Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifikation af Nukleolarfaktorer under HIV-1-replikation gennem rev-Immunopræcipitation og massespektrometri

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59329
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 1, 1,2
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Summary

Her beskriver vi rev immun præcipitation i nærværelse af HIV-1 replikation for massespektrometri. De beskrevne metoder kan anvendes til identifikation af nukleolarfaktorer, der er involveret i HIV-1-infektions cyklussen, og gælder for andre sygdomsmodeller til karakterisering af under studerede veje.

Abstract

HIV-1 infektiøse cyklus kræver viral protein interaktioner med værts faktorer for at lette viral replikation, emballering, og frigivelse. Den smitsomme cyklus kræver yderligere dannelsen af virale/Host-protein komplekser med HIV-1-RNA for at regulere splejningen og muliggøre nukleocytoplasmisk transport. HIV-1 rev-proteinet opnår den nukleare eksport af HIV-1 mRNAs gennem multimerisering med intronic CIS-virkende mål-den rev respons element (rre). Et nucleolar lokaliserings signal (NoLS) findes inden for COOH-endestation af det rev arginin-rige motiv (ARM), der tillader akkumulering af rev/RRE komplekser i nucleolus. Nucleolar faktorer er spekuleret til at støtte HIV-1 infektiøse cyklus gennem forskellige andre funktioner ud over at mætte mRNA-uafhængig nuklear eksport og splicing. Vi beskriver en chromatinimmunpræcipitation metode af vild-type (WT) rev i sammenligning med rev nucleolar mutationer (sletning og enkelt-punkt rev-Nols mutationer) i nærværelse af HIV-1 replikation for massespektrometri. Nukleolar faktorer impliceret i nukleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 og nucleolin C23), samt cellulære splejsning faktorer, mister interaktion med rev i nærværelse af rev-Nols mutationer. Forskellige andre nukleolar faktorer, såsom snoRNA C/D box 58, er identificeret til at miste interaktion med rev mutationer, men deres funktion i HIV-1 replikation cyklus forbliver ukendt. Resultaterne præsenteres her demonstrere brugen af denne metode til identifikation af virale/Host nucleolar faktorer, der opretholder HIV-1 infektiøse cyklus. De begreber, der anvendes i denne fremgangsmåde, gælder for andre virale og sygdomsmodeller, som kræver karakterisering af under studerede veje.

Introduction

Nucleolus postuleres som samspillet jorden af forskellige cellulære vært og virale faktorer, der kræves for viral replikation. Nucleolus er en kompleks struktur inddelt i tre forskellige rum: fibrillar-rummet, det tætte fibrillar-rum og det granulære rum. HIV-1 rev-proteinet lokaliserer specifikt i granulære rum; årsagen til dette lokaliserings mønster er dog ukendt. Ved tilstedeværelse af enkeltpunkts-mutationer inden for NoLS-sekvensen (rev-mutationer 4, 5 og 6) opretholder rev et nukleolært mønster og har tidligere vist sig at redde HIV-1HXB2 -replikation, dog med nedsat effektivitet sammenlignet med WT rev1 . Alle enkeltpunkts-mutationer kan ikke opretholde HIV-1NL4-3- infektions cyklussen. I nærværelse af flere enkeltpunkts-mutationer inden for NoLS-sekvensen (rev-NoLS-mutationer 2 og 9) er rev blevet observeret for at sprede hele kernen og cytoplasmaet og har ikke været i stand til at redde HIV-1HXB2 Replication1. Målet med denne proteomics undersøgelse er at dechifrere nucleolar samt nonnucleolar cellulære faktorer involveret i den rev-medierede HIV-1 infektiøse pathway. Rev chromatinimmunpræcipitation betingelser er optimeret gennem interaktion med nucleolar B23 phosphoprotein, som tidligere har vist sig at miste interaktion med rev i nærværelse af nukleolar mutationer.

Rev cellulære faktorer er blevet grundigt undersøgt i fortiden; Men, dette er sket i fravær af viral patogenese. Et protein, især, der er karakteriseret i denne undersøgelse gennem rev interaktion under HIV-1 replikation er nucleolar glycosyleret B23-også kaldet nucleophosmin (NPM), numatrin, eller NO38 i padder2,3, 4. B23 udtrykkes som tre isoformer (NPM1, NPM2 og NPM3)-alle medlemmer af nukleofsmin/nucleoplasmin Nuclear chaperone-familien5,6. Den NPM1 molekylære chaperone funktioner i den korrekte samling af nukleosomer, i dannelsen af protein/nukleinsyre komplekser involveret i kromatin højere orden strukturer7,8, og i forebyggelsen af aggregering og misfoldning af målproteiner gennem et N-terminal kerneområde (rester 1-120)9. NPM1 funktionalitet strækker sig til ribosom Genesis gennem transport af preribosomale partikler mellem kernen og cytoplasmaet10,11, behandling af preribosomal RNA i den interne transkriberet spacer sekvens 12,13, og arrestere nucleolar aggregering af proteiner under ribosomale assembly14,15. NPM1 er impliceret i hæmning af apoptose16 og i stabilisering af tumor suppressorer ARF17,18 og P5319, afslører sin dobbelte rolle som en onkogen faktor og tumor suppressor. NPM1 deltager i cellulære aktiviteter af genom stabilitet, centrosome replikation, og transskription. NPM1 findes i nucleoli under celle cyklus Interphase, langs den kromosomale periferi under mitose, og i prenucleolar organer (PNB) ved afslutningen af mitose. NPM2 og NPM3 er ikke så godt undersøgt som NPM1, som gennemgår ændrede ekspressionsniveauer under malignitet20.

NPM1 er dokumenteret i nucleocytoplasmic fjer ning af forskellige nukleare/nukleolære proteiner gennem en intern NES og NLS9,21 og blev tidligere rapporteret til at drive den nukleare import af HIV-1 TAT og rev proteiner. I nærværelse af B23-binding-domæne-β-galactosidase fusion proteiner, TAT mislocalizes inden for cytoplasmaet og mister transaktiverende aktivitet; Dette viser en stærk affinitet af TAT for B232. En anden undersøgelse etablerede en rev/B23 stabilt kompleks i fravær af RRE-holdige mRNAs. Ved tilstedeværelse af RRE mRNA dissocieres rev fra B23 og binder fortrinsvis til HIV RRE, hvilket fører til forskydning af B2322. Det er ukendt, hvor, på det subnukleare niveau, TAT transaktiveringen og rev udveksling processen af B23 for HIV mRNA finde sted. Begge proteiner postuleres for at komme ind i nucleolus samtidigt gennem B23 interaktion. Inddragelsen af andre Host cellulære proteiner i HIV-nukleolar pathway forventes. De metoder, der er beskrevet i denne proteomics undersøgelse vil hjælpe belyse samspillet mellem nucleolus med vært cellulære faktorer involveret under HIV-1 patogenese.

Proteomics-undersøgelsen blev indledt gennem ekspression af rev NoLS single-point mutationer (M4, M5 og M6) og flere arginin erstatninger (m2 og M9) for HIV-1HXB2 produktion. I denne model, en Hela cellelinje stabilt udtrykker rev-mangelfuld HIV-1HXB2 (hlfb) er transficeret med WT rev og rev nucleolar mutationer indeholdende en flag tag ved 3 ' ende. Tilstedeværelsen af WT rev vil gøre det muligt at forekomme viral replikering i HLfB-kulturen sammenlignet med rev-NoLS-mutationer, der ikke redder rev-mangel (m2 og M9), eller tillader viral replikering at forekomme, men ikke så effektivt som WT rev (M4, M5 og M6)1. Celle lysatet opsamles 48 h senere efter viral proliferation ved tilstedeværelse af rev-ekspression og udsættes for immunopræcipitation med en lyse buffer, der er optimeret til rev/B23-interaktion. Lysis buffer optimering ved hjælp af varierende saltkoncentrationer er beskrevet, og protein elueringsmetoder for HIV-1 rev sammenlignes og analyseres i sølvfarvede eller Coomassie-farvede SDS-side geler. Den første proteomics-tilgang indebærer en direkte analyse af en elueret prøve fra udtrykt WT rev, m2, M6 og M9 ved tandem massespektrometri. En anden fremgangsmåde, hvormed eluaterne af WT rev, M4, M5 og M6 gennemgik en gel ekstraktionsproces, sammenlignes med den første metode. Peptidaffinitet til rev-NoLS-mutationer i forhold til WT rev analyseres, og sandsynligheden for protein identifikation vises. Disse tilgange afslører potentielle faktorer (nucleolar og nonnucleolar), der deltager i HIV-1 mRNA transport og splejning med rev under HIV-1 replikation. Samlet set er celle lysis, IP, og elueringsbetingelser, der er beskrevet, gældende for virale proteiner af interesse for forståelsen af vært cellulære faktorer, der aktiverer og regulerer smitsomme veje. Dette gælder også for studiet af cellulære Host faktorer, der kræves for persistens af forskellige sygdomsmodeller. I denne proteomics model, HIV-1 rev IP er optimeret til B23 interaktion at belyse nukleolar faktorer involveret i nucleocytoplasmic fjer-aktivitet og HIV-1 mRNA binding. Derudover, cellelinjer stabilt udtrykker smitsomme sygdomme modeller, der er mangelfuld for centrale proteiner af interesse kan udvikles, svarende til HLfB cellelinje, at studere infektiøse veje af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellekultur

  1. Vedligehold HLfB i Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin og 1 mM natrium pyruvat inden for vævs-kultur-behandlede 100 mm plader. Opbevar cellekulturer ved 37 °C i en befuret inkubator forsynet med 5% CO2. Passage flydende celler til en celletæthed på 1 x 106 celler/ml.
  2. Kassér cellekultur mediet. Cellerne skylles forsigtigt med 10 mL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS). Fjern og kassér 1x PBS uden at forstyrre cellelaget.
  3. Tilsæt 2 mL 1x trypsin-EDTA-opløsning til cellerne. Klippe skålen til at belægge enkeltlags og inkubere ved 37 °c i et befuret kammer i 5 min.
  4. Tryk fast på siden af skålen med håndfladen for at løsne cellerne. Resuspender de løsrevne celler i 8 mL friske kultur medier. Drej cellerne ved 400 x g i 5 min.
  5. Kassér kulturmediet uden at forstyrre celle pellet. Ophæng celle pellet i 10 mL friske dyrkningsmedier. Subkultur 1 mL koncentrerede celler med 9 mL friske dyrkningsmedier inden for vævskultur behandlede 100 mm plader.
    Bemærk: for hver rev-NoLS-mutation vil 3x 100 mm HLfB eller HeLa-kultur pladerne give nok proteinlysat til Western blot-analyse og massespektrometri. Tilføj ekstra plader til en WT rev positiv kontrol og negativ kontrol. Subkulturen celle volumen vil kræve optimering med brug af forskellige celletyper.

2. udtryk for rev-NoLS-3'flag mutationer under HIV-1-replikation

  1. Vokse HLfB cellekultur til en celletæthed på 2 x 106 celler/ml. 4 mL calciumphosphat-DNA-suspension forberedes for hver 100 mm plade som følger.
    1. Etiket 2 15 mL rør som 1 og 2. Der tilsættes 2 mL 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl og 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) til tube 1. Tilsæt TE 79/10 (1 mM Tris-HCl og 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) til tube 2. Mængden af TE 79/10 er 1,760 mL-mængden af DNA.
    2. Tilsæt 20 μg plasmid, der indeholder rev-NoLs-3'flag-mutationen af interesse for tube 2 og bland dens indhold gennem resuspension. Tilsæt 240 μL 2 M CaCl2 til tube 2 og bland igen gennem resuspension.
    3. Overfør blandingen af tube 2 til tube 1 dropwise, forsigtigt blande. Lad suspensionen sidde ved stuetemperatur i 30 min. vortex nedbør.
  2. Tilsæt 1 ml suspension dråbevis til hver af de 3-cellekultur, 100 mm plader mens forsigtigt hvirvlende medierne. Returner pladerne til inkubatoren og lad transfektering blandingen stå i 6 h. Udskift transfektering blandingen med 10 ml friske dyrkningsmedier og Inkuber cellerne i 42 h.

3. indsamling af viral proteinlysat

  1. Kassér celle mediet 48 h post transfection. Placer hver 100 mm plade på en seng af is. Etiketten 15 mL rør til hver rev-NoLS mutation prøve og Anbring rørene på is.
  2. Cellerne skylles forsigtigt med 10 mL forkølet 1x PBS uden at forstyrre cellelaget. Kassér 1x PBS. Tilsæt 3 mL lysisbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl og 1% X-100 rengøringsmiddel [Se tabel over materialer]), behandlet med cocktail af proteasehæmmer, til hver af de 100 mm plader.
  3. Brug en celle skraber til at afbryde cellelaget. Vippe pladen og forsigtigt skrabe og samle cellerne i en pulje. Celle lysatet opsamles ved hjælp af en 1.000 μL mikropipette og blandes celle lysaterne fra hver af 3 100 mm pladerne i det proplede 15 mL rør.
  4. Inkuber celle lysatet på is i 15 min, vortexning hver 5 min. centrifuger celle lysatet ved 15.000 x g i 5 min.
  5. Saml protein supernatanten uden at forstyrre cellerester pellet og overføre den til en anden steril 15 mL rør. Opnå den virale protein lyatkoncentration ved hjælp af Bradford-metoden (se punkt 4).
  6. Gem en alikvot af indgangs prøven (20 μg) til vestlig immun-analyse. Tilsæt 2x prøve buffer (20% glycerol, 0,02% bromphenolblåt blå, 125 mm Tris-CL [pH 6,8], 5% SDS og 10% 2-mercaptoethanol) til den endelige volumen. Kog det ved 95 °C i 10 minutter, og opbevar indgangs prøven ved-20 °C.

4. Bradford-analyse

Bemærk: Forbered 10x bovin serumalbumin (BSA) fra 100x BSA bestand før generering protein standardkurver.

  1. Aliquot vand i mikrocentrifuge glas til følgende blank og standarder: blank = 800 μL; Standard 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standard 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standard 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standard 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standard 5 = 10 mg/mL, 790 μL. aliquot 10x BSA i følgende udpegede standarder: standard 1 = 2 μL; Standard 2 = 4 μL; Standard 3 = 6 μL; Standard 4 = 8 μL; Standard 5 = 10 μL.
  2. Tilbered en blanding af protein prøver ved at blande 795 μL vand med 5 μL protein prøver. Tilsæt 200 μL protein assay Dye reagens (Se tabellen over materialer) til hver blank, standard og protein prøve. Vortex prøverne kortvarigt for en jævn blanding og Inkuber ved stuetemperatur (18-20 °C) i 5 min.
  3. Overfør de tomme, standarder og protein prøver til kuvetter. Protein koncentrationerne ved en OD på 595 nm måles.

5. coimmunoprecipitation af rev-NoLS-3'flag

  1. Skyl 25 μL m2 affinitets gel perler (Se tabellen over materialer) med 500 μl lysis-buffer, behandlet med cocktail af proteasehæmmer. Skyl mere affinitets gel perler til hver mutation prøve og kontrol.
    Bemærk: Forbered nok m2 affinitets gel perler til to geler (50 μl)-en til vestlig immunanalyse og den anden til protein farvning og massespektrometri.
  2. Spin ved 820 x g i 2 min ved 4 °c. Fjern supernatanten. Skyl 2x mere.
  3. Tilsæt viral proteinlysat (1 mg/mL i 5 mL total volumen) til de prerinserede m2 affinitets perler. Juster den totale lydstyrke ved hjælp af lysis-buffer.
  4. Inkuber reaktionen i 3 timer ved rotation ved 4 °C. Centrifuge de m2 affinitets perler/viral proteinlysat på 820 x g i 1 min.
  5. Supernatanten opsamles og gemmes en alikvot post-IP-prøve (20 μg) til vestlig immun-analyse. Måle proteinkoncentrationen af post-IP-lysningen. Saml 20 μg for vestlig immunoblotting.
  6. Tilføj 2x eksempel buffer til den endelige diskenhed. Kog det ved 95 °C i 10 min, og opbevar post-IP-prøven ved-20 °C.
  7. Skyl m2-perlerne med 750 μL lysis-buffer og vask perlerne på en rotator ved 4 °C i 5 min. centrifuger m2-perlerne ved 820 x g og kassér supernatanten.
  8. Gentag trin 5,7 for yderligere to skyller på en rotator ved 4 °C i 5 minutter. Efter den tredje vask, fjerne eventuelle spor af lysis buffer fra m2 perler/Co-IP-kompleks ved hjælp af en lang gel-loading spids.
    Bemærk: Knib enden af gel-læsse spidsen med flade pincet, før du fjerner eventuelle spormængder af lysis-bufferen. Dette vil forhindre afbrydelse og optagelse af m2 perler.
  9. Resuspendere m2 perler i 55 μL af 2x loading buffer. Prøven koges ved 95 °C i 10 minutter.
  10. 25 μl af eluatet indlades på to separate SDS-siders geléer (en gel til vestlig blot og den anden til coomassie-farvning).

6. klargøring af SDS-PAGE gels

  1. Støbt 2 15% SDS-acrylamid-løse geler ved at blande følgende reagenser i et 50 ml rør (i et endeligt volumen på 40 ml, nok til fire geler): 4,16 ml ultrarent vand, 15 ml 40% acrylamid: bisacrylamid (29:1), 10 ml 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8) , 400 μL 10% SDS, 400 μL 10% ammonium persulfat og 40 μL af TEMED.
  2. Bland den løse gel ved at invertere 50 mL røret flere gange. Pipette blandingen afpipetteres i et forrenset Western gel-apparat (fire geler-tre til vestlig blot og en til coomassie/sølvfarvning).
  3. Pipetten forsigtigt nok vand til at dække det øverste lag af gel blandingen. Lad den løse gel polymerisere.
  4. Hæld vandlaget fra den løse gel, ved hjælp af en delikat opgave visker (Se tabellen over materialer) til at absorbere eventuelle overskydende vand.
  5. Støbt to 5% SDS-acrylamid stabling gels ved at blande følgende reagenser i et 50 ml rør (i et endeligt volumen på 20 ml, nok til fire geler): 11,88 ml ultrarent vand, 2,5 ml af 40% acrylamid: bisacrylamid (29:1), 5,2 ml af 1,5 M Tris-HCL (pH 8,8) , 200 μL 10% SDS, 200 μL 10% ammonium persulfat og 20 μL af TEMED.
  6. Bland stabel gel ved at invertere 50 mL røret flere gange. Pipette blandingen af stabel-gel over den opløser gel til toppen af apparatet.
  7. Anbring en gel-kassette kam, der indeholder det relevante antal baner, i stabel-gelen. Absorbere ethvert overløb af gel blandingen ved hjælp af en delikat opgave visker (Se tabellen over materialer). Lad stabel gel til at polymerisere helt.
  8. Oversvømme det vestlige gel apparat med 1x vestlig løbe buffer (5x koncentration: 250 mM Tris-CL [pH 8,3], 1,92 M Glycin, 0,5% SDS og 10 mM EDTA).
  9. Træk forsigtigt gel-kassette kammen ud af stablings gelen. Tillad 1x Western Running buffer til at fylde lastning brønde. Skyl hver brønd med 1x vestlig løbe buffer ved hjælp af en sprøjte før indlæsningen af prøverne.
  10. Læg de vestlige immun prøver i hver af de tilsvarende gel (input prøver, coimmunoprecipiterede prøver og post-IP prøver). Læg de vestlige gel-protein markører.
  11. Ilægning af coimmunoprecipiterede prøver til Coomassie/sølvfarvning i en anden gel. Læg de vestlige gel-protein markører.
  12. Tilslut det kørende gel-apparat til en strømkilde, og Kør geler ved 100 V, indtil belastnings farven når til den løse gel. Forøg spændingen til 140 V, indtil belastnings farven når bunden af den løse gel.

7. Western blot Transfer

  1. Skil det vestlige gel-apparat ad. Skær og kassér stabel gelen, og efterlader den løse gel intakt.
  2. Overfør forsigtigt de løse geler til en ren bakke fyldt med vestlig overførsels buffer (25 mM Tris, 194 mM glycin, 0,005% SDS, 20% methanol) og sug dem i 15 min.
  3. Saml geloverførings apparatet på følgende måde.
    1. Skær tre PVDF-overførings membraner og seks stykker filtrerpapir (Se tabellen over materialer) til størrelsen af den løse gel.
    2. Sæt PVDF-membranen i methanol i 5 min. fugt den i vand i 5 min. Placer PVDF-membranen i den vestlige overførsels buffer, indtil den er klar til brug.
    3. Placer gelholderen kassette i en glas bageplade fyldt delvist med vestlig Transfer buffer, med den sorte side i bunden.
    4. Placer en skum pude gennemblødt med vestlig overførsels buffer mod den sorte side af gel holder kassetten.
    5. Våd et stykke filtrerpapir i Western Transfer buffer og Placer det på toppen af skumpuden. Anbring den løse gel oven på filter papiret.
      Bemærk: Anbring den afløsnings gelé i den korrekte indlæsnings retning, der skal overføres til PVDF-membranen.
    6. Placer en PVDF-overførings membran oven på den løse gel. Våd et stykke filtrerpapir med vestlig overførsels buffer, og Placer det oven på PVDF-overførsels membranen.
    7. Placer en anden skum pude gennemblødt med vestlig overførsels buffer på toppen af filtrerpapiret. Fold forsigtigt den hvide side af gel holder kassetten oven på den gennemblødt skum pude. Lås kassetten stramt.
    8. Anbring gelholder kassetten i elektrode modulet til overførings apparaturet. Gentag trin 7.3.4-7.3.8 for hver af de resterende løsnings-gel.
    9. Fyld overførings apparatets tank med Western Transfer buffer. Anbring en omrørings stang i apparat beholderen.
    10. Anbring apparat beholderen oven på en røreplade. Justér omrøringen til 5-6, og sørg for, at røre stangen ikke sidder fast eller rammer gelholderen kassetter.
    11. geloverførings apparatet til en strømkilde, og Overfør gelen ved 100 V i 1 time ved 4 °C.

8. immunoblotting

  1. Tag gelholder kassetten ud, og Placer den sorte side ned mod en ren glas bageplade. Åbn kassetten og kassér forsigtigt skumpuden og filtrerpapiret. Marker et hjørne af PVDF-membranen for at identificere den korrekte indlæsnings retning. Hold membranen våd.
    Bemærk: PVDF-membranen kan lufttørres og opbevares i en ren, forseglet beholder. Rehydrere membranen ved at gentage trin 7.3.2.
  2. Membranen placeres i 100 mL blokerende opløsning (5% mælk, 1x TBS og 0,1% Tween 20). Bloker membranen med blid Rocking ved stuetemperatur (18-20 °C) i 1 time.
  3. Skær over membranen over det 25 kDa-protein mærke. Placer den øverste del af membranen, der indeholder protein bånd større end 25 kDa, i blokerende opløsning indeholdende B23 mus monoklonale IgG1 (1:500 fortynding). Bloker natten over, Rocking ved 4 °C.
  4. Placer den nederste del af membranen, der indeholder protein bånd mindre end 25 kDa, i blokerende opløsning indeholdende m2 mus monoklonale IgG1 (1:1000 fortynding, se tabellen over materialer). Bloker natten over, Rocking ved 4 °C.
  5. Vask membranen 3x i 10 minutter i 25 mL vestlig vaskeopløsning (1x TBS, 0,1% Tween 20) på en gynge platform.
  6. Inkuber membranerne i gede-anti-mus IgG1-HRP (1:5000 fortynding) fortyndet i blokerende opløsning i 1 h ved stuetemperatur. Vask membranen 3x i 10 minutter i 25 mL vestlig vaskeopløsning på en gynge platform.
  7. Forbered chemiluminescens vestlige blotting substrat. Brug en P1000-mikropipette til at tilføje substratet til membranen.
  8. Udvikle hver membran i chemiluminescens vestlige blotting substrat for 5 min. Fjern membranen fra substratet. Absorbere overskydende substrat ved hjælp af en delikat opgave visker (Se tabellen over materialer).
  9. Placer membranen i en ren plade beskytter tapede til indersiden af en kassette. Tag kassetten i et mørkt rum og Placer et ark film i kassetten. Lås kassetten på plads og Inkuber i 5 – 15 min. Fjern filmen fra kassetten og udvikl den.

9. coomassie farvning

  1. Skil det vestlige gel-apparat ad. Skær og kassér stabel gelen, og efterlader den løse gel intakt. Overfør forsigtigt den afløsnings gelé til en ren bakke fyldt med 25 ml ultrarent vand.
  2. Inkuber gelen på en Rocking-platform i 15 min. Brug blid Rocking til at forhindre, at den løse gel bryder ud. Kassér det ultrarent vand og Gentag vaske trinnet 2x mere.
    Bemærk: Hvis der er SDS bobler tilbage efter vaske trinene, kan gelen vaskes i ultrarent vand natten over. Resterende SDS kan forårsage høj baggrunds farvning af gelen.
  3. Bland Coomassie plet reagens ved at invertere flasken (Se tabellen over materialer). Placer 100 mL Coomassie plet reagens for at dække den afløsnings gel, og Inkuber gelen på en gynge platform i 1 h. kassér Coomassie plet reagens og vask gelen i deioniseret vand på en gynge platform i 15 min.
  4. Kassér det deioniserede vand. Gentag vaske trinnet 2x mere. Fortsæt med at vaske gelen, indtil den ønskede opløsning af protein båndene observeres.

10. sølvfarvning

  1. Skil det vestlige gel-apparat ad. Skær og kassér stabel gelen, og efterlader den løse gel intakt. Overfør forsigtigt den afløsnings gelé til en ren bakke fyldt med 25 ml ultrarent vand.
  2. Inkuber gelen på en Rocking-platform i 15 min. Brug blid Rocking til at forhindre, at den løse gel bryder ud. Kassér det ultrarent vand og Gentag vaske trinnet 2x mere.
    Bemærk: Hvis der er SDS bobler tilbage efter vaske trinene, kan gelen vaskes i ultrarent vand natten over. Resterende SDS kan forårsage høj baggrunds farvning af gelen.
  3. Fastgør gelen i 30% ethanol: 10% eddikesyre opløsning (6:3:1 vand: ethanol: eddikesyre) natten over ved stuetemperatur. Gelen vaskes i en 10% ethanol-opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur. Udskift ethanolopløsningen og vask den i yderligere 5 minutter.
  4. Forbered sensibiliserende arbejds løsning fra Pierce Silver Stain kit ved at blande en-del sølv bejdsning sensibiliserende med 500 dele ultrarent vand (50 μl sensibiliserende med 25 ml ultrarent vand). Opløs den løse gel i den sensibiliserende arbejdsopløsning i 1 min. vask gelen i ultrarent vand i 1 min., Udskift vandet, og vask gelen igen i 1 min.
  5. Forbered bejdsning arbejds løsning ved at blande en-del sølv bejdser forstærker med 50 dele sølv bejdser (500 μl forstærker med 25 ml sølv bejdser). Gelen i bejdsning i plet opløsning i 30 minutter.
  6. Forbered udvikler arbejds løsning ved at blande 1 del Silver Stain forstærker med 50 dele Silver Stain Developer (500 μl forstærker med 25 ml udvikler). Klargør 5% eddikesyre opløsning som stopopløsning. Gelen skylles med ultrarent vand i 1 min., Udskift vandet, og vask gelen i yderligere 1 min.
  7. Udskift vandet med udviklerens arbejds løsning, og Inkuber, indtil det ønskede protein bånd intensitet er løst (5 min). Udskift udviklerens arbejds løsning med stop-opløsning og Inkuber i 10 min.

11. in-gel reduktion, alkylering, og fordøjelse af Coomassie-farvede gel bånd

  1. Skær gel båndene fra gelen ved hjælp af et rent barberblad. Skær hvert gel-bånd i ca. 5 mm terninger og anbring dem i et rent 0,5 mL mikrocentrifuge glas.
  2. Depletter gelstykkerne ved at dække dem med 100 mM ammoniumbicarbonat i 1:1 acetonitril: vand ved stuetemperatur i 15 min. kassér supernatanten. Gentag dette trin.
  3. Tør gelstykkerne i 5 minutter i en vakuum centrifuge. Proteiner reduceres ved at dække de tørrede gel stykker med 10 mm ditiotreitol i 100 mm ammoniumbicarbonat og inkuberet dem i 1 time ved 56 °c.
  4. Afpipettér enhver supernatant. Alkylere proteinerne ved at dække gelstykker med 100 mM iodoacetamid i vand og inkuberet dem i 1 time ved stuetemperatur i mørket.
  5. Pipetten af supernatanten og krympe gelstykkerne ved at dække dem med acetonitril og ryste dem forsigtigt ved stuetemperatur i 15 min. pipetten af supernatanten og reswell gel stykkerne ved at dække dem med 100 mM ammoniumbicarbonat og ryste dem forsigtigt ved stuetemperatur i 15 minutter.
  6. Gentag trin 11,5. Tør gelstykkerne i 5 minutter i en vakuum centrifuge.
  7. Dæk gelstykker med 50 ng/μL sekvens modificeret trypsin (Se tabellen over materialer) i 100 mm ammoniumbicarbonat. Lad gelen svulme i 5 min; afpipettere eventuelt resterende opløsning. Dæk gel-stykkerne med 100 mM ammoniumbicarbonat, og giv dem mulighed for at reswell helt, og Tilføj yderligere 100 mM ammoniumbicarbonat, så gelstykkerne er helt dækket.
  8. Gelstykkerne inkubates natten over ved 37 °C. Stop reaktionen ved at tilføje 1/10 af mængden af 10% myresyre i vand. Saml supernatanten fra hvert rør.
  9. Pak gelstykkerne ud ved at dække dem med 1% myresyre i 60% acetonitril og inkuberet dem i 15 minutter med blid rystning.
  10. Reducer mængden af de kombinerede supernatanter til mindre end 20 μL i en vakuum centrifuge, samtidig med at man sørger for at undgå at tørre Supernatanterne helt. Tilsæt 1% myresyre for at bringe det totale volumen tilbage til 20 μL.

12. væskekromatografi/massespektrometri

Bemærk: prøverne blev analyseret ved hjælp af et massespektrometer udstyret med ultra HPLC, en nanospray kilde og en kolonne (Se tabellen over materialer). Opløsningsmiddel A og B er 0,1% myresyre i henholdsvis vand og acetonitril.

  1. Ilægning af de Ford øjede proteiner til høj restitution polypropylen Autosampler hætteglas. Læg hætteglassene i prøve styringen i et UPLC-system.
  2. Injicer 6 μL af hver prøve. Læg hver prøve på diffuse Rings kolonnen i nanoflisen i 1,5 min ved 8 μL/min, ved hjælp af 99% solvens A/1% solvens B.
  3. Peptiderne elueret i massespektrometer med en lineær gradient fra 3% til 35% af opløsningsmidlet B over 30 min, efterfulgt af en gradient fra 35% til 50% af solvens B over 4 min og 50% til 90% af solvens B over 1 min. vedligehold 90% acetonitril i 3 min; Reducer derefter% B tilbage til 3% over 5 minutter.
  4. Opnå positive ion profil Mass spec data i opløsning (20.000 opløsning) mode. Hent data fra 100 til 2.000 da med en hastighed på en scanning hver 0,6 s. Hent data i MSE -tilstand ved at skifte scanninger uden kollisionsenergi og scanninger med forhøjet kollisionsenergi.
  5. For den forhøjede kollisionsenergi, rampe kollisions energien i fælden celle fra 15 V til 40 V. erhverve en lås masse scanning hver 30 s, ved hjælp af + 2 ion af [Glu1]-fibrinopeptid B som lås masse. Erhverve en datafil ved hjælp af en tom injektion af solvens A, ved hjælp af den samme anskaffelsesmetode mellem hvert par af prøver til at styre overførsel.

13. data analyse for massespektrometri

  1. Kopier massespektrometri resultater filer til computeren kører en kvantitativ og kvalitativ proteomics forskningsplatform (f. eks, ProteinLynx global server). Dataanalyse er meget CPU-intensiv og bør udføres på en separat, højtydende dataanalyse computer.
  2. Opret et nyt projekt for dataene. Opret en ny mikrotiterplade, der repræsenterer Autosampler pladen. Tildel prøverne til samme position i mikrotiterpladen som deres position i Autosampler.
  3. Tildel hver enkelt prøve behandlingsparametre. Parametre, der skal anvendes, er automatisk kromatografisk spids bredde og MSTOF-opløsning. lav energi tærskel, 100 tæller; forhøjet energi tærskel, 5 tæller; intensitets tærskel, 500 tæller.
  4. Tildel hvert eksempel på arbejdsgangs parametre. Parametre til brug er database, sammenkædet Human SwissProt og HIV, med omvendte sekvenser; automatisk peptid og fragment tolerance; min. fragment ion-matches pr. peptid, 3; min. fragment ion-kampe pr. protein, 7; min peptid matcher pr. protein, 1; primær Digest reagens, trypsin; glemte kavaler, 1; fast modifikator reagenser, carbamidomethyl C; variable modifikatorreagenser, oxidation M; falsk opdagelse sats, 100.
  5. Vælg eksemplerne, og vælg Behandl seneste rådata. Når søgningen er fuldført, skal du markere eksemplerne og vælge Eksportér data til stillads (version 3). Åbn stillads, Opret en ny fil, og Importer hver fil eksporteret fra proteomics platform som en ny biosample ved hjælp af prækursor ion kvantitation.
  6. Når alle filer er importeret, skal du fortsætte til skærmbilledet Indlæs og analysér data . Vælg den samme database, der bruges til søgning og import af data ved hjælp af LFDR-scoring og protein gruppering med standard eksperiment. Indstil visningsmuligheder til protein identifikation sandsynlighed, protein tærsklen til 20%, det mindste antal peptider til 1, og peptidtærsklen til 0% i løbet af analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rev-NoLS single-og multiple-point arginin mutationer, svarende til en række subcellulære lokaliseringsmønstre, blev undersøgt i deres evne til at interagere med cellulære Host faktorer i forhold til WT rev. WT rev-3'flag og pcDNA-flag vektor blev udtrykt i HLfB kultur. Protein komplekser blev forarbejdet fra Total celle lysat og plettet med sølv plet reagens. Rev-NoLS-3'flaget er detekterbart (ca. 18 kDa) i tre forskellige lyse buffer forhold, der indeholder forskellige koncentrationer af NaCl (137 mM, 200 mM og 300 mM) i figur 1. B23 var detekterbar (37 kDa) i lysisbuffer indeholdende lavere saltkoncentration (137 mM, vogn 2 – 4), næppe detekterbar i lyse buffer indeholdende 200 mM NaCl, og målbart i lysis buffer indeholdende en høj saltkoncentration (300 mM NaCl). I figur 2, WT rev-3'Flag, rev-Nols M1-3 ' flag, og pcDNA-flag vektor blev udtrykt i hlfb kultur. Protein komplekser blev forarbejdet fra Total celle lysater fremstillet af to lyse buffer betingelser (137 mm og 200 mm NaCl). M2 mus monoklonalt IgG1 blev anvendt til påvisning af rev-3'flag udtryk fra celle lysates. B23 detektion var optimal i lysis buffer indeholdende 137 mM NaCl med WT rev-3'flag (input og α-flag-rev IP), men mistede affinitet med rev-NoLS M1-3 ' flag. B23 affinitet med WT rev-3'flag faldt med en højere saltkoncentration i lysis buffer indeholdende 200 mM NaCl. pcDNA -negativ kontrol gav ikke ikke-specifik immunodetektion i input og α-flag-rev IP af alle lyse buffer betingelser.

Elueringsforholdene blev optimeret for rev-NoLS-3'flag-IP i figur 3. WT rev-3'flag og pcDNA-flag vektor blev udtrykt i hlfb kultur. Protein komplekser blev forarbejdet fra Total celle lysater og elueret ved hjælp af tre forskellige betingelser for at udrydde lys og tung kæde baggrund (25 og 50 kDa)-2x prøve loading buffer ved 37 °c i 15 min, 2x prøve loading buffer ved 95 °c for 3 min, og 3x flag peptid e ved 4 °C i 30 min. rev NoLS-3'flag (~ 18 kDa) var mest detekterbar efter eluering gennem kogning i 2x prøve loading buffer. B23 (~ 37 kDa) var detekterbar under to betingelser-37 °C inkubation i 2x prøve loading buffer for 15 min og 95 °C inkubation i 2x prøve loading buffer for 3 min.

M2 (nuklear/nukleolar i lokalisering, Ufunktionelt i HIV-1HXB2 produktion), M6 (nukleolar i mønster, funktionel i HIV-1HXB2 produktion), og M9 (spredt i cytoplasmaet/kernen, Ufunktionelt i viral produktion) blev udtrykt i HLfB kultur. Protein komplekser blev forarbejdet fra Total celle lysat, elueret gennem 95 °C inkubation i 2x prøve loading buffer i 3 min, og forsvandt i sølv plet reagens (figur 4). WT rev blev detekterbart efter IP-flag reaktion. Rev-NoLS m2, M6 og M9 blev også detekterbare ved 18 kDa. Der blev observeret bands svarende til B23 protein ved 37 kDa-mærket. Protein komplekser blev yderligere observeret i hver bane svarende til IP-reaktioner af WT rev, m2, M6, M9, og pcDNA negative baggrundskontrol. Protein lysater blev analyseret ved immunodetektion for α-flag-rev og B23. Rigelig WT rev og moderate niveauer af M6 blev udtrykt (α-flag input) og detekterbar efter flag IP (α-flag-rev IP, figur 5). M2 og M9 blev ikke stærkt udtrykt fra 20 μg protein lysat input, men detekterbare ved lav intensitet efter flag IP fra 5 mg protein lysat. pcDNA -negativ kontrol gav ikke ikke-specifik immunodetektion i input og α-flag-rev IP. B23 affinitet med WT rev blev observeret efter IP-flag reaktion (B23 Co-IP). B23 affinitet blev observeret en anelse med m2 (to enkeltpunkts-mutationer R48, 50G) og M6 (enkeltpunkts mutation R50G). B23 affinitet blev tabt i nærværelse af tre enkeltpunkts mutationer af M9 (R46, 48, 50G) inden for rev-NoLS.

I alt blev lysater fra immunopræcipiteret WT rev og rev-Nols-3'flag-mutationer (4, 5, 6 og 8) behandlet, plettet med coomassie-reagens og visualiseret i forhold til BSA-serielle fortyndinger (højre panel). Rev-NoLS-3'flaget er detekterbart (12,5-25 μg) ved tilstedeværelse og fravær af mutationer ved 18 kDa (figur 6). Protein komplekser behandlet fra IP reaktioner af WT rev-3'flag, nucleolar-lokalisering rev-NoLS-3'flag mutationer (M4, M5, og M6), og negativ kontrol pcDNA-flag blev visualiseret i SDS-side gels farvet med Coomassie reagens (figur 7). WT rev (WT1 og WT2) kunne detekteres efter IP-flag reaktion ved 18 kDa. Rev-NoLS-mutationer var svagt detekterbare efter ekspression i HLfB og IP-flag reaktion. pcDNA -negativ kontrol gav ikke uspecifik baggrund ved 18 kDa.

Immunoprecipitated lysater fremstillet af WT rev-3'flag, m2, M6, M9 og negativ kontrol pcDNA-flag (vist i figur 4) blev analyseret ved tandem massespektrometri. Sandsynligheden for protein identifikation (i procent) vises for sammenligning af protein interaktioner, der forekommer med hver nukleolar-lokaliserende rev-NoLS-mutation versus WT rev (tabel 1). Cellulære proteiner, hvoraf nogle er nukleolar i lokaliserings mønster (ribosomale isoformer, eukaryote Translation Initierings faktor 48, snorna C/D box 58b og nucleophosmin B23), blev identificeret som direkte/indirekte binde partnere af WT rev. disse nukleolar faktorer mistede bindingsaffinitet til m2 (to enkeltpunkts-mutationer R48, 50G), M6 (single-point mutation R50G) og M9 (tre enkeltpunkts-mutation R46, 48, 50G), svarende til pcDNA negativ kontrol. Hver bane af den Coomassie-farvede gel i figur 6 blev forarbejdet til tandem massespektrometri (tabel 2). Peptidaffinitet til rev-NoLS-mutationer blev analyseret og vist ved hjælp af protein identifikations sandsynlighed (i procenter). En række cellulære proteiner, hvoraf nogle er nukleolar i lokaliserings mønster (nucleolin C23, nucleophosmin B23, og nukleosome montage protein), blev identificeret som direkte/indirekte proteinbindende faktorer af WT rev. disse nukleolar faktorer blev ikke identificeret til at binde med M4, M5, og M6. Transport faktorer ARHGEF1 (Rho guanin nucleotid Exchange Factor 1) og TBC1D24 (TCB1 domæne familie, medlem 24) blev tabt i affinitet i nærværelse af rev-NoLS mutationer. Splicing faktorer hnRNPC (heterogene ribonuclear protein C) og PNN (Pinin, desmosome-associeret protein) blev desuden observeret for at binde til WT rev, som mistede interaktion med rev single-point nucleolar mutationer.

Figure 1
Figur 1 : Optimering af cellelyse betingelser for rev-3'flag Co-IP under HIV-1-produktion. WT rev-NoLS-3'flag og negativ kontrol pcDNA-flag IP-betingelserne blev optimeret i tre forskellige NaCl-koncentrationer (137 mm, 200 mm og 300 mm) i lysis-buffer. Som observeret gennem sølvfarvning, 137 mm NaCl var den optimale saltkoncentration for rev chromatinimmunpræcipitation og B23 binding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Optimering af lyse betingelser for rev-3'flag Co-IP og B23 immunodetektion under HIV-1-produktion. WT rev-NoLS-3'flag, M1-3 ' flag, og negativ kontrol pcDNA-flag IP betingelser blev optimeret i to forskellige NaCl koncentrationer (137 mm og 200 mm) i lysis buffer. Som observeret gennem immunodetektion, 137 mm NaCl var den optimale saltkoncentration for rev chromatinimmunpræcipitation og B23 binding. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Optimering af rev-3'flag Co-IP eluering under HIV-1 produktion, visualiseret ved sølvfarvning. Protein komplekser blev forarbejdet fra Total celle lysater udarbejdet under WT rev-3'flag og pcDNA-flag IP. Tre forskellige elueringsbetingelser blev testet-2x prøve indlæsnings buffer ved 37 °C i 15 minutter, 2x prøve indlæsnings buffer ved 95 °C i 3 minutter og 3x flag peptid ved 4 °C i 30 min. De optimale elueringsforhold for WT rev forekom efter 15 min inkubationsperiode i 2x prøve indlæsnings buffer ved 37 °C og efter 3 min inkubationsperiode i 2x prøve indlæsnings buffer ved 95 °C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Immunopræcipitation af rev-3'flagmutationer 2, 6 og 9 under HIV-1-produktion. Protein komplekser, der bindes direkte/indirekte med WT rev, m2 (R48, 50G), M6 (R50G), M9 (R46, 48, 50G) og negativ kontrol pcDNA-flag i tilstedeværelse af HIV-1-replikation, vises i en sølvfarvet SDS-siders gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Rev-3'flag Co-IP af mutationer 2, 6 og 9 for B23 immunodetektion under HIV-1-produktion. Protein lysaterne og IP-Reaktionerne fremstillet af WT rev, m2, M6, M9 og negativ kontrol pcDNA-flaget i figur 4 blev yderligere analyseret ved immunodetektion for α-flag-rev og B23. WT rev og mutant udtryk, samt interaktion med B23 nucleocytoplasmic protein, observeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Kvantificering af rev-NoLS-mutationer 4, 5, 6 og 8 efter flag IP-reaktion . IP-reaktioner fra HLfB udtrykker WT rev og nucleolar-lokalisering M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ΔRQ) og negativ kontrol pcDNA-flaget blev målt for proteinkoncentration ved hjælp af BSA serielle fortyndinger. Der blev observeret en proteinkoncentration på 12,5-25 μg for hver prøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Immunopræcipitation af nukleolære-lokaliserende rev-NoLS-mutationer 4, 5 og 6 under HIV-1-produktion. Coomassie-farvede SDS-SIDERS gel, der indeholder immunopræcipiterede protein komplekser af WT rev (1 og 2), M4, M5 og M6, vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Identificerede proteiner Molekylvægt WT rev M2 M6 M9
signal genkendelse partikel 14kDa (homologous alu RNA binding protein) 15 kDa 95% 0 0 0
ribosomale protein S3A 30 kDa 95% 0 0 0
eukaryote oversættelses Initierings faktor 4b 69 kDa 95% 0 0 0
ribosomale protein L31 14 kDa 91% 0 0 0
ribosomale protein L12 18 kDa 93% 0 0 0
ribosomale protein L22 15 kDa 91% 0 0 0
små nucleolar RNA, C/D boks 58B 15 kDa 87% 0 0 0
zink finger, CCHC domæne indeholdende 11 185 kDa 87% 0 0 0
actin binding LIM protein 1 79 kDa 79% 0 0 0
ribosomale protein S13 17 kDa 78% 0 0 0
nukleophosmin (nukleolær glycosyleret B23, numatrin) 33 kDa 73% 0 0 0

Tabel 1: identifikation af cellulære værts faktorer, der interagerer med WT rev under HIV-1-produktion. Protein eluater fremstillet af WT rev, m2, M6 og M9 blev direkte analyseret af tandem massespektrometri. Protein interaktioner, der er direkte/indirekte bundet til WT rev versus m2, M6 og M9, opsummeres med sandsynlighed for protein identifikation (i procenter).

Identificerede proteiner Molekylvægt M4 M5 M6 Wt pCDNA
poly (A) bindende protein, cytoplasmisk 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
varmechok 70kDa protein 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
ribosomale protein L7 29 kDa 91% 0 100% 100% 0
Histon-klynge 1, H1e 22 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
ribosomale protein L13 24 kDa 99% 0 100% 100% 0
komplement komponent 1, q subkomponent binding protein 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0
Y boks binding protein 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
nukleosom montage protein 1-lignende 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
ribosomale protein L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0
ribosomale protein L18 22 kDa 27 0 100% 100% 0
varmechok 70kDa protein 8 71 kDa 5 99% 100% 100% 0
ribosomale protein L19 23 kDa 10 0 81% 100% 0
ribosomale protein L27 16 kDa 92% 0 100% 100% 0
ribosomale protein L7a 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein L24 18 kDa 0 0 100% 99% 0
Tubulin, beta klasse I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
ribosomale protein L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
varmechok 70kDa protein 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
ribosomale protein S2 31 kDa 87% 0 100% 100% 0
Casein kinase 2, alpha 1 polypeptid 45 kDa 0 0 50% 100% 0
ribosomale protein L14 23 kDa 0 0 81% 100% 0
ribosomale protein, stor, p0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
Histon-klynge 1, H1B 23 kDa 0 0 73% 100% 0
varmechok 70kDa protein 5 (glukose-reguleret protein) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
ribosomale protein S4, X-linked 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0
ribosomale protein L28 16 kDa 0 0 100% 99% 0
ribosomale protein S14 16 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein S3A 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein L21 19 kDa 0 0 100% 100% 0
zink finger CCCH-type, antiviral 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
Histon-klynge 1, H1c 21 kDa 0 0 0 98% 0
ribosomale protein L36 12 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein S18 18 kDa 90% 0 100% 100% 0
modulator af apoptose 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
ribosomale protein L17 21 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein S26 13 kDa 91% 0 99% 98% 0
ribosomale protein L32 18 kDa 0 0 48% 100% 0
ribosomale protein L35 15 kDa 0 0 97% 100% 0
ribosomale protein L29 18 kDa 0 0 57% 94% 0
ribosomale protein S9 23 kDa 0 0 100% 100% 0
heterogene nukleare ribonucleoprotein H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
ribosomale protein S8 22 kDa 0 0 78% 100% 0
ribosomale protein L10 25 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein L23a 18 kDa 0 0 68% 100% 0
ribosomale protein S6 29 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomale protein L31 14 kDa 0 0 95% 100% 0
ribosomale protein S13 17 kDa 0 0 100% 99% 0
ribosomale protein L10a 25 kDa 45% 0 81% 100% 0
poly (A) bindende protein, cytoplasmisk 4 (inducerbar form) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
transmembran emp24 protein transport domæne, der indeholder 1 25 kDa 0 0 0 100% 0
EBNA1 bindende protein 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
bevaret Helix-loop-Helix allestedsnærværende kinase 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
ribosomale protein L12 18 kDa 0 0 57% 100% 0
ribosomale protein S24 15 kDa 0 0 100% 100% 0
koldt chok domæne protein A 40 kDa 0 0 0 100% 0
ribosomale protein L27a 17 kDa 0 0 89% 99% 0
heterogene nukleare ribonucleoprotein F 46 kDa 0 0 99% 99% 0
ribosomale protein L11 20 kDa 0 0 99% 100% 0
ribosomale protein L26-lignende 1 17 kDa 0 0 100% 100% 0
Casein kinase 2, alpha Prime polypeptid 41 kDa 0 0 0 100% 0
Tubulin, alpha 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
ribosomale protein L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
mitokondriel ribosomale protein L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
nucleolin 77 kDa 0 0 25 100% 0
mitokondriel ribosomale protein S21 11 kDa 0 0 93% 94% 0
KRR1, lille underenhed (SSU) processome komponent, ligner (gær) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
mitokondrie ribosomalt protein S7 28 kDa 0 0 0 100% 0
chloridkanal, nukleotidfølsom, 1A 22 kDa 0 0 97% 86% 0
i B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
guanin nucleotid binding protein-lignende 3 (nucleolar) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
mitokondriel ribosomale protein S23 22 kDa 0 0 100% 50% 0
mitokondriel ribosomale protein s22 41 kDa 0 0 0 99% 0
nukleophosmin (nukleolær glycosyleret B23, numatrin) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
ribosomale protein S19 16 kDa 0 0 0 99% 0
glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase 36 kDa 0 0 100% 0 0
Histon-klynge 1, H2bg 14 kDa 0 0 53% 72% 0
ribosomale protein S23 16 kDa 0 0 68% 0 0
Rho guaninnukleotid-udvekslings faktor (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
død associeret protein 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
mitokondriel ribosomale protein S6 14 kDa 0 0 52% 84% 0
ribosomale protein L39 6 kDa 0 0 0 87% 0
mitokondriel ribosomale protein S28 21 kDa 0 0 85% 99% 0
Histon-klynge 1, H4h 11 kDa 0 0 0 93% 0
mitokondriel ribosomale protein L43 23 kDa 0 0 0 97% 0
ribosomale protein S15 17 kDa 0 0 0 85% 0
ribosomale protein S12 15 kDa 0 0 68% 39% 0
ribosomale protein L35a 13 kDa 0 0 0 96% 0
mitokondriel ribosomale protein L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
mitokondriel ribosomale protein S14 15 kDa 0 0 45% 76% 0
fosfodiesterase 5A, cGMP-specifik 95 kDa 14 0 0 72% 0
ribosomale protein L15 24 kDa 0 0 0 56% 0
heterogene nukleare ribonucleoprotein C (C1/C2) 22 kDa 0 0 0 100% 0
mitokondriel ribosomale protein S16 11 kDa 0 0 0 92% 0
ribosomale protein S15a 15 kDa 0 0 0 91% 0
neurexin 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
Autisme modtagelighed kandidat 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
mitokondriel ribosomale protein L17 20 kDa 0 0 0 92% 0
splejnings faktor 3a, underenhed 1, 120kDa 89 kDa 0 0 56% 89% 0
La ribonucleoprotein domæne familie, medlem 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
leprecan-lignende 2 62 kDa 0 0 0 68% 0
ribosomale protein L18a 21 kDa 0 0 0 86% 0
ribosomale protein L23 15 kDa 0 0 60% 47% 0
transmembran emp24 protein transport domæne, der indeholder 9 27 kDa 0 0 0 78% 0
signal genkendelse partikel 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
Lectin, galactoside-bindende, opløseligt, 3 26 kDa 0 71% 28 0 0
mitokondriel ribosomale protein L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
H1 Histon familie, medlem X 22 kDa 0 0 0 96% 0
kasein kinase 2, beta-polypeptid 25 kDa 0 0 0 89% 0
opløst stof Carrier familie 4, natriumbicarbonat cotransporter, medlem 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
WD REPEAT-domæne 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
transkriptionsfaktor A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38% 0
ribosomale protein S16 16 kDa 0 0 75% 0 0
SP140 nukleare krop protein 92 kDa 0 0 0 64% 0
otoferlin 227 kDa 62% 0 0 0 0
Golgi transport 1B 15 kDa 0 0 0 33% 0
mitokondriel ribosomale protein S34 26 kDa 0 0 0 33% 0
ribosomale protein L30 13 kDa 0 0 0 49% 0
actin binding LIM protein 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
guanin nucleotid binding protein-lignende 2 (nucleolar) 84 kDa 40% 0 0 0 0
high density lipoprotein bindende protein 141 kDa 0 0 34% 0 0
adenosin-deaminase, RNA-specifik, B2 81 kDa 0 0 28 0 0
cystatin E/M 17 kDa 0 27 0 0 0
zink finger protein 786 80 kDa 0 0 23 0 0
pleckstrin Homology-lignende domæne, familie B, medlem 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
proteinphosphatase methylesterase 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
Janus kinase og mikrotubulus interagerende protein 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
signal genkendelse partikel 68kDa 67 kDa 0 0 0 93% 0
TBC1 domæne familie, medlem 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
mitokondriel ribosomale protein L27 16 kDa 0 0 0 89% 0
mitokondriel ribosomale protein L2 24 kDa 0 0 0 88% 0
mitokondriel ribosomale protein S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
Pentatricopeptid Gentag domæne 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
ribosomale protein, Large, P2 12 kDa 0 0 0 76% 0
IMP (inosin 5 '-monophosphat) dehydrogenase 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
Tubulin, beta 4B klasse IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
mitokondriel ribosomale protein L23 19 kDa 0 0 0 74% 0
mitokondriel ribosomale protein S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
galactose-3-O-sulfotransferase 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
suppressor af variegation 4-20 ligner 1 (Drosophila) 99 kDa 0 72% 0 0 0
mitokondriel ribosomale protein S25 20 kDa 0 0 0 70% 0
ribosomale L1-domæne, der indeholder 1 55 kDa 0 0 0 70% 0
familie med sekvens lighed 110, medlem D 29 kDa 69% 0 0 0 0
ribosomale protein L36a-lignende 12 kDa 0 0 0 66% 0
cerebellin 4 forløber 22 kDa 0 0 0 64% 0
N-acetylglucosamin-1-fosfat transferase, alfa-og beta-under enheder 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 ligner B (S. cerevisiae) 38 kDa 0 0 0 64% 0
transskription langstrakt regulator 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
homeobox a1 15 kDa 0 0 0 62% 0
phospholipid Transfer protein 49 kDa 0 0 0 62% 0
Rho GTPase-aktivering af protein 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
mitokondriel ribosomale protein S18B 29 kDa 0 0 0 52% 0
endoplasmatiske reticulum aminopeptidase 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
treparts motiv med 28 89 kDa 0 50% 0 0 0
umoden tyktarms karcinom transskriptionen 1 24 kDa 0 0 0 50% 0
PÅ Rich Interactive domæne 1A (SWI-like) 242 kDa 0 0 49% 0 0
mitokondrie ribosomale protein S17 15 kDa 0 0 0 48% 0
Pinin, desmosome associeret protein 82 kDa 0 0 0 48% 0
protein fosfatase, Mg2 +/Mn2 + afhængig, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
G patch domæne og ankyrin gentager 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
mitokondrie ribosomalt protein L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
spirende uhæmmet af benzimidazoler 3 ligner (gær) 37 kDa 0 44% 0 0 0
WD og tetratricopeptid gentager 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
proteindisulfid-isomeriase familie A, medlem 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
kazrin, periplakin, vekselvirkende protein 86 kDa 0 41% 0 0 0
coiled-spole-Helix-coiled-Coil-Helix-domæne, der indeholder 2 16 kDa 0 0 40% 0 0
varmechok protein 90kDa Alpha (cytosolic), klasse A-medlem 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
retinitis pigmentosa GTPase regulator 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (carboxy-Terminal domæne, RNA polymerase II, polypeptid A)
fosfatase, underenhed 1		 104 kDa 0 39% 0 0 0
mitokondriel ribosomale protein L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-lignende 76 kDa 0 38% 0 0 0
Dnaj (Hsp40) homolog, familien C, medlem 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
mitokondriel ribosomale protein 51 og 15 kDa 0 0 0 38% 0
bystin-lignende 50 kDa 0 0 0 38% 0
huntingtin-associeret protein 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
zink finger protein 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
celle division cyklus og apoptose regulator 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
protein tyrosin fosfatase, ikke-receptor type 13
(APO-1/CD95 (FAS)-associeret fosfatase)		 256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-et domæne, der indeholder 2 56 kDa 0 0 0 31 0
aktivering af signal kointegrator 1 kompleks underenhed 2 28 kDa 0 0 0 31 0
centrosomal protein 76kDa 74 kDa 0 30 0 0 0
polymerase (RNA) III (DNA-instrueret) polypeptid C (62kD) 61 kDa 0 0 0 30 0
5-hydroxytryptamin (serotonin) receptor 6 47 kDa 0 0 0 29 0
T celle receptor Alpha tilmelder 56 2 kDa 0 26 0 0 0
biorientering af kromosomer i celle Division 1-lignende 330 kDa 0 0 0 25 0
RAS Association og DIL domæner 114 kDa 0 0 25 0 0
WD REPEAT-domæne 66 130 kDa 0 0 0 24 0
kromosom 6 åben læse ramme 25 13 kDa 0 0 22 0 0
transmembran protein 177 34 kDa 0 0 0 21 0
neurale prækursor celle udtrykt, udviklingsmæssigt nedreguleret 4-lignende 101 kDa 0 20 0 0 0

Tabel 2: identifikation af cellulære værts faktorer, som er kompleks med nukleolar-lokaliserende rev-mutationer 4, 5 og 6 under HIV-1-produktion. Den Coomassie-farvede SDS-side gel i figur 6 blev forarbejdet til tandem massespektrometri. Protein interaktion resultater af WT rev versus nucleolar mutationer M4, M5, og M6 er opsummeret af protein identifikation sandsynlighed (i procenter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Massespektrometriske analyser, der sammenlignede rev-NoLS-mutationer og WT rev i tilstedeværelse af HIV-1, blev vurderet til at forstå nukleolarfaktorer, der var involveret i viral replikeringscyklussen. Dette vil identificere de nukleolarkomponenter, der er nødvendige for viral infektivitet. Nucleolar B23 har en høj affinitet til rev-NoLS og funktioner i nukleolar lokalisering af rev3 og nucleocytoplasmic transport af rev-bundet hiv mRNAs22. Affiniteten af B23 med rev-NoLS-mutationer, som indeholdt enkelt eller flere argininsubstitutioner, blev vurderet ved hjælp af immunopræcipitation af rev-3'flag under viral produktion (figur 2; WT og mutationer m2, M6 og M9). B23 affinitet til enkeltpunkts rev-NoLS-mutationer M4, M5 og M6 blev tidligere undersøgt i nærværelse af HIV-1-replikation. I den tidligere undersøgelse blev IP-eluater af M4, M5 og M6 udsat for vestlig blot med et antistof, der var specifikt for α-flaget for rev og B23 affinitet1. I baggrunden af rev-enkeltpunkts-mutationer blev B23-bindingsaffinitet reduceret betydeligt. B23 opretholdt affinitet med WT rev under HIV-replikation. Enkeltpunkts-mutationer induceret inden for rev-NoLS forventes at nedsætte bindingsaffinitet til andre cellulære værts faktorer, der letter HIV mRNA binding og transport. Rev-NoLS single-og multiple-point mutationer i denne model afskaffede nucleophosmin B23 affinitet til rev, hvilket indikerer en forstyrrelse i nucleocytoplasmic fjer og HIV mRNA transport. Det er sandsynligt, at nukleolarfaktorer (nucleolin C23 og nukleosomsamlings protein 1), transport faktorer (ARHGEF1 og TCB1D24) og splejnings faktorer (hnRNPC og PNN) er involveret i HIV-1-infektions cyklussen gennem interaktion med rev-protein komplekser. Tabel 1 og tabel 2 viser forskellige andre cellulære faktorer, både nucleolar og nonnucleolar i mønster, der potentielt er involveret i HIV-1 replikation cyklus gennem rev. den nucleolar faktor-Snorna C/D box 58, impliceret i snorna behandling, snoRNA transport til nucleolus, og 2 '-O-methylering af ribosomale RNA-blev identificeret endnu funktionen af dette protein i HIV-1 replikation cyklus forbliver ukendt. De specifikke roller af disse cellulære faktorer i HIV-1 infektiøse cyklus er i øjeblikket ved at blive undersøgt.

Resultaterne præsenteres her demonstrere brugen af denne metode til identifikation af virale/Host nucleolar faktorer, der opretholder HIV-1 infektiøse cyklus. Virale/Host nucleolar faktorer, der deltager i andre sygdomsmodeller kunne identificeres ved hjælp af denne fremgangsmåde. Det er endvidere sandsynligt, at en nukleolar faktor kan involvere multifunktionelle roller i forskellige sygdomsmodeller. For eksempel har B23 været impliceret i transport af nukleolar virale proteiner, viral assembly, encapsidation, replikering, og latency i andre virale infektiøse modeller. B23 er karakteriseret ved interaktioner med NoLS af cellulære faktorer for nucleocytoplasmic transport-p120 vækstfaktor (aminosyrer 40-57)23 og C23 præ-rRNA processor (aminosyrer 540 – 628)24. B23 er også dokumenteret til at interagere med den humane T-celle lymfotropic virus (HTLV-1) protein Rex (aminosyrer 1-22)25, HIV-1 TAT (aminosyrer 49 – 57)2, og HIV-1 Rev (aminosyrer 37-47)26. Den japanske encephalitis virus (JEV) genom koder en nukleolar-lokalisering af kerne protein, hvorigennem aminosyrer Gly42 og Pro43 interagerer med N-terminal regionen B23 under JEV-infektion, hvilket resulterer i transport af viral Core protein/B23 i kernen27. Det enkelt strengede RNA-genom af hepatitis B-virus (HBV) er delvist sammensat af dobbeltstrenget DNA, som koder et nukleolar-kerne protein. HBV Core protein associerede med nucleolin og B23 i nucleolus28; B23 blev påvist i HBV-samlingen gennem interaktion med kerne proteinet N-terminal domænet. Specifikt, B23 aminosyrer 259-294 binde til N-terminal domæne af HBV kerne protein til at tillade viral encapsidation29. Den negative fornuft, enkeltstrenget RNA-Hepatitis D-virus (HDV) udtrykker HDVAg-antigen i to isoformer; den lille isoform aids i RNA replikation, og den store isoform letter viral samling. RNA-replikation finder sted inden for nucleolus og kræver B23 interaktion med hdvag30,31. HDV-infektion forårsager en docetaxels opregulering af B23, som hovedsageligt interagerer med den lille hdvag isoform og mindre med den store hdvag isoform. Interaktioner foregår gennem det lille HDVAg NLS-domæne, hvorigennem B23 binder og opnår nuklear akkumulering. Ved sletning af HDV-bindingsstedet til B23 blev RNA-replikation forringet. HDVAg blev vist at colocalisere med B23 og nucleolin i nucleolus. Nucleolin blev opdaget at besidde transkriptionelle egenskaber som en repressor32, afslørende nucleolus som et rum for regulering af HDV replikation. B23 er også involveret i latenstid af Kaposis sarkom-associerede herpes virus (KSHV) genom. Kshv latent protein-v-cyclin-med Host CDK6 kinase, fosforylerer B23 på Thr199, hvilket letter B23 interaktion med latenstid associeret nukleare antigen33. Latenstid-associerede nukleare antigen virker for at forhindre viral lytisk replikation. Nedbrydning af B23 fører til KSHV reaktivering, afslørende B23 som regulator af KSHV latency. B23 funktion i HIV-1 replikation cyklus er karakteriseret i nukleocytoplasmic transport aktivitet af TAT og rev, og det er ukendt, hvis B23 kan inducere ventetid under HIV-infektion. B23's involvering i replikation, encapsidation og samling af HIV-1 er i øjeblikket ukendt.

Tilpasning af denne metode til andre sygdomsmodeller ville kræve en stor indsats og tid til generering af protein-mangelfulde infektiøse rygknogler udtrykt i de relevante cellelinjer. Fordelen ved denne rev-mangelfuld HIV-1HXB2 backbone er evnen til at undersøge rev-Nols mutationer i nærværelse af den fulde virale backbone, virale infektiøse faktorer, og Host faktorer involveret i HIV-1 replikation cyklus. Andre undersøgelser har undersøgt rev nucleolar funktion i fravær af det fulde HIV-1 infektiøse system. Grundig karakterisering af infektions-og sygdoms veje skal omfatte repræsentative miljøer, der understøtter den naturlige sygdomsprogression. To forskellige typer analyser blev gennemført og sammenlignet i evnen til at identificere nukleolar faktorer. Tabel 1 viser faktorer, der forblev bundet til WT rev som følge af direkte massespektrometri-analyse af proteineluat. Denne analyse gav flere kendte faktorer for HIV-1 rev. denne direkte metode blev sammenlignet med en anden proces, der involverer ekstraktion af protein adskilt inden for SDS-PAGE gels og massespektrometri analyse af sådanne proteiner. Denne anden metode gav en række kendte og potentielle faktorer, der er bundet til den rev protein kompleks, men manglede følgende proteiner tidligere identificeret i tabel 1: signal genkendelse partikel 14 kDa, eukaryote Translation indledning faktor 4B, ribosomale protein L22, små nucleolar RNA C/D boks 58B, og zink finger CCHC domæne, der indeholder 11. I sidste ende, den overlegne metode valgt til massespektrometri analyser i denne protokol involveret udvinding af peptider fra SDS-side gels. Den første direkte metode omfattede 2x prøve buffer i eluatet uden bromphenolblåt blå; de resterende komponenter i 2x-prøve bufferen kan forstyrre komplet trypsin-behandling og kan give ufuldstændigt forarbejdede peptider til massespektrometri-analyse. Den anden indirekte metode var i stand til at rense trypsin-behandlede peptider fra potentielle forurenende stoffer af SDS-side.

De massespektrometri præparationsmetoder, der er beskrevet her, kunne udnyttes til identifikation af terapeutiske indgreb til udryddelse af HIV-1-infektion gennem målretning rev. alle sletninger og enkeltpunkts rev-NoLS-mutationer kan undersøges for dominerende-negativ aktivitet og udnyttes i anholdelsen af rev funktion. Dominerende negative egenskaber af interesse for rev funktionel anholdelse er følgende: rev/RRE bindende affinitet; omflytning af nucleolar WT rev gennem multimerisering med rev mutanter; tab i affinitet til centrale cellulære faktorer involveret i HIV-1 mRNA transport og splejing. Rev-multimerisering, der involverer coexpression af rev-NoLS-mutationer med WT rev, kan undersøges. Dominerende negative mutationer i denne model forventes at multimerize med WT rev og Shift nucleolar mønstre mod kernen og cytoplasmaet, hvilket fører til en rev funktionel anholdelse. Massespektrometri kunne bruges til at identificere tabet af centrale cellulære faktorer involveret i HIV-1 mRNA splejsning og transport. Identifikationen af manglende interaktioner med WT rev som følge af coexpression med dominerende-negative rev-NoLS mutationer vil afsløre involvering af nukleolar-specifikke veje i HIV-1 patogenese. Alternativt kan virale HIV-1NL4-3- partikler genereret i baggrunden af rev-Nols-mutationer undersøges for alle emballerede celle faktorer. Cellulære og virale faktorer pakket i virale partikler kan identificeres yderligere gennem massespektrometri. Dette ville afsløre tilstedeværelsen af nukleolar faktorer inden for virale partikler og den rolle, identificerede nukleolar faktorer i viral infektion. De beskrevne metoder gælder for andre virale og sygdomsmodeller til identifikation og karakterisering af under studerede veje. Dette vil gøre det muligt at udvikle terapeutiske interventioner mod sygdomme, hvor der findes begrænsede behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Dr. Barbara K. Felber og Dr. George N. Pavlakis for HLfB vedlige kultur fra National Institutes of Health (NIH) AIDS forskning og reference reagens program, division af AIDS, National Institute of allergi og infektiøse Sygdomme (NIAID), NIH. Forfatterne anerkender også finansielle kilder, der leveres af NIH, tilskud AI042552 og AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Tags

Immunologi og infektion HIV-1-replikation rev Immunopræcipitation massespektrometri nucleolus B23
Identifikation af Nukleolarfaktorer under HIV-1-replikation gennem rev-Immunopræcipitation og massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, … More

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter