Det er ofte nødvendig å vurdere den potensielle cytotoksisitet av et sett med forbindelser på kulturperler celler. Her beskriver vi en strategi for pålitelig skjerm for giftige forbindelser i et 96-brønn format.
Cytotoksisitet er en kritisk parameter som må kvantifisert når man studerer medikamenter som kan ha terapeutiske fordeler. På grunn av dette, mange narkotika screening analyser utnytte cytotoksisitet som en av de kritiske egenskaper for å bli profilert for individuelle forbindelser. Celler i kultur er en nyttig modell for å vurdere cytotoksisitet før du fortsetter å følge opp lovende bly forbindelser i mer kostbare og arbeidsintensive dyremodeller. Vi beskriver en strategi for å identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en tdTomato uttrykker menneskelige nevrale stamceller (NSC) linje. Strategien bruker to komplementære analyser for å vurdere celle nummer. En analysen fungerer via reduksjon av 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) til formazan som en proxy for celle nummer og den andre direkte teller tdTomato uttrykker NSCs. De to analysene kan utføres samtidig i et enkelt eksperiment, og er ikke arbeidsintensive, raske og rimelige. Strategien beskrevet i denne demonstrasjonen testet 57 forbindelser i en undersøkende primærskjerm for toksisitet i en 96-brønn plateformat. Tre av treffene ble preget videre i en seks-punkts dose respons ved hjelp av samme analysen satt opp som den primære skjermen. I tillegg til å gi utmerket bekreftelse for toksisitet, kan sammenligning av resultater fra de to analysene være effektive i å identifisere forbindelser som påvirker andre aspekter av cellevekst.
En av de viktigste egenskapene som må fastsettes for en kjemisk forbindelse som har terapeutisk potensial er dens toksisitet for dyreceller. Dette karakteristiske vil avgjøre om et medikament er en god kandidat for mer omfattende studier. I de fleste tilfeller er forbindelser med minimal toksisitet søkt, men det finnes situasjoner der en forbindelse med kapasitet til å drepe bestemte celletyper er av interesse, for eksempel, anti-tumorigene narkotika. Selv om hele dyr er den beste modellen systemer for å fastslå systemisk toksisitet, er kostnaden og arbeidskraft involvert uoverkommelige når mer enn noen få forbindelser må testes. Som sådan er pattedyr cellekultur vanligvis brukt som den mest effektive alternativ1,2. Små til middels gjennomstrømning narkotika skjermer er en viktig modalitet som toksisitet kan vurderes i cellekultur. Disse skjermene kan brukes til å forhøre kommenterte biblioteker rettet mot individuelle signal veier. Den generelle formatet på en slik skjerm er å først teste alle forbindelsene i biblioteket på en enkelt dose (vanligvis 10 μM) i en undersøkende primær toksisitet skjermen, og deretter utføre en grundig sekundær dose respons skjermen for fullt karakterisere toksisitet profilen til treff fra hovedskjermen. Metodene for å implementere denne strategien vil bli beskrevet her og gi en rask, effektiv og rimelig måte å identifisere og karakterisere giftige forbindelser.
Flere metoder er utviklet for å vurdere cytotoksisitet av små forbindelser og nanomaterialebasert i pattedyrceller3,4. Det bør bemerkes at visse materialer kan samhandle med analysen gir villedende resultater, og slike interaksjoner bør testes når karakteriserer treff fra toksisitet skjermer4. Cytotoksisitet analyser inkluderer trypan Blue eksklusjon5, melkesyre DEHYDROGENASE (LDH) Release analysen6, Alamar blå analysen7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, og ATP-analysen9. Alle disse analysene måle ulike aspekter av celle metabolisme som kan tjene som en proxy for celle nummer. Mens alle tilbyr fordeler, tetrazolium salt-baserte analyser som 3-(4, 5-dimethylthizol-2-YL)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2, 3-BIS (2-metoksy-4-Nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide indre salt (XTT)-1 og 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1, 3-benzen disulfonate (WST-1)10,11 gir god nøyaktighet og brukervennlighet til lave kostnader. MTT, som vil bli brukt i denne demonstrasjonen, er redusert til et uløselig formazan av en mitokondrie reduktase og frekvensen av denne konverteringen samsvarer sterkt med celle nummer. Denne analysen har vært rutinemessig utnyttet både i liten skala og for screening biblioteker med opptil 2 000 forbindelser12. Direkte telling av celler med en merket markør tilbyr en annen metode for å vurdere mobilnummeret, og i motsetning til MTT-analysen kan det gi ytterligere informasjon om dynamikken i mobilnettet vekst. Flere offentlig tilgjengelige algoritmer er tilgjengelige for å utføre automatiserte celle tellings analyser, og det finnes også proprietære algoritmer som er en del av programvarepakker for Imaging leserne13,14. I denne metoden beskrivelse, en menneskelig neural Stem Cell (NSC) linje som har blitt genetisk redigert til constitutively uttrykke tdTomato15 vil tjene som en test linje for å sammenligne cellulære levedyktighet resultater mellom en MTT-analysen og en automatisert celle telling analysen i en skjerm vurdere toksisitet av 57 test forbindelser. Selv om det primære målet med denne strategien var å identifisere og karakterisere giftige forbindelser, har den ekstra fordelen av potensielt identifisere veksthemmende og vekst styrke forbindelser og dermed gir en effektiv metode for å identifisere legemidler som kan modulere mobilnettet vekst.
Det primære målet med denne artikkelen var å beskrive en strategi som kan effektivt og rimelig identifisere forbindelser som påvirker cellevekst i en lav-til moderat gjennomstrømming screening. To ortogonale teknikker ble benyttet for å vurdere celle nummer for å øke tilliten til konklusjonene og tilby ytterligere innsikt som ikke ville være tilgjengelig hvis bare en enkelt analysen ble brukt. En av analysene brukt en fluorescerende celle imager å direkte telle tdTomato-positive celler og den andre var avhengig…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NINDS intramural Research program.
B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |