Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifiering av nukleolära faktorer under HIV-1-replikation genom rev immunoprecipitation och masspektrometri

Published: June 26, 2019 doi: 10.3791/59329
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 3, 1, 1,2
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

Summary

Här beskriver vi rev immunoprecipitation i närvaro av HIV-1 replikering för masspektrometri. De beskrivna metoderna kan användas för att identifiera nukleolära faktorer som är involverade i den infektiösa HIV-1-cykeln och är tillämpliga på andra sjukdomsmodeller för karakterisering av understuderade vägar.

Abstract

HIV-1 infektiös cykel kräver viral protein interaktioner med värd faktorer för att underlätta viral replikering, förpackning, och frisättning. Den smittsamma cykeln ytterligare kräver bildandet av viral/Host proteinkomplex med HIV-1-RNA för att reglera skarvning och möjliggöra nukleocytoplasmic transport. HIV-1 rev protein åstadkommer kärn exporten av HIV-1 mRNAs genom multimerization med intronic CIS-verkande mål-rev Response element (rre). En nukleolär lokalisering signal (NoLS) finns inom COOH-Terminus av Rev arginin-rika motiv (ARM), vilket gör att ansamling av Rev/RRE komplex i Nukleolus. Nucleolar faktorer spekuleras för att stödja HIV-1 infektiös cykel genom olika andra funktioner förutom medhjälp mRNA-oberoende kärnkraft export och splitsning. Vi beskriver en immunoprecipitation metod av Wild-Type (WT) rev i jämförelse med rev nukleolära mutationer (borttagande och Single-Point rev-NoLS mutationer) i närvaro av HIV-1 replikering för masspektrometri. Nukleolära faktorer inblandade i nukleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 och nukleolin C23), samt cellulära skarvning faktorer, förlorar interaktion med rev i närvaro av Rev-NoLS mutationer. Olika andra nukleolära faktorer, såsom snoRNA C/D Box 58, identifieras för att förlora interaktion med rev mutationer, men deras funktion i HIV-1 replikering cykel förblir okända. De resultat som presenteras här visar användningen av denna metod för identifiering av virala/värd nukleolära faktorer som upprätthåller HIV-1 infektiös cykel. Begreppen som används i denna metod är tillämpliga på andra virala och sjukdomsmodeller som kräver karakterisering av understuderade vägar.

Introduction

Den Nukleolus är postuleras som interaktions grunden för olika cellulära värden och virala faktorer som krävs för viral replikering. Den Nukleolus är en komplex struktur indelad i tre olika fack: den fibrillar facket, den täta fibrillar facket, och den granulat facket. HIV-1 rev protein lokaliserar specifikt inom granulat fack; orsaken till det här lokaliserings mönstret är dock okänt. I närvaro av Single-Point mutationer inom NOLS sekvens (rev mutationer 4, 5, och 6), rev upprätthåller ett nukleolära mönster och har tidigare visat sig rädda hiv-1ande HXB2 replikering, dock, med minskad effektivitet jämfört med WT rev1 . Alla Single-Point mutationer är oförmögna att upprätthålla HIV-1NL4-3 infektiös cykel. I närvaro av flera Single-Point mutationer inom NoLS sekvens (rev-NoLS mutationer 2 och 9), rev har observerats för att skingra hela kärnan och cytoplasman och har inte kunnat rädda HIV-1ande HXB2 replikering1. Målet med denna proteomik studie är att dechiffrera nukleolar samt nonnucleolar cellulära faktorer inblandade i rev-medierad HIV-1 smittsam väg. Rev immunoprecipitation villkor optimeras genom interaktion med nukleolära B23 Phosphoprotein, som tidigare har visat sig förlora interaktion med rev i närvaro av nukleolära mutationer.

Rev cellulära faktorer har studerats utförligt i det förflutna; emellertid, detta har gjorts i avsaknad av viral patogenes. Ett protein, i synnerhet, som kännetecknas i denna studie genom rev interaktion under hiv-1 replikering är den nukleolära fosfoprotein B23-även kallad nukleofobi (NPM), numatrin, eller NO38 i amfibier2,3, 4. B23 uttrycks som tre isoformer (NPM1, NPM2, och NPM3)-alla medlemmar av nukleoforsmin/nukleokplasmin kärn-förkläde familj5,6. Den NPM1 molekylära förkläde funktioner i rätt sammansättning av nukleosomer, i bildandet av protein/nukleinsyra komplex inblandade i kromatin högre ordningens strukturer7,8, och i förebyggande av aggregering och felaktig uppfällning av målproteiner genom en N-Terminal kärn domän (rester 1-120)9. NPM1 funktionalitet sträcker sig till Ribosomen Genesis genom transport av preribosomala partiklar mellan kärnan och cytoplasman10,11, behandling av preribosomalt RNA i den interna transkriberade spacer sekvens 12,13, och arrestera nukleolära aggregering av proteiner under ribosomal församling14,15. NPM1 är inblandad i hämning av apoptos16 och i stabiliseringen av tumörsuppressorer ARF17,18 och p5319, avslöjar dess dubbla roll som en onkogen faktor och tumör suppressor. NPM1 deltar i cellulära aktiviteter av genomstabilitet, centrosom replikering, och transkription. NPM1 finns i nukleolerna under cellcykeln Interphase, längs kromosomala periferin under Mitos, och i prenukleolar organ (PNB) vid avslutningen av Mitosen. NPM2 och NPM3 är inte lika väl studerade som NPM1, som genomgår förändrade uttrycks nivåer under malignitet20.

NPM1 dokumenteras i nukleocytoplasmic shuttling av olika nukleära/nukleolära proteiner genom en intern NES och nls9,21 och rapporterades tidigare att driva den nukleära importen av hiv-1 tat och rev proteiner. I närvaro av B23-binding-domän-β-galaktosidas fusion proteiner, tat mislocalizes inom cytoplasman och förlorar transactivation aktivitet; Detta visar en stark affinitet av TAT för B232. En annan studie etablerat en rev/B23 stabil komplex i avsaknad av RRE-innehållande mRNAs. I närvaro av RRE mRNA, rev separerar från B23 och binder företrädesvis till HIV RRE, vilket leder till förskjutning av B2322. Det är okänt var, på subnukleär nivå, tat transaktivering och rev Exchange-processen för B23 för HIV mRNA äga rum. Båda proteiner antas för att komma in i Nukleolus samtidigt genom B23 interaktion. Medverkan av andra värd cellulära proteiner i hiv nukleolära vägen väntas. De metoder som beskrivs i denna proteomik undersökning kommer att bidra till att belysa samspelet mellan Nukleolus med värd cellulära faktorer inblandade under HIV-1 patogenes.

Den proteomik undersökningen inleddes genom uttrycket av Rev NoLS Single-Point mutationer (M4, M5, och M6) och multipla arginin substitutioner (m2 och M9) för HIV-1ande HXB2 produktion. I denna modell, en hela cell linje stabilt uttrycker rev-brist hiv-1ande HXB2 (hlfb) är transfekterade med WT rev och rev nukleolära mutationer som innehåller en flagga tagg vid 3 ' End. Närvaron av WT rev kommer att tillåta viral replikering inträffa i HLfB kultur, i jämförelse med rev-NoLS mutationer som inte rädda rev-brist (m2 och M9), eller tillåta viral replikering inträffa men inte lika effektivt som WT rev (M4, M5, och M6)1. Cellen lysate samlas 48 h senare efter viral proliferation i närvaro av Rev uttryck och utsätts för immunoprecipitation med en lysis buffert optimerad för rev/B23 interaktion. Lyseringsbuffert optimering med varierande saltkoncentrationer beskrivs, och proteinelueringmetoder för HIV-1 Rev jämförs och analyseras i silver-färgade eller Coomassie-färgade SDS-PAGE Gels. Den första proteomikmetoden innebär direkt analys av ett eluerat prov från uttryckta WT rev, m2, M6 och M9 av tandem masspektrometri. En andra metod som eluater av WT rev, M4, M5 och M6 genomgick en gel utvinning process jämförs med den första metoden. Peptid tillhörighet till rev-NoLS-mutationer i jämförelse med WT rev analyseras och sannolikheten för protein identifiering visas. Dessa metoder avslöjar potentiella faktorer (nukleolar och nonnucleolar) som deltar i HIV-1 mRNA transport och skarvning med rev under HIV-1 replikering. Sammantaget är de beskrivna cell Lys-, IP-och elutionsförhållandena tillämpliga på virala proteiner av intresse för förståelsen av värden cellulära faktorer som aktiverar och reglerar smittsamma vägar. Detta är också tillämplig på studier av cellulära värden faktorer som krävs för persistens av olika sjukdomsmodeller. I denna proteomik modell, HIV-1 rev IP är optimerad för B23 interaktion för att belysa nukleolära faktorer inblandade i nukleocytoplasmic shuttling aktivitet och HIV-1 mRNA bindning. Dessutom, cellinjer stabilt uttrycker infektionssjukdomar modeller som är bristfällig för viktiga proteiner av intresse kan utvecklas, liknande HLfB cell linjen, att studera smittsamma vägar av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell odling

  1. Upprätthålla HLfB i Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, och 1 mM natrium pyruvat inom vävnad-kultur-behandlade 100 mm plattor. Håll cellkulturerna vid 37 ° c i en fuktad inkubator som levereras med 5% CO2. Passage konfluenta celler till en celltäthet av 1 x 106 celler/ml.
  2. Kassera cell odlingsmediet. Skölj cellerna varsamt med 10 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort och kassera 1x PBS utan att störa cell skiktet.
  3. Tillsätt 2 mL 1x trypsin-EDTA-lösning till cellerna. Vagga skålen för att belägga enskiktslager och inkubera vid 37 ° c i en fuktad kammare i 5 min.
  4. Tryck hårt på sidan av skålen med handflatan för att lossa cellerna. Omsuspendera de fristående cellerna i 8 mL färsk odlingsmaterial. Snurra cellerna på 400 x g i 5 min.
  5. Kassera kulturmedia utan att störa cellpelleten. Omsuspendera cellpelleten i 10 mL färsk odlings media. Subkultur 1 mL koncentrerade celler med 9 mL färsk odlingsmaterial inom vävnads-kulturbehandlade 100 mm plattor.
    Anmärkning: för varje rev-NoLS mutation, 3x 100 mm HLfB eller HeLa kultur plattor kommer att ge tillräckligt med proteinlysat för Western blot-analys och masspektrometri. Lägg till extra plattor för en WT rev positiv kontroll och negativ kontroll. Subkulturen cell volymen kommer att kräva optimering med hjälp av olika celltyper.

2. uttryck för rev-NoLS-3 ' Flag mutationer under HIV-1 replikering

  1. Odla HLfB cellkultur till en celltäthet av 2 x 106 celler/ml. Bered 4 mL kalciumfosfat-DNA-fjädring för varje 100 mm-platta enligt följande.
    1. Etikett 2 15 mL rör som 1 och 2. Tillsätt 2 mL 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl och 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) till rör 1. Tillsätt TE 79/10 (1 mM Tris-HCl och 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) till tub 2. Volymen av TE 79/10 är 1,760 mL-volymen av DNA.
    2. Tillsätt 20 μg plasmid som innehåller den rev-NoLs-3 ' Flag mutation av intresse för röret 2 och blanda dess innehåll genom resuspension. Tillsätt 240 μL 2 M CaCl2 till tub 2 och blanda igen genom resuspension.
    3. Överför blandningen av röret 2 till röret 1 dropwise, försiktigt blanda. Låt fjädringen sitta vid rumstemperatur i 30 min. Vortex nederbörden.
  2. Tillsätt 1 ml av suspensionen droppvis till var och en av 3-cells kulturen, 100 mm plattor medan försiktigt virvlande mediet. Returnera plattorna till inkubatorn och lämna transfektionsmeten i 6 h. Byt ut transfektionsmeten mot 10 mL färsk odlings media och inkubera cellerna i 42 h.

3. insamling av viral proteinlysat

  1. Kassera cellmedia 48 h posttransfektion. Placera varje 100 mm plåt på en bädd av is. Märk 15 mL rör för varje rev-NoLS-mutationsprov och placera rören på isen.
  2. Skölj cellerna varsamt med 10 mL prekyld 1x PBS utan att störa cell skiktet. Kassera 1x PBS. Tillsätt 3 mL lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl och 1% X-100 rengöringsmedel [se tabellen med material]), behandlade med proteashämmare cocktail, till var och en av de 100 mm plattorna.
  3. Använd en cell skrapa för att störa cell skiktet. Luta plattan och försiktigt skrapa och samla in cellerna i en pool. Samla in cellen lysate med en 1 000 μl mikropipett och blanda cell celllysat från var och en av de 3 100 mm plattorna i den förmärkta 15 ml röret.
  4. Inkubera cellen lysate på is för 15 min, vortexa var 5 min. Centrifugera cellen lysate på 15 000 x g för 5 min.
  5. Samla proteinet supernatanten utan att störa cellen skräp pellets och överföra den till en annan steril 15 mL rör. Få viral proteinlysatkoncentrationen med hjälp av Bradford-metoden (se avsnitt 4).
  6. Spara en alikvot av ingångs provet (20 μg) för västerländsk immunoblot-analys. Tillsätt 2x provbuffert (20% glycerol, 0,02% bromfenolblått, 125 mM Tris-cl [pH 6,8], 5% SDS och 10% 2-merkaptoetanol) till den slutliga volymen. Koka den vid 95 ° c i 10 min, och förvara inmatnings provet vid-20 ° c.

4. Bradford analys

Anmärkning: Förbered 10X bovint serum albumin (BSA) från 100x BSA lager innan du genererar protein standardkurvor.

  1. Alikvot till mikrocentrifugrör för följande blank-och standard: blank = 800 μL; Standard 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standard 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standard 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standard 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standard 5 = 10 mg/mL, 790 μL. alikvot 10X BSA i följande utsedda standarder: standard 1 = 2 μL; Standard 2 = 4 μL; Standard 3 = 6 μL; Standard 4 = 8 μL; Standard 5 = 10 μL.
  2. Bered en blandning av proteinprover genom att blanda 795 μL vatten med 5 μL proteinprover. Tillsätt 200 μL protein test Dye-reagens (se material tabellen) för varje blind-, standard-och protein prov. Vortex proverna kort för en jämn blandning och inkubera i rumstemperatur (18-20 ° c) i 5 min.
  3. Överför blank-, standard-och proteinproverna till cuvettes. Mät proteinkoncentrationerna vid en OD på 595 nm.

5. coimmunoprecipitation av Rev-NoLS-3 ' Flag

  1. Skölj 25 μL m2 affinitet gel pärlor (se tabellen av material) med 500 μl av lysis buffert, behandlas med proteas inhibitor cocktail. Skölj mer affinitet gel pärlor för varje mutation prov och kontroller.
    Anmärkning: Förbered tillräckligt m2 affinitet gel pärlor för två geler (50 μL)-en för västra immunoblot analys och den andra för protein färgning och masspektrometri.
  2. Snurra på 820 x g i 2 min vid 4 ° c. Ta bort supernatanten. Skölj 2x mer.
  3. Tillsätt viral proteinlysat (1 mg/mL i 5 mL total volym) till de prerinsed m2 affinitetspärlorna. Justera den totala volymen med hjälp av lyseringsbuffert.
  4. Inkubera reaktionen i 3 timmar, rotera vid 4 ° c. Centrifugera m2 affinitetspärlor/viral proteinlysat vid 820 x g i 1 min.
  5. Samla supernatanten och spara en alikvot av post-IP-prov (20 μg) för västerländsk immunoblot analys. Mät protein koncentrationen efter IP-lysat. Samla 20 μg för västerländsk Immunoblotting.
  6. Lägg till 2x-exempelbufferten till den slutliga volymen. Koka den vid 95 ° c i 10 min, och förvara post-IP provet vid-20 ° c.
  7. Skölj m2 pärlor med 750 μL av lysis buffert och tvätta pärlorna på en rotator vid 4 ° c i 5 min. Centrifugera m2 pärlor på 820 x g och Kassera supernatanten.
  8. Upprepa steg 5,7 för ytterligare två tvättar på en rotator vid 4 ° c i 5 minuter. Efter den tredje tvätten, ta bort alla spår av lysis buffert från m2 pärlor/Co-IP-komplexet med en lång gel-loading spets.
    Anmärkning: Nyp i änden av gel-loading spets med platt pincett innan du tar bort några spårmängder av lyseringsbufferten. Detta kommer att förhindra störningar och upptag av m2 pärlor.
  9. Omsuspendera m2 pärlor i 55 μL av 2x lastbuffert. Koka provet vid 95 ° c i 10 min.
  10. Fyll på 25 μL eluat på två separata geler med SDS-sida (en gel för västerländsk Immunoblotting och den andra för Coomassie färgning).

6. beredning av SDS-PAGE Gels

  1. Cast 2 15% SDS-akrylamid lösa geler genom att blanda följande reagenser i en 50 mL tub (vid en slutlig volym av 40 mL, tillräckligt för fyra geler): 4,16 mL ultrarent vatten, 15 mL 40% akrylamid: bisacrylamid (29:1), 10 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 400 μL av 10% SDS, 400 μL av 10% ammoniumpersulfat och 40 μL TEMED.
  2. Blanda lösnings gelen genom att invertera 50 mL-röret flera gånger. Pipettera den lösa gel blandningen i en förlutad Western gel-apparat (fyra geler-tre för västerländsk Immunoblotting och en för Coomassie/silver färgning).
  3. Pipettera försiktigt tillräckligt med vatten för att täcka det översta lagret av gel blandningen. Låt den lösa gelen att polymerisera.
  4. Häll vattenskiktet från lösa gel, med hjälp av en delikat uppgift torkar (se tabellen av material) för att absorbera överflödigt vatten.
  5. Kasta två 5% SDS-akrylamidstapling geler genom att blanda följande reagenser i en 50 mL tub (vid en slutlig volym av 20 mL, tillräckligt för fyra geler): 11,88 mL ultrarent vatten, 2,5 mL av 40% akrylamid: bisacrylamid (29:1), 5,2 mL av 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 μL av 10% SDS, 200 μL av 10% ammoniumpersulfat och 20 μL TEMED.
  6. Blanda Staplings gelen genom att invertera 50 mL-röret flera gånger. Pipettera den stapling gel blandningen ovanför lösa gelen till toppen av apparaten.
  7. Placera en gel kassett kam som innehåller lämpligt antal körfält i Staplings gelen. Absorbera alla spill av gel blandningen med hjälp av en delikat uppgift torkar (se tabellen av material). Låt Staplings gelen att polymerisera helt.
  8. Översvämma den västerländska gel apparaten med 1x västlig löpbuffert (5x koncentration: 250 mM Tris-cl [pH 8,3], 1,92 M glycin, 0,5% SDS och 10 mM EDTA).
  9. Dra försiktigt ut gel kassetts kammen från Staplings gelen. Låt 1x västlig löpbuffert fylla Last brunnarna. Spola varje brunn med 1x västlig löpbuffert med hjälp av en spruta innan proverna lastas.
  10. Ladda västra immunoblot prover i varje motsvarande gel (input prover, coimmunoprecipitated prover, och efter IP-prover). Fyll på de västerländska gel protein markörerna.
  11. Ladda coimmunoprecipitated prover för Coomassie/silver färgning i en annan gel. Fyll på de västerländska gel protein markörerna.
  12. Anslut den rinnande gelapparaten till en strömkälla och kör gelen vid 100 V tills laddnings färgen når den lösa gelen. Öka spänningen till 140 V tills lastning färgämne når botten av lösa gelen.

7. Western blot-överföring

  1. Demontera den västerländska gel apparaten. Skiva och kassera stapling gel, lämnar lösa gelen intakt.
  2. Överför försiktigt de lösa gelen till en ren bricka fylld med västra överföringbufferten (25 mM Tris, 194 mM glycin, 0,005% SDS, 20% metanol) och blötlägg dem i 15 min.
  3. Montera gel överförings apparaten enligt följande.
    1. Skär tre PVDF överföring membran och sex stycken filtrerpapper (se tabellen av material) till storleken på den lösa gelen.
    2. Blötlägg PVDF-membranet i metanol i 5 min. återfukta den i vatten i 5 min. Placera PVDF-membranet i den västra överföringbufferten tills den är klar att användas.
    3. Placera gel hållaren kassetten i en glas bakplåt fylls delvis med västra överföringskorten, med den svarta sidan längst ner.
    4. Placera en skum dyna indränkt med västra överföringbufferten mot den svarta sidan av gel hållaren kassetten.
    5. Blöt en bit filtrerpapper i västra överföringsbufferten och placera den ovanpå skumdynan. Placera lösnings gelen ovanpå filterpapperet.
      Notera: placera lösnings gelen i rätt lastnings orientering som ska överföras till PVDF-membranet.
    6. Placera en PVDF överföring membran ovanpå lösa gelen. Blöt en bit filtrerpapper med Western överföring buffert och placera den ovanpå PVDF överföring membran.
    7. Placera en annan skum pad indränkt med västra överföringbufferten ovanpå filterpapperet. Vik försiktigt den vita sidan av gel hållaren kassetten ovanpå den indränkta skumdynan. Lås kassetten ordentligt.
    8. Placera gel hållaren i överförings apparatens elektrod enhet. Upprepa steg 7.3.4-7.3.8 för varje återstående lösa gel.
    9. Fyll överförings apparat behållaren med västra överföringsbufferten. Placera en omrörnings stång i apparat tanken.
    10. Placera apparat tanken ovanpå en rör platta. Justera rör inställningen till 5-6, att se till att rör bar inte fastnat eller slå gel hållaren kassetter.
    11. Anslut gel överförings apparaten till en strömkälla och överför gelen vid 100 V i 1 h vid 4 ° c.

8. Immunoblotting

  1. Ta bort gel hållaren kassetten och placera den svarta sidan nedåt mot en ren glas bakplåt. Öppna kassetten och kassera försiktigt skumdynan och filtrerpapperet. Markera ett hörn av PVDF-membranet för att identifiera rätt lastnings orientering. Håll membranet vått.
    Obs: PVDF-membranet kan lufttorkas och förvaras i en ren, sluten behållare. Rehydrera membranet genom att upprepa steg 7.3.2.
  2. Placera membranet i 100 mL blockerande lösning (5% mjölk, 1x TBS och 0,1% Tween 20). Blockera membranet genom att försiktigt gunga i rumstemperatur (18-20 ° c) i 1 h.
  3. Skär över membranet ovanför 25 kDa protein markör. Placera den övre delen av membranet, som innehåller protein band större än 25 kDa, i blockerande lösning som innehåller B23 Mouse monoklonala IgG1 (1:500 utspädning). Block över natten, gunga vid 4 ° c.
  4. Placera den undre delen av membranet, som innehåller protein band som är mindre än 25 kDa, i blockerande lösning innehållande m2 mus monoklonal IgG1 (1:1000 utspädning, se tabell över material). Block över natten, gunga vid 4 ° c.
  5. Tvätta membranet 3x i 10 min i 25 mL Western Wash-lösning (1x TBS, 0,1% Tween 20) på en gungande plattform.
  6. Inkubera membranen i get-anti-Mouse IgG1-HRP (1:5000 spädning) utspädd i blockerande lösning för 1 h vid rumstemperatur. Tvätta membranet 3x i 10 min i 25 mL Western Wash-lösning på en gungande plattform.
  7. Förbered kemiluminescens västerländska blotting substrat. Använd en P1000-mikropipett för att lägga till underlaget i membranet.
  8. Utveckla varje membran i kemiluminescens Western blotting substrat för 5 min. ta bort membranet från underlaget. Absorbera överflödigt substrat med hjälp av en delikat uppgift torkar (se tabellen av material).
  9. Placera membranet i en ren plåt beskyddare tejpade på insidan av en kassett. Ta kassetten till ett mörkt rum och placera ett ark film i kassetten. Lås kassetten på plats och inkubera i 5 – 15 minuter. ta bort filmen från kassetten och utveckla den.

9. Coomassie färgning

  1. Demontera den västerländska gel apparaten. Skiva och kassera stapling gel, lämnar lösa gelen intakt. Överför försiktigt den lösa gelen till en ren bricka fylld med 25 ml ultrarent vatten.
  2. Inkubera gelen på en gungande plattform i 15 min. Använd mild Rocking för att förhindra att lösa gelen från att bryta. Kassera ultrarent vatten och upprepa tvättsteg 2x mer.
    Anmärkning: om SDS bubblor kvar efter tvättsteg, kan gelen tvättas i ultrarent vatten över natten. Rester av säkerhetsdatablad kan orsaka hög bakgrunds färgning av gelen.
  3. Blanda Coomassie Stain reagens genom att invertera flaskan (se material tabellen). Placera 100 mL Coomassie Stain reagens för att täcka lös gelen och inkubera gelen på en gungande plattform för 1 h. Kassera Coomassie Stain reagens och tvätta gelen i avjoniserat vatten på en gungande plattform i 15 min.
  4. Kassera avjoniserat vatten. Upprepa tvättsteget 2x mer. Fortsätt att tvätta gelen tills önskad upplösning av protein banden observeras.

10. silver färgning

  1. Demontera den västerländska gel apparaten. Skiva och kassera stapling gel, lämnar lösa gelen intakt. Överför försiktigt den lösa gelen till en ren bricka fylld med 25 ml ultrarent vatten.
  2. Inkubera gelen på en gungande plattform i 15 min. Använd mild Rocking för att förhindra att lösa gelen från att bryta. Kassera ultrarent vatten och upprepa tvättsteg 2x mer.
    Anmärkning: om SDS bubblor kvar efter tvättsteg, kan gelen tvättas i ultrarent vatten över natten. Rester av säkerhetsdatablad kan orsaka hög bakgrunds färgning av gelen.
  3. Fixera gelen i 30% etanol: 10% ättiksyralösning (6:3:1 vatten: etanol: ättiksyra) över natten vid rumstemperatur. Tvätta gelen i en 10% etanollösning i 5 min vid rumstemperatur. Byt etanollösningen och tvätta i ytterligare 5 min.
  4. Förbered sensibiliserande arbetslösning från Pierce silver Stain kit genom att blanda en del silver fläck sensibiliserande med 500 delar ultrarent vatten (50 μl av sensibiliserande med 25 ml ultrarent vatten). Inkubera lösa gelen i sensibiliserande arbetslösning för 1 min. Tvätta gelen i ultrarent vatten i 1 min, Byt ut vattnet och tvätta gelen igen i 1 min.
  5. Förbered fläcken arbetande lösning genom att blanda en del silver fläck förstärkare med 50 delar silver fläck (500 μL av förstärkare med 25 mL silver fläck). Inkubera gelen i bets arbetslösning i 30 min.
  6. Förbered utvecklare arbetslösning genom att blanda 1 del silver fläck förstärkare med 50 delar silver fläck utvecklare (500 μL av förstärkare med 25 mL utvecklare). Bered 5% ättiksyralösning som stopplösning. Tvätta gelen med ultrarent vatten i 1 min, Byt ut vattnet och tvätta gelen i ytterligare 1 min.
  7. Byt ut vattnet mot utvecklarens arbetslösning och inkubera tills önskad proteinbandsintensitet är löst (5 min). Byt ut arbetslösningen för utvecklare med stopplösning och inkubera i 10 minuter.

11. i-gel reduktion, alkylering, och nedbrytning av Coomassie-färgade gel band

  1. Skär gel banden från gelen med ett rent rakblad. Skär varje gel band i ca 5 mm kuber och placera dem i en ren 0,5 ml mikrocentrifug röret.
  2. Destain gel bitarna genom att täcka dem med 100 mM ammoniumbikarbonat i 1:1 acetonitril: vatten vid rumstemperatur i 15 min. Kassera supernatanten. Upprepa det här steget.
  3. Torka gel bitarna i 5 min i en vakuum centrifug. Reducera proteinerna genom att täcka de torkade gel bitarna med 10 mM ditiothreitol i 100 mM ammoniumbikarbonat och inkuberera dem i 1 h vid 56 ° c.
  4. Pipettera av någon supernatant. Alkylat proteinerna genom att täcka gel bitarna med 100 mM iodoacetamid i vatten och inkuberande dem för 1 h vid rumstemperatur i mörker.
  5. Pipettera av supernatanten och krympa gel bitarna genom att täcka dem med acetonitril och skaka dem försiktigt vid rumstemperatur i 15 min. Pipettera av supernatanten och reswell gel bitarna genom att täcka dem med 100 mM ammoniumbikarbonat och skaka dem i rumstemperatur i 15 min.
  6. Upprepa steg 11,5. Torka gel bitarna i 5 min i en vakuum centrifug.
  7. Täck gel bitarna med 50 ng/μL sekvenserings grad modifierad trypsin (se tabell över material) i 100 mm ammoniumbikarbonat. Låt gelen att svälla i 5 min; Pipettera sedan bort eventuell kvarvarande lösning. Täck gel bitarna med 100 mM ammoniumbikarbonat och låt dem reswell helt, lägga till ytterligare 100 mM ammoniumbikarbonat så att gelen bitarna är helt täckta.
  8. Inkubera gel bitarna över natten vid 37 ° c. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 1/10 av volymen 10% myrsyra i vatten. Samla supernatanten från varje tub.
  9. Extrahera gel bitarna genom att täcka dem med 1% myrsyra i 60% acetonitril och inkuberande dem för 15 min med mild skakning.
  10. Minska volymen av de kombinerade supernatanterna till mindre än 20 μL i en vakuum centrifug, samtidigt som du noga med att undvika att torka supernatanterna helt. Tillsätt 1% myrsyra för att få tillbaka den totala volymen till 20 μL.

12. vätskekromatografi/masspektrometri

Anmärkning: proverna analyserades med hjälp av en masspektrometer utrustad med Ultra HPLC, en Nanospray-källa och en kolonn (se tabell över material). Lösningsmedel A och B är 0,1% myrsyra i vatten respektive acetonitril.

  1. Ladda smält proteiner i hög återhämtning polypropylen autosampler flaskor. Fyll på injektionsflaskorna i ett UPLC-Systems prov hanterare.
  2. Injicera 6 μL av varje prov. Fyll på varje prov på nanoklinkers svällningskolonn i 1,5 min vid 8 μL/min med 99% spädningsvätska A/1% spädningsvätska B.
  3. Eluera peptiderna i masspektrometern med en linjär gradient från 3% till 35% av lösningsmedel B över 30 min, följt av en gradient från 35% till 50% av lösningsmedel B över 4 min och 50% till 90% av lösningsmedel B över 1 min. underhålla 90% acetonitril för 3 min; minska sedan% B tillbaka till 3% över 5 min.
  4. Förvärva positiva Jon profil massa spec data i upplösning (20 000 upplösning) läge. Hämta data från 100 till 2 000 da med en hastighet av en genomsökning varje 0,6 s. Hämta data i MSE -läge genom att växla skanningar utan kollision energi och skannar med förhöjd kollision energi.
  5. För förhöjd kollision energi, ramp kollisionen energin i fällan cellen från 15 V till 40 V. förvärva en Lås massa Skanna var 30 s, med hjälp av + 2 Ion av [GLU1]-fibrinopeptide B som lås massan. Förvärva en datafil med en tom injektion av lösningsmedel A, med samma förvärvsmetod mellan varje par av prover för att styra överföring.

13. data analys för masspektrometri

  1. Kopiera masspektrometri resultat filer till datorn som kör en kvantitativ och kvalitativ proteomik forskningsplattform (t. ex., ProteinLynx global Server). Dataanalys är mycket CPU-intensiva och bör utföras på en separat högpresterande dataanalys dator.
  2. Skapa ett nytt projekt för data. Skapa en ny mikrotiterplatta som representerar autosamplerplattan. Tilldela proverna till samma position i mikrotiterplattan som deras position i autosampler.
  3. Tilldela varje exempel bearbetningsparametrar. Parametrar som ska användas är automatisk kromatografisk topp bredd och MSTOF-upplösning. låg energi tröskel, 100 räknas; förhöjd energi tröskel, 5 antal; tröskelvärde för intensitet, 500 räknas.
  4. Tilldela varje exempel Arbetsflödesparametrar. Parametrar att använda är databas, sammanfogad mänsklig SwissProt och HIV, med omvända sekvenser; automatisk peptid och fragment tolerans; minsta fragment Ion tändstickor per peptid, 3; minsta fragment Ion tändstickor per protein, 7; min peptid tändstickor per protein, 1; primärt sammanfattat reagens, trypsin; missade klyvning, 1; fasta modifieringsmedel, karbamidometyl C; variabla modifierreagenser, oxidation M; falsk identifierings frekvens, 100.
  5. Markera exemplen och välj bearbeta senaste rå data. När sökningen är klar väljer du exemplen och väljer Exportera data till scaffold (version 3). Öppna ställningen, skapa en ny fil och importera varje fil som exporteras från proteomik-plattformen som ett nytt bio prov med hjälp av prekursorjonkvantifiering.
  6. När alla filer har importerats fortsätter du till skärmen Ladda och analysera data . Välj samma databas som används för Sök-och import data med hjälp av LFDR scoring och standard experiment hela proteingruppering. Ställ in visningsalternativ för sannolikhet protein identifiering, protein tröskeln till 20%, det minsta antalet peptider till 1, och peptid tröskeln till 0% under analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rev-NoLS Single-och multipel-punkt arginin-mutationer, som motsvarar en mängd olika subcellulära lokaliserings mönster, undersöktes i deras förmåga att interagera med cellulära värd faktorer i jämförelse med WT rev. WT rev-3 ' Flag och pcDNA-Flag vektor uttrycktes i HLfB-kultur. Protein komplex behandlades från total cell lysate och färgas med silver fläck reagens. Rev-NoLS-3 ' Flag är detekterbar (ca 18 kDa) i tre olika lysis buffert villkor som innehåller olika koncentrationer av NaCl (137 mM, 200 mM, och 300 mM) i figur 1. B23 var detekterbar (37 kDa) i lyseringsbuffert innehållande lägre saltkoncentration (137 mM, körfält 2 – 4), knappt detekterbar i lyseringsbuffert innehållande 200 mM NaCl, och omätbara i lyseringsbuffert som innehåller en hög saltkoncentration (300 mM NaCl). I figur 2, WT rev-3 ' Flag, rev-NOLS M1-tre ' flagga, och pcDNA-flagga vektor uttrycktes i hlfb kultur. Protein komplex bearbetades från totala cell lysat som framställts från två lyseringsbuffertzoner (137 mM och 200 mM NaCl). M2 Mouse monoklonal IgG1 användes för detektion av Rev-3 ' Flag uttryck från cell Lysates. B23 Detection var optimal i lyseringsbufferten som innehöll 137 mM NaCl med WT rev-3 ' Flag (input och α-Flag-rev IP) men förlorade affinitet med rev-NoLS M1-3 ' flagga. B23 affinitet med WT rev-3 ' Flag minskade med en högre saltkoncentration i lyseringsbuffert innehållande 200 mM NaCl. pcDNA -negativ kontroll gav inte icke-specifik immunodetektion i input och α-Flag-rev IP för alla lyseringsbuffertens villkor.

Elueringförhållandena optimerades för rev-NoLS-3 ' Flag IP i figur 3. WT rev-3 ' Flag och pcDNA-flagga vektor uttrycktes i hlfb kultur. Protein komplex bearbetades från totala cell celllysat och eluerade med hjälp av tre olika villkor för att utrota ljus och tung kedja bakgrund (25 och 50 kDa)-2x prov lastning buffert vid 37 ° c för 15 min, 2x prov lastning buffert vid 95 ° c för 3 min, och 3x flagga peptid e vid 4 ° c i 30 min. rev NoLS-3 ' Flag (~ 18 kDa) var mest detekterbar efter eluering genom kokning i 2x prov lastbuffert. B23 (~ 37 kDa) var detekterbar under två förhållanden-37 ° c inkubering i 2x prov lastning buffert för 15 min och 95 ° c inkubering i 2x prov lastbuffert för 3 min.

M2 (nukleära/nukleolära i lokalisering, fungerar inte i hiv-1ande HXB2 produktion), M6 (nukleolar i mönster, funktionell i hiv-1ande HXB2 produktion), och M9 (dispergerad i cytoplasman/kärnan, fungerar inte i viral produktion) var uttrycks i HLfB kultur. Protein komplex bearbetades från total cell lysate, eluerad genom 95 ° c inkubering i 2x prov lastning buffert för 3 min, och lösas i silver fläck reagens (figur 4). WT rev var detekterbar efter IP flagga reaktion. Rev-NoLS m2, M6, och M9 var också detekterbara vid 18 kDa. Band motsvarande B23 protein observerades vid 37 kDa markör. Protein komplex observerades ytterligare i varje körfält som motsvarar IP-reaktioner av WT rev, m2, M6, M9 och pcDNA negativ bakgrundskontroll. Protein celllysat analyserades genom immunodetection för α-Flag-rev och B23. Riklig WT rev och måttlig nivåer av M6 uttrycktes (α-flagga input) och detekterbar efter flagg IP (α-Flag-rev IP, figur 5). M2 och M9 var inte högt uttryckt från 20 μg protein lysate input men detekterbar vid låg intensitet efter flagg IP från 5 mg proteinlysat. pcDNA negativ kontroll gav inte icke-specifik immunodetektion i input och α-Flag-rev IP. B23 affinitet med WT rev observerades efter IP-flagga reaktion (B23 Co-IP). B23 affinitet observerades något med m2 (två Single-Point mutationer R48, 50G) och M6 (Single-Point mutation R50G). B23 affinitet förlorades i närvaro av tre Single-Point mutationer av M9 (R46, 48, 50G) inom rev-NoLS.

Totalt celllysat från immunoprecipitated WT rev och rev-NOLS-3 ' Flag mutationer (4, 5, 6 och 8) behandlades, färgas med Coomassie reagens, och visualiseras i jämförelse med BSA seriella utspädningar (höger panel). Rev-NoLS-3 ' Flag är detekterbar (12,5-25 μg) i närvaro och frånvaro av mutationer vid 18 kDa (figur 6). Protein komplex som bearbetas från IP-reaktioner av WT rev-3 ' Flag, nucleolar-lokalisera rev-NoLS-3 ' Flag mutationer (M4, M5 och M6), och negativ kontroll pcDNA-flaggan var visualiseras i SDS-Page geler färgade med Coomassie reagens (figur 7). WT rev (WT1 och WT2) var detekterbar efter IP flagga reaktion vid 18 kDa. Rev-NoLS mutationer var något detekterbara efter uttryck i HLfB och IP-flagga reaktion. pcDNA negativ kontroll gav inte ospecifik bakgrund vid 18 kDa.

Immunoprecipitated celllysat förberett från WT rev-3 ' Flag, m2, M6, M9, och negativ kontroll pcDNA-flaggan (visas i figur 4) analyserades av tandem masspektrometri. Sannolikhet för protein identifiering (i procent) visas för jämförelse av proteininteraktioner som inträffar med varje nukleolär-localizing rev-NoLS-mutation kontra WT rev (tabell 1). Cellulära proteiner, av vilka några är nukleolära i lokaliserings mönster (ribosomala isoformer, eukaryotisk översättning initierings faktor 48, snoRNA C/D Box 58B, och nukleophosmin B23), identifierades som direkta/indirekta bindande partners av WT rev. dessa nukleolära faktorer förlorade bindnings affinitet till m2 (två Single-Point mutationer R48, 50G), M6 (Single-Point mutation R50G), och M9 (tre Single-Point mutation R46, 48, 50G), liknande pcDNA negativ kontroll. Varje körfält i den Coomassie-färgade gelen i figur 6 behandlades för tandemmasspektrometri (tabell 2). Peptid tillhörighet till rev-NoLS-mutationer analyserades och visades med sannolikhet för protein identifiering (i procent). En mängd olika cellulära proteiner, av vilka några är nukleolära i lokalisering mönster (nukleolin C23, nukleophosmin B23, och nukleosome församlingen protein), identifierades som direkta/indirekta proteinbindnings faktorer för WT rev. dessa nukleolära faktorer var inte som är identifierade för bindning med M4, M5 och M6. Transport faktorer ARHGEF1 (RHO guanin nukleotid utbyte faktor 1) och TBC1D24 (TCB1 domän familj, medlem 24) förlorades i affinitet i närvaro av Rev-NOLS mutationer. Skarvning faktorer hnRNPC (heterogena ribonuclear protein C) och PNN (Pinin, desmosome-associerade protein) observerades dessutom att binda till WT rev, som förlorade interaktion med rev Single-Point nukleolära mutationer.

Figure 1
Figur 1 : Optimering av cell Lys villkor för rev-3 ' Flag Co-IP under hiv-1 produktion. WT rev-NoLS-3 ' Flag och negativ kontroll pcDNA-flagg IP-villkoren optimerades i tre olika NaCl-koncentrationer (137 mm, 200 mm och 300 mm) i lyseringsbuffert. Som observerats genom silver färgning, 137 mM NaCl var den optimala salt koncentrationen för rev immunoprecipitation och B23 bindning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Optimering av Lys villkor för rev-3 ' Flag Co-IP och B23 immunodetection under hiv-1 produktion. WT rev-NoLS-3' Flag, M1-3 ' flagga och negativ kontroll pcDNA-flagg IP-villkoren optimerades i två olika NaCl-koncentrationer (137 mm och 200 mm) i lyseringsbuffert. Som observerats genom immunodetection, 137 mM NaCl var den optimala salt koncentrationen för rev immunoprecipitation och B23 bindning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Optimering av Rev-3 ' Flag Co-IP eluering under hiv-1 produktion, visualiseras genom silver färgning. Protein komplex bearbetades från totala cell celllysat förberett under WT rev-3 ' Flag och pcDNA-Flag IP. Tre olika elueringförhållanden testades-2x prov lastning buffert vid 37 ° c för 15 min, 2x prov lastning buffert vid 95 ° c för 3 min, och 3x flagga peptid vid 4 ° c i 30 min. De optimala elutionsförhållandena för WT rev inträffade efter 15 min inkubationstid i 2x provlastningsbuffert vid 37 ° c och efter 3 min inkubationstid i 2x prov lastbuffert vid 95 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Immunoprecipitation av Rev-3 ' Flag mutationer 2, 6, och 9 under hiv-1 produktion. Protein komplex som binds direkt/indirekt med WT rev, m2 (R48, 50G), M6 (R50G), M9 (R46, 48, 50G) och negativ kontroll pcDNA-flaggan i närvaro av hiv-1 replikering visas i en silverfärgad SDS-Page gel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Rev-3 ' Flag Co-IP av mutationer 2, 6, och 9 för B23 immunodetection under hiv-1 produktion. Proteinet celllysat och IP-reaktioner som framställts från WT rev, m2, M6, M9 och negativ kontroll pcDNA-flaggan i figur 4 analyserades ytterligare av immunodetection för α-Flag-rev och B23. WT rev och Mutant uttryck, samt interaktion med B23 nukleocytoplasmic protein, observeras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Kvantifiering av Rev-NoLS-mutationer 4, 5, 6 och 8 efter flagg-IP-reaktion . IP-reaktioner från HLfB som uttrycker WT rev och nucleolar-localizing M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ΔRQ) och negativ kontroll pcDNA-flagga mättes för proteinkoncentration med hjälp av BSA seriella utspädningar. En proteinkoncentration på 12,5-25 μg observerades för varje prov. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Immunoprecipitation av nukleolära-lokalisera rev-NoLS mutationer 4, 5, och 6 under hiv-1 produktion. Coomassie-färgade SDS-PAGE gelinnehållande immunoprecipitated proteinkomplex av WT rev (1 och 2), M4, M5, och M6 visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Identifierade proteiner Molekylvikt WT rev M2 M6 M9
signaligenkänning partikel 14kDa (homologt Alu RNA bindande protein) 15 kDa 95% 0 0 0
ribosomalt protein S3A 30 kDa 95% 0 0 0
eukaryotisk översättning initierings faktor 4B 69 kDa 95% 0 0 0
ribosomalt protein L31 14 kDa 91% 0 0 0
ribosomalt protein L12 18 kDa 93% 0 0 0
ribosomalt protein L22 15 kDa 91% 0 0 0
litet nukleolärt RNA, C/D-låda 58B 15 kDa 87% 0 0 0
zink finger, CCHC domän innehållande 11 185 kDa 87% 0 0 0
aktin binding lim protein 1 79 kDa 79% 0 0 0
ribosomalt protein S13 17 kDa 78% 0 0 0
nukleofobi (nukleolärt fosfoprotein B23, numatrin) 33 kDa 73% 0 0 0

Tabell 1: identifiering av cellulära värd faktorer som samverkar med WT rev under hiv-1-produktion. Proteineluater som framställts av WT rev, m2, M6 och M9 analyserades direkt av tandem masspektrometri. Proteininteraktioner som är direkt/indirekt bundna till WT rev kontra m2, M6 och M9 sammanfattas med sannolikhet för protein identifiering (i procent).

Identifierade proteiner Molekylvikt M4 M5 M6 Wt pCDNA
Poly (A) bindande protein, cytoplasmiska 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
värme chock 70kDa protein 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
ribosomalt protein L7 29 kDa 91% 0 100% 100% 0
Histon-kluster 1, H1e 22 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L13 24 kDa 99% 0 100% 100% 0
komplement komponent 1, q subkomponentbindande protein 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0
Y låda bindande protein 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
nukleosome församlingen proteinet 1-lik 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
ribosomalt protein L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0
ribosomalt protein L18 22 kDa 27 0 100% 100% 0
värme chock 70kDa protein 8 71 kDa 5 99% 100% 100% 0
ribosomalt protein L19 23 kDa 10 0 81% 100% 0
ribosomalt protein L27 16 kDa 92% 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L7a 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L24 18 kDa 0 0 100% 99% 0
tubulin, beta klass I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
ribosomalt protein L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
värme chock 70kDa protein 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
ribosomalt protein S2 31 kDa 87% 0 100% 100% 0
kasein Kinas 2, alfa-1 polypeptid 45 kDa 0 0 50% 100% 0
ribosomalt protein L14 23 kDa 0 0 81% 100% 0
ribosomalt protein, stort, P0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
Histon-kluster 1, H1B 23 kDa 0 0 73% 100% 0
värme chock 70kDa protein 5 (glukos-reglerat protein) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
ribosomalt protein S4, X-bunden 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0
ribosomalt protein L28 16 kDa 0 0 100% 99% 0
ribosomalt protein S14 16 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein S3A 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L21 19 kDa 0 0 100% 100% 0
zink finger CCCH-typ, antiviral 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
Histon-kluster 1, H1c 21 kDa 0 0 0 98% 0
ribosomalt protein L36 12 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein S18 18 kDa 90% 0 100% 100% 0
modulator för apoptos 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
ribosomalt protein L17 21 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein S26 13 kDa 91% 0 99% 98% 0
ribosomalt protein L32 18 kDa 0 0 48% 100% 0
ribosomalt protein L35 15 kDa 0 0 97% 100% 0
ribosomalt protein L29 18 kDa 0 0 57% 94% 0
ribosomalt protein S9 23 kDa 0 0 100% 100% 0
heterogena nukleära ribonukleoprotein H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
ribosomalt protein S8 22 kDa 0 0 78% 100% 0
ribosomalt protein L10 25 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L23a 18 kDa 0 0 68% 100% 0
ribosomalt protein S6 29 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomalt protein L31 14 kDa 0 0 95% 100% 0
ribosomalt protein S13 17 kDa 0 0 100% 99% 0
ribosomalt protein L10a 25 kDa 45% 0 81% 100% 0
Poly (A) bindande protein, cytoplasmiska 4 (inducerbar form) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
Transmembran emp24 proteintransport domän innehållande 1 25 kDa 0 0 0 100% 0
EBNA1 bindande protein 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
bevarad Helix-loop-Helix allestädes närvarande Kinas 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
ribosomalt protein L12 18 kDa 0 0 57% 100% 0
ribosomalt protein S24 15 kDa 0 0 100% 100% 0
kallt chock domän protein A 40 kDa 0 0 0 100% 0
ribosomalt protein L27a 17 kDa 0 0 89% 99% 0
heterogena nukleära ribonukleoprotein F 46 kDa 0 0 99% 99% 0
ribosomalt protein L11 20 kDa 0 0 99% 100% 0
ribosomalt protein L26-liknande 1 17 kDa 0 0 100% 100% 0
kasein Kinas 2, alpha Prime polypeptid 41 kDa 0 0 0 100% 0
tubulin, alfa 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
ribosomalt protein L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
mitokondriellt ribosomalt protein L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
nukleolin 77 kDa 0 0 25 100% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S21 11 kDa 0 0 93% 94% 0
KRR1, liten subenhet (SSU) processome komponent, homolog (jäst) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S7 28 kDa 0 0 0 100% 0
klo RID kanal, nukleotidkänslig, 1A 22 kDa 0 0 97% 86% 0
cyklin B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
guanin nukleotid bindande protein-liknande 3 (nucleolar) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S23 22 kDa 0 0 100% 50% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S22 41 kDa 0 0 0 99% 0
nukleofobi (nukleolärt fosfoprotein B23, numatrin) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
ribosomalt protein S19 16 kDa 0 0 0 99% 0
glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas 36 kDa 0 0 100% 0 0
Histon-kluster 1, H2bg 14 kDa 0 0 53% 72% 0
ribosomalt protein S23 16 kDa 0 0 68% 0 0
Rho guanin nukleotid utbytes faktor (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
död associerat protein 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S6 14 kDa 0 0 52% 84% 0
ribosomalt protein L39 6 kDa 0 0 0 87% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S28 21 kDa 0 0 85% 99% 0
Histon-kluster 1, H4h 11 kDa 0 0 0 93% 0
mitokondriellt ribosomalt protein L43 23 kDa 0 0 0 97% 0
ribosomalt protein S15 17 kDa 0 0 0 85% 0
ribosomalt protein S12 15 kDa 0 0 68% 39% 0
ribosomalt protein L35a 13 kDa 0 0 0 96% 0
mitokondriellt ribosomalt protein L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S14 15 kDa 0 0 45% 76% 0
fosfodiesteras 5A, cGMP-specifika 95 kDa 14 0 0 72% 0
ribosomalt protein L15 24 kDa 0 0 0 56% 0
heterogena nukleära ribonukleoprotein C (C1/C2) 22 kDa 0 0 0 100% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S16 11 kDa 0 0 0 92% 0
ribosomalt protein S15a 15 kDa 0 0 0 91% 0
neurexin 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
Autism känslighet kandidat 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein L17 20 kDa 0 0 0 92% 0
skarvning faktor 3a, subenhet 1, 120kDa 89 kDa 0 0 56% 89% 0
La ribonukleoprotein domän familj, medlem 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
leprecan-liknande 2 62 kDa 0 0 0 68% 0
ribosomalt protein L18a 21 kDa 0 0 0 86% 0
ribosomalt protein L23 15 kDa 0 0 60% 47% 0
Transmembran emp24 proteintransport domän innehållande 9 27 kDa 0 0 0 78% 0
signaligenkänning partikel 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
lectin, galaktosidbindning, löslig, 3 26 kDa 0 71% 28 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
H1 Histon familj, medlem X 22 kDa 0 0 0 96% 0
kasein Kinas 2, beta-polypeptid 25 kDa 0 0 0 89% 0
solute Carrier familj 4, natriumbikarbonat cotransporter, ledamot 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
WD upprepa domän 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
transkriptionsförlängning faktor A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38% 0
ribosomalt protein S16 16 kDa 0 0 75% 0 0
SP140 kärn-förkroppsligar protein 92 kDa 0 0 0 64% 0
otoferlin 227 kDa 62% 0 0 0 0
Golgi transport 1B 15 kDa 0 0 0 33% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S34 26 kDa 0 0 0 33% 0
ribosomalt protein L30 13 kDa 0 0 0 49% 0
aktin binding lim protein 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
guanin nukleotid bindande protein-liknande 2 (nucleolar) 84 kDa 40% 0 0 0 0
protein med hög densitet lipoproteinbindning 141 kDa 0 0 34% 0 0
adenosindeaminas, RNA-specifik, B2 81 kDa 0 0 28 0 0
cystatin E/M 17 kDa 0 27 0 0 0
zink finger protein 786 80 kDa 0 0 23 0 0
pleckstrin Homology-liknande domän, familj B, medlem 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
proteinfosfatas methylesterasen 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
Janus Kinas och mikrotubuli interagerande protein 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
signaligenkänning partikel 68kDa 67 kDa 0 0 0 93% 0
TBC1 domän familj, ledamot 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
mitokondriellt ribosomalt protein L27 16 kDa 0 0 0 89% 0
mitokondriellt ribosomalt protein L2 24 kDa 0 0 0 88% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
Pentatricopeptide upprepa domän 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
ribosomalt protein, Large, P2 12 kDa 0 0 0 76% 0
IMP (inosin 5 '-monofosfat) dehydrogenas 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
tubulin, beta 4B-klass IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein L23 19 kDa 0 0 0 74% 0
mitokondriellt ribosomalt protein S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
galaktose-3-O-sulfotransferas 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
suppressor för variegering 4-20 homolog 1 (Drosophila) 99 kDa 0 72% 0 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein S25 20 kDa 0 0 0 70% 0
ribosomal L1-domän innehållande 1 55 kDa 0 0 0 70% 0
familj med sekvens likhet 110, medlem D 29 kDa 69% 0 0 0 0
ribosomalt protein L36a-liknande 12 kDa 0 0 0 66% 0
cerebellin 4 föregångare 22 kDa 0 0 0 64% 0
N-acetylglukosamin-1-fosfattransferas, alfa-och beta-subenheter 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 homolog B (S. cerevisiae) 38 kDa 0 0 0 64% 0
transkriptionsförlängning regulator 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
Hedgehog a1 15 kDa 0 0 0 62% 0
fosfolipid överföring protein 49 kDa 0 0 0 62% 0
Rho GTPase aktivera protein 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein S18B 29 kDa 0 0 0 52% 0
endoplasmatiska Retikulum aminopeptidas 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
Treparts motiv innehållande 28 89 kDa 0 50% 0 0 0
omogen tjocktarmscancer avskrift 1 24 kDa 0 0 0 50% 0
PÅ Rich Interactive Domain 1A (SWI-liknande) 242 kDa 0 0 49% 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein S17 15 kDa 0 0 0 48% 0
Pinin, desmosome associerat protein 82 kDa 0 0 0 48% 0
proteinfosfatas, MG2 +/Mn2 + beroende, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
G patch domän och ankyrin upprepar 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
spirande ohämmad av bensimidazoler 3 homolog (jäst) 37 kDa 0 44% 0 0 0
WD och tetratricopeptide upprepar 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
proteindisulfid Isomerase familj A, medlem 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
kazrin, periplakin interagerande protein 86 kDa 0 41% 0 0 0
coiled-Coil-Helix-coiled-Coil-Helix domän innehållande 2 16 kDa 0 0 40% 0 0
värme chock protein 90kDa alfa (cytosolic), klass A-medlem 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
retinitis pigmentosa GTPase regulator 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (carboxy-terminaldomän, RNA-polymeras II, polypeptid A)
fosfatas, subenhet 1		 104 kDa 0 39% 0 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-like 76 kDa 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) homolog, under familj C, medlem 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
mitokondriellt ribosomalt protein L51 15 kDa 0 0 0 38% 0
bystin-liknande 50 kDa 0 0 0 38% 0
huntingtin-associerat protein 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
zink finger protein 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
cell Division cykel och apoptos regulator 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
proteintyrosinfosfatas, icke-receptortyp 13
(APO-1/CD95 (fas)-associerat fosfatas)		 256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-en domän som innehåller 2 56 kDa 0 0 0 31 0
Aktivera signal cointegrator 1 Complex subenhet 2 28 kDa 0 0 0 31 0
centrosomal protein 76kDa 74 kDa 0 30 0 0 0
polymeras (RNA) III (DNA-riktad) polypeptid C (62kd) 61 kDa 0 0 0 30 0
5-hydroxytryptamin (serotonin) receptor 6 47 kDa 0 0 0 29 0
T cell receptor alpha ansluta 56 2 kDa 0 26 0 0 0
biorientering av kromosomer i cell Division 1-like 330 kDa 0 0 0 25 0
Ras Association och DIL domäner 114 kDa 0 0 25 0 0
WD upprepa domän 66 130 kDa 0 0 0 24 0
kromosom 6 öppen läsbild 25 13 kDa 0 0 22 0 0
Transmembranprotein 177 34 kDa 0 0 0 21 0
neurala prekursorer cell uttryckt, developmentalt Down-reglerade 4-liknande 101 kDa 0 20 0 0 0

Tabell 2: identifiering av cellulära värd faktorer komplex med nucleolar-lokalisera rev mutationer 4, 5, och 6 under hiv-1 produktion. Den Coomassie-färgade SDS-PAGE gel i figur 6 behandlades för tandem masspektrometri. Protein interaktion resultat av WT rev kontra nukleolära mutationer M4, M5, och M6 sammanfattas med protein identifiering sannolikhet (i procent).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Masspektrometriska analyser som jämförde rev-NoLS-mutationer och WT rev i närvaro av HIV-1 utvärderades för att förstå nukleolära faktorer involverade i virusets replikeringscykel. Detta skulle identifiera nukleolära komponenter som krävs för viral smittsamhet. Nukleolära B23 har en hög affinitet till rev-NOLS och funktioner i nukleolära lokalisering av Rev3 och nukleocytoplasmic transport av Rev-bunden hiv mrnas22. Affinitet av B23 med rev-NoLS mutationer, som innehöll en eller flera arginin substitutioner, utvärderades genom immunoprecipitation av Rev-3 ' Flag under viral produktion (figur 2; WT och mutationer m2, M6 och M9). B23 affinitet till Single-Point rev-NoLS mutationer M4, M5, och M6 har tidigare undersökts i närvaro av HIV-1-replikering. I den tidigare studien utsattes IP eluater för M4, M5 och M6 för västerländska Immunoblotting med en antikropp som är specifik för α-flaggan för rev och B23 Affinity1. I bakgrunden av Rev Single-Point mutationer, B23 bindning affiniteten minskade signifikant. B23 bibehållen tillhörighet med WT rev under HIV-replikering. Single-Point mutationer inducerade inom rev-NoLS förväntades minska bindningsaffinitet till andra cellulära värd faktorer som underlättar HIV mRNA bindning och transport. Rev-NoLS Single-och multipel-punktmutationer i denna modell avskaffade nukleophosmin B23 affinitet till rev, indikerar en störning i nukleocytoplasmic shuttling och HIV mRNA transport. Det är troligt att nukleolära faktorer (nukleolin C23 och nukleosome församlingen protein 1), transportfaktorer (ARHGEF1 och TCB1D24), och skarvning faktorer (hnRNPC och PNN) är inblandade i HIV-1 infektiös cykel genom interaktion med rev proteinkomplex. Tabell 1 och tabell 2 avslöjar olika andra cellulära faktorer, både nukleolär och nonnucleolar i mönster, som potentiellt är inblandade i hiv-1 replikering cykel genom rev den nukleolära faktorn-Snorna C/D Box 58, inblandad i snorna bearbetning, snoRNA transport till Nukleolus, och 2 '-O-metylering av ribosomalt RNA-identifierades ändå funktionen av detta protein i HIV-1 replikering cykeln förblir okänd. De specifika rollerna för dessa cellulära faktorer i HIV-1 infektiösa cykeln utreds för närvarande.

De resultat som presenteras här visar användningen av denna metod för identifiering av virala/värd nukleolära faktorer som upprätthåller HIV-1 infektiös cykel. Virala/värd nukleolära faktorer som deltar i andra sjukdomsmodeller kan identifieras med hjälp av denna metod. Det är dessutom troligt att en nukleolär faktor kan innebära multifunktionella roller i olika sjukdomsmodeller. Till exempel har B23 varit inblandad i transporten av nukleolära virala proteiner, viral församling, encapsidation, replikering och latens i andra virala smittsamma modeller. B23 kännetecknas i samspel med NoLS av cellulära faktorer för nukleocytoplasmic transport-P120 tillväxtfaktor (aminosyror 40-57)23 och C23 pre-rRNA processor (aminosyror 540-628)24. B23 dokumenteras också för att interagera med humant T-cells lymfotropic virus (HTLV-1) protein Rex (aminosyror 1-22)25, hiv-1 tat (aminosyror 49 – 57)2, och hiv-1 rev (aminosyror 37-47)26. Den japanska encefalit virus (JEV) arvsmassan kodar en nukleolär-lokalisera kärn protein, genom vilken aminosyror Gly42 och Pro43 interagera med N-Terminal regionen B23 under JEV-infektion, vilket resulterar i transport av viral Core protein/B23 till Nucleus27. Det enkelsträngade RNA-genomet av hepatit B-viruset (HBV) består delvis av dubbelsträngat DNA, som kodar för ett nukleolärt kärn protein. HBV-kärnproteinet associeras med nukleolin och B23 i Nukleolus28; B23 visades i HBV-församlingen genom interaktion med kärn proteinet N-Terminal Domain. Specifikt, B23 aminosyror binder 259-294 till N-Terminal domänen av HBV-kärnprotein för att möjliggöra viral encapsidation29. Den negativa känslan, enkelsträngat RNA hepatit D-virus (HDV) uttrycker HDVAg antigen i två isoformer; den lilla isoformen stöd i RNA-replikering, och den stora isoformen underlättar viral församling. RNA-replikation sker inom Nukleolus och kräver B23 interaktion med hdvag30,31. HDV-infektion orsakar en uprekling av B23, som samverkar mestadels med den små HDVAg-isoformen och mindre med den stora HDVAg-isoformen. Interaktioner sker genom den lilla HDVAg NLS-domänen, genom vilken B23 binder och uppnår nukleär ackumulering. Vid radering av HDV-bindnings platsen till B23, var RNA-replikering nedsatt. HDVAg visades att colocalize med B23 och nucleolin i nucleolus. Nukleolin upptäcktes för att inneha transkriptionella egenskaper som en repressormolekyl32, avslöjar nucleolus som ett fack för reglering av HDV-replikering. B23 är också involverad i latensen av Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV) arvsmassa. KSHV latent protein-v-Cyclin-med Host CDK6 Kinas, fosforylater B23 vid Thr199, vilket underlättar B23 interaktion med latens-associerad nukleär antigen33. Den latens-associerade nukleära antigen agerar för att förhindra viral lytisk replikation. Utarmning av B23 leder till KSHV reaktivering, avslöjar B23 som en regulator av KSHV latens. B23 funktion i HIV-1 replikering cykel kännetecknas av nukleocytoplasmic transport aktiviteten av tat och rev, och det är okänt om B23 kan inducera latens under HIV-infektion. B23's inblandning i replikering, encapsidation, och montering av HIV-1 är för närvarande okänd.

Anpassning av denna metod till andra sjukdomsmodeller skulle kräva mycket ansträngning och tid för generering av protein-bristfällig infektiösa ryggrader uttryckt i lämpliga cellinjer. Fördelen med denna rev-bristfällig HIV-1ande HXB2 ryggraden är förmågan att undersöka rev-NOLS mutationer i närvaro av den fullständiga viral ryggraden, viral infektiösa faktorer, och värd faktorer som är INBLANDADE i hiv-1 replikering cykel. Andra studier har undersökt rev nukleolära funktion i avsaknad av hela hiv-1 smittsamma systemet. Noggrann karakterisering av infektions-och sjukdoms vägar måste innefatta representativa miljöer som stöder den naturliga sjukdomsprogression. Två olika typer av analyser genomfördes och jämfördes i förmågan att identifiera nukleolära faktorer. Tabell 1 listar faktorer som förblev bundna till WT rev som en följd av direkt masspektrometri analys av proteineluat. Denna analys gav flera kända faktorer av HIV-1 rev. denna direkta metod jämfördes med en annan process som inbegriper utvinning av protein separerade inom SDS-PAGE Gels och masspektrometri analys av sådana proteiner. Denna andra metod gav en mängd kända och potentiella faktorer som är bundna till rev proteinkomplex men saknade följande proteiner som tidigare identifierats i tabell 1: signaligenkänning partikel 14 kDa, eukaryotisk översättning initiering faktor 4B, ribosomalt protein L22, små nukleolära RNA C/D Box 58B, och zink finger CCHC domän innehållande 11. I slutändan, den överlägsna metod som valts för masspektrometri analyser i detta protokoll inblandade utvinning av peptider från SDS-PAGE Gels. Den första direkta metoden inkluderade 2x provbuffert i eluatet utan bromfenolblått; de återstående komponenterna i 2x-exempelbufferten kan störa fullständig trypsinbehandling och kan ge ofullständigt bearbetade peptider för masspektrometrianalys. Den andra indirekta metoden kunde rena trypsinbehandlade peptider från potentiella föroreningar av SDS-PAGE.

De masspektrometri beredningsmetoder som beskrivs här skulle kunna utnyttjas för identifiering av terapeutiska ingrepp för att utrota HIV-1-infektion genom inriktning rev. alla borttagningoch Single-Point rev-NoLS mutationer kan undersökas för dominant-negativ aktivitet och utnyttjas i gripandet av Rev-funktionen. Dominerande negativa egenskaper av intresse för rev funktionell gripande är följande: rev/RRE bindning tillhörighet; omlokalisering av nukleolära WT rev genom multimerization med rev mutanter; förlust i affinitet till viktiga cellulära faktorer involverade i HIV-1 mRNA transport och splitsning. Rev multimerization som involverar coexpression av Rev-NoLS mutationer med WT rev kan undersökas. Dominerande negativa mutationer i denna modell förväntas multimerize med WT rev och Skift nukleolära mönster mot kärnan och cytoplasman, vilket leder till en rev funktionell gripande. Masspektrometri kan användas för att identifiera förlusten av viktiga cellulära faktorer inblandade i HIV-1 mRNA skarvning och transport. Identifieringen av saknade interaktioner med WT rev som ett resultat av coexpression med dominerande-negativa rev-NoLS mutationer skulle avslöja inblandning av nukleolära-specifika vägar i HIV-1 patogenes. Alternativt, viral HIV-1NL4-3 partiklar som genereras i bakgrunden av Rev-NOLS mutationer kan undersökas för alla förpackade cellulära faktorer. Cellulära och virala faktorer förpackade i viruspartiklar kan identifieras ytterligare genom masspektrometri. Detta skulle avslöja förekomsten av nukleolära faktorer inom viruspartiklar och den roll som identifierats nukleolära faktorer i virusinfektion. De beskrivna metoderna gäller för andra virus-och sjukdomsmodeller för identifiering och karakterisering av understuderade vägar. Detta skulle göra det möjligt att utveckla terapeutiska interventioner mot sjukdomar genom vilka det finns begränsade behandlingar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner Dr Barbara K. Felber och Dr George N. Pavlakis för HLfB anhängare kultur som tillhandahålls av National Institutes of Health (NIH) AIDS forskning och referens reagens program, avdelningen för AIDS, National Institute of allergi och infektiösa Sjukdomar (NIAID), NIH. Författarna erkänner också finansiella källor som tillhandahålls av NIH, bidrag AI042552 och AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Tags

Immunologi och infektion HIV-1 replikation rev immunoprecipitation masspektrometri Nukleolus B23
Identifiering av nukleolära faktorer under HIV-1-replikation genom rev immunoprecipitation och masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, … More

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter