिओलर और nonnucleolar दोनों, कि संभावित Rev के माध्यम से एचआईवी-1 प्रतिकृति चक्र में शामिल हैं. न्यूक्लिओलर कारक - snoRNA C/D बॉक्स 58, snoRNA में फंसाया प्रसंस्करण, न्यूक्लिओलस के लिए snoRNA परिवहन, और 2'-ओ-मेथिलेशन रिबोसोमल आरएनए के - अभी तक एचआईवी-1 प्रतिकृति चक्र में इस प्रोटीन के समारोह अज्ञात रहता है की पहचान की थी। एचआईवी-1 संक्रामक चक्र में इन सेलुलर कारकों की विशिष्ट भूमिकाओं की वर्तमान में जांच की जा रही है।

यहाँ प्रस्तुत परिणाम वायरल / मेजबान न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान के लिए इस दृष्टिकोण के उपयोग को प्रदर्शित करता है जो एचआईवी-1 संक्रामक चक्र को बनाए रखते हैं। वायरल/ मेजबान न्यूक्लिओलर कारक जो अन्य रोग मॉडलों में भाग लेते हैं, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके पहचाने जा सकते हैं। यह आगे की संभावना है कि एक न्यूक्लिओलर कारक विभिन्न रोग मॉडलों में बहुआयामी भूमिकाओं को शामिल कर सकता है। उदाहरण के लिए, B23 अन्य वायरल संक्रामक मॉडल में न्यूक्लिओलर वायरल प्रोटीन, वायरल विधानसभा, encapsidation, प्रतिकृति, और विलंबता के परिवहन में फंसाया गया है. B23 न्यूक्लिओसाइटोप्लाज्मिक परिवहन के लिए सेलुलर कारकों के NoLS के साथ बातचीत में विशेषता है - p120 वृद्धि कारक (एमिनो एसिड 40-57)23 और C23 पूर्व RRNA प्रोसेसर (एमिनो एसिड 540-628)24. B23 भी मानव टी सेल लिम्फोट्रोपिक वायरस के साथ बातचीत करने के लिए प्रलेखित है (HTLV-1) प्रोटीन रेक्स (एमिनो एसिड 1-22)25, एचआईवी-1 टाट (एमिनो एसिड 49-57)2, और एचआईवी-1 रेव (एमिनो एसिड 37-47)26. जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस (जेईवी) जीनोम एक न्यूक्लिओलर-स्थानीयकरण कोर प्रोटीन को एन्कोड करता है, जिसके माध्यम से एमिनो एसिड ग्ली42 और प्रो43 जेईवी संक्रमण के दौरान बी 23 के एन-टर्मिनल क्षेत्र के साथ बातचीत करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वायरल कोर प्रोटीन/बी 23 में परिवहन होता है। नाभिक27| हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) का एकल-स्लेडेड आरएनए जीनोम आंशिक रूप से डबल-स्लैड डीएनए से बना है, जो न्यूक्लिओलर कोर प्रोटीन को एन्कोड करता है। एचबीवी कोर प्रोटीन न्यूक्लिओलोलस28में न्यूक्लिओलोलिन और बी 23 से संबद्ध है; B23 एचबीवी विधानसभा में कोर प्रोटीन एन-टर्मिनल डोमेन के साथ बातचीत के माध्यम से प्रदर्शन किया गया था. विशेष रूप से, B23 एमिनो एसिड 259-294 एचबीवी कोर प्रोटीन के एन-टर्मिनल डोमेन के लिए बाध्य वायरल encapsidation29की अनुमति देने के लिए. नकारात्मक भावना, एकल फैला आरएनए हेपेटाइटिस डी वायरस (HDV) दो आइसोफॉर्म्स में HDVAg प्रतिजन व्यक्त करता है; आरएनए प्रतिकृति में छोटे समरूप एड्स, और बड़े आइसोफॉर्म वायरल असेंबली की सुविधा प्रदान करता है। आरएनए प्रतिकृति न्यूक्लिओलस के भीतर होती है और इसके लिए एचडीवीएजी30,31के साथ बी 23 अन्योन्यक्रिया की आवश्यकता होती है । HDV संक्रमण B23 के एक upregulation का कारण बनता है, जो ज्यादातर छोटे HDVAg आइसोफॉर्म और बड़े HDVAg आइसोफॉर्म के साथ कम के साथ सूचना का आदान-पास. बातचीत छोटे HDVAg NLS डोमेन के माध्यम से जगह ले, जिसके माध्यम से B23 बांधता है और परमाणु संचय प्राप्त करता है. B23 करने के लिए HDV बाइंडिंग साइट को हटाने पर, आरएनए प्रतिकृति बिगड़ा हुआ था। HDVAg को न्यूक्लिओलस में बी 23 और न्यूक्लिओलिन के साथ सहस्थानी दिखाया गया था। नाभिक एक दमनकारी32के रूप में ट्रांसक्रिप्शनल गुणों के अधिकारी की खोज की थी, HDV प्रतिकृति के विनियमन के लिए एक डिब्बे के रूप में नाभिक खुलासा. B23 भी Kaposi सार्कोमा से जुड़े दाद वायरस (KSHV) जीनोम की विलंबता में शामिल है. KSHV गुप्त प्रोटीन - v-cyclin - मेजबान CDK6 kinase के साथ, फोस्फोरीलेट्स B23 Thr199 पर, विलंबता संबद्ध परमाणु प्रतिजन33के साथ B23 बातचीत की सुविधा. विलंबता संबद्ध परमाणु प्रतिजन वायरल lytic प्रतिकृति को रोकने के लिए कार्य करता है. B23 की कमी KSHV पुनः सक्रियण की ओर जाता है, KSHV विलंबता के एक नियामक के रूप में B23 खुलासा. एचआईवी-1 प्रतिकृति चक्र में B23 समारोह Tat और Rev के न्यूक्लियोसाइटोप्लाज्मिक परिवहन गतिविधि में विशेषता है, और यह अज्ञात है अगर B23 एचआईवी संक्रमण के दौरान विलंबता पैदा कर सकते हैं. प्रतिकृति, encapsidation, और एचआईवी-1 की विधानसभा में B23 की भागीदारी वर्तमान में अज्ञात है.

अन्य रोग मॉडलों के लिए इस विधि के अनुकूलन के लिए उचित सेल लाइनों में व्यक्त प्रोटीन की कमी संक्रामक रीढ़ की पीढ़ी के लिए बहुत प्रयास और समय की आवश्यकता होगी। इस रेव की कमी एचआईवी-1HXB2 रीढ़ की हड्डी का लाभ पूर्ण वायरल रीढ़ की उपस्थिति में रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों की जांच करने की क्षमता है, वायरल संक्रामक कारकों, और एचआईवी-1 प्रतिकृति चक्र में शामिल मेजबान कारकों. अन्य अध्ययनों से पूर्ण एचआईवी-1 संक्रामक प्रणाली के अभाव में रेव न्यूक्लिओलर समारोह की जांच की है। संक्रामक और रोग रास्ते की पूरी विशेषता प्रतिनिधि वातावरण है कि रोग प्रगति के प्राकृतिक पाठ्यक्रम का समर्थन शामिल करना चाहिए. दो विभिन्न प्रकार के विश्लेषण किए गए और न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान करने की क्षमता की तुलना में। तालिका 1 उन कारकों को सूचीबद्ध करता है जो प्रोटीन के प्रत्यक्ष द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के परिणामस्वरूप WT Rev से बंधे हुए थे। इस विश्लेषण से एचआईवी-1 रेव के कई ज्ञात कारक मिले। इस प्रत्यक्ष विधि की तुलना एसडीएस-पेज जैल के भीतर अलग प्रोटीन की निकासी और ऐसे प्रोटीन के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से संबंधित एक अन्य प्रक्रिया से की गई थी। यह दूसरी विधि ज्ञात और संभावित कारकों है कि रेव प्रोटीन परिसर के लिए बाध्य कर रहे हैं की एक किस्म है, लेकिन निम्नलिखित प्रोटीन पहले तालिका 1में पहचान की कमी प्राप्त: संकेत मान्यता कण 14 kDa, यूकैरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक 4B, राइबोसोमल प्रोटीन L22, छोटे न्यूक्लिओलर आरएनए C/D बॉक्स 58B, और जस्ता उंगली CCHC डोमेन जिसमें 11. अंत में, इस प्रोटोकॉल में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए चुना बेहतर विधि एसडीएस-पेज जैल से पेप्टाइड्स की निकासी शामिल. पहली प्रत्यक्ष विधि ब्रोमोफेनोल नीले बिना eluate में 2x नमूना बफर शामिल; 2x नमूना बफर के शेष घटकों पूरा trypsin उपचार के साथ हस्तक्षेप कर सकता है और सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए अपूर्ण संसाधित पेप्टाइड्स उपज सकता है. दूसरी अप्रत्यक्ष विधि एसडीएस-पेज के संभावित contaminants से trypsin इलाज पेप्टाइड्स को शुद्ध करने में सक्षम था.

यहाँ वर्णित मास स्पेक्ट्रोमेट्री तैयारी विधियों को लक्षित Rev. सभी विलोपन और एकल बिंदु Rev-NoLS उत्परिवर्तनों के लिए जांच की जा सकती है के माध्यम से एचआईवी-1 संक्रमण के उन्मूलन के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप की पहचान के लिए उपयोग किया जा सकता है प्रमुख नकारात्मक गतिविधि और रेव समारोह की गिरफ्तारी में उपयोग किया. Rev कार्यात्मक गिरफ्तारी के लिए ब्याज की प्रमुख नकारात्मक विशेषताओं निम्नलिखित हैं: Rev/RRE बाध्यकारी समानता; रेव म्यूटेंट के साथ multimerization के माध्यम से न्यूक्लिओलर WT रेव के relocalization; एचआईवी-1 MRNA परिवहन और splicing में शामिल प्रमुख सेलुलर कारकों के लिए आत्मीयता में हानि. डब्ल्यूटी रेव के साथ रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों के सह-अभिव्यक्ति को शामिल करते हुए रेव मल्टीमराइजेशन की जांच की जा सकती है। इस मॉडल में प्रमुख नकारात्मक उत्परिवर्तनों WT रेव के साथ multimerize और नाभिक और कोशिका द्रव्य की ओर नाभिक पैटर्न बदलाव की उम्मीद कर रहे हैं, एक रेव कार्यात्मक गिरफ्तारी के लिए अग्रणी. मास स्पेक्ट्रोमेट्री एचआईवी-1 MRNA splicing और परिवहन में शामिल प्रमुख सेलुलर कारकों के नुकसान की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रमुख-नकारात्मक रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों के साथ सहअभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप डब्ल्यूटी रेव के साथ लापता बातचीत की पहचान एचआईवी-1 रोगजनन में न्यूक्लिओलर-विशिष्ट रास्ते की भागीदारी का खुलासा करेगी। वैकल्पिक रूप से, रेव-नोल्स उत्परिवर्तनों की पृष्ठभूमि में उत्पन्न वायरल एचआईवी-1NL4-3 कणों की सभी पैक सेलुलर कारकों के लिए जांच की जा सकती है। वायरल कणों के भीतर पैक सेलुलर और वायरल कारकों आगे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पहचाना जा सकता है. यह वायरल कणों के भीतर न्यूक्लिओलर कारकों की उपस्थिति और वायरल संक्रमण में पहचान न्यूक्लिओलर कारकों की भूमिका को प्रकट करेगा। वर्णित तरीकों की पहचान और understudied रास्ते की विशेषता के लिए अन्य वायरल और रोग मॉडल के लिए लागू होते हैं. यह रोगों जिसके द्वारा सीमित उपचार उपलब्ध हैं के खिलाफ चिकित्सीय हस्तक्षेप के विकास की अनुमति होगी.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम, एड्स के प्रभाग, एलर्जी और संक्रामक संस्थान द्वारा प्रदान की HLfB अनुयायी संस्कृति के लिए डॉ बारबरा के Felber और डॉ जॉर्ज एन Pavlakis स्वीकार करते हैं रोग (एनआईएआईडी), एनआईएच। लेखक भी NIH, अनुदान AI042552 और AI029329 द्वारा प्रदान की वित्तीय स्रोतों को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 148 एचआईवी-1 प्रतिकृति rev इम्यूनोवेरिसेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री न्यूक्लिओलस B23
Rev इम्यूनोवेरिसेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से एचआईवी-1 प्रतिकृति के दौरान न्यूक्लिओलर कारकों की पहचान
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Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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