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Biochemistry

Identifizieren von Aminosäure-Overproduzenten mit selten-Codon-reichen Markern

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59331
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

Summary

Diese Studie präsentiert eine alternative Strategie zur herkömmlichen toxischen analogen Methode zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten durch verwendung seltener Kodon-reicher Marker, um Genauigkeit, Empfindlichkeit und hohen Durchsatz gleichzeitig zu erreichen.

Abstract

Um den ständig wachsenden Markt für Aminosäuren zu befriedigen, werden Hochleistungs-Produktionsstämme benötigt. Die Aminosäure-Overproduzenten werden konventionell identifiziert, indem sie die Wettbewerbe zwischen Aminosäuren und ihren Analoga nutzen. Diese analoge Methode ist jedoch von geringer Genauigkeit, und richtige Analoga für bestimmte Aminosäuren sind begrenzt. Hier stellen wir eine alternative Strategie vor, die ein genaues, sensibles und hochdurchsatzreiches Screening von Aminosäureüberproduzenten mit selten-kodonreichen Markern ermöglicht. Diese Strategie ist inspiriert von dem Phänomen der Kodonverwendungsverzerrung in der Proteintranslation, für das Codons in häufige oder seltene basierend auf ihren Häufigkeiten des Auftretens in der kodierenden DNA kategorisiert werden. Die Übersetzung seltener Codons hängt von ihren entsprechenden seltenen Transfer-RNAs (tRNAs) ab, die von den cognate-Aminosäuren unter Hunger nicht vollständig aufgeladen werden können. Theoretisch können die seltenen tRNAs aufgeladen werden, wenn es einen Überschuss der Aminosäuren nach dem Aufladen der synonymen gemeinsamen Isoaktoren gibt. Daher könnten verzögerte Übersetzungen, die durch seltene Codons verursacht werden, durch Fütterung oder intrazelluläre Überproduktion der entsprechenden Aminosäuren wiederhergestellt werden. Unter dieser Annahme wird ein Selektions- oder Screening-System zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten eingerichtet, indem die gemeinsamen Kodone der zielgerichteten Aminosäuren durch ihre synonymen seltenen Alternativen in den Antibiotikaresistenzgenen oder den Genen ersetzt werden. fluoreszierende oder chromogene Proteine. Wir zeigen, dass die Proteinausdrücke durch die Aufnahme seltener Codons stark behindert werden können und dass die Proteine positiv mit den Aminosäurekonzentrationen korrelieren. Mit diesem System können Überproduzenten mehrerer Aminosäuren leicht aus Mutationsbibliotheken abgeschirmt werden. Diese auf seltenen Kodonen basierende Strategie erfordert nur ein einzelnes modifiziertes Gen, und der Wirt ist weniger wahrscheinlich, der Auswahl zu entgehen als bei anderen Methoden. Es bietet einen alternativen Ansatz für die Gewinnung von Aminosäure-Overproduzenten.

Introduction

Die aktuelle Produktion von Aminosäuren hängt stark von der Fermentation ab. Allerdings liegen die Titer und Erträge für die meisten Aminosäurenproduktionsstämme unter den steigenden Anforderungen des globalen Aminosäuremarktes, der Milliarden von Dollar wert ist1,2. Die Gewinnung von Hochleistungs-Aminosäure-Overproduzenten sind entscheidend für die Aufwertung der Aminosäureindustrie.

Traditionelle Strategie zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten nutzt die Wettbewerbe zwischen Aminosäuren und ihren Analoga in der Proteinsynthese3,4. Diese Analoga sind in der Lage, die tRNAs aufzuladen, die die entsprechenden Aminosäuren erkennen und so die Dehnungen der Peptidketten hemmen, was zu festem Wachstum oder Zelltodführt 5. Eine Möglichkeit, den analogen Spannungen zu widerstehen, besteht darin, die Konzentrationen von intrazellulären Aminosäuren zu erhöhen. Die angereicherten Aminosäuren übertreffen die Analoga für die endlichen tRNAs und sorgen für die korrekte Synthese funktioneller Proteine. Daher können Stämme, die die Analoga überleben, ausgewählt werden und sind wahrscheinlich die Überproduzenten der entsprechenden Aminosäuren.

Obwohl sich bei der Auswahl von Überproduzenten für Aminosäuren wie L-Leucin6als erfolgreich erwiesen hat, leidet die analoge Strategie unter gravierenden Nachteilen. Ein Hauptanliegen ist der analoge Widerstand, der aus dem Prozess der Mutagenese oder durch spontane Mutationen entstanden ist. Stämme mit Widerstand können der Auswahl entkommen, indem sie die Analoga5blockieren, exportieren oder herabstufen. Ein weiteres Problem sind die toxischen Nebenwirkungen der Analoga auf andere zelluläre Prozesse7. Infolgedessen können Stämme, die die analoge Selektion überleben, nicht die Aminosäure-Overproduzenten sein, während die gewünschten Overproduzenten aufgrund der negativen Nebenwirkungen fälschlicherweise ausgerottet werden könnten.

Hier wird eine neuartige Strategie vorgestellt, die auf dem Gesetz der Kodonvoreingenommenheit basiert, um genaue und schnelle Identifizierungen von Aminosäureüberproduzenten zu erreichen. Die meisten Aminosäuren werden durch mehr als ein Nukleotid-Triplet kodiert, das von den Wirtsorganismen anders bevorzugt wird8,9. Einige Codons werden selten in den Codierungssequenzen verwendet und werden als die seltenen Codons bezeichnet. Ihre Übersetzungen in Aminosäuren basieren auf den cognate tRNAs, die die entsprechenden Aminosäuren tragen. Jedoch, die tRNAs, die seltene Codons erkennen, haben in der Regel viel geringere Überfluss als die tRNAs der gemeinsamen Codons10,11. Folglich sind diese seltenen tRNAs weniger wahrscheinlich, die freien Aminosäuren in den Wettbewerben mit anderen Isoaktoren zu erfassen, und Übersetzungen der selten-codonreichen Sequenzen beginnen zu verlangsamen oder werden sogar beendet, wenn die Mengen an Aminosäuren begrenzt sind. 10. Die Übersetzungen könnten theoretisch wiederhergestellt werden, wenn nach dem Aufladen der synonymen gemeinsamen tRNAs aufgrund von Überproduktionen oder Extra-Fütterungen der entsprechenden Aminosäuren12ein Aminosäureüberschuss vorliegt. Wenn das selten-kodonreiche Gen einen Selektions- oder Screening-Marker kodiert, können Stämme, die die entsprechenden Phänotypen aufweisen, leicht identifiziert werden und sind wahrscheinlich die Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren.

Die obige Strategie wird angewendet, um eine Auswahl und ein Screening-System zur Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten zu etablieren. Das Selektionssystem verwendet Antibiotikaresistenzgene (z. B. kanR) als Marker, während das Screening-System die Gene verwendet, die fluoreszierende (z. B. grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) oder chromogene (z. B. PrancerPurple) Proteine kodieren. Die Markergene in beiden Systemen werden modifiziert, indem definierte Zahlen der gemeinsamen Codons für die zielgerichtete Aminosäure durch ihre synonyme seltene Alternative ersetzt werden. Stämme in der Mutationsbibliothek, die das selten-kodonreiche Markergen beherbergen, werden unter geeigneten Bedingungen ausgewählt oder gescreent, und die Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren können leicht identifiziert werden. Der Arbeitsablauf beginnt mit dem Aufbau des selten-kodonreichen Marker-Gensystems, gefolgt von der Optimierung der Arbeitsbedingungen und der Identifizierung und Verifizierung der Aminosäure-Überproduzenten. Diese analog-unabhängige Strategie basiert auf dem Dogma in der Proteintranslation und wurde praktisch verifiziert, um eine genaue und schnelle Identifizierung von Aminosäureüberproduzenten zu ermöglichen. Theoretisch könnte es direkt an Aminosäuren mit seltenen Codons und an alle Mikroorganismen angewendet werden. Insgesamt wird die auf seltenen Kodonen basierende Strategie als effiziente Alternative zum herkömmlichen analogen Ansatz dienen, wenn geeignete Analoga für bestimmte Aminosäuren nicht verfügbar sind oder wenn eine hohe falsch positive Rate das Hauptanliegen ist. Das nachstehende Protokoll verwendet seltenes Leucin-Kodon, um diese Strategie bei der Identifizierung von Escherichia coli L-Leucin-Overproduzenten zu demonstrieren.

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Protocol

1. Aufbau der Plasmide, die die selten-codonreichen Markergene exemiten

  1. Wählen Sie ein Markergen aus, das eine entsprechende Anzahl der gemeinsamen Codons für die zielgerichtete Aminosäure enthält.
    HINWEIS: Für L-Leucin wird das Kanamycinresistenzgen kanR, das 29 Leucin-Codons enthält, von denen 27 häufige Codons sind, für den Aufbau des Selektionssystems13verwendet. Das gfp-Gen, das 17 gemeinsame Codons aus 19 Leucin-Codons enthält, oder das violette Protein-kodierkodierviolette Gen prancerpurple (ppg), das 14 Leucin-Gemeine Codons enthält, wird für das Screening-System verwendet (Ergänzende Tabelle 1 ).
  2. Ersetzen Sie die gemeinsamen Codons in den Markergenen durch das synonyme seltene Codon. Für L-Leucin ersetzen Sie seine Codons in kanR, gfpoder ppg durch das seltene Codon CTA, wodurch kan R-RCs, gfp-RCoder ppg-RC, bzw.13 ( Ergänzende Tabelle 1).
    HINWEIS: Die Häufigkeit des seltenen Codons in den Markergenen wirkt sich auf die Stringenz des Selektions- oder Screening-Systems aus. Im Allgemeinen wird die Erhöhung der Anzahl seltener Codons die Strenge des Auswahl- oder Screening-Systems erhöhen. Um die entsprechende Selektions- oder Screeningstärke zu erreichen, entwerfen Sie eine Reihe von Markergenen, die eine unterschiedliche Anzahl seltener Codons beherbergen, und vergleichen Sie deren Auswirkungen.
  3. Generieren Sie Bausteine der selten-codonreichen Markergene mit Werkzeugen wie GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) für die Gensynthese. Alternativ können Sie die Markergene aus kommerziellen Gensynthesediensten bestellen.
    1. Wählen Sie auf der GeneDesign-Seite Bausteindesign (Überlappung der konstanten Länge)aus.
    2. Fügen Sie die Sequenzen der selten-codonreichen Markergene in das Sequenzfeld ein.
    3. Definieren Sie die Überlappungslänge zwischen den Baugruppenoligos. Beachten Sie, dass die Standard-40 bp für die meisten Sequenzen einwandfrei funktioniert.
      HINWEIS: Weitere Anweisungen zu den Einstellungen der anderen Parameter finden Sie im Online-Handbuch.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bausteine entwerfen, und bestellen Sie die auf der Seite aufgeführten Oligonukleotide.
  4. Synthetisieren Sie die selten-codonmodifizierten Gene durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte genaue Synthese15.
  5. Ligate die selten-codonreiche kanR-RC zu Vektor pET-28a, gfp-RC zu pSB1C3 und ppg-RC zu CPB-37-44116.
    HINWEIS: Die Plasmidkarten pET-28a und pSB1C3 sind in der SnapGene Online-Plasmiddatenbank verfügbar(ergänzende Tabelle 1); Die Plasmidkarte CPB-37-441 ist auf der ATUM Chromogen protein website verfügbar.
    1. Auf Eis fügen Sie den Vektor und die Markerfragmente in einem Molverhältnis von 1:1 bis 7,5 l Baugruppenmischung (siehe Materialtabelle)zu einem Gesamtvolumen von 10 l hinzu. Inkubieren Sie die Probe bei 50 °C für 1 h.
    2. Verwandeln Sie 5 l des Montageprodukts in 50 l sachkundigen Zellen (siehe Materialtabelle) bei 42 °C für 30 s.
    3. Die Zellen in SOC (Super optimale Brühe mit Katabolitenrepression) bei 37 °C für 1 h zurückgewinnen, auf LB (Lysogeny-Brühe) Agarmedium verblechen und bei 37 °C über Nacht bebrüten.
    4. Die Kolonie in LB-Medium impfen und bei 37 °C für 8 h inkubieren.
    5. Isolieren Sie das Plasmid mit einem bevorzugten kommerziellen Kit.

2. Optimierung der Auswahlbedingungen

  1. Machen Sie den Elternteil stamm für Mutagenese in kompetente Zellen17.
  2. Transformieren Sie 50 l der kompetenten Zellen mit 1 l Plasmid, das den Wildtyp KanRträgt, und transformieren Sie einen weiteren Satz der kompetenten Zellen mit dem Plasmid, das Kan R-RC29 enthält, wobei alle Leucin-Codon durch das seltene Codon CTA.
  3. Fügen Sie 950 l SOC-Medium hinzu und inkubieren Sie die Probe in einem Shaker bei 250 Rpm bei 37 °C für 1 h.
  4. Platte 100 l der Zellkultur auf das LB-Agarmedium, das 50 'g'mL-1 Kanamycin enthält, und bebrütet es bei 37 °C für ca. 8 h, bis Kolonien auftreten.
  5. Wählen Sie die Kolonien aus, die den Wildtyp KanR und den Leucin-Seltenkodon-reichen Kan R-RC29 beherbergen, und verwenden Sie jede, um 5 ml fünffach verdünntes LB-Medium (0,2x LB) mit 50 -mL-1 Kanamycin zu impfen. Die Proben in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Das Medium ist entscheidend für das Auswahlsystem. Es sollte gerade genug Kohlenstoff und Stickstoff enthalten, um die Expression des Antibiotikaresistenzproteins aus dem Wildtyp-Gen anstelle der selten-Codon-modifizierten Derivate zu ermöglichen. In diesem Fall ist die L-Leucin-Konzentration im 1x LB-Medium zu hoch, um die Proteinexpression aus dem selten-codonreichen KanRvollständig zu hemmen. So wird ein verdünntes LB-Medium mit einem Verdünnungsfaktor wie 5 verwendet, um einen deutlichen Unterschied in proteinischen Ausdrücken von dem Wildtyp und den selten-codonreichen Genen zu erzeugen.
  6. Übertragen Sie 200 l jeder Zellkulturen zu definierten Zeitpunkten (z. B. 8 h, 16 h und 24 h) in dreifacher Auslage. Messen Sie den OD600 (optische Dichte bei 600 nm) mit einem Plattenleser.
    ANMERKUNG: Wenn eine Abnahme der Zelle OD600 für Stämme, die die selten-codonreichen Markergene beherbergen, im Vergleich zu den OD600 des Stammes, der die Wildtyp-Markergene beherbergt, nicht nachgewiesen werden kann, versuchen Sie, die Menge an seltenem Codon in der Marker-Gene oder verwenden Sie ein verdünnteres Medium.
  7. Führen Sie den Aminosäure-Fütterungstest durch, um zu testen, ob die Ausdrücke der selten-codonreichen Markergene (z.B. kanR-RC29) durch Erhöhung der Konzentration der zielgerichteten Aminosäuren wiederhergestellt werden können.
    HINWEIS: Für die Auswahl von L-Leucin-Übererzeugern wird L-Leucin zur Fütterung verwendet.
    1. Impfen Sie die Stämme, die das Kan-RC29-Markergen beherbergen, in 5 ml des 0,2x LB (mit 50 mmL -1 Kanamycin) mit oder ohne zuliefernvon 1 g L-1 L-Leucin. Impfen Sie weitere 5 ml des 0.2x LB mit Stämmen, die den Wildtyp KanR als Steuerung beherbergen. Die Proben in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C inkubieren.
    2. Messen Sie die OD600 für jede Kultur zu definierten Zeitpunkten (z. B. 15 h, 17 h, 19 h und 22 h).

3. Optimierung der Screening-Bedingungen

  1. Transformieren Sie 50 l des für die Mutagenese verwendeten Stamms mit 1 l Plasmid (50ng-L -1), der den Wildtyp gfp oder den Wildtyp ppgträgt. Verwandeln Sie auch den Stamm mit den selten-codonreichen Derivaten der Markergene.
  2. Fügen Sie 950 l SOC-Medium hinzu und inkubieren Sie die Probe in einem Shaker bei 250 Rpm bei 37 °C für 1 h.
  3. Platte 100 l der Zellkultur auf das LB-Agarmedium, das die entsprechenden Antibiotika enthält (25 g-mL-1 Chloramphenicol für das gfp-Plasmid mit einem cm-R-Marker oder 50-mmL-1-Kanamycin für die ppg Plasmamit einem Kan-R-Marker) und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  4. Wählen Sie eine Kolonie, die die wilde Gfp oder ppg beherbergt, und eine Kolonie, die das entsprechende selten-Codon-reiche Derivat beherbergt, und übertragen Sie sie einzeln auf 5 ml des ordnungsgemäß verdünnten LB-Mediums. Die Proben in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C inkubieren.
    ANMERKUNG: Für E. coli-Stämme, die das Leucin selten-codon-reich gfp-RC oder ppg-RCbeherbergen, kann das unverdünnte LB-Medium (1x LB) verwendet werden, um signifikante Unterschiede in den Ausdrücken des Wildtyps und des selten-codonreichen Markers zu erzeugen. Gene. Außerdem werden induzierbare Promotoren verwendet, um die Ausdrücke der Screening-Marker-Gene zu fördern. Beginnen Sie die Induktion, wenn die Zellen in die exponentielle Phase eintreten, um bessere Diskriminierungen zu erreichen.
  5. Übertragen Sie bei Fluoreszenzmarkern 200 l jeder Zellkulturen in eine 96-well klar-bodenförmige schwarze Platte in Dreifacharbeit zu definierten Zeitpunkten (z. B. 2 h, 4 h und 6 h). Messen Sie die OD600 und die Fluoreszenz und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität (das Verhältnis von Fluoreszenz zu OD600). Bei chromogenen Markern können Sie die Farbentwicklung der Zellkulturen messen.
    ANMERKUNG: Wenn niedrigere Fluoreszenzintensitäten für Stämme, die das gfp-RC beherbergen, im Vergleich zu den Stämmen, die den Wildtyp gfpbeherbergen, nicht nachgewiesen werden können, oder wenn eine hellere Farbe für Zellen, die das violette Protein exzieren, nicht erkannt werden kann aus dem ppg-RC als aus dem Wildtyp-Gen, versuchen Sie, die Anzahl der seltenen Codon auf den Marker-Genen zu erhöhen oder verwenden Sie ein verdünnteres Medium.
  6. Führen Sie den Fütterungstest durch (siehe Schritte 2.7.1 und 2.7.2). Messen Sie die Fluoreszenzintensität oder die Farbentwicklung zu definierten Zeitpunkten (z. B. 12 h, 18 h und 24 h).

4. Identifizierung der Aminosäure-Übererzeuger

  1. 100 l der Kultur der Mutanten in 5 ml MEDIUM (2% v/v) impfen und in einem Shaker bei 250 U/min bei 37 °C inkubieren, bis die Werte von OD600 0,4 erreichen.
  2. Machen Sie die Mutanten in kompetente Zellen17.
  3. Transformieren Sie 50 l der mutierten Zellen mit 1 l des Plasmids (ca. 50 ng-L -1), die den Selektionsmarker kanR-RC29 oder die Screening-Marker gfp-RC oder ppg-RCtragen. Fügen Sie 950 L SOC-Medium hinzu und drehen Sie die Probe in einem 37 °C-Shaker für 1 h.
  4. Wählen Sie Aminosäure-Overproduzenten.
    1. Zentrifugieren Sie die Zellkultur bei 4.000 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml 0,2x LB Medium mit 50 'g'mL-1 Kanamycin hinzu. Inkubieren Sie die Probe in einem 37 °C-Shaker über Nacht.
    2. Die Nachtkultur (z.B. 100 l, hängt von der Zelldichte der Kultur ab) auf 0,2x LB-Agarmedium mit einem Kanamyzin von 50 mm-1 Kanamyzin und inkubieren bei 37 °C für 12 h.
      HINWEIS: Die entwickelten Kolonien sind die Kandidaten der gezielten Aminosäureüberproduzenten und in diesem Fall der L-Leucin-Overproduzenten.
  5. Überprüfen Sie die Aminosäure-Overproduzenten.
    1. Die entsprechende Anzahl von Zellen (z. B. 100 l), die den Screening-Marker (wie in Schritt 4.3 beschrieben) enthalten, auf das LB-Agarmedium geben, das das entsprechende Antibiotikum enthält (25 x mmL-1 Chloramphenicol zum Screening mit gfp-RC und 50 -1 Kanamycin zum Screening mit ppg-RC) und bei 37 °C für 8 h inkubieren.
    2. Impfen Sie das LB-Medium, das das entsprechende Antibiotikum enthält (siehe Schritt 4.5.1), mit jeder einzelnen Kolonie von der Platte. Die Proben in einem Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute bei 37 °C inkubieren.
    3. Messen Sie die OD600 und die Fluoreszenz und berechnen Sie die Fluoreszenzintensität, wenn gfp-RC verwendet wird. Messen Sie die Farbentwicklung der Zellkulturen, wenn ppg-RC verwendet wird. Beachten Sie, dass die Stämme, die eine höhere Fluoreszenzintensität oder eine tiefere Farbe als die des Elternstamms aufweisen, die Kandidaten-Aminosäure-Overproduzenten und in diesem Fall die L-Leucin-Overproduzenten sind.
      HINWEIS: Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung eignet sich auch zur Identifizierung von einzelligen High-Produzenten, wenn die selten-codonreichen fluoreszierenden Proteingene zum Screening verwendet werden.
  6. Überprüfen Sie die Aminosäure-Iivitäten der Kandidatenstämme.
    1. 5 ml LB-Medium mit jeder der Kandidatenstämme impfen und die Zellen über Nacht in einem Shaker bei 250 U/min bei 37 °C wachsen lassen.
    2. Ernte der Zellen aus 1 ml der Zellkultur durch Zentrifugation bei 4.000 x g für 2 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 1 ml sterilem Wasser wieder auf.
    3. 20 ml M9-Medium mit 4 % Glukose mit 200 l der Zellsuspension impfen und in einem 250 ml-Shaker bei 250 U/min bei 37 °C für 24 h inkubieren.
    4. Zentrifuge 1 ml des Kulturmediums bei 4.000 x g für 5 min. Übertragen Sie 200 l des Überstandes auf ein sauberes 1,5 ml Rohr. Vorbereiten von L-Leucin-Lösungen (HPLC (High-Performance-Flüssigkeitschromatographie) von 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 und 1 g L-1 als Standard.
    5. 100 l Triethylamin und 100 l Phenylisothiocyanat dem Überstand und den Standards hinzufügen, sanft mischen und bei Raumtemperatur für 1 h18inkubieren.
      VORSICHT: Triethylamin und Phenylisothiocyanat können schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen und sind schädlich, wenn sie eingeatmet werden. Tragen Sie Handschuhe und eine Maske und führen Sie diesen Schritt, wenn möglich, in einer Dunstabzugshaube durch.
    6. Fügen Sie 400 l n-Hexan in das gleiche Röhrchen und Wirbel es für 10 s. Filtern Sie die untere Phase, die die Aminosäurederivate enthält, durch eine 0,2 m Polytetrafluorethylenmembran.
      VORSICHT: n-Hexan kann Hautreizungen verursachen. Tragen Sie Handschuhe und Schutzkleidung. Wenn es in Kontakt mit der Haut kommt, spülen Sie die Haut mit viel Wasser.
    7. Bereiten Sie die mobile Phase A vor, indem Sie 0,1 M Natriumacetat (pH 6,5) und Acetonitril in einem Volumenverhältnis von 99,3:0,7 mischen. Acetonitril (80% v/v) als mobile Phase B vorbereiten. Filtern Sie alle beweglichen Phasen durch 0,2 m Polytetrafluorethylenmembranen.
      VORSICHT: Acetonitril ist beim Einatmen schädlich und kann Haut- und Augenreizungen verursachen. Tragen Sie Handschuhe und Schutzkleidung und führen Sie diesen Schritt in einer Dunstabzugshaube durch.
    8. Führen Sie 1 l der Probe auf einer Ultra-HPLC aus, die mit einer C18-Säule gemäß dem Elutionsprogramm in Tabelle 1 mit einer Durchflussrate von 0,42 ml -1 und einer Säulentemperatur von 40 °C ausgestattet ist. Erkennen Sie die zielgerichteten Aminosäuren bei 254 nm mit einem Dioden-Array-Detektor und berechnen Sie deren Konzentrationen, indem Sie die Spitzenbereiche der Standardkurve zuordnen.
Zeit (min) Mobile Phase A (%) Mobile Phase B (%)
0 98 2
3,5 70 30
7 43 57
7.1 0 100
11 98 2

Tabelle 1: Elutionsprogramm zur Quantifizierung von Aminosäuren.

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Representative Results

Für das Selektionssystem sollte eine starke Abnahme der OD600 für Stämme beobachtet werden, die das selten-codonreiche Antibiotikaresistenzgen beherbergen, im Vergleich zu dem Stamm, der das Wildtyp-Antibiotikaresistenzgen beherbergt, wenn er in einem geeigneten mittel (Abbildung 1a). Unter den gleichen Bedingungen wird die Abnahme der Zelle OD600 deutlicher, wenn die Anzahl der seltenen Codons im Antibiotikum-Resistenzgen zunimmt (Abbildung 1a). Es sollte beachtet werden, dass die Hemmung von seltenem Codon auf Proteinausdrücke meist unter verhungerten Bedingungen stattfindet. Wenn das LB-Medium nicht richtig verdünnt ist, wird daher keine signifikante Abnahme der Zelle OD600 für den Stamm beobachtet, der das selten-codonreiche Markergen im Vergleich zu dem Stamm beherbergt, der das Wildtypgen beherbergt (Abbildung 1b). Nach zusätzlicher Fütterung der entsprechenden Aminosäure wird die OD600 für den Stamm, der das selten-codonreiche Antibiotikaresistenzgen beherbergt, deutlich zunehmen und sich dem des Stammes nähern, der das Wildtyp-Gen beherbergt (Abbildung 1c).

Figure 1
Abbildung 1: Auswirkungen seltener Codons auf die Ausdrücke von Markergenen, die für die Auswahl und die Screening-Systeme verwendet werden. (a) Die Zelle OD600 für eine E. coli-Stämme, die das Antibiotikaresistenzgen (kanR) mit 6, 16, 26 und 29 Leucin-Seltenkodon (RC6, RC16, RC26 und RC29) nach 5 h Inkubation beherbergen. (b) Die Zelle OD600 für einen E. coli-Stamm, der den Wildtyp (WT) und den selten-codonreichen KanR (RC) in 1x, 0.5x und 0.2x LB-Medien nach 5 h Inkubation beherbergt. (c) Auswirkungen der Fütterung von L-Leucin auf das Zellwachstum für E. coli-Stämme, die das selten-codonreiche Kan-R-Gen nach 5 h Inkubation beherbergen. Die Werte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die SD (n = 6) dar. Die Fütterung von L-Leucin erhöhte die OD600 für Zellen, die den selten-codonreichen KanRbeherbergen. Die einzige Ausnahme war die Fütterung von 2 g L-1 L-Leucin aufgrund einer hohen SD in OD600 für die Fütterungsbehandlung. (d) Auswirkungen von Seltenerkodon- und L-Leucin-Fütterung auf GFP-Ausdrücke aus dem Wildtyp (WT) und den Leucin-Genen,rare-codon-rich (RC) nach 16 h Inkubation. Die Fütterung von 0,5–2L-1 L-Leucin erhöhte die Fluoreszenzintensität für Zellen, die das selten-codonreiche gfp beherbergen, signifikant. Die Werte und Fehlerbalken stellen den Mittelwert und die SD (n = 3) dar. **P < 0,01, ***P < 0,001, bestimmt durch zweischwänzigen t-Test, und es wurden nur die wichtigsten Ergebnisse gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Für das Screening-System werden die Fluoreszenzintensität und die Anzahl der fluoreszierenden Zellen für den Stamm, der das fluoreszierende Protein aus dem selten-codonreichen Gen ausdrückt, deutlich geringer sein als aus dem Wildtyp-Gen (Abbildung1d und Abbildung 2). Bei Verwendung des violetten Proteins sollte die Farbe, die aus dem selten-codonreichen ppg entwickelt wurde, leichter sein als die des Wildtyp-Gens, wenn sie unter den gleichen Bedingungen für die gleiche Inkubationszeit ausgedrückt wird (Abbildung 3). Die Fütterung der entsprechenden Aminosäure wird Proteinausdrücke aus den selten-codonreichen Genen wiederherstellen. Bei Stämmen, die den selten-codonreichen gfpbeherbergen, sollte die Fluoreszenzintensität (Abbildung 1d) und die Anzahl der fluoreszierenden Zellen (Abbildung 2) deutlich zunehmen und sich der der Stämme nähern, die den Wildtyp gfp enthalten. . Wenn unverdünntes LB verwendet wird, würden die Aminosäuren im Medium ausreichen, um eine langsame Expression der selten-codonreichen ppg auch ohne zusätzliche L-Leucin-Fütterung zu ermöglichen, und das exprimierte violette Protein würde sichtbar werden, sobald die Zellen pelletiert werden ( Abbildung 3). Dies verhehlt jedoch nicht, dass die Genexpression aus dem selten-codonreichen ppg durch die Fütterung des L-Leucins auf 2 g L-1, besonders wenn sie in der flüssigen Kultur beobachtet werden (Abbildung 3). Daher ist die flüssige Kultur eine bessere Wahl für das Screening auf der Grundlage chromogener Proteine, und die Verwendung von verdünntem LB-Medium würde einen signifikanteren Unterschied zwischen den Phänotypen, die durch den Wildtyp induziert werden, und den selten-codonreichen Genen bringen.

Figure 2
Abbildung 2: Die Anzahl der fluoreszierenden E. coli-Zellen, die den Wildtyp gfp oder das Leucin seltene codonreiche gfp (gfp-RC) nach zugabe von L-Leucin beherbergen. Zellen wurden in 1x LB Medium kultiviert. Skalenbalken = 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Farbentwicklung für Zellen, die den Wildtyp (WT) und die Leucin rare-codon-reichen (RC) ppg Gene beherbergen, die ein violettes Protein in 1x LB Medium (linkes Panel) kodieren, und die Wirkung der L-Leucin-Fütterung auf die Zellkultur-Farbentwicklung ( rechtes Panel). Die ppg-Gene wurden induziert, als die Zellen in die exponentielle Phase eintraten und die Bilder 3 h nach der Induktion aufgenommen wurden. Das L-Leucin wurde dem Medium zusammen mit dem Induktor im Fütterungstest zugesetzt. Die farbigen Kreise wurden durch Die Auswahl der Farben der Zellkulturen und der Zellpellets erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die auf seltenen Kodonen basierende Strategie ist in der Lage, Überproduzenten der zielgerichteten Aminosäuren aus der Mutationsbibliothek zu identifizieren, und diese Mutanten sollten höhere Mengen der zielgerichteten Aminosäuren produzieren als die Elternstämme (Abbildung 4).

Figure 4
Abbildung 4: Aminosäuren, die durch den Wildtyp und die mutierten Stämme hergestellt werden, die durch die auf seltenen Codonbasierende Strategie identifiziert werden. (a) L-Leucin-Produktionen von E. coli-Stämmen, die aus Mutationsbibliotheken durch die KanR-RC29 (EL-1 bis EL-5) und die gfp-RC identifiziert wurden, die 29 bzw. 19 Leucin-Kodone (EL-6 bis EL-10) beherbergen. (b) L-Arginin-Produktionen von Corynebacterium glutamicum-Stämmen, die von dem selten-codonreichen Kan R ausgewählt wurden, der acht Arginin-Seltene Codons (AGG) enthielt. Das Markergen wurde in die C. glutamicum Mutationsbibliotheken eingeführt, die vom Wildstamm ATCC13032 abgeleitet wurden. Das Selektionsmedium war 0,3x CGIII, die mit 25-g-mL-1-Kanamycin geliefert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Anzahl der seltenen Codons in den Markergenen und dem Selektions- oder Screeningmedium ist entscheidend, um Proteinausdrücke aus den selten-codonmodifizierten Markergenen zu hemmen. Wenn kein signifikanter Unterschied zwischen Proteinausdrücken aus den Wildtyp-Markergenen und ihren Derivaten nachgewiesen werden kann, kann die Erhöhung der Anzahl seltener Codons oder die Verwendung eines nährstoffbegrenzten Mediums die Unterschiede verstärken. Wenn die Hemmungswirkung jedoch zu stark ist, können die Proteinausdrücke auch durch zusätzliche Fütterung der entsprechenden Aminosäuren nicht wiedergewonnen werden. In diesem Fall sollte die Anzahl der seltenen Codons in den Markergenen reduziert werden, um einen Teil des Stresses zu lindern. Eine andere Möglichkeit, die Auswahl- oder Screening-Stringenz zu optimieren, besteht darin, die Kopierzahlen und die Expressionsniveaus der selten-codonreichen Markergene anzupassen. Die Verringerung der Kopierzahl und der Expressionsniveaus der Markergene führt in der Regel zu stärkeren Differenzierungen zwischen den Aminosäureüberproduzenten und den anfänglichen Stämmen. Daher sollten Vektoren verwendet werden, die die Replikationsherkunften mit niedriger Kopiernummer enthalten, wie p15A oder pSC101, sowie schwache Promotoren. Wenn das Markergen von einem induzierbaren Promotor angetrieben wird, wird eine geringe Induktion empfohlen.

Die auf seltenen Kodonen basierende Strategie für die Auswahl oder das Screening von Aminosäureüberproduzenten ist eine umgekehrte Anpassung der häufig verwendeten Strategie der "Kodonoptimierung", die darauf abzielt, die Ausdrücke exogener Proteine zu erleichtern. Bei der Codon-Optimierung werden die seltenen Codons auf den Zielgenen durch die synonymen gemeinsamen in Bezug auf den Wirt ersetzt; So könnten die Gene anderer Organismen viel schneller in Proteine übersetzt werden als die exogenen Gene mit hohen Anteilen seltener Codons19. Daher ist davon auszugehen, dass die "umgekehrte Optimierung", die die gemeinsamen Codons auf ihre synonymen seltenen umstellt, Genausdrücke hemmen sollte. Die Genausdrücke sollten jedoch durch eine verbesserte Aufladung der entsprechenden seltenen tRNAs wiederhergestellt werden, wenn sich die zielgerichteten Aminosäuren intrazellulär ansammeln. Die Aufnahme seltener Kodons erhöht die Schwelle der Aminosäurekonzentration in Proteinausdrücken, was eine mögliche Strategie zur Auswahl oder des Abschirmens von Aminosäureüberproduzenten in Kombination mit den richtigen Markergenen bietet.

Neben den Antibiotikaresistenzgenen, den fluoreszierenden Proteingenen und den im Protokoll verwendeten chromogenen Proteingenen könnten verschiedene Markergene eingesetzt werden, um das auf seltenen Codonen basierende Selektions- oder Screening-System zu etablieren. Zum Beispiel könnten tödliche Gene wie tolC20 und sacB21 verwendet werden, um Aminosäure-Overproduzenten auszuwählen. In diesem Fall sollten gängige Codons auf den Genen, die zum Antidotensystem gehören, durch die synonymen seltenen Codons der zielgerichteten Aminosäuren ersetzt werden. Stämme, die die zielgerichteten Aminosäuren überproduzieren, sind in der Lage, das Gegenmittelsystem zu starten und somit die toxischen Wirkungen zu überleben, die durch die tödlichen Gene induziert werden.

Es sollte beachtet werden, dass Nebenwirkungen auftreten können, wenn hohe Mengen an Aminosäuren in der Fütterung Assay verwenden. Dies liegt daran, dass einige Aminosäuren für die Mikroorganismen giftig sind. Zum Beispiel eine Konzentration von etwa 100 mg L-1 für L-Serin ist in der Lage, das Wachstum von E. coli22zu hemmen. Obwohl wir niedriger als die des Wildtyp-Gens sind, stellten wir fest, dass die Fütterung bis zu 2 g L-1 L-Serin könnte immer noch die Ausdrücke von Antibiotikaresistenz-Genen wiederherstellen, die reich an Serin selten enkodon13. Daher würde die Aminosäuretoxizität, zumindest für L-Serin, die Zuverlässigkeit des Fütterungstestes nicht gefährden. Um die möglichen negativen Auswirkungen der Aminosäuretoxizität auf die Produktivitäten der zielgerichteten Stämme zu überwinden, könnten Strategien wie die zufällige Mutagenese und die Verbesserung der Aminosäureexporte23 angewendet werden. Tatsächlich eignet sich die auf seltenen Kodonen basierende Methode zur Identifizierung toleranter Stämme, die Aminosäuren über den toxischen Werten standhalten oder überproduzieren können. Die wichtigsten Mutationen, die Aminosäuretoleranz verleihen, konnten identifiziert und in die zielgerichteten Stämme eingeführt werden, was die idealen Wirte für die Konstruktion von Aminosäureüberproduzenten wäre.

Das seltene Codon-basierte Selektions- oder Screening-System sorgt für hohe Genauigkeit. Mit anderen Worten, Stämme, die durch das System identifiziert werden, sollen die Überproduzenten der gezielten Aminosäuren sein. In einigen Fällen können die Kandidaten, die die Antibiotikaauswahl überleben, jedoch keine höheren Mengen der angestrebten Aminosäuren produzieren als der Stammstamm. Dies könnte auf die Antibiotikaresistenz zurückgeführt werden, die von den Stämmen durch Mutagenese erworben wurde, und dann auf einen Verlust des Selektionsplasmids24zurückzuführen. Infolgedessen könnten Stämme ohne verbesserte Aminosäure-Iivitäten den Antibiotika-Stress überleben und der Selektion entkommen. Diese falsch positiven Stämme könnten eliminiert werden, indem ein anderer Selektionsmarker in das Selektionsplasmid eingefügt wird, wie z. B. ein Wildtyp-Gen, das Resistenzen gegen ein anderes Antibiotikum verleiht. Stämme, die das Selektionsplasmid verloren haben, sind weniger wahrscheinlich, eine doppelte Resistenz gegen die beiden Antibiotika zu erhalten und werden bei der Selektion eliminiert.

Mutanten, die durch das auf seltenen Codon basierende System identifiziert werden, sollten in der Lage sein, die zielgerichteten Aminosäuren im Vergleich zu den ursprünglichen Stämmen zu überproduzieren. Die Aminosäure-Iktivitäten für die ausgewählten Stämme können jedoch immer noch niedriger sein als die industriellen Anforderungen. Dies deutet nicht auf ein Scheitern der auf seltenen Kodonbasierenden Strategie hin, da die Dehnungsleistungen unabhängig vom Auswahl- oder Screening-Verfahren sind, sondern von Faktoren wie den Eigenschaften der anfangsen Dehnung, dem Ansatz der Mutagenese, der Größe der Mutationsbibliothek und die Fermentationsbedingungen. Um produktionsstarke Stämme zu erhalten, sollte auf die Strategien der Dehnungstechnik geachtet werden, z. B. durch zufällige Mutagenese oder durch rationale Gestaltung der biosynthetischen Aminosäurewege. Die Kombination der adaptiven Laborentwicklung und der auf seltenen Kodonen basierenden Strategie würde die Gewinnung von Aminosäureüberproduzenten erleichtern.

Das Methionin und das Tryptophan haben keine alternativen Codons unter den 20 proteinogenen Aminosäuren. Daher kann diese Strategie nicht direkt auf diese Aminosäuren angewendet werden. Eine mögliche Lösung ist die Verwendung von technischen tRNAs, die in der Lage sind, die Stop-Codons zu erkennen, um diese Aminosäuren zu tragen. So könnten die entsprechenden Stop-Codons als künstliche seltene Codons dieser Aminosäuren25,26angenommen werden.

Einer der größten Mängel in Bezug auf die konventionelle analoge Strategie für die Auswahl von Aminosäure-Overproduzenten ist die hohe falsch positive Rate5,27. Stämme, die durch Mutagenese gehen, könnten leicht Resistenz entocieren gegen die toxischen Aminosäureanaloge, und die Toleranz kann sogar ohne die Hilfe von Mutagenen erworben werden27. Diese Stämme könnten leicht den Selektionsdruck aus den Aminosäure-Analogen entweichen und folglich sind die ausgewählten Stämme in der Regel nicht die wahren Aminosäure-Overproduzenten, was die Effizienz des Auswahlprozesses stark opfert.

Im Gegensatz dazu übertrifft die auf seltenkodonbasierte Strategie die traditionelle analoge Methode, indem sie genaue und schnelle Identifizierungen von Aminosäureüberproduzenten ermöglicht. Unserer Kenntnis nach ist dies die erste Strategie, die das natürliche Gesetz der Codon-Voreingenommenheit annimmt. Es stützt sich nur auf ein einziges selten-codonreiches Marker-Gen und eliminiert somit die Verwendung von toxischen Analoga. Die Markergene sind in der Regel ungiftig für die Wirtsstämme, und die Proteinausdrücke von selten-codonreichen Genen hängen aufgrund des universellen und strengen Gesetzes der Codon-Voreingenommenheit in erster Linie von den intrazellulären Konzentrationen der entsprechenden Aminosäuren ab. über alle Arten hinweg. Dadurch würde verhindert, dass die Stämme dem Selektionsdruck entweichen. Außerdem könnte die auf seltenen Kodonen basierende Strategie aufgrund der großen Vielfalt an Markergenen verschiedene Möglichkeiten sowohl für die Auswahl als auch für das Screening von Aminosäureüberproduzenten bieten.

Aufgrund des universellen Phänomens der Codon-Bias in allen lebenden Organismen28, könnte die seltene codonbasierte Selektions- oder Screening-Strategie theoretisch auch für andere Mikroorganismen neben E. colieingesetzt werden, insbesondere für solche mit Potenziale. Beim Wechsel zu einem anderen Host sollte die Wahl seltener Codons, die für die Gestaltung der Markergene verwendet werden, auf den Codon-Nutzungsfrequenzen und den Häufigkeiten der entsprechenden tRNAs für den jeweiligen Host basieren. Auch das medium, das für die Auswahl oder das Screening verwendet wird, sollte entsprechend optimiert werden. Ein Beispiel ist das häufig verwendete C. glutamicum in Aminosäurefermentationen. Ein selten kodonmodifiziertes Kan-R-Gen, das acht argininseltene Kodone (AGG) enthält, hat sich in einer früheren Studie 13 (Abbildung 4b) bei der Auswahl von C. Glutamicum L-Arginin-Overproduzenten als wirksam erwiesen. Untersuchungen der auf seltenen Kodonbasis basierenden Strategie sollten die Konstruktionen und das Verständnis von Aminosäureüberproduzenten erleichtern. Neben Aminosäuren, die rare-codon-basierte Strategie könnte auch mit Isobutanol, 3-Methyl-1-Butanol, 2-Methyl-1-Butanol, und andere Produkte, die die gleichen biosynthetischen Wege mit bestimmten Aminosäuren teilen verwendet werden29. Stämme, die durch Markergene identifiziert werden, die die seltenen Codons dieser Aminosäuren beherbergen, sind in der Lage, die Vorläuferverbindungen zu überproduzieren, die zur Synthese der Aminosäurederivate kanalisiert werden könnten. Daher könnte die auf seltenen Kodonen basierende Strategie als indirekte, aber schnelle Methode dienen, um die Potenziale der Stämme bei der Anhäufung dieser Chemikalien entweder intra- oder extrazellulär widerzuspiegeln. Schlüsselmutationen, die erhöhte Aminosäure-Iquitäten von verschiedenen Überproduzenten verleihen, konnten durch tiefe Sequenzierung identifiziert und einzeln oder gleichzeitig in industriell hergestellte Stämme eingeführt werden, um die Aminosäureproduktion weiter zu verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde gemeinsam von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nr. 21676026), dem National Key R&D Program of China (Grant-Nr. 2017YFD0201400) und der China Postdoctoral Science Foundation (Grant-Nr. 2017M620643) unterstützt. Die Arbeiten am UCLA Institute of Advancement (Suzhou) wurden durch interne Zuschüsse der Provinz Jiangsu und des Industrieparks Suzhou unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo 51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit Transgen EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit Transgen EG101-01
Gibson assembly master mix NEB E2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Solarbio I8070
L-leucine Sigma L8000
Microplate reader Biotek Synergy 2
n-hexane Thermo H3061
Phenyl isothiocyanate Sigma P1034
PrancerPurple CPB-37-441 ATUM CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymerase Transgen AP231-01
Triethylamine Sigma T0886
Ultra-high performance liquid chromatography Agilent 1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum ATCC 13032
XL10-Gold E. coli competent cell Agilent 200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column Agilent 959759-902K

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Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N., Yang, Y., Liang, X., Ma, X. Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers. J. Vis. Exp. (148), e59331, doi:10.3791/59331 (2019).

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