Summary
La derivación de un flavonol es crucial para su aplicación en la salud y la industria alimentaria. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la biosíntesis de un flavonol de una flavanona y discutimos los pasos cruciales y sus ventajas sobre otros enfoques.
Abstract
Los flavonols son una subclase importante de flavonoides con una variedad de actividades biológicas y farmacológicas. Aquí, proporcionamos un método para la síntesis enzimática in vitro de un flavonol. En este método, Atf3h y Atfls1, dos genes clave en la vía biosintética de los flavonols, se clonan y se sobreexpresan en Escherichiacoli. Las enzimas recombinantes se purifican a través de una columna de afinidad y luego se establece una cascada bienimática en un tampón sintético específico. Dos flavonols se sintetizan en este sistema como ejemplos y se determinan mediante análisis TLC y HPLC/LC/MS. El método muestra ventajas obvias en la derivación de flavonols sobre otros enfoques. Es ahorro de tiempo y mano de obra y altamente rentable. La reacción es fácil de controlar con precisión y, por lo tanto, se amplía para la producción en masa. El producto objetivo se puede purificar fácilmente debido a los componentes simples en el sistema. Sin embargo, este sistema se limita generalmente a la producción de un flavonol a partir de una flavanona.
Introduction
Los flavonols son una subclase importante de flavonoides vegetales y participan en el desarrollo de plantas y pigmentación1,2,3. Más importante aún, estos compuestos poseen una amplia gama de actividades beneficiosas para la salud, tales como contraelcancero4,5, antioxidante6, antiinflamatorio7, antiobesidad8, antihipertensivo9 , y las propiedades de memoria10,lo que conduce a un gran número de estudios sobre estos metabolitos secundarios derivados de plantas. Tradicionalmente, estos compuestos se derivan principalmente de la extracción de plantas utilizando disolventes orgánicos. Sin embargo, debido a su muy bajo contenido en plantas11,12,13, el costo de producción para la mayoría de los flavonols sigue siendo alto, lo que impone grandes restricciones a su aplicación en la salud y los alimentos Industria.
Durante las últimas décadas, los científicos han desarrollado un buen número de métodos para derivar flavonoides14,15. Sin embargo, la síntesis química de estas moléculas complicadas posee una variedad de desventajas intrínsecas16. Requiere no sólo reactivos tóxicos y condiciones de reacción extremas, sino también muchos pasos para producir un compuesto flavonoides objetivo14,17. Además, otro desafío importante en esta estrategia es la síntesis quiral de moléculas flavonoides activas. Por lo tanto, no es una estrategia ideal para producir flavonoides a escala comercial a través de la síntesis química16,17.
Recientemente, los científicos han desarrollado una estrategia alternativa prometedora para producir estos complicados compuestos naturales mediante la ingeniería de microbios con una vía para la biosíntesis de flavonoides18,19,20, 21 , 22, que ha sido descifrado con éxito en las plantas23. Por ejemplo, Duan y otros introdujeron una vía biosintética en la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae para producir kaempferol (KMF)24. Malla et al. produjeron astracpuedeína, un flavonol glucosilado, mediante la introducción deflavanona 3-hidroxilasa (f3h), flavonol sintasa (fls1), y UDP-glucosa:flavonoide 3-O-glucosidasa UGT78K1 genes en Escherichia coliBL21(DE3)17. A pesar de que hay bastantes paradigmas, no todos los microbios genéticamente modificados producen los productos de interés debido a la complejidad de una plataforma celular, la incompatibilidad entre los elementos genéticos sintetizados artificialmente y los anfitriones, el efecto de los productos objetivo contra las células huésped, y la inestabilidad de un sistema celular de ingeniería en sí16.
Otra estrategia alternativa prometedora para la producción de flavonoides es establecer una cascada multienzimática in vitro. Cheng y otros. han informado de que los policítlos de enterocina se pueden sintetizar con éxito mediante el montaje de una vía enzimática completa en una olla25. Esta estrategia sintética sin células elude las restricciones de una fábrica de producción microbiana y por lo tanto es factible para producir algunos flavonoides en gran cantidad16.
Recientemente, hemos desarrollado con éxito un sistema sintético de bienzima para convertir la naringenina (NRN) en KMF en una olla16. Aquí, describimos este sistema con grandes detalles y los métodos involucrados en el análisis de los productos. También presentamos dos ejemplos que utilizan este sistema para producir KMF a partir de NRN y quercetina (QRC) de eriodictyol (ERD). Además, discutimos los pasos cruciales de este método y las futuras direcciones de investigación en la biosíntesis de flavonoides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Aislar el ARN total de los tejidos vegetales26,27
- Homogeneizar los tejidos vegetales.
- Recoger 100 mg de un tejido vegetal fresco (por ejemplo, plántulas de 4 semanas de Arabidopsis thaliana). Congele el tejido y un mortero con nitrógeno líquido, seguido de moler el tejido en polvo.
- Añadir 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN (ver Tabla de Materiales)en el mortero. El reactivo se congelará inmediatamente. Homogeneizar la muestra de tejido con el pestillo cuando el reactivo congelado se derrite.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de 1,5 ml, centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 5 min a 4 oC y, a continuación, transferir la solución homogeneizada despejada a otro tubo fresco de 1,5 ml.
- Incubar la muestra homogeneizada a temperatura ambiente durante 5 min.
- Aísle el ARN total.
- Añadir 0,2 ml de cloroformo al homogeneato, tapar el tubo de forma segura, agitar el tubo vigorosamente a mano durante 15 s e incubar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min.
- Centrifugar la muestra a 12.000 x g durante 15 min a 4 oC y transferir la fase acuosa superior incolora a un tubo fresco de 1,5 ml. La muestra se separa en tres fases después de la centrifugación.
- Añadir 0,5 ml de alcohol isopropílico a la fase acuosa, agitar el tubo a mano de forma vigorosa e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min.
- Centrifugar la mezcla a 12.000 x g durante 10 min a 4oC y retirar el sobrenadante.
- Lavar el pellet de ARN una vez con 1 ml de etanol al 75% por vórtice, seguido de centrifugación a 7.500 x g durante 5 min a 4 oC.
- Repita el paso 1.2.5.
- Seque al aire el pellet durante 5-10 minutos y vuelva a disolver el ARN en agua tratada con dietilopirato (DEPC) pipeteando hacia arriba y hacia abajo, seguido de medir la concentración total de ARN con un microespectrofotómetro (ver Tabla de Materiales).
2. Sintetizar ADN complementario (ADN)28
- Sintetizar la primera hebra de ADNc utilizando un kit (ver Tabla de Materiales). Configurar un sistema de reacción de 20 l, tal y como se muestra en la Tabla 1, e incubar el tubo de reacción en un instrumento de PCR durante 50 min a 42 oC, seguido de terminar la reacción a 85 oC durante 5 min. Almacene el producto de reacción a -20 oC para la amplificación futura de genes.
| Reactivos | Volumen |
| mezcla dNTP, 2,5 mM cada una | 4,0 l |
| Primer Mix | 2,0 l |
| Plantilla de ARN | 1.0 g |
| Zona de influencia de transcriptasa inversa, 5o | 4,0 l |
| Transcriptasa inversa, 200 U/L | 1.0 L |
| Libre de RNase H2O | hasta 20,0 l |
Tabla 1: Invertir la transcripción del ARN total en ADNc
3. Construir plásmidos recombinantes29
- Imprima imprimaciones PCR de diseño.
- Diseñar las imprimaciones PCR utilizando un software (ver Tabla de Materiales)basado en las secuencias de genes enzimáticos clave obtenidos de la base de datos GenBank y sintetizar las imprimaciones por una empresa (ver Tabla de Materiales). En el extremo 5' de la imprimación, agregue un sitio de enzimas de restricción (por ejemplo, BamHI o EcoRI en este protocolo).
NOTA: Las imprimaciones utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla2.
- Diseñar las imprimaciones PCR utilizando un software (ver Tabla de Materiales)basado en las secuencias de genes enzimáticos clave obtenidos de la base de datos GenBank y sintetizar las imprimaciones por una empresa (ver Tabla de Materiales). En el extremo 5' de la imprimación, agregue un sitio de enzimas de restricción (por ejemplo, BamHI o EcoRI en este protocolo).
| Secuencia, 5' a 3' | Propósito |
| AAGGATCCATGGCTCCAGGAACTTTGACT | Imprimación delantera para amplificación de PCR del gen Atf3h de Arabidopsis thaliana. Bam El sitio HI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+). |
| AAGAATTCCTAAGCGAAGATTTGGTCGA | Imprimación inversa para amplificación pcR del gen Atf3h de A. thaliana. Eco El sitio de RI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+). |
| AAGGATCCATGGAGGTCGAAAGAGTCCA | Imprimación delantera para amplificación de PCR del gen Atfls1 de A. thaliana. Bam El sitio HI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+). |
| AAGAATTCTCAATCCAGAGGAAGTTTAT | Imprimación inversa para amplificación pcR del gen Atfls1 de A. thaliana. Eco El sitio de RI está en cursiva y se adjunta para clonar en pET32a(+). |
Tabla 2: Imprimaciones de oligonucleótidos utilizadas en el estudio actual
- Clonar los genes en un vector de expresión procasinotica.
- Amplificar los genes de la primera hebra del ADNC sintetizado utilizando una polimerasa de ADN de alta fidelidad (ver Tabla de Materiales). Configurar un sistema de reacción de PCR de 100-L como se muestra en la Tabla 3 y ejecutar el siguiente ciclo de PCR: 94 oC durante 2 min para la desnaturalización inicial; a continuación, 35 ciclos de 94 oC para 30 s para la desnaturalización, 55 oC para 2 min para recocido, y 72 oC durante 1 min para la extensión; seguido de un alargamiento final a 72 oC durante 10 min. Enfriar la mezcla de reacción a 12 oC.
NOTA: El tiempo de extensión es variable y determinado por la longitud del gen con polimerización de aproximadamente 1000 bases por minuto para la mayoría de las polimerasas de ADN. - Visualizar los productos de PCR (más comúnmente 5 L) en un gel de agarosa del 1% y purificar el fragmento de ADN específico de los productos restantes utilizando un kit de limpieza de ADN (ver Tabla de Materiales).
- Digerir el fragmento de ADN purificado y el vector (por ejemplo, pET-32a(+)) con enzimas de restricción (por ejemplo, BamHI o EcoRI en este protocolo). Configurar un sistema de reacción de 50 l en un tubo de PCR de 0,2 ml, como se muestra en la Tabla 4 e incubar la mezcla a 37 oC durante 3 h. Separar el ADN digerido en un gel de agarosa del 1%.
- Recuperar la banda de ADN utilizando un kit de extracción de gel (ver Tabla de Materiales). Purificar aún más el ADN utilizando un kit de limpieza de ADN (ver Tabla de Materiales), seguido de la medición de la concentración de ADN con un microespectrofotómetro (ver Tabla de Materiales).
- Ligar el fragmento de gen en el ADN vectorial linealizado utilizando una ligasa de ADN T4 (ver Tabla de Materiales). Configure una reacción de ligadura en un tubo de 1,5 ml como se muestra en la Tabla 5 e incubar el tubo a temperatura ambiente durante 2 - 3 h.
NOTA: La relación molar de una plaquita a un vector es variable y oscila entre 3:1 y 10:1. - Añadir 2,5 ml de la mezcla de ligadura en 50 ml de células de Escherichia coli químicamente competentes (p. ej., TOP10 o DH5o), mezclar suavemente y mantener el tubo en hielo durante 30 minutos. Choque térmico de las células a 42 oC durante 90 s e inmediatamente coloque el tubo en hielo durante 2 minutos.
- Añadir 200 ml de medio líquido LB sin antibióticos en el tubo e incubar el tubo en una coctelera de 37 oC a 220 rpm durante 1 h. Esparcir 50 - 100 ml de las células en una placa LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 37 oC durante la noche.
- Amplificar los genes de la primera hebra del ADNC sintetizado utilizando una polimerasa de ADN de alta fidelidad (ver Tabla de Materiales). Configurar un sistema de reacción de PCR de 100-L como se muestra en la Tabla 3 y ejecutar el siguiente ciclo de PCR: 94 oC durante 2 min para la desnaturalización inicial; a continuación, 35 ciclos de 94 oC para 30 s para la desnaturalización, 55 oC para 2 min para recocido, y 72 oC durante 1 min para la extensión; seguido de un alargamiento final a 72 oC durante 10 min. Enfriar la mezcla de reacción a 12 oC.
| Reactivos | Volumen |
| Pfu Master Mix, 2o | 50,0 l |
| Primer delantero, 10 m | 4,0 l |
| Imprimación inversa, 10 m | 4,0 l |
| Cdna | 2,0 l |
| H2O | 40,0 l |
Tabla 3: Configuración de un sistema de reacción PCR
| Reactivos | Volumen |
| Fragmento de ADN/Vector | 3.0 g |
| Bam Hola | 1.0 L |
| Eco Ri | 1.0 L |
| Búfer Cutsmart, 10o | 5.0 L |
| H2O | hasta 50,0 l |
Tabla 4: Doble digestión de un fragmento/vector de ADN
| Reactivos | Volumen |
| insertar | X L (0,09 pmol) |
| Vector | Y-L (0,03 pmol) |
| Zona de influencia de la ligadura, 10o | 1.0 L |
| T4 DNA Ligase, 400 U/L | 1.0 L |
| H2O | hasta 10,0 l |
Tabla 5: Ligadura de un fragmento genético en un vector linealizado
- Pantalla de colonias positivas.
- Inocular una sola colonia desde la placa LB en 200 ml de medio líquido LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 37 oC, 250 rpm durante 2 - 3 h.
NOTA: En general, escoja 4 - 8 colonias para la detección de colonias positivas. - Configure una reacción pcR de la colonia de 10-L similar a la del paso 3.2.1.
NOTA: Utilice 1 l de cultivo lb en lugar de 1 l de plantilla de ADNr. - Visualice los productos de PCR en un gel de agarosa al 1%. Inocular el cultivo restante con un resultado positivo en 3 ml de medio líquido LB que contiene 100 g/ml de ampicilina e incubar en una coctelera de 37 oC a 250 rpm durante 14 - 16 h.
- Aísle el ADN plásmido de cultivos recombinantes de E. coli utilizando un kit de minipreparación plásmido (ver Tabla de Materiales).
- Identifique los plásmidos recombinantes purificados mediante un análisis enzimático de doble restricción (por ejemplo, BamHI y EcoRI en este protocolo). Configurar un sistema de reacción de 10-L similar al del paso 3.2.3, seguido de la incubación a 37 oC durante 3 h. Visualizar la banda específica liberada del plásmido recombinante en un gel de agarosa del 1%.
- Inocular una sola colonia desde la placa LB en 200 ml de medio líquido LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 37 oC, 250 rpm durante 2 - 3 h.
- Verifique las secuencias de plásmidos recombinantes positivos.
- Envía los plásmidos a una compañía para la secuenciación. Analizar los resultados utilizando un software de análisis de secuencia de ADN (ver Tabla de Materiales)comparando la secuencia obtenida de la empresa de secuenciación con la secuencia de referencia obtenida de la base de datos GenBank.
4. Proteínas enzimáticas recombinantes express30
- Transforme el plásmido recombinante correcto en E. coli BL21(DE3) competente.
- Añadir 0,1 ml del plásmido a 10 ml de E. coli BL21(DE3) competente en un tubo de 1,5 ml sobre hielo y mantener el tubo en hielo durante 5 minutos.
- Choque por calor las células en un baño de agua de 42 oC durante 90 s y colóquelo en hielo de nuevo durante 2 minutos.
- Añadir 200 ml de medio líquido LB sin antibióticos e incubar en una coctelera de 37 oC a 220 rpm durante 5 min.
- Esparza 50 ml de transformación en una placa de agar LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar la placa durante la noche en una incubadora de 37oC.
- Inducir la expresión de genes.
- Inocular 3 - 5 colonias de la placa en un tubo que contenga 3 ml de medio líquido LB con 100 g/ml de ampicilina e incubar a 250 rpm en una coctelera de 37 oC durante la noche.
- Transfiera todo el cultivo nocturno a 300 ml de medio líquido LB que contenga 100 g/ml de ampicilina e incubar a 250 rpm en un agitador de 37 oC hasta que la densidad óptica del cultivo a 600 nm esté entre 0,4 y 0,6.
- Añadir isopropilo-D-tiogalactoside (IPTG) en el cultivo con una concentración final de 0,2 mM e inducir la expresión de los genes a 250 rpm, 20 - 22 oC durante 3 h.
5. Purificar las proteínas enzimáticas recombinantes31
- Cosechar las bacterias por centrifugación del cultivo a 4 oC, 12.000 x g durante 10 min.
- Resuspender el pellet en 15 ml de tampón de lisis bacteriana que contiene 0,1% De tritón X-100, 1 mM EDTA, 10% glicerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM de TDT, 0,1 mM de PMSF, 1 g/mL de aprotinaína, 1 g/ml de leupeptina y pepstatina de 1 g/ml en Tris-Cl de 50 mM (pH 8,0).
- Sonicar la suspensión bacteriana para liberar las proteínas enzimáticas recombinantes, seguida de centrifugación a 13.000 x g, 4 oC durante 10 min.
- Cosecha y alícuota el sobrenadante en tubos de 1,5 ml a 1 ml/tubo y guárdalos a -70oC para su uso futuro.
- Aplicar 500 l de resina de purificación de su etiqueta (ver Tabla de Materiales)a una columna de afinidad vacía reutilizable. Lave la resina con 5 volúmenes de agua desionizada para desechar el etanol en la solución en stock. Equilibre la resina con 10 volúmenes de lecho del tampón de unión que comprende Tris-Cl (20 mM, pH 7,9), imidazol (10 mM) y NaCl (0,5 M).
- Aplicar 4 ml del sobrenadante del paso 5.4 a una suspensión de la resina anterior y bloquear dos extremos de la columna con tapónes.
- Incubar la mezcla a 4oC sobre un rotador a baja velocidad durante 2 h.
- Lave la resina ligada a proteínas de fusión con 15 volúmenes de lecho del tampón de unión a 4 oC a un caudal de 1 ml/min antes de la elución.
- Añadir 500 ml de tampón de elución (que contiene 20 mM Tris-Cl (pH 7.9), 500 mM de imidazol, 0,5 M de NaCl) a la columna e incubar la suspensión a 4 oC en un rotador a baja velocidad durante 10 minutos.
- Repita el paso 5.5 cuatro veces más.
- Lave la resina secuencialmente con 10 volúmenes de cama de agua desionizada y 3 volúmenes de lecho de 20% de etanol. Remoje la resina en un 20% de etanol. Bloquear la columna con tapónes y almacenarla a 4 oC.
- Mida la concentración de las proteínas purificadas por el ensayo de proteínas Bradford. Determinar la pureza de las proteínas en un gel 10% SDS-PAGE y visualizar las bandas por el ensayo de tinción azul Coomassie.
- Añadir glicerol a la solución proteica purificada a una concentración final del 10% para estabilizar la actividad enzimática. Aliquot y guárdalo a -80oC.
6. Producir un flavonol a partir de una flavanona en un sistema sintético de bienzimain vitro16
- Prepare los buffers.
- Hacer 2tampón sintético sin sulfato ferroso compuesto por 200 mM Tris-HCl (pH 7.2), 16,4 mM de ácido cetoglutárico, 0,8% de ascorbato sódico y 20% de glicerol. Disolver 1,938 g de base Tris, 0,640 g de ascorbato sódico, 0,250 g de ácido cetoglutárico y 16 ml de glicerol a 64 ml de agua desionizada. Ajuste el pH a 7,2 por ácido clorhídrico (HCl) y añada agua desionizada hasta 80 ml. Almacene el tampón a 4 oC para su uso futuro.
- Haga una solución de stock 100x de sulfato ferroso de 2 mM. Disolver 55,6 mg de sulfato ferroso heptahidrato en 50 ml de agua desionizada, remover y añadir agua hasta 100 ml.
- Haga una solución de stock de flavonoide de 25 mM. Disolver un flavonoide en metanol a fondo y almacenarlo a -20oC.
- Configure un sistema sintético para producir un flavonol a partir de una flavanona.
- Prepare el sistema sintético como se muestra en la Tabla6.
- Incubar la reacción a 40 oC en un tubo abierto de 2,0 ml a 600 rpm (en un bloque de calor de agitación) durante 40 min.
- Terminar la reacción añadiendo 10 s de ácido acético y 100 l de acetato de etilo.
- Dos horas más tarde, transfiera las fases orgánicas a tubos de 1,5 ml para el secado al aire en una campana a temperatura ambiente.
| Reactivos | Volumen |
| 2o Tampón sintético sin sulfato ferroso | 50,0 l |
| 25 mM flavonol | 2,0 l |
| Sulfato ferroso de 2 mM | 0,5 l |
| 1 mg/ml AtF3H | 2,5 l |
| 1 mg/ml AtFLS1 | 2,5 l |
| Flavanona de 25 mM | 2,0 l |
| H2O | hasta 100,0 l |
Tabla 6: El sistema sintético utilizado en este protocolo.
7. Analizar los productos de reacción
- Análisis de cromatografía de capa fina (TLC).
- Piscina 5 tubos de las muestras de flavonoides del paso 6.2.4 y sacar 300 s para el secado al aire. Vuelva a disolver el polvo de flavonoide en 160 ml de metanol. Preparar muestras auténticas de flavonoide con concentraciones en serie de 12,5, 25, 50, 100 y 200 ng/L en metanol. Cargar 1 l de las muestras de reacción y las muestras de flavonoides auténticos en placas de poliamida 6.
- Ejecute las placas cargadas de muestras en un sistema de disolvente que comprenda cloroformo/metanol/acetato de etilo/ácido fórmico a una proporción de 5.0:1.5:1.0:0.5.
- Seque al aire las placas a temperatura ambiente. Rocíe las placas con una soluciónetanólica al 1% de cloruro de aluminio (AlCl 3), seguida de un secado al aire de nuevo a temperatura ambiente.
- Treinta minutos más tarde, visualice las manchas en las placas bajo una luz UV a 254 nm y tome imágenes.
- Analice el valor gris de cada punto de las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ v1.51j8 en este protocolo).
- Abra el software ImageJ. Haga clic en Archivo > Abrir para abrir la imagen que se va a analizar.
- Haga clic en la herramientade selección de Rectangular más a la izquierda en la interfaz de usuario de ImageJ. Delinee la región de interés (ROI)
en la imagen con el ratón y pulse para etiquetar el primer ROI. - Mueva la selección rectangular con el ratón
a la derecha al siguiente ROI y pulse para etiquetar el segundo ROI. - Repita el paso anterior para etiquetar todos los demás ROI.
- Pulse
para generar trazados de perfil para todos los ROI en una ventana emergente.
NOTA: En este momento, la herramienta selección de línea recta en la interfaz de usuario de ImageJ se activará automáticamente. - Usa la Herramienta Selección de Línea Recta para dibujar líneas base con el fin de definir un área cerrada para cada pico de interés.
- Active la herramienta Wand haciendo clic en el icono correspondiente en la interfaz de usuario de ImageJ. Haga clic dentro del pico para mostrar los resultados de todos los picos en una ventana emergente.
- Haga una curva estándar basada en TLC del flavonoide auténtico trazando los valores grises del paso 7.1.5.7 contra las concentraciones de flavonoides correspondientes del paso 7.1.1. A continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo de acuerdo con la fórmula resultante.
- Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS)
- Procesar las muestras desde el paso 7.1.1 secuencialmente a través de filtros de 0,45 y 0,22 m.
- Cargue las muestras en un sistema HPLC/LC/MS (ver Tabla de materiales)y separe las muestras a 30 oC utilizando una columna C18 (4,6 x 150 mm; i.d., 5 m). Eluir la columna a 1,0 ml/min por un gradiente de 10 - 85% (v/v) acetonitrilo (ACN) en agua (0 - 10 min, 10 - 25% ACN; 10 - 35 min, 25 - 50% ACN; 35 - 45 min, 50 - 85% ACN; 45 - 50 min, 85 - 10% ACN; 50 - 60 min , 10% ACN) y monitorizar la absorción del eluido de 200 a 800 nm. Realizar el análisis DE LC/MS en un modo iónico negativo con un flujo de nitrógeno de secado de 10 L/min a 300 oC y un flujo de gas de vaina de 7 L/min a 250 oC y recopilar datos utilizando un software incorporado (ver Tabla de materiales).
- Extraiga cromatógrafos de longitud de onda única para calcular las áreas pico de muestras de reacción y compuestos flavonoides auténticos utilizando un software (ver Tabla de Materiales).
- Abra el programa Análisis cualitativo y haga clic en Archivo > Abrir archivo de datos. Seleccione los archivos que desea analizar en la ventana Abrir archivo de datos y haga clic en Abrir para abrir los archivos.
- Haga clic con el botón derecho del ratón en la ventana Chromatogram Results y, a continuación, en loshromatogramas Extract Cen un menú emergente.
- Abra el cuadro de diálogo Extract Chromatogramas. En la lista Tipo, haga clic en Otros cromatogramas. En el cuadro combinado Detector, seleccione DAD1. A continuación, haga clic en Aceptar para mostrar los resultados de HPLC en la ventana Resultados delhromatograma C.
- Haga clic en el icono Manual Integration acoplado en la parte superior de la ventana Resultados delhromatograma C. Dibuje una línea base para el pico necesario para el análisis de integración manual con el ratón.
- Haga clic en Ver > Lista de picos de integración para mostrar los resultados.
- Haga una curva estándar basada en HPLC del flavonoide auténtico trazando las áreas pico del paso 7.2.3.5 contra las concentraciones de flavonoides correspondientes del paso 7.2.1. A continuación, calcule el rendimiento del flavonoide de interés producido en este protocolo de acuerdo con la fórmula resultante.
- Analice los datos de EM para la masa exacta de compuestos flavonoides utilizando un software (ver Tabla de Materiales).
- Repita los pasos 7.2.3.1 - 7.2.3.3.
- Haga clic en el icono Selección de rango de la barra de herramientas Resultados del hromatograma C.
- Seleccione el pico de interés. Haga clic con el botón derecho del ratón en el rango seleccionado y haga clic en Extraer MS Spectrum en el menú emergente para mostrar los resultados en la ventana Resultados de MS Spectrum.
en la imagen con el ratón y pulse para etiquetar el primer ROI.
a la derecha al siguiente ROI y pulse para etiquetar el segundo ROI.
para generar trazados de perfil para todos los ROI en una ventana emergente.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H y FLS1 son dos enzimas clave importantes en la conversión de una flavanona en un flavonol en plantas como se muestra en la Figura1. Para desarrollar un sistema biosintético in vitro para producir un flavonol a partir de una flavanona, Atf3h (No de adhesión a GenBank. NM_114983.3) y Atfls1 (no de adhesión de GenBank. NM_120951.3) los genes fueron clonados de las plántulas de A. thaliana de 4 semanas de edad en una expresión procakariota vectorial pET-32a(+). Los plásmidos recombinantes se transformaron en E. coli BL21(DE3) y las proteínas de fusión se expresaron después de la inducción ipTG, seguido de purificación utilizando resinas de agarosa Ni-IDA. Como se muestra en la Figura2, las proteínas de fusión purificadas mostraron una alta pureza de más del 95% en un gel 10% SDS-PAGE, que eran lo suficientemente puros para el establecimiento de una cascada bienimática in vitro.
Figura 1: Representación esquemática para la biosíntesis de un flavonol a partir de una flavanonain vitro. F3H, flavanona 3-hidroxilasa; FLS1, flavonol sintasa 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Purificación de proteínas recombinantes AtF3H y AtFLS1. Los genes Atf3h y Atfls1 fueron clonados de plántulas de 4 semanas de edad de Arabidopsis thaliana en una expresión procacrotica vector pET-32a(+) y expresado en Escherichia coli BL21(DE3). Las proteínas recombinantes fueron purificadas a través de una columna de cromatografía de afinidad llena de resinas de agarosa Ni-IDA. La pureza se determinó en un gel 10% SDS-PAGE. M, marcadores proteicos; 1, proteína AtF3H recombinante; 2, proteína AtFLS1 recombinante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para establecer una cascada biencimática utilizando las proteínas recombinantes purificadas, se preparó un sistema sintético como se muestra en la Tabla6. Para determinar si este sistema se puede utilizar para la conversión de una flavanona en un flavonol, se añadió NRN al sistema, y la biosíntesis de KMF fue detectada por los análisis TLC y HPLC/LC/MS. Como se muestra en la Figura 3A,surgieron dos nuevos puntos en una placa TLC de poliamida. Un lugar mostró una distancia de migración similar a la del dihydrokaempferol (DHK), y el otro similar al de KMF. Un análisis adicional de HPLC y LC/MS demostró que los nuevos productos químicos mostraban un tiempo de retención de 11,91 min y 20,16 min, respectivamente (Figura3B)y un pico de iones cuasi molecular [M-H]a m/z 287.0500 y 285.0500, respectivamente (Figura3C ), que eran idénticos a los de DHK y KMF, respectivamente. Los datos indican que KMF se produjo a partir de NRN en este sistema y el rendimiento fue tan alto como 34,94 mg/L.
Figura 3: Síntesis de KMF de NRN en una cascada bienimática. (A) Análisis de los productos de reacción de una olla por poliamida TLC. 1, estándar NRN; 2, estándar DHK; 3, estándar KMF; 4, mezcla de reacción. (B) Perfiles de análisis HPLC de los productos de reacción. NRN, DHK y KMF mostraron un tiempo de retención de 18,74 min, 11,91 min y 20,16 min, respectivamente. (C) Perfiles de análisis de MS de los compuestos flavonoides en las mezclas de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para determinar aún más si este sistema in vitro puede utilizarse para la conversión de otras flavanonas en sus correspondientes flavonols, se añadió eriodictoiol (ERD) al sistema para determinar si el ERD se puede convertir en quercetina (QRC). Como se muestra en la Figura 4A,dos nuevos puntos en una placa TLC de poliamida mostraron una distancia de migración similar a la de la dihidroquercetina (DHQ) y el QRC, respectivamente. Los análisis de HPLC y LC/MS demostraron que estos nuevos productos químicos revelaron un tiempo de retención de 10,03 min y 16,23 min, respectivamente (Figura4B)y un pico de iones cuasi molecular [M-H]a m/z 303.1000 y 301.1000, respectivamente (Figura 4C) , que correspondía exactamente a las de DHQ y QRC, respectivamente. Los datos indican que este sistema puede convertir ERD en QRC y el rendimiento fue de 25,55 mg/L.
Figura 4: Producción de QRC a partir de ERD en un sistema sintético de bienzima. (A) Análisis de los productos de reacción por poliamida TLC. 1, estándar ERD; 2, estándar DHQ; 3, estándar QRC; 4, mezcla de reacción. (B) Perfiles de análisis HPLC de los productos de reacción. ERD, DHQ y QRC mostraron un tiempo de retención de 15,45 min, 10,03 min y 16,23 min, respectivamente. (C) Perfiles de análisis de La MS de los compuestos de las mezclas de reacción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un buen número de estudios se centran en la derivación de flavonols debido a su posible aplicación en la atención de la salud y la industria alimentaria. Sin embargo, la extracción tradicional de plantas utilizando disolventes orgánicos y síntesis química poseen desventajas intrínsecas, que restringen su uso en la producción de flavonols. Aquí, informamos de un método detallado para producir un flavonol a partir de una flavanona en una olla estableciendo una cascada bienimática in vitro. Los pasos críticos de este protocolo son: 1) obtener enzimas recombinantes puras con altas actividades y 2) establecer una cascada de reacción bienica de una olla. En términos generales, la expresión de genes derivados de plantas en bacterias prefiere formar el cuerpo de inclusión, lo que conducirá a la pérdida de actividad enzimática. Como sabemos, algunos péptidos, como TrxA y SUMO, ayudan a mejorar la expresión y solubilidad de las proteínas recombinantes expresadas en las bacterias16. Por lo tanto, será útil clonar los genes de destino en los plásmidos que contienen estas etiquetas de expresión, como pET-32a(+) y pET SUMO (Paso 3.2.3). Es bien sabido que la concentración ipTG y la temperatura de inducción son otros dos parámetros cruciales que afectan a la solubilidad de las proteínas expresadas procarioticamente16. Para disminuir aún más la formación del cuerpo de inclusión, se debe optimizar la concentración de IPTG y la temperatura de inducción. La concentración óptima de IPTG y la temperatura de inducción dependen principalmente del tipo de plásmidos y de las cepas bacterianas. En este protocolo, la concentración IPTG y la temperatura de inducción se optimizan a 0,2 mM y 20 - 22 oC, respectivamente (paso 4.2.3). Además, la temperatura y el glicerol son dos parámetros importantes para mantener la estabilidad y la actividad al purificar y almacenar las enzimas recombinantes. En este protocolo, es crucial purificar las proteínas recombinantes a 4oC (Pasos 5.5 - 5.12), añadir un 10% de glicerol en la solución de enzimas purificadas (Paso 5.13), e inmediatamente alícuota y almacenar la solución a -80oC (Paso 5.13). En el establecimiento de una cascada de reacción de una olla, el pH y la temperatura son dos parámetros vitales. Es obvio que el pH demasiado alto es perjudicial para la conversión porque los iones ferrosos (Fe2+),un componente necesario para la actividad enzimática de Recombinante F3H y FLS116,32,33, se precipitan por formando una suspensión de hidróxido ferroso bajo tal condición. Aunque una temperatura relativamente más alta facilita el progreso de una reacción catalizada por enzimas, la temperatura demasiado alta inactivará la enzima. Por lo tanto, es fundamental para la conversión estabilizar el pH y la temperatura de reacción. Nuestra publicación anterior establece el pH y la temperatura óptimos en 7,2 y 40 oC, respectivamente (Paso 6)16.
Este protocolo podría ser convenientemente modificado para biosintetizar un número de flavonols de varias flavanonas utilizando diferentes sustratos. En este protocolo, se proporcionan dos ejemplos. Como se muestra en la Figura 3, al agregar NRN como sustrato en este sistema, se produjeron nuevos productos químicos. Los análisis TLC y HPLC/LC/MS indican que los nuevos productos químicos fueron DHK y KMF, y el NRN se convirtió en el KMF en este sistema. Para reforzar aún más la confianza en los resultados, caracterización espectral de 1RMN H (resonancia magnética nuclear de hidrógeno-1), RMN nuclear de 13C (resonancia magnética nuclear de carbono-13), NOESY (Espectroscopy de efecto de sobrehauser nuclear), difracción de polvo), el analizador DE CHN y similares pueden ser necesarios para dar fe de la presencia de productos químicos en una nueva entidad. Del mismo modo, el ERD podría convertirse con éxito en QRC en esta cascada bienimática (Figura4).
Hay una limitación importante para este método. Según la vía biosintética conocida de flavonoides, un flavonol puede ser producido por este sistema a partir de un aminoácido aromático o sus derivados aguas abajo. Por ejemplo, KMF se puede producir a partir de ácido p-coumaric por una serie de enzimas clave, incluyendo 4-coumaroyl:CoA-ligase (4CL), chalcone synthasa (CHS), chalcone issomerasa (CHI), F3H y FLS23. Del mismo modo, QRC se puede producir a partir de ácido cafeico utilizando el mismo panel de enzimas clave (datos no publicados). Sin embargo, la coenzima A (CoA), ATP, y manonyl-CoA necesitan ser incluidos en el sistema para convertir el ácido p-coumaric en KMF, lo que aumentará en gran medida el costo de producción. Por lo tanto, este sistema se limita generalmente a convertir una flavanona en un dihidroflavonol o un flavonol. Además, la conversión completa de los materiales de partida es otro desafío. Para mejorar aún más la eficiencia de este sistema, la investigación futura debe centrarse en el cribado de enzimas clave con altas actividades de otras plantas, la mutación de genes que codifican enzimas clave, la inmovilización de las enzimas altamente activas a portadores inertes, y desarrollo de un mejor sistema de amortiguación.
Este sistema sintético de bienzima de una olla posee ventajas intrínsecas obvias sobre otros enfoques para producir un flavonol, como la síntesis química, la fábrica de células microbianas y la extracción de plantas utilizando disolventes orgánicos16. En primer lugar, el tiempo de reacción es muy corto y sólo necesita 40 min, por lo que este sistema de producción ahorra mano de obra y tiempo. En segundo lugar, no existe una regulación fisiológica compleja en este sistema como ocurrió en la fábrica de células microbianas y, además, todos los componentes son claros. Por lo tanto, es fácil controlar la reacción con precisión y por lo tanto conveniente para hacer una optimización adicional en el futuro. En tercer lugar, dado que este sistema de reacción contiene sólo productos químicos simples y enzimas recombinantes purificadas y sólo genera un intermedio importante como se muestra en la Figura 3 y la Figura 4,se espera que sea más fácil purificar las moléculas diana generados en este sistema que los de fábricas y plantas celulares. En cuarto lugar, los principales componentes del sistema son productos químicos comunes y baratos y enzimas recombinantes expresadas procariotamente, por lo que es altamente rentable para este método derivar flavonoides deseados. En quinto lugar, debido a la simplicidad de los componentes de este sistema, es fácil escalar para la producción en masa de flavonoides objetivo, lo que indica un enorme potencial de industrialización. Además, este sistema proporciona una guía para la producción económica de otros metabolitos secundarios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Fondos de Start-up de Profesores Especialmente Nombrados de la Universidad de Yangzhou, los Fondos de Start-up del Profesor Especialmente Nombrado de Jiangsu, el Proyecto Six Talent Peaks en la Provincia de Jiangsu (Grant No. 2014-SWYY-016) y un Proyecto financiado por el Programa Académico Prioritario Desarrollo de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (Medicina Veterinaria). Agradecemos al Centro de Pruebas de la Universidad de Yangzhou para los análisis HPLC y MS de flavonoides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
