Summary
Härledningen av en flavonol är avgörande för dess tillämpning inom hälso-och sjukvården och livsmedelsindustrin. Här ger vi ett detaljerat protokoll för biosyntesen av en flavonol från en flavanone och diskutera de avgörande stegen och dess fördelar jämfört med andra metoder.
Abstract
Flavonoler är en stor subklass av flavonoider med en mängd olika biologiska och farmakologiska aktiviteter. Här, vi ger en metod för in vitro enzymatisk syntes av en flavonol. I denna metod, Atf3h och Atfls1, två viktiga gener i den biosyntetiska vägen av flavonoler, klonas och överuttrycks i Escherichia coli. De rekombinanta enzymerna renas via en affinitetskolonn och därefter etableras en bienzymatisk kaskad i en specifik syntetisk buffert. Två flavonoler syntetiseras i detta system som exempel och bestäms av TLC och HPLC/LC/MS analyser. Metoden visar uppenbara fördelar i härledning av flavonoler över andra metoder. Det är tid-och arbetsbesparande och mycket kostnadseffektivt. Reaktionen är lätt att kontrolleras noggrant och därmed skalas upp för massproduktion. Mål produkten kan renas enkelt på grund av de enkla komponenterna i systemet. Emellertid, detta system är vanligtvis begränsad till produktion av en flavonol från en flavanone.
Introduction
Flavonoler är en stor underklass av växt flavonoider och är involverade i växternas utveckling och pigmentering1,2,3. Ännu viktigare, dessa föreningar besitter ett brett spektrum av hälso-positiva aktiviteter, såsom anti-cancer4,5, anti-oxidativ6, anti-inflammatorisk7, antifetma8, blodtryckssänkande9 och minnes återkallnings egenskaper10, vilket leder till ett stort antal studier av dessa växthärledda sekundära metaboliter. Traditionellt är dessa föreningar huvudsakligen härrör från växt utvinning med organiska lösningsmedel. Men på grund av deras mycket låga halter i växter11,12,13, produktionskostnaden för de flesta flavonoler fortfarande hög, vilket innebär stora restriktioner för deras tillämpning inom vården och livsmedels Industrin.
Under de senaste decennierna har forskarna utvecklat ett ganska antal metoder för att härleda flavonoider14,15. Emellertid, kemisk syntes av dessa komplicerade molekyler besitter en mängd inneboende nackdelar16. Det kräver inte bara giftiga reagenser och extrema reaktions förhållanden, men också många steg för att producera ett mål flavonoid förening14,17. Dessutom är en annan viktig utmaning i denna strategi den kirala syntesen av aktiva flavonoid molekyler. Därför är det inte en idealisk strategi för att producera flavonoider i kommersiell skala via kemisk syntes16,17.
Nyligen har forskarna utvecklat en lovande alternativ strategi för att producera dessa komplicerade naturliga föreningar genom att Engineering mikrober med en väg för flavonoid biosyntes18,19,20, 21 , 22, som framgångsrikt har dechiffrerats i växter23. Till exempel införde Duan et al. en biosyntetisk väg in i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae att producera kaempferol (KMF)24. Malla et al. producerade astragalin, en glykosylerad flavonol, genom att införaflavanone 3-hydroxylas (f3h), flavonol syntas (fls1), och UDP-glukos: flavonoid 3-O-glukosyltransferas UGT78K1 gener till Escherichia coliBL21 (de3)17. Även om det finns en hel del paradigm, inte alla genetiskt modifierade mikrober producera produkter av intresse på grund av komplexiteten i en cellulära plattform, inkompatibilitet mellan artificiellt syntetiserade genetiska element och värdar, den hämmande effekt av målprodukter mot värdceller, och instabilitet i en konstruerad cellulära systemet själv16.
En annan lovande alternativ strategi för flavonoid produktion är att etablera en multienzymatisk kaskad in vitro-. Cheng et al. har rapporterat att enterocin polypetider kan framgångsrikt syntetiseras genom att samla en komplett enzymatisk väg i en pott25. Denna cell-fri syntetisk strategi kringgår begränsningarna av en mikrobiell produktion fabriken och därmed är möjligt för att producera vissa flavonoider i stor mängd16.
Nyligen har vi framgångsrikt utvecklat ett bienzym syntetiskt system för att omvandla naringenin (NRN) till KMF i en pott16. Här beskriver vi detta system i stora detaljer och de metoder som ingår i analysering av produkterna. Vi presenterar också två exempel som använder detta system för att producera KMF från NRN och quercetin (QRC) från eriodictyol (ERD). Dessutom diskuterar vi viktiga steg i denna metod och framtida forsknings riktningar i biosyntesen av flavonoider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolera totalt RNA från växt vävnader26,27
- Homogenisera växternas vävnader.
- Samla 100 mg av en ny växtvävnad (t. ex., 4-veckors-gamla plantor från Arabidopsis thaliana). Frys vävnaden och en mortel och murbruk med flytande kväve, följt av slipning vävnaden i pulver.
- Tillsätt 1 mL RNA-isoleringsreagens (se tabell över material) i murbruket. Reagensen kommer att frysas omedelbart. Homogenisera vävnadsprovet med mortelstöt när den frusna reagensen smälter.
- Överför homogena till ett 1,5-mL-rör, Centrifugera provet på 12 000 x g i 5 min vid 4 ° c och överför sedan den renade homogena lösningen till ett annat färskt 1,5 ml-rör.
- Inkubera det homogeniserade provet i rumstemperatur i 5 minuter.
- Isolera totalt RNA.
- Tillsätt 0,2 mL kloroform till homogenisering, locket röret säkert, skaka röret kraftigt för hand för 15 s, och inkubera provet i rumstemperatur i 5 min.
- Centrifugera provet på 12 000 x g i 15 min vid 4 ° c och överför den färglösa övre vattenfasen till ett färskt 1,5 ml-rör. Provet skiljs åt i tre faser efter centrifugering.
- Tillsätt 0,5 mL isopropylalkohol till vattenfasen, skaka röret för hand på ett kraftfullt sätt och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 10 minuter.
- Centrifugera blandningen vid 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten.
- Tvätta RNA-pelleten en gång med 1 mL 75% etanol genom vortexing, följt av centrifugering vid 7 500 x g i 5 minuter vid 4 ° c.
- Upprepa steg 1.2.5.
- Lufttorka pelleten i 5-10 minuter och lös åter RNA i dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat vatten genom att Pipettera upp och ner, följt av att mäta den totala RNA-koncentrationen med en mikrospektrofotometer (se tabell över material).
2. syntetisera kompletterande DNA (cDNA)28
- Syntetisera den första del av cDNA med hjälp av en sats (se tabell över material). Ställ in ett 20 μL reaktionssystem som visas i tabell 1 och inkubera reaktionsröret i ett PCR-instrument för 50 min vid 42 ° c, följt av att avsluta reaktionen vid 85 ° c i 5 min. Förvara reaktionsprodukten vid-20 ° c för framtida förstärkning av gener.
| Reagenser | Volym |
| dNTP mix, 2.5 mM vardera | 4,0 μL |
| Primer mix | 2,0 μL |
| RNA-mall | 1,0 μg |
| Omvänd Transkriptasbuffert, 5 × | 4,0 μL |
| Omvänt transkriptas, 200 U/μL | 1,0 μL |
| RNase-gratis H2O | upp till 20,0 μL |
Tabell 1: omvänd Transkription av totalt RNA till cDNA
3. konstruera rekombinanta plasmider29
- Designa PCR-primers.
- Designa PCR-primers med hjälp av en programvara (se tabell över material) baserat på sekvenser av viktiga enzymgener som erhållits från genbanks databas och syntetisera primers av ett företag (se tabell över material). I 5 ' slutet av primern, tillsätt en begränsning enzym plats (t. ex., BAMHi eller EcoRI i detta protokoll).
Anmärkning: de primers som används i denna studie visas i tabell 2.
- Designa PCR-primers med hjälp av en programvara (se tabell över material) baserat på sekvenser av viktiga enzymgener som erhållits från genbanks databas och syntetisera primers av ett företag (se tabell över material). I 5 ' slutet av primern, tillsätt en begränsning enzym plats (t. ex., BAMHi eller EcoRI i detta protokoll).
| Sekvens, 5 ' → 3 ' | Syfte |
| AAGgatccatggctccaggaactttgact | Forward primer för PCR amplifiering av Atf3h Gene från Arabidopsis thaliana. BAM Hej webbplats är kursiv och bifogas för kloning i pET32a (+). |
| AAGaattcctaagcgaagatttggtcga | Omvänd primer för PCR amplifiering av Atf3h Gene från A. thaliana. Eco RI-webbplatsen är kursiv och bifogas för kloning till pET32a (+). |
| AAGgatccatggaggtcgaaagagtcca | Forward primer för PCR amplifiering av Atfls1 Gene från A. thaliana. BAM Hej webbplats är kursiv och bifogas för kloning i pET32a (+). |
| AAGaattctcaatccagaggaagtttat | Omvänd primer för PCR amplifiering av Atfls1 Gene från A. thaliana. Eco RI-webbplatsen är kursiv och bifogas för kloning till pET32a (+). |
Tabell 2: oligonukleotidprimers som används i den aktuella studien
- Klona generna till en prokaryotisk uttrycks vektor.
- Förstärka generna från den första del av den syntetiserade cDNA med hjälp av en HiFi-DNA-polymeras (se tabell över material). Ställ in ett 100 μL PCR-reaktionssystem enligt tabell 3 och kör följande PCR-cykel: 94 ° c i 2 minuter för initial denaturering. då 35 cykler av 94 ° c för 30 s för denaturering, 55 ° c för 2 min för glödgning, och 72 ° c för 1 min för förlängning; följt av en slutlig förlängning vid 72 ° c i 10 min. kyl reaktionsblandningen till 12 ° c.
Notera: förlängningstiden varierar och bestäms av gen längden med polymerisation av ca 1000 baser per minut för de flesta DNA-polymeraser. - Visualisera PCR-produkterna (vanligast 5 μL) på en 1% aguppsgel och rena det specifika DNA-fragmentet från de kvarvarande produkterna med hjälp av en DNA-rengöringsset (se tabell över material).
- Smält det renade DNA-fragmentet och vektorn (t. ex. pET-32a (+)) med restriktionsenzymer (t. ex. BAMHi eller EcoRI i detta protokoll). Ställ upp ett 50-μL reaktionssystem i ett 0,2 mL PCR-rör som visas i tabell 4 och inkubera blandningen vid 37 ° c i 3 h. separera det smälta DNA på en 1% aguppa gel.
- Återvinna DNA-bandet med hjälp av en gel extraktion Kit (se tabell över material). Ytterligare rena DNA med hjälp av en DNA Clean-Up Kit (se tabell över material), följt av mätning av DNA-koncentrationen med en mikrospektrofotometer (se tabell över material).
- Ligate genen fragment i linearized vektor-DNA med hjälp av en T4 DNA Ligase (se tabell över material). Ställ in en ligeringreaktion i ett 1,5-mL-rör som visas i tabell 5 och Inkubera röret i rumstemperatur för 2-3 h.
Obs: molar förhållandet mellan ett skär till en vektor är varierande och varierade från 3:1 till 10:1. - Tillsätt 2,5 μL av ligationsblandningen i 50 μL av kemiskt kompetenta Escherichia coli -celler (t. ex. DH5α), blanda försiktigt och håll röret på is i 30 min. värme chock cellerna vid 42 ° c för 90 s och omedelbart placera röret på is för 2 min.
- Tillsätt 200 μL flytande LB-medium utan antibiotika i röret och Inkubera röret i en shaker på 37 ° c vid 220 varv/min i 1 h. spread 50-100 μL av cellerna på en LB-platta som innehåller 100 μg/mL ampicillin och inkubera vid 37 ° c över natten.
- Förstärka generna från den första del av den syntetiserade cDNA med hjälp av en HiFi-DNA-polymeras (se tabell över material). Ställ in ett 100 μL PCR-reaktionssystem enligt tabell 3 och kör följande PCR-cykel: 94 ° c i 2 minuter för initial denaturering. då 35 cykler av 94 ° c för 30 s för denaturering, 55 ° c för 2 min för glödgning, och 72 ° c för 1 min för förlängning; följt av en slutlig förlängning vid 72 ° c i 10 min. kyl reaktionsblandningen till 12 ° c.
| Reagenser | Volym |
| PFU Master Mix, 2 × | 50,0 μL |
| Framåtriktad primer, 10 μM | 4,0 μL |
| Omvänd primer, 10 μM | 4,0 μL |
| cDNA | 2,0 μL |
| H2O | 40,0 μL |
Tabell 3: inrättande av ett PCR-reaktionssystem
| Reagenser | Volym |
| DNA-fragment/vektor | 3,0 μg |
| BAM Hej | 1,0 μL |
| Eco Ri | 1,0 μL |
| Cutsmart buffert, 10 × | 5,0 μL |
| H2O | upp till 50,0 μL |
Tabell 4: dubbel nedbrytning av ett DNA-fragment/vektor
| Reagenser | Volym |
| Infoga | X μL (0,09 pmol) |
| Vektor | Y μL (0,03 pmol) |
| Ligationsbuffert, 10 × | 1,0 μL |
| T4 DNA Ligase, 400 U/μL | 1,0 μL |
| H2O | upp till 10,0 μL |
Tabell 5: ligering av ett genfragment i en lineariserad vektor
- Screen positiva kolonier.
- Inokulera en enda koloni från LB-plattan till 200 μL flytande LB-medium innehållande 100 μg/mL ampicillin och inkubera vid 37 ° c, 250 RPM för 2-3 h.
Anmärkning: i allmänhet plocka 4-8 kolonier för screening positiva kolonier. - Ställ in en 10 μL koloni PCR-reaktion liknande den i steg 3.2.1.
Anmärkning: Använd 1 μL LB-odling i stället för 1 μL cDNA-mall. - Visualisera PCR-produkterna på en 1% agaros gel. Inokulera den återstående kulturen med ett positivt resultat i 3 mL flytande LB-medium innehållande 100 μg/mL ampicillin och inkubera i en shaker på 37 ° c vid 250 RPM för 14-16 h.
- Isolera plasmid DNA från rekombinanta E. coli kulturer med hjälp av en Plasmid miniprep Kit (se tabell över material).
- Identifiera de renade rekombinanta plasmiderna med en dubbel begränsnings enzym analys (t. ex. BAMHi och EcoRI i detta protokoll). Ställ in ett 10-μL reaktionssystem liknande det i steg 3.2.3, följt av inkubering vid 37 ° c i 3 timmar. visualisera det specifika bandet som frigörs från den rekombinanta plasmiden på en 1% aguppkom gel.
- Inokulera en enda koloni från LB-plattan till 200 μL flytande LB-medium innehållande 100 μg/mL ampicillin och inkubera vid 37 ° c, 250 RPM för 2-3 h.
- Kontrollera sekvensen av positiva rekombinanta plasmider.
- Skicka plasmiderna till ett företag för sekvensering. Analysera resultaten med hjälp av en DNA-sekvenseringsprogramvara (se tabell över material) genom att jämföra sekvensen som erhålls från sekvenserings företaget med referenssekvens som erhållits från genbanks databas.
4. Express rekombinanta enzym proteiner30
- Omvandla rätt rekombinant plasmid till kompetent E. coli BL21 (de3).
- Tillsätt 0,1 μL av Plasmiden till 10 μL av den behöriga E. coli BL21 (de3) i ett 1,5-ml-rör på is och håll röret på is i 5 min.
- Värm chock cellerna i en 42 ° c vattenbad för 90 s och placera den på is igen för 2 min.
- Tillsätt 200 μL LB flytande medium utan antibiotika och inkubera i en shaker på 37 ° c vid 220 varv/min i 5 min.
- Fördela 50 μL omvandling på en LB-agarplatta som innehåller 100 μg/mL ampicillin och inkubera plattan över natten i en inkubator på 37 ° c.
- Framkalla geners uttryck.
- Inokulera 3-5 kolonier från plattan i ett rör innehållande 3 mL LB flytande medium med 100 μg/mL ampicillin och inkubera vid 250 rpm i en shaker på 37 ° c över natten.
- Överför alla över natten kulturen i 300 mL LB flytande medium som innehåller 100 μg/mL ampicillin och inkubera vid 250 rpm i en 37 ° c shaker tills den optiska tätheten av kulturen vid 600 Nm är mellan 0,4-0,6.
- Tillsätt isopropylalkohol β-D-thiogalactoside (IPTG) i kulturen med en slutlig koncentration av 0,2 mM och inducera uttrycket av gener vid 250 rpm, 20-22 ° c för 3 h.
5. rena de rekombinanta enzym proteinerna31
- Skörda bakterierna genom centrifugering av kulturen vid 4 ° c, 12 000 x g i 10 min.
- Omsuspendera pelleten i 15 mL bakteriell Lysbuffert som innehåller 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL leupeptin och 1 μg/mL Pepstatin i 50 mM Tris-cl (pH 8,0).
- Sonikera den bakteriella suspensionen för att frigöra de rekombinanta enzym proteinerna, följt av centrifugering vid 13 000 x g, 4 ° c i 10 min.
- Skörd och alikvot supernatanten i 1,5-ml rör på 1 ml/rör och förvara dem vid-70 ° c för framtida bruk.
- Applicera 500 μL av sin-taggrening harts (se tabell över material) till en återanvändbar tom tillhörighet kolumn. Tvätta hartset med 5 säng volymer avjoniserat vatten för att kassera etanol i stamlösningen. Balansera hartset med 10-bäddsvolymer av bindningsbufferten bestående av Tris-cl (20 mM, pH 7,9), Imidazol (10 mM) och NaCl (0,5 M).
- Applicera 4 ml av supernatanten från steg 5,4 till en flytgödsel av ovanstående harts och blockera två ändar av kolonnen med proppar.
- Inkubera blandningen vid 4 ° c på en rotator vid låg hastighet för 2 h.
- Tvätta fusionsproteinet bundet harts med 15 bädd volymer av bindningsbufferten vid 4 ° c med en flödeshastighet på 1 mL/min före elueringen.
- Tillsätt 500 μL elueringbuffert (innehållande 20 mM Tris-cl (pH 7,9), 500 mM Imidazol, 0,5 M NaCl) till kolonnen och inkubera slam vid 4 ° c på en rotator med låg hastighet under 10 min. samla upp eluenten som renade proteinprover.
- Upprepa steg 5,5 fyra gånger.
- Tvätta hartset sekventiellt med 10 säng volymer avjoniserat vatten och 3 säng volymer på 20% etanol. Blötlägg hartset i 20% etanol. Blockera kolonnen med proppar och förvara den vid 4 ° c.
- Mät koncentrationen av de renade proteinerna genom Bradford protein assay. Bestäm renheten hos proteinerna på en 10%-SIDIG gel och visualisera banden med Coomassie Blue infärgnings analys.
- Tillsätt glycerol till den renade proteinlösningen till en slutlig koncentration på 10% för att stabilisera enzymaktiviteten. Och förvara den vid-80 ° c.
6. producera en flavonol från en flavanone i ett in vitro- bienzym syntetiskt system16
- Förbered buffertar.
- Gör 2x syntetisk buffert utan järnsulfat bestående av 200 mM Tris-HCl (pH 7,2), 16,4 mM α-ketoglutarinsyra, 0,8% natriumaskorbat och 20% glycerol. Lös 1,938 g av Tris bas, 0,640 g natriumaskorbat, 0,250 g α-ketoglutarinsyra och 16 mL glycerol till 64 mL avjoniserat vatten. Justera pH till 7,2 med saltsyra (HCl) och Tillsätt avjoniserat vatten upp till 80 mL. Förvara bufferten vid 4 ° c för framtida bruk.
- Gör en 100x lagerlösning av 2 mM järnsulfat. Lös 55,6 mg järnsulfat heptahydrat i 50 mL avjoniserat vatten, rör om och tillsätt vatten upp till 100 mL.
- Gör en stamlösning av 25 mM flavonoid. Lös upp en flavonoid i metanol grundligt och förvaras vid-20 ° C.
- Inrätta ett syntetiskt system för att producera en flavonol från en flavanone.
- Bered det syntetiska systemet som visas i tabell 6.
- Inkubera reaktionen vid 40 ° c i en öppen 2,0-mL tub vid 600 rpm (i ett skakande värmeblock) för 40 min.
- Avsluta reaktionen genom att tillsätta 10 μL ättiksyra och 100 μL etylacetat.
- Två timmar senare, överför de organiska faserna till 1,5-mL rör för lufttorkning i en huva vid rumstemperatur.
| Reagenser | Volym |
| 2 × syntetisk buffert utan järnsulfat | 50,0 μL |
| 25 mM flavonol | 2,0 μL |
| 2 mM järnsulfat | 0,5 μL |
| 1 mg/mL AtF3H | 2,5 μL |
| 1 mg/mL AtFLS1 | 2,5 μL |
| 25 mM flavanone | 2,0 μL |
| H2O | upp till 100,0 μL |
Tabell 6: det syntetiska system som används i detta protokoll.
7. analysera reaktionsprodukterna
- Tunn lagerkromatografi (TLC) analys.
- Pool 5 rör av flavonoid prover från steg 6.2.4 och ta ut 300 μL för lufttorkning. Redissolve den flavonoid pulver i 160 μL av metanol. Förbered autentiska flavonoid prover med seriella koncentrationer av 12,5, 25, 50, 100, och 200 ng/μL i metanol. Fyll på 1 μL av reaktionsproverna och de autentiska flavonoidproverna på polyamid 6-plattor.
- Kör de provladdade plattorna i ett lösningsmedelssystem som består av kloroform/metanol/etylacetat/myrsyra i förhållandet 5.0:1.5:1.0:0.5.
- Lufttorka plattorna vid rumstemperatur. Spraya plattorna med 1% etanollösning av aluminiumklorid (AlCl3), följt av lufttorkning igen vid rumstemperatur.
- Trettio minuter senare, visualisera fläckar på plattorna under en UV-ljus på 254 nm och ta bilder.
- Analysera grå värdet för varje plats på bilderna med hjälp av en bildbehandlings program (t. ex. ImageJ v 1.51 J8 i detta protokoll).
- Öppna programvaran ImageJ. Klicka på arkiv > Öppna för att öppna bilden som ska analyseras.
- Klicka på vänster mest RectangUlar markeringsverktyget i imagej användargränssnittet. Redogöra för intresseregionen (ROI) i bilden med musen och tryck på
för att märka den första ROI. - Flytta den rektangulära markeringen med musen till höger till nästa ROI och tryck
på för att märka den andra ROI. - Upprepa föregående steg för att märka alla andra ROIs.
- Tryck
för att generera profiltomter för alla Rois i ett popup-fönster.
Obs: vid denna tidpunkt aktiveras det raka linje markeringsverktyget i imagej-användargränssnittet automatiskt. - Använd den raka linje markeringsverktyget för att rita baslinjer för att definiera ett stängt område för varje intressepunkt.
- Aktivera verktyget trollspö genom att klicka på motsvarande ikon i imagej-användargränssnittet. Klicka inuti toppen om du vill visa resultat för alla toppar i ett popup-fönster.
- Gör en TLC-baserad standardkurva av den autentiska flavonoid genom att plotta de grå värdena från steg 7.1.5.7 mot motsvarande flavonoid koncentrationer från steg 7.1.1. Sedan, beräkna avkastningen av flavonoid av intresse som produceras i detta protokoll enligt den resulterande formeln.
- Högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) och vätskekromatografi/masspektrometri (LC/MS) analyser
- Bearbeta proverna från steg 7.1.1 sekventiellt genom 0,45 μm och 0,22 μm filter.
- Fyll på proverna i ett HPLC/LC/MS-system (se tabell över material) och separera proverna vid 30 ° c med en C18-kolonn (4,6 × 150 mm; i.d., 5 μm). Eluera kolonnen vid 1,0 mL/min med en gradient på 10-85% (v/v) acetonitril (ACN) i vatten (0-10 min, 10-25% ACN; 10-35 min, 25-50% ACN; 35-45 min, 50-85% ACN; 45-50 min, 85-10% ACN; 50-60 min , 10% ACN) och övervaka eluatens absorbans från 200 till 800 nm. Utför LC/MS-analysen i ett negativt Jon läge med ett torkande kväveflöde på 10 L/min vid 300 ° c och ett mantel gas flöde på 7 L/min vid 250 ° c och samla in data med hjälp av en inbyggd programvara (se tabell över material).
- Extrahera enkelvåglängd Kromatografer för att beräkna de högsta områdena av reaktions prov och autentiska flavonoid föreningar med hjälp av en programvara (se tabell över material).
- Öppna det kvalitativa analysprogrammet och klicka på arkiv ≫ öppna data filen. Välj den eller de filer som ska analyseras i fönstret öppna data fil och klicka på Öppna för att öppna filen/fil (er).
- Högerklicka med musen i fönstret kromatograms Rresultaten och sedan på Extract Chromatogram i en popup-meny.
- Öppna dialogrutan Extract Chromatograms . Klicka på andra kromatogrami listan typ . I kombinationsrutan detektor väljer du DAD1. Klicka sedan på OK för att Visa HPLC-resultaten i fönstret Chromatogram resultat .
- Klicka på ikonen MAnnual integration dockad överst i fönstret Chromatogram resultat . Rita en baslinje för den topp som krävs för manuell integrations analys med musen.
- Klicka på visa ≫ integration topp lista för att visa resultaten.
- Gör en HPLC-baserad standardkurva av den autentiska flavonoid genom att plotta topp områden från steg 7.2.3.5 mot motsvarande flavonoid koncentrationer från steg 7.2.1. Sedan, beräkna avkastningen av flavonoid av intresse som produceras i detta protokoll enligt den resulterande formeln.
- Analysera MS data för den exakta massan av flavonoid föreningar med hjälp av en programvara (se tabell över material).
- Upprepa steg 7.2.3.1-7.2.3.3.
- Klicka på ikonen områdesval i verktygsfältet Chromatogram resultat .
- Välj topp av intresse. Högerklicka med musen i det markerade området och klicka på EXTRAHERA MS Spectrum i popup-menyn för att visa resultaten i fönstret MS Spectrum resultat .
för att märka den första ROI.
på för att märka den andra ROI.
för att generera profiltomter för alla Rois i ett popup-fönster.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F3H och FLS1 är två viktiga viktiga enzymer i omvandlingen av en flavanone till en flavonol i växter som visas i figur 1. Att utveckla ett in vitro-biosyntetiskt system för att framställa en flavonol från en flavanone, Atf3h (genbank anslutning nr. NM_ 114983.3) och Atfls1 (genbank-Anslutningsnr. NM_ 120951.3) gener klonas från plantor av 4-veckors gammal A. thaliana till ett prokaryotiskt uttryck vektor pET-32a (+). De rekombinanta plasmiderna omvandlades till E. coli BL21 (de3) och fusionsproteinerna uttrycktes efter IPTG-induktion, följt av rening med ni-Ida-agreshartser. Som framgår i figur 2, den renade fusions proteiner visade en hög renhet på över 95% på en 10% SDS-Page gel, som var ren nog för inrättandet av en in vitro bienzymatisk kaskad.
Figur 1: schematisk representation för biosyntesen av en flavonol från en flavanonein vitro. F3H, flavanone 3-hydroxylase; FLS1, flavonol syntas 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: rening av rekombinanta AtF3H-och AtFLS1-proteiner. De Atf3h och Atfls1 gener klonas från 4-veckors gamla plantor av Arabidopsis thaliana till en prokaryotisk uttryck vektor pET-32a (+) och uttrycks i Escherichia coli BL21 (de3). De rekombinanta proteinerna renas genom en affinitetskromatografikolonn fylld med ni-IDA agupphartser. Renhet bestämdes på en 10% SDS-PAGE gel. M, protein markörer; 1, rekombinant AtF3H protein; 2, rekombinant AtFLS1 protein. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att upprätta en bienzymatisk kaskad med de renade rekombinanta proteinerna utarbetades ett syntetiskt system som visas i tabell 6. För att avgöra om detta system kan användas för omvandling av en flavanone till en flavonol, NRN lades in i systemet, och biosyntesen av KMF upptäcktes av TLC och HPLC/LC/MS analyser. Som framgår av figur 3afanns det två nya fläckar på en polyamid-TLC-platta. En plats visade ett migrations avstånd som liknar dihydrokaempferol (DHK), och det andra liknar KMF. Ytterligare analys av HPLC och LC/MS visade att de nya kemikalierna uppvisade en retentionstid på 11,91 min respektive 20,16 min (figur 3b) och en kvasimolekylär Jon topp [M − H]− vid M/z 287,0500 respektive 285,0500 (figur 3c ), som var identiska med DHK respektive KMF. Data indikerar att KMF producerades från NRN i detta system och avkastningen var så hög som 34,94 mg/L.
Figur 3: syntes av KMF från NRN i en bienzymatisk kaskad. Aanalys av en-Pot reaktionsprodukter av polyamid TLC. 1, NRN-standard; 2, DHK standard; 3, KMF standard; 4, reaktionsblandning. B) reaktions produkternas HPLC-analys profiler. NRN, DHK, och KMF visade en retentionstid på 18,74 min, 11,91 min, och 20,16 min, respektive. C) MS-analys profiler för flavonoidföreningarna i reaktions blandningarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att ytterligare avgöra om detta in vitro-system kan användas för omvandling av andra flavanones till deras motsvarande flavonoler, eriodictyol (ERD) lades in i systemet för att avgöra om ERD kan omvandlas till quercetin (QRC). Som framgår av figur 4avisade två nya fläckar på en polyamid-TLC-platta ett flyttnings avstånd som liknar dihydroquercetin (DHQ) respektive QRC. HPLC-och LC/MS-analyser visade att dessa nya kemikalier avslöjade en retentionstid på 10,03 min respektive 16,23 min (figur 4b) och en kvasimolekylär Jon topp [M − H]− vid M/z 303,1000 respektive 301,1000 (figur 4c). , som motsvarade exakt de av DHQ och QRC, respektive. Data indikerar att detta system kan omvandla ERD till QRC och avkastningen var 25,55 mg/L.
Figur 4: produktion av QRC från ERD i ett bienzym syntetiskt system. A) analys av reaktionsprodukter av polyamid-TLC. 1, ERD standard; 2, DHQ-standarden; 3, QRC-standarden; 4, reaktionsblandning. B) reaktions produkternas HPLC-analys profiler. ERD, DHQ och QRC visade en retentionstid på 15,45 min, 10,03 min och 16,23 min, respektive. C) MS-analyskprofiler för föreningarna i reaktions blandningarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ganska många studier är inriktade på härledning av flavonoler på grund av deras potentiella tillämpning inom hälso-och sjukvård och livsmedelsindustrin. Men traditionella växt utvinning med organiska lösningsmedel och kemisk syntes besitter inneboende nackdelar, som begränsar deras användning i produktionen av flavonoler. Här, Vi rapporterar en detaljerad metod för att producera en flavonol från en flavanone i en kruka genom att etablera en in vitro bienzymatisk kaskad. De kritiska stegen i detta protokoll är: 1) erhålla rena rekombinanta enzymer med hög aktivitet och 2) upprättande av en en-Pot bienzymatisk reaktion kaskad. Generellt sett föredrar uttrycket av vegetabiliska gener i bakterier att bilda inkluderande organ, vilket kommer att leda till förlust av enzymaktivitet. Som vi vet, vissa peptider, såsom TrxA och SUMO, bidra till att förbättra uttrycket och lösligheten av rekombinanta proteiner uttrycks i bakterier16. Därför, det kommer att vara bra att klona målgener i plasmider som innehåller dessa uttryck taggar, såsom pET-32a (+) och pET SUMO (steg 3.2.3). Det är välkänt att IPTG koncentration och induktions temperatur är ytterligare två viktiga parametrar som påverkar lösligheten av prokaryotiskt uttryckt proteiner16. För att ytterligare minska bildandet av inklusionskoncentrat bör IPTG-koncentrationen och induktions temperaturen optimeras. Den optimala IPTG-koncentrationen och induktions temperaturen beror främst på vilken typ av plasmider och bakteriestammar. I detta protokoll optimeras IPTG-koncentrationen och induktions temperaturen vid 0,2 mM respektive 20-22 ° c (steg 4.2.3). Dessutom är temperatur och glycerol två viktiga parametrar för att bibehålla stabiliteten och aktiviteten vid rening och lagring av de rekombinanta enzymerna. I detta protokoll är det viktigt att rena de rekombinanta proteinerna vid 4 ° c (steg 5,5-5,12), tillsätt 10% glycerol i lösningen av renade enzymer (steg 5,13) och omedelbart alikvot och förvara lösningen vid-80 ° c (steg 5,13). I upprättandet av en en-Pot reaktion kaskad, pH och temperatur är två vitala parametrar. Det är uppenbart att för högt pH är skadligt för omvandlingen eftersom de järnhaltiga joner (FE2 +), en nödvändig komponent för enzymaktiviteten av rekombinant F3H och FLS116,32,33, fälls ut av att bilda en flytgödsel av järnhydroxid under ett sådant tillstånd. Även om en relativt högre temperatur underlättar utvecklingen av en enzym-katalyserad reaktion, för hög temperatur kommer att inaktivera enzymet. Därför är det viktigt för omvandlingen att stabilisera pH-och reaktions temperaturen. Vår tidigare publikation anger optimal pH och temperatur vid 7,2 respektive 40 ° c (steg 6)16.
Detta protokoll kan enkelt modifieras för att biosyntetisera ett antal flavonoler från olika flavanones med olika substrat. I detta protokoll finns två exempel. Som framgår av figur 3, när du lägger NRN som ett substrat i detta system, nya kemikalier producerades. TLC och HPLC/LC/MS analyser tyder på att de nya kemikalierna var DHK och KMF, och NRN omvandlades till KMF i detta system. För att ytterligare stärka förtroendet för resultaten, spektrala karakterisering av 1H NMR (väte-1 nukleär magnetisk resonans), 13C NMR (Carbon-13 kärnmagnetisk resonans), NOESY (Nuclear Overhauser effekt spektroskopi), XRD (X-ray pulver diffraktion), CHN Analyzer och liknande kan krävas för att intyga närvaron av kemikalier i en ny enhet. På samma sätt kan ERD omvandlas framgångsrikt till QRC i denna bienzymatiska kaskad (figur 4).
Det finns en viktig begränsning för denna metod. Enligt den kända biosyntetiska vägen av flavonoider, en flavonol kan produceras av detta system från en aromatisk aminosyra eller dess nedströms derivat. Till exempel kan KMF produceras från p-coumaric syra av en rad viktiga enzymer, inklusive 4-coumaroyl: COA-Ligase (4cl), Chalkon syntas (CHS), Chalkon Isomerase (Chi), F3H och FLS23. På samma sätt, QRC kan framställas från caffeic Acid med samma panel av viktiga enzymer (opublicerade data). Emellertid, coenzym A (CoA), ATP, och manonyl-CoA måste ingå i systemet för att omvandla p-coumaric syra till KMF, vilket kommer att kraftigt öka produktionskostnaden. Därför, detta system är vanligtvis begränsad till konvertera en flavanone till en dihydroflavonol eller en flavonol. Dessutom är fullständig omvandling av utgångsmaterial en annan utmaning. För att ytterligare förbättra effektiviteten i detta system bör framtida forskning inriktas på screening av viktiga enzymer med hög aktivitet från andra växter, mutation av gener som kodar för viktiga enzymer, immobilisering av de mycket aktiva enzymerna till inerta bärare och utveckling av ett bättre buffertsystem.
Denna en-Pot bienzym syntetiskt system besitter uppenbara inneboende fördelar jämfört med andra metoder för att producera en flavonol, såsom kemisk syntes, mikrobiell cell Factory, och växt utvinning med organiska lösningsmedel16. För det första är reaktionstiden mycket kort och behöver bara 40 min, så detta produktionssystem är arbets-och tidsbesparande. För det andra finns det ingen komplicerad fysiologisk reglering i detta system som inträffade i den mikrobiella Cellfabriken och dessutom är alla komponenter tydliga. Därför är det lätt att kontrollera reaktionen exakt och därmed bekvämt att göra ytterligare optimering i framtiden. För det tredje, eftersom detta reaktionssystem endast innehåller enkla kemikalier och renade rekombinanta enzymer och endast genererar en större intermediär som visas i figur 3 och figur 4, förväntas det att det är lättare att rena mål molekylerna som genereras i detta system än de från cell fabriker och fabriker. För det fjärde, de viktigaste komponenterna i systemet är vanliga och billiga kemikalier och prokaryota uttrycks rekombinanta enzymer, så det är mycket kostnadseffektivt för denna metod för att härleda önskade flavonoider. För det femte, på grund av enkelheten i komponenterna i detta system, är det lätt att skala upp för massproduktion av mål flavonoider, vilket indikerar en enorm industrialiserings potential. Dessutom, detta system ger en guide för ekonomisk produktion av andra sekundära metaboliter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Yangzhou University särskilt utsedda professor start-up fonder, Jiangsu särskilt utsedda professor start-up fonder, sex Talent Peaks projekt i Jiangsu-provinsen (Grant No. 2014-SWYY-016), och ett projekt som finansieras av den prioriterade akademiska program utvecklingen i Jiangsu högre utbildningsanstalter (veterinärmedicin). Vi tackar testcentret för Yangzhou University för HPLC och MS analyser av flavonoider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
References
- Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications. Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).
- Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development. European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).
- Cui, B., et al. Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods. Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).
- Li, X., et al. A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).
- Kim, H., et al. Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells. International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).
- Kimura, H., et al. Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME). Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).
- Cassidy, A., et al. Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults. The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).
- Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats. Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).
- Serban, M. C., et al. Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials. Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).
- Nakagawa, T., et al. Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients. Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).
- Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis. Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).
- Agar, O. T., et al. Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey. Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).
- Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).
- Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. New Synthetic Methods of Flavones. Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).
- Lu, Y. H., et al. Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl). Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).
- Zhang, Z., et al. Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).
- Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).
- Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).
- Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).
- Miyahisa, I., et al. Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli. Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).
- Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli. Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).
- Koopman, F., et al. De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).
- Winkel-Shirley, B. Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).
- Duan, L., et al. Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).
- Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides. Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).
- Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. Preparation of RNA from plant tissue using trizol. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Directional cloning into plasmid vectors. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography. Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).
- Halbwirth, H., et al. Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).
- Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).
