Summary
De fleste planter inden for Fællesskaber sandsynligt hænger ved metoden mycorrhizal (AM) svampe, men mægling af plante interaktioner af dem har været undersøgt primært af voksende planter med versus uden tilførte. Vi præsenterer en metode til at manipulere fælles mycorrhizal netværk blandt mycorrhizal planter til at undersøge deres konsekvenser for anlægget interaktioner.
Abstract
Metoden mycorrhizal (AM) svampe indflydelse plante MINERALSKE næringsstoffer udbredelse og vækst, derfor, de har potentiale til at påvirke plante interaktioner. Kraft af deres indflydelse er i extraradical mycelia, der breder sig ud over næringsstoffer udtynding zoner fundet rødder til i sidste ende interconnect individer inden for en fælles mycorrhizal netværk (CMN). De fleste eksperimenter, men har undersøgt rolle AM svampe i anlægget interaktioner ved at dyrke planter med versus uden mycorrhizal svampe, en metode, der undlader at tage eksplicit stilling til rollen som CMNs. Her, foreslår vi en metode, der manipulerer CMNs for at undersøge deres rolle i anlægget interaktioner. Vores metode bruger modificerede beholdere med konisk bund med en nylon mesh og/eller hydrofobe materiale der dækker slidsede åbninger, 15N gødning og en næringsfattige interstitiel sand. CMNs er tilbage enten intakt mellem interagerende enkeltpersoner, afbrudt af rotation af beholdere, eller forhindret fra formning af en solid barriere. Vores resultater tyder på, at roterende beholdere er tilstrækkelige til at afbryde CMNs og undgå deres virkninger på plante interaktioner på tværs af CMNs. Vores tilgang er fordelagtig, fordi det efterligner aspekter af naturen, såsom frøplanter tappe allerede etablerede CMNs og brugen af en suite af AM svampe, der kan giver forskellige fordele. Selvom vores eksperiment er begrænset til at undersøge planter på stadiet sætteplante, kan plante interaktioner på tværs af CMNs påvises ved hjælp af vores tilgang, som derfor kan anvendes til at undersøge biologiske spørgsmål om driften af CMNs i økosystemer.
Introduction
Metoden mycorrhizal (AM) svampe bistået planter i kolonisering af jord 460 millioner år siden1 og i dag, de er allestedsnærværende symbionter af de fleste planter2, give dem med afgørende mineralske næringsstoffer for vækst. De tynde, tråd-lignende hyfer AM svampe fouragere for mineralske næringsstoffer ud over næringsstoffer udtynding zoner nær rødder, ofte støder og koloniserer rodsystemer af nærliggende planter i et "fælles mycorrhizal netværk" (CMN). Fælles mycorrhizal netværk også kan danne når svampe germlings join etableret netværk3, eller når er hyfer fuse (anastomose) med conspecific hyfer4,5,6,7. Omfanget af disse extraradical hyfer i jorden er enorme, med extraradical hyfer udgør 20-30% af samlede jord mikrobielle biomasse i prairie og græsning jorder8 og strækker sig til 111 m·cm-3 i uforstyrret græsarealer9 .
Fælles mycorrhizal netværk partition mineralske næringsstoffer blandt sammenkoblede nærliggende planter10,11,12,13. Planter kan modtage op til 80% af deres fosfor og 25% af deres kvælstof krav fra AM svampe, samtidig med at op til 20% af deres samlede faste kulstof til svampe i afkast14. Seneste in vitro-roden orgel kultur arbejde har fundet, at CMNs fortrinsvis udveksle mineralske næringsstoffer med værten rødder, der leverer den mest CO2-svampe11,12. Desuden kan forskellige arter af AM svampe variere i deres kvalitet som symbiotiske partnere, med nogle svampe, udveksle mere fosfor for mindre CO2 end andre15. Selv om roden orgel kulturer er gavnlige modeller for at studere AM symbiose, fordi de præsenterer omhyggeligt kontrollerede miljøer og evnen til at direkte observere hyphal sammenkoblinger, omfatter de ikke photosynthesizing skud, som påvirker vigtige fysiologiske processer som fotosyntese, transpiration og temperaturprofil ændringer, såvel som udgør kulstof og mineralske næringsstoffer synker.
I naturen tappe frøplanter sandsynligvis allerede etablerede CMNs. Indtil for nylig, men har forskere kun undersøgt virkningen af AM svampe på planteernæring af voksende planter med og uden AM svampe, ofte med en enkelt art af AM svamp. Selv om dette arbejde har været uhyre informativ til vores forståelse af metoden tilførte, har denne metode overset den potentielt afgørende rolle, som CMNs kan have i interaktioner blandt sammenkoblede værtsplanter. Især interagere planter, der er stærkt afhængige af AM svampe vækst minimalt uden AM svampe16,17, eventuelt confounding vores fortolkning af AM svamp-medieret interaktioner når brugt som 'kontrol' til baseline reference.
Vi foreslår en roteret-core tilgang til undersøgelse af CMNs rolle i anlægget interaktioner og strukturering af befolkningen. Vores tilgang efterligner komponenter AM symbiose i naturen fordi hele planter join etableret CMNs og alle planter er dyrket med AM svampe. Ved at fjerne roden interaktioner, fokuserer vores metodologi specifikt på interaktioner medieret af AM svampe mens også tracking mineralske næringsstoffer bevægelse inden for CMNs. Vores tilgang bygger på tidligere arbejde, der har brugt roteret kerner både i feltet og i drivhuset for at forstå AM funktion realistisk.
Metoden roteret core er blevet oprettet i litteraturen som en metode til at manipulere extraradical hyfer18,19,20,21, og det har haft flere reinkarnationer afhængigt af formålet over de sidste to årtier. I første omgang, mesh poser eller hindringer at tillade i vækst af hyfer blev brugt til at give rod-fri rum for at kvantificere mængden af metoden mycorrhizal hyfer i jord22,23. Derefter, cylindriske kerner af jord omgivet af stive vandrør eller plast rør med slots er omfattet i en nylon mesh gennemtrængelige af hyfer, men ikke rødder blev udviklet. Disse kunne nemt drejes for at forstyrre extraradical mycelia18,24,25. De roterede kerner var placeret mellem planter og jord hyphal længder pr. gram jord18, 13C strømme til extraradical mycelia24, eller fosfor optagelse fra plante-fri kerner var kvantificerede18. En anden brug af sådanne kerner var at dyrke planter inden for dem i feltet for at reducere kolonisering af rødderne af AM svampe gennem hyppige hyphal forstyrrelser som et alternativ til sterilisering eller anvendelsen af fungicider, som begge har indirekte virkninger på jordens indhold af organiske spørgsmål og andre mikrober18.
Hyphal mesh barriere tilgang har været brugt til at undersøge næringsstoffordeling og plante interaktioner på tværs af CMNs, men i rektangulære mikrokosmos og ikke med roterede kerner. Walder et al.26 undersøgt samspillet mellem Linum usitatissimum (hør) og Sorghum bicolor (sorghum) af sporing mineralske næringsstoffer for kulstof udveksling ved hjælp af isotoper over CMNs af enten AM svampe Rhizophagus irregularis eller Funneliformis mosseae26. Mikrokosmos i deres undersøgelse bestod af planten rum adskilt af mesh barrierer, hyphal rum kun tilgængelig for mycorrhizal hyfer og mærket hyphal rum, der indeholdt radioaktive og stabile isotoper. Som objekter anvendes studiet behandlinger uden mycorrhizal svampe. Sangen et al.27 anvendes en lignende tilgang til at finde anlægget signaler kunne transporteres kun blandt etablerede CMNs af F. mosseae , når en plante var inficeret af en svampe patogen. Også, på samme måde til Walder et al.26, Merrild et al.28 voksede planter i enkelte rum adskilt af mesh til at undersøge plante ydeevne af Solanum lycopersicum (tomat) stiklinger af CMNs kædet sammen med en stor Cucumis sativus (agurk) plante, der repræsenterede en rigelige carbon kilde. De brugte også behandlinger uden mycorrhizal svampe i stedet for severing CMNs28. I et andet, tilhørende eksperiment, carbon for fosfor exchange blev undersøgt ved hjælp af mesh poser mærket med 32s. mikrokosmos med hyphal mesh barrierer og CMN severing som en behandling blev brugt af Janos et al.29, der undersøgte konkurrencedygtige interaktioner mellem stiklinger af savanna træarter Eucalyptus tetrodonta og transplantationer af regnskoven træet, Litsea glutinosa. I denne undersøgelse, Janos et al.29 løftede rum indeholdende planter et par centimeter, glidende lag af mesh mod hinanden for at bryde hyphal sammenkoblinger29.
Det sidste trin i udviklingen af metoden roteret core har været at dyrke planter inde kerner, der er i potter eller mikrokosmos20,30. Wyss30 brugt roteret kerner til at fastslå, hvis extraradical AM mycelium kan kolonisere Pinus elliottii planter, når spredes fra en donor eller 'sygeplejerske' AM vært plante, Tamarindus indica, og hvordan extraradical mycelium af ectomycorrhizal svampe påvirkninger sætteplante ydeevne. Store kommercielle rørformede sætteplante containere (Tabel af materialer) inden for mikrokosmos var enten solid plast (ingen CMNs) eller kærv og dækket med en hydrofobe membran. Slidsede sætteplante containere var enten ikke roteret (intakt CMNs) eller roteret for at bryde etablerede CMNs. drejet kerner med forskellige maskestørrelser barriere størrelser blev brugt af Babikova et al.20 til at undersøge belowground signalering gennem CMNs blandt Vicia faba (bønne) planter. I deres undersøgelse, var en central donor plante i 30 cm diameter mesocosms sammenkoblet ved rødder og hyfer (ingen hindring) eller kun ved CMNs etableret gennem et 40 μm mesh. Centrale planter var afskåret fra samspil med nærliggende planter gennem rotation af de trådnet-lukket kerner, eller CMNs blev forhindret af en 0,5 μm finmasket omslutter kernen.
Vi præsenterer her, en metode, der kombinerer aspekter af forudgående roteret core tilgange til at undersøge CMNs indflydelse på direkte plante interaktioner kombineret med stabil isotop sporing. Vores metode bruger et 'target plant' tilgang, hvor de centrale anlæg af interesse er omgivet af nærliggende planter. Planter dyrkes inde drejelig sætteplante containere, der er slidset og dækket med nylon serigrafisk mesh, hydrofobe membran, eller er ikke-modificerede solid plast. Fælles mycorrhizal netværk der udskilles en gang om ugen eller holdes intakt, og 15N stabile isotoper spore transporter af kvælstof fra naboer roterede kerner til anlægget centrale mål. Ved at sammenligne plante størrelse med mineralske næringsstoffer og stabil isotop optagelse, vurderer vi, hvilke planter kan drage fordel eller lider af CMNs i interaktioner blandt værtsplanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. konstruktion og montering af drejelig kerner
- Ændre kommercielle rørformede sætteplante containere (efterfølgende kaldt 'containere'; Tabel over materialer) at have 19 mm bred x 48 cm længde åbninger.
- Brug en Boremaskinen med en 19 mm hul så uden en central, pilot twist drill, skåret to huller, over hinanden, i siderne af en container (2,5 cm diameter x 12.1 cm længde), således at hullerne er ca 1 cm fra hinanden. Hold beholderen mod et hegn på Boremaskinen og har et stop med en kort dyvel, der vil passe inde i containeren til at hjælpe med at holde den på plads mens boring. Bruge en container med fleksibel plast til at forhindre krakning.
- Skære de resterende tyndt stykke plastik mellem hullerne med saks, wire cutter eller tin snips (for stiv plast bruge en sabre-SAV) aflang for at gøre en åbning ca 2 cm bred og 5 cm lang.
- Gentag trin 1.1.1 – 1.1.2 på den modsatte side af beholderen.
- Dække slots med nylon mesh og/eller hydrofobe membran (figur 1A).
- Skåret nylon mesh med 40 μm porer i 9,5 cm x 8,5 cm stykker. Skær så mange stykker som der er containere.
- Lim nylon mesh eksternt på beholdere til at dække begge åbninger med nogle mindre overlapning i stoffet ved hjælp af højstyrke, industrielle varme limen.
- Hvis forebyggelse af vandbevægelse er nødvendig, er sådan som når du bruger vandopløselige næringsstoffer eller stabile isotoper, dække nylon mesh lag med en hydrofobe membran31,32 (Table of Materials) at tillader svamp hyfer til pass, men kun bevægelse af vanddamp og ikke flydende vand.
- Placer den varme lim rundt om åbningerne på beholderen og langs de lange kanter af nylon mesh. Rulle container på stof til at undgå at brænde fingrene. Tilføje et lag af lim langs stof kanten hvor trådnet kanter overlapning. Tryk på kanten på nogle pap til fast forsegle det. Altid rulle konsekvent i én retning, der vil være den samme retning med rotation af de færdige objektbeholdere i potter eller mikrokosmos, så overlappende mesh kant ikke vil blive skubbet til potentielt grave i underlaget.
- Når limen er afkølet, tape stof til beholderen at forhindre løs kanter og rippe ved hjælp af en fleksibel tape, som elektrikers tape top og bund ender.
- Bruger den samme tape som i trin 1.2.5, dække de små huller på siderne af koniske udgangen (ikke hul i spidsen af nederst) af hver container til at forhindre rodvækst ud af beholderen ind i resten af pot/mikrokosmos.
- Forhindre jord tab samtidig med dræning, placere en glas marmor i bunden af hver container.
- For en kontrol behandling, der ikke indebærer nogen potentiale for en CMN form mellem planter, bruge solid, uforandret beholdere (figur 1A).
2. montering af gryder eller mikrokosmos til at passe de koniske ender af containere
- At sikre beholdere stå oprejst i en fast position og har ordentlig dræning, flip en gryde, så bunden vender opad. Skær omkring bunden af potten, efterlader en lille læbe for støtte, ved hjælp af en sabre-sav.
- Forberedelse af polystyren skum
- Skære polystyren skum, ca. 36 mm tyk, at den samme diameter som bunden af puljen ved hjælp af en Båndsavens med en cirkel-skæring jig.
- Bore huller i skummet ved hjælp af en boremaskine presse og 19 mm hul så (uden en central twist drill) i mønster, hvor beholderne placeres.
- En target plante eksperiment, bore et centralt hul med jævnt fordelt huller til nabolandet personer omkring den. For en gryde med en 15,5 cm i diameter huller plads seks 12 mm fra hinanden omkring omkredsen af en 11 cm diameter cirkel (figur 1B).
- Læg hullerne hexagonalt eller i en kvadratisk matrix (figur 1 c, D) for en mikrokosmos eksperiment.
3. fyldning af beholdere og gryder med blandinger af jord og sand
- Vælg en ønskede jord blanding og tilføje er svamp field-indsamlede eller pot-kulturperler inokulum til jord af ensartet blande hakkede root stykker (1-2 cm lang) grundigt med jorden. Bland den ønskede jord med en ufrugtbar silica sand eller glas perler for at mindske koncentrationen af mineralske næringsstoffer til rådighed til planter.
- Placer de fyldte beholdere i boret skum eller mikrokosmos bunden og fylde den interstitielle rum med en ufrugtbar substrat.
- Fylde den interstitielle rum mellem beholdere med næringsfattige kvartssand blandingen ved hjælp af en tragt til at hjælpe med at fylde små rum. At sikre tilstrækkelig dræning og efterligne teksturen af jorden, bland medium partikelstørrelse sand, såsom 6-20 grade, med små partikelstørrelse sand, såsom 30-65 klasse, i en cement mixer.
4. etablering af CMNs i hele Potter/mikrokosmos
- Plante forbehandling 'sygeplejerske' planter af de ønskede arter i hver beholder til at opretholde AM svampe, således at de kan sprede blandt beholderne og etablere CMNs.
- Når alle beholdere har etableret kimplanter, fjerne skud ved klipning, så at kun en enkelt forbliver i hver container.
- Give 2-3 måneder for planternes vækst og CMN etablering.
5. oprettelse af forsøgsanlæg og behandlinger
- Soen forsøgsanlæg ved såning eller omplantning i containere. Hvis såning, vente, indtil alle containere har en spirede sætteplante før du fjerner forbehandling sygeplejerske planter af klipning deres skud. Hvis omplantning, klip alle forbehandling planter inden omplantning eksperimentelle stiklinger for at forhindre utilsigtede konkurrencebegrænsende virkninger.
- Etablere CMN behandlinger af enten forlader beholdere ikke flyttes til varigheden af forsøget (intakt CMNs) eller rotere dem ugentligt til fysisk sever hyfer udvide blandt de modificerede containere (afhuggede CMNs; Figur 1A). Når severing CMNs, rotere hver beholder gennem en fuld omdrejning at undgå utilsigtet at ændre overjordiske interaktioner, især for heliotropic planter.
- Tungt vand alle gryder eller mikrokosmos umiddelbart efter rotation til at genetablere kontakt mellem den interstitielle substrat og siderne af containere.
6. opsporing af mineralske næringsstoffer bevægelighed på tværs af CMNs
- Befrugte nærliggende planter med 0,5% 15N beriget KNO3 og NH4Cl.
- Befrugte mål individ med en 14N gødning af samme koncentration.
7. overvågning og vedligeholdelse af eksperiment
- Regelmæssigt (i det mindste hver måned) re randomisere positioner i potter eller mikrokosmos i løbet af eksperimentet.
- Ugentlig måle vækst, såsom højde eller længste blad længde (for græs) til at overvåge når væksten begynder at aftage, fordi det er vigtigt at høste før planterne bliver root bundet.
8. høst af forsøget
- Klip alle overjordiske væv og placere enkelte planter i mærket konvolutter, der identificerer deres behandling, pot eller mikrokosmos og holdning.
- Tør overjordiske væv ved 60 ° C til konstant vægt. Mål hver plantevæv tørvægt.
- Tillad jord tørre før udvinding af containere og høst rødderne.
- Forsigtigt børste så meget jord som muligt fra rodsystemer og vaske dem i en gryde vand eller under en blide strøm af vand på en sigte med en 250 micron porestørrelse.
- Tillad rødderne til lufttørring og vejer hele rodsystemet.
- Klip rodsystemet tilfældigt og gemme root fragmenter i 50% ethanol. Når de farves33, skal du bruge disse fragmenter til kvantificering af roden kolonisering ved hjælp af gitterlinjer skæringspunktet metode34.
- Re vejer den resterende rodsystem og gemme det i en mærket papir kuvert til tørre på 60 ° C for vurdering af tørvægt. Bruge følgende ligning for at beregne vægten af hele rodsystemet:
9. mineralske næringsstoffer og stabil isotop analyser
- Gruppere udplantningsplanterne af biomasse i "deciler" eller 10 grupper, "octiles" eller 8 grupper, "kvartiler" eller fire grupper, etc. efter rang-bestilling dem efter vægt hvis væv antal er for lavt for minimumskrav for fordøjelsen at bestemme mineralske næringsstoffer koncentrationer.
- Send Blandtegning prøver til en kontraktansat lab for mineralske næringsstoffer og stabil isotop analyser (Tabel af materialer).
- Beskrive isotopiske overflod ved hjælp af følgende sædvanlige udtryk:
hvor R repræsenterer 15N /14N forholdet af en prøve eller af standard, som er atmosfæriske N. - Brug den ikke-modificerede, solid container behandling til at tjene som en kontrol for baggrunden 15N nøgletal i følgende massebalancen ligningen når kvantificere mængden af 15N taget op af en target plante i afskåret eller intakt CMN behandlinger:
hvor δ15N repræsenterer den isotopiske overflod af mål, naboer og målgruppen af planter i ingen CMN behandlingen, og x repræsenterer (som en decimalbrøk) procent kvælstof fremstillet ved målet planten fra nabo containere som etiket blev tilføjet. Værdier for δ15Nnaboer er opnået for hvert mål plantens sammensat naboer.
- Beskrive isotopiske overflod ved hjælp af følgende sædvanlige udtryk:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at afgøre, hvordan CMNs kan påvirke plante ydeevne gennem næringsstoffordeling, voksede vi Andropogon gerardii Vitman, en dominerende prærien græs i en target plante eksperiment med 6 jævnt fordelt naboer og intakt, afhuggede, eller ingen CMNs. Vi fandt, at afbrydelse eller forhindre CMNs mindskedes mål overjordiske tør vægte (figur 2), tyder på, at intakt CMNs forfremmet plantevækst. Planter med afhuggede CMNs og forhindret CMNs reagerede navnlig ligeledes til deres behandlinger, tyder på, at rotationen af containere, en gang om ugen lykkedes afdæmpe virkningerne af CMNs. Afhuggede CMN behandlingen, dog kan være foretrukne som en kontrol fordi nylon mesh (som var dækket af en hydrofobe membran i dette eksperiment) i både intakt og afhuggede behandlinger kan påvirke vand dynamics såsom jord slidsede containere (roteret eller ej) tørring hurtigere end i ikke-modificerede containere.
Konkurrence, hvor væksten af en enkelt undertrykker væksten af et andet nærliggende individ, blev fundet i intakt CMN behandling, men ikke i de afhuggede eller ingen CMNs behandlinger. Vi fandt, at kun når CMNs var intakte målrette og summerede nabo størrelser har en negativ sammenhæng, som det fremgår af lineær regression (figur 3). De afhuggede og ingen CMNs behandlinger afviger ikke fra hinanden, og sammen, deres skråninger afviger ikke væsentligt fra nul. Derfor, de væsentligt afveg fra negativ hældning af den intakte CMNs behandling (figur 3). Desuden fandt vi, at Gini-koefficienter, et mål for størrelsen ulighed, der spænder fra nul til én i hvilke nul afspejler en perfekt lige store distribution, afveg blandt behandlinger. Intakte CMNs behandlingen havde den største ulighed10,35,36. Størrelse uligheder er påvirket af konkurrence inden for befolkninger, især når store individer dominerer ressource erhvervelse, hvorved uforholdsmæssigt undertrykke væksten af små individer, også kendt som asymmetriske konkurrence37 , 38.
Om mineralske næringsstoffer var begrænsning af væksten, og hvis CMNs har bidraget til at blev intensivere konkurrencen for disse næringsstoffer fastlagt gennem sammenligninger af mineralske næringsstoffer blad væv koncentrationer versus plante størrelse. Af alle de mineralske næringsstoffer vurderet, fandt vi, at kun Mn blad væv koncentrationer var positivt associeret med target plante overjordiske tør vægte over alle behandlinger, med ingen væsentlige forskelle blandt skråninger, tyder på, at Mn kan have begrænset vækst blandt alle behandlinger (figur 4). Ikke desto mindre var regression linje højder, som tyder på forskelle i gennemsnitlige koncentrationer blandt behandlinger, påvirket af CMN overskæring og forebyggelse. Blandtegning N koncentrationer ikke blev påvirket væsentligt af CMN behandlinger, men N-koncentrationen faldt betydeligt med aboveground tørvægt af målgruppen af planter, hvilket tyder på en potentiel 'fortynding effect' af plante størrelse på væv Nielsen39, 40. Nielsen var derfor ikke sandsynligt vækst-begrænsende mineralske næringsstoffer i vores eksperiment. I en anden lignende eksperiment, mener Blandtegning P var væsentligt påvirket af CMN behandling, men også viste en fortynding effekt i forhold til at plante størrelse for planter med intakt CMNs35.
For at undersøge, om CMNs varierende partition mineralske næringsstoffer mellem indbyrdes forbundne personer, vurderet vi plante målvæv for 15N i blad væv versus plante størrelse. Vi havde tilføjet 15N-mærket kun til naboer containere. Vi fandt, at målgruppen af planter med intakt CMNs havde højere 15N koncentrationer i forhold til både andre behandlinger, som ikke afviger fra hinanden (figur 5A). Selv om målet overjordiske tørvægt var forbundet med mængden af kvælstof hidrørende fra naboer containere over både intakt og afhuggede CMNs behandlinger, havde intakt CMNs en stærkt positiv væsentligt anderledes hældning fra, af de afhuggede CMNs behandling (figur 5B). Disse resultater tyder på, at store planter, potentielt med rigelige photosynthate, fået flere 15Nielsen fra CMNs at nå ind i nabolandet beholdere end gjorde små mål individer. Vores resultater tyder også på at de hydrofobe membran med held forhindret gratis vand (og efterfølgende 15N) bevægelse i potter.
I en anden roteret Kernemålet plante eksperiment, guava (Psidium guajava) træ frøplanter blev dyrket i store sætteplante containere indlejret i store Potter, og alle (også de store gryder) blev fyldt med den samme forholdsvis næringsrige jord blanding. Når CMNs blev afbrudt af rotation i mangel af naboer, plantevækst betydeligt formindsket til samme størrelse som planter inden for en solid containere, hvilket tyder på at roteret planter blot havde reduceret adgang til fuld jord volumen af de store gryder (figur 6 ). Når målgruppen af planter havde et vilkårligt antal naboer, plante størrelse faldt til lignende størrelser, og nogen statistisk påvises effekt af severing CMNs forsvundet (figur 6).
I et felt eksperiment ved hjælp af roteret-kerner lavet af PVC-rør, undersøgte en af os extraradical mycelium indflydelse på planten ydeevne i et felt eksperiment med Soapberry (Sapindus saponaria L.) stiklinger (figur 7). Selvom extraradical mycelium ud over rør havde ringe effekt på plantevækst under tretten-måned eksperimentet, reduceret severing det ved drejning af rør Blandtegning N, P og Cu koncentrationer betydeligt (med 25% eller mere).
Figur 1. Eksperimentere opsætningen af containere i intakt, brudt, eller kontrol behandlinger (A), gryder i en target plante eksperiment (B), eller mikrokosmos med et sekskantet (C) eller firkantede (D) layout af containere. Mørke ovale pletter på modificerede containere er en åbning i containeren dækket med en 40 µm nylon mesh for svampe hyfer at trænge ind (A). Fælles mycorrhizal netværk forbliver intakt med ingen rotation af containerne, er afbrudt af rotation eller er forhindret i at etablere en solid plastic container (A). I en target plante pot eksperiment, kan beholdere placeres i en skum bund, der placerer dem (B). For et mikrokosmos eksperiment, kan bunden ved lagt ud i en sekskantet array med seks ækvidistante, nærmeste naboer for hver 'target' enkelte (C) eller i en kvadratisk matrix med fire nærmeste naboer og en anden fire, lidt fjernere, diagonal naboer for hver 'target' (D). Panelet B er ændret fra Weremijewicz et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Betyde (± SE) overjordiske og belowground tør vægt (g) af target Andropogon gerardii individer blandt almindelige mycorrhizal netværk behandlinger. Overjordiske tør vægte er vist som positive værdier over abscissen og belowground tør vægte er positive værdier under abscissen. Overjordiske tørvægt barer toppet af samme skrivelse ikke afviger Tukeys ærligt signifikant forskel post-hoc test på ɑ = 0,05. Belowground tør vægte afviger ikke blandt behandlinger og dermed er ikke toppet af breve. Dette tal er ændret fra Weremijewicz et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Samlede nabo (g) versus mål plante overjordiske tør vægt (g) til Andropogon gerardii planter. Planter med intakt fælles mycorrhizal netværk (CMNs) er repræsenteret af mørke trekanter og en fast linje, med afhuggede CMNs af grå kvadrater og en stiplet linje, og ingen CMNs af hvide diamanter og en punkteret. Dette tal er ændret fra Weremijewicz et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Målrette overjordiske tør vægt (g) versus Blandtegning mangan koncentrationer (µg·g-1) af Andropogon gerardii. Planter med intakt fælles mycorrhizal netværk (CMNs) er repræsenteret af mørke trekanter og en fast linje, med afhuggede CMNs af grå kvadrater og en stiplet linje, og ingen CMN af hvide diamanter og en punkteret. Dette tal er ændret fra Weremijewicz et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Δ15N (‰) ± SE af target Andropogon gerardii enkeltpersoner (A) med intakt fælles mycorrhizal net (CMNs, sorte bjælker), udskilles CMNs (grå søjler), og ingen CMN (hvid barer) og procent kvælstof fremstillet af nabo container jord ved planter med intakte CMNs i omgivende solen (trekanter) eller skygge (grå firkanter) versus target overjordiske tørvægt (g; B). barer toppet af samme skrivelse i panelet A ikke afviger Tukeys ærligt signifikant forskel post-hoc test på ɑ = 0,05. Disse tal er ændret fra Weremijewicz et al.10. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Betyde (± SE) overjordiske og belowground tør vægt (g) af target Psidium guajava individer blandt almindelige mycorrhizal netværk (CMNs) og nabo behandlinger. Langs abscissen, en ingen nabo behandling er repræsenteret af "0N", en nabo af "1N," osv., mens en kontrol behandling med ingen CMNs (podede solid container og ingen naboer) repræsenteres af lys skygge og bogstavet "C". Biomasse af planter med intakt CMNs er repræsenteret af faste barer, mens dem med afhuggede CMNs er skraverede. Overjordiske tør vægte er vist som positive værdier over abscissen og belowground tør vægte er positive værdier under abscissen. Barer toppet af samme skrivelse ikke afviger Tukeys ærligt signifikant forskel post-hoc test på ɑ = 0,05. Overjordiske og belowground tør vægt kontrol behandling blev kun sammenlignet med intakt og afhuggede CMN behandlinger med ingen naboer (angivet med græske bogstaver) fordi kontrolelementet ikke omfatter naboer som en yderligere faktor i behandlingen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Udvidelse af den roterede core metode til et felt eksperiment (A) og repræsentative 13-måned-forhenværende Sapindus saponaria L. stiklinger med intakte (ikke roteret) og afskåret (roteret) fælles mycorrhizal netværk (B). PVC rør (9 cm diameter x 20 cm højde) blev boret med en hulsav til har fire 5,3 cm diameter huller i to imod par. Hullerne blev dækket med en nylon serigrafisk mesh med 30 µm porer gennem hvilke extraradical mycelium kunne udvide både fra og til de kerner, som var fyldt med jord fra den plantning site (A). Fælles mycorrhizal netværk blev holdt intakt eller udskilles ved rotation ved hjælp af en stor rørtang. Positioner af parret roteret og ikke-roteret kerner (ca 20 cm fra hinanden) er markeret med flag hver 2 m langs fem transekter i eksperimentel plottet i en Lychee grove (A). Dokumentation for forstyrrelse af extraradical mycelium reduktion af N, P og Cu optagelse er vist klorotiske planter mærket "roteret" vist i B. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores resultater bekræfter, at vores roteret core metode skarpt kan fokusere på rollen som CMNs i belowground plante interaktioner. Der er flere kritiske trin i protokollen, dog, hvis ændret, har potentiale til at påvirke evnen til at opdage CMN virkninger. Det er afgørende at fylde interstitiel område omkringliggende beholdere med et medium, næringsfattige. I vores forgæves, roteret core target plante eksperiment med guava tree planter, selv om der var en markant reduktion af target vækst i overværelse af et vilkårligt antal naboer, ingen virkninger af CMNs for belowground konkurrencen var fundne, sandsynligvis på grund af mineralske næringsstoftilgængelighed i hele Potter. Derimod sikrer brugen af en næringsfattige medium mellem roteret kerner at hyfer skal nå ind i nabolandet containere, som ofte er fyldt med både hyfer og rødder (især når du arbejder med root-intensive græsser). Extraradical hyfer i nærliggende containere således er i direkte konkurrence med rodsystemer og skal partitionere mineralske næringsstoffer erhvervet fra sådanne 'pletter' blandt planter tilsluttet en CMN. En anden afgørende komponent i at gøre belowground interaktioner kan påvises er at undgå overjordiske konkurrence. Vores guava eksperiment viste, at effekten af ekstra jord volumen adgang tydeligt når target planter havde ingen naboer hovedsagelig blev elimineret, når målet frøbedsplanter var skyggen af naboer. Ved hjælp af græsser, som for det meste vokser lodret, eller begrænsende seedling blade kroner til at forhindre overlapning vil bidrage til at afbøde overjordiske interaktioner.
Brug af noget stive beholdere i stedet for mesh poser, er afgørende for opretholdelsen af en lang eksperiment med lethed af severing CMNs gennem rotation. I et tidligt forsøg på en CMN eksperiment, forsøger at trække en kniv mellem mesh poser til at bryde CMNs ikke kun resulterede i beskadigede poser hvorfra rødder kunne Rage men syntes også at positivt øge jord beluftning resulterer i drastisk forbedret planternes vækst når CMNs blev afbrudt. Fordi den roterede core tilgang flytter forsigtigt hver beholder i en invariant holdning (takket være de bærende holdning huller i bunden af potten eller mikrokosmos), minimerer det omkringliggende substrat forstyrrelser og potentielle beluftning. Det er imidlertid helt afgørende, at grundigt vand potterne efter rotation af containere til vende tilbage lav fertilitet, interstitiel sand substrat tæt kontakt containere.
Den foreslåede roterede core metode kan ændres på en række måder at besvare en række spørgsmål vedrørende driften af CMNs og extraradical mycelia. For eksempel, kan mængden af kulstof til værtsplanter at give CMNs reduceres ved skygge10. Shade klud viklet modificerede sætteplante beskyttere at omringe individuelle beholdere lykkedes at reducere kulstof klargøring til CMNs og således 15N optagelse fra CMNs10. Derudover befolkningsstruktur kan undersøges i store mikrokosmos (figur 1 c, D) bestående af mange planter, hver i en individuel, roterede beholder. Det er vigtigt at bemærke, at pleje skal træffes for at undgå pseudoreplikation41 , når du gør det. Enkelte planter er bestemt ikke "replikater" fordi de ikke er uafhængige af de andre planter i et mikrokosmos. Hele eksperimentelle enheden (pot eller mikrokosmos) er derimod en replikeres, hvilket er grunden til vi brugte gennemsnit eller udgjorde nabo plante størrelser pr pot, inden du kører analyser af varians eller lineær regressionsanalyse.
Vores tilgang kan ændres for feltundersøgelser at udelukke rod konkurrence og undersøge indflydelsen fra intakt CMNs. Ved afløsning containere med PVC rør stykker med store huller er dækket med nylon serigrafisk mesh, roteret kerner kan modstå barske feltbetingelser, som i Soapberry eksperimentet. Svarende til vores guava pot eksperiment, men effekten af severing potentielle CMNs kunne ikke skelnes fra blot begrænse jord volumen hvorfra mineralske næringsstoffer kan erhverves.
Vores tilgang giver en kontrolleret, omhyggelig sammenligning af planter samspil på tværs af CMNs versus mycorrhizal planter, der ikke hænger vedvarende (i stedet for planter helt mangler tilførte). Dermed, det efterligner aspekter af naturen, såsom frøplanter tiltræder etableret CMNs samt brugen af en suite af AM svampe. Seneste arbejde har vist, at forskellige AM svamp arter kan være forskellige kvalitet partnere til planter, og at tilstedeværelsen af en anden art af AM svamp på en rodsystem kan fremkalde et 'usamarbejdsvillig' svamp arter at give mere fosfor til gengæld for kulstof end når den alene på rodsystem42. Desuden kan forskellige arter af svampe give fordele end mineralske næringsstoffer erhvervelse at plante værter som tørke og saltholdighed tolerance eller beskyttelse mod patogener2. Disse resultater understreger betydningen af ved hjælp af en suite af svampe for at etablere CMNs. trods sin realisme, en iøjnefaldende begrænsning af vores tilgang er eksperimentets varighed. Størrelsen af beholdere eller PVC rør begrænser længden af tid inden planterne bliver root bundet og dermed tendens til at begrænse fokus til kun kimplanter eller unge træer. Vi indsende ikke desto mindre, at der er betydelig fleksibilitet i udformningen af mål-plante roteret core eksperimenter, hvor en eller begge mål og naboer kan manipuleres i en bred vifte af måder at forstå roller for CMNs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke de to anonyme korrekturlæsere for deres forslag. Vi takker også de talrige undergraduates hvem har hjulpet med opbygningen af gryder, mikrokosmos, og slidset containere og som har bistået med vedligeholdelse og høst eksperimenter. Vi takker også North Central College for opstart midler (til JW) samt nuværende faciliteter og Ashley Wojciechowski for at opnå en North Central College Richter Grant støtte et eksperiment ved hjælp af disse metoder. En del af dette arbejde blev finansieret af en National Science Foundation ph.d.-afhandling forbedring Grant (DEB-1401677).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) | Stuewe and Sons, Inc | Ray Leach Cone-tainer ™ | RLC3U |
| Course glass beads | Industrial Supply, Inc. | 12/20 sieve | Size #1 |
| Course silica sand | Florida Silica Sand | 6/20 50lb bags | None |
| Fine glass beads | Black Beauty | Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) | BB-Glass-Fine |
| Hydrophobic membrane | Gore-tex | None | None |
| Large commercial tubular seedling containers | Stuewe and Sons, Inc. | Deepot ™ | D16L |
| Medium silica sand | Florida Silica Sand | 30/65 50 lb bags | None |
| Nylon mesh | Tube Lite Company, Inc. | Silk screen | LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER |
| Soil and foliar nutrient analysis facility | Kansas State University Soil Testing Lab | None | None |
| Stable isotope core facility | University of Miami | None | None |
References
- Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (25), 11841-11843 (1994).
- Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , 3 edn, Academic Press. (2008).
- Giovannetti, M., Avio, L., Sbrana, C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 41-67 (2015).
- Giovannetti, M., Sbrana, C. Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Vol. 328. Nato Science Series, Sub-Series I: Life and Behavioural Sciences. Cresti, A., Heath, M., Geitmann, I. B. , 221-231 (2001).
- Giovannetti, M., Sbrana, C., Avio, L., Strani, P. Patterns of below-ground plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks. New Phytologist. 164 (1), 175-181 (2004).
- Avio, L., Pellegrino, E., Bonari, E., Giovannetti, M. Functional diversity of arbuscular mycorrhizal fungal isolates in relation to extraradical mycelial networks. New Phytologist. 172 (2), 347-357 (2006).
- Giovannetti, M., et al. At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signaling & Behavior. 1 (1), 1-5 (2006).
- Miller, R., Kling, M. J. The importance of integration and scale in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant and Soil. 226 (2), 295-309 (2000).
- Miller, R., Jastrow, J., Reinhardt, D. R. External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie communities. Oecologia. 103 (1), 17-23 (1995).
- Weremijewicz, J., Sternberg, L. dS. L. O., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify competition by preferential mineral nutrient allocation to large host plants. New Phytologist. , (2016).
- Fellbaum, C. R., et al. Fungal nutrient allocation in common mycorrhizal networks is regulated by the carbon source strength of individual host plants. New Phytologist. 203 (2), 646-656 (2014).
- Lekberg, Y., Hammer, E. C., Olsson, P. A. Plants as resource islands and storage units--adopting the mycocentric view of arbuscular mycorrhizal networks. FEMS Microbiol Ecol. 74 (2), 336-345 (2010).
- Jakobsen, I., Hammer, E. C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 91-131 (2015).
- Jakobsen, I., Rosendahl, L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants. New Phytologist. 115 (1), 77-83 (1990).
- Kiers, E. T., et al. Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science. 333 (6044), 880-882 (2011).
- Hartnett, D. C., Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T. Mycorrhizal influence on intra- and interspecific neighbour interactions among co-occuring prairie grasses. Journal of Ecology. 81 (4), 787-795 (1993).
- Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T., Todd, T. C. Differential responses of C3 and C4 grasses to mycorrhizal symbiosis, phosphorus fertilization, and soil microorganisms. Canadian Journal of Botany. 68 (3), 461-467 (1990).
- Johnson, D., Leake, J. R., Read, D. J. Novel in-growth core system enables functional studies of grassland mycorrhizal mycelial networks. New Phytologist. 152 (3), 555-562 (2001).
- Leake, J. R., et al. Networks of power and influence: the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 82 (8), 1016-1045 (2004).
- Babikova, Z., et al. Underground signals carried through common mycelial networks warn neighbouring plants of aphid attack. Ecology Letters. 16 (7), 835-843 (2013).
- Schüepp, H., Miller, D. D., Bodmer, M. A new technique for monitoring hyphal growth of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi through soil. Transactions of the British Mycological Society. 89 (4), 429-435 (1987).
- Miller, D. D., Bodmer, M., Schüepp, H. Spread of endomycorrhizal colonization and effects on growth of apple seedlings. New Phytologist. 111 (1), 51-59 (1989).
- Jakobsen, I., Gazey, C., Abbott, L. K. Phosphate transport by communities of arbuscular mycorrhizal fungi in intact soil cores. New Phytologist. 149 (1), 95-103 (2001).
- Johnson, D., Leake, J., Ostle, N., Ineson, P., Read, D. J. In situ 13CO2 pulse‐labelling of upland grassland demonstrates a rapid pathway of carbon flux from arbuscular mycorrhizal mycelia to the soil. New Phytologist. 153 (2), 327-334 (2002).
- Johnson, D., Leake, J., Read, D. J. Transfer of recent photosynthate into mycorrhizal mycelium of an upland grassland: short-term respiratory losses and accumulation. of 14C. Soil Biology and Biochemistry. 34 (10), 1521-1524 (2002).
- Walder, F., et al. Mycorrhizal networks: Common goods of plants shared under unequal terms of trade. Plant Physiology. 159 (June 2012), 789-797 (2012).
- Song, Y. Y., et al. Interplant communication of tomato tlants through underground common mycorrhizal networks. Plos One. 5 (10), e13324 (2010).
- Merrild, M. P., Ambus, P., Rosendahl, S., Jakobsen, I. Common arbuscular mycorrhizal networks amplify competition for phosphorus between seedlings and established plants. New Phytologist. 200 (1), 229-240 (2013).
- Janos, D. P., Scott, J., Aristizábal, C., Bowman, D. M. J. S. Arbuscular-mycorrhizal networks inhibit Eucalyptus tetrodonta seedlings in rain forest soil microcosms. Plos One. 8 (2), e57716 (2013).
- Wyss Lozano Hoyos, T. Pinus elliottii var. densa Seedling Performance Reflects Ectomycorrhizas, Soil Nutrient Availability and Root Competition. , (2010).
- Mäder, P., Vierheilig, H., Alt, M., Wiemken, A. Boundries between soil compartments formed by microporous hydrophobic membranes (GORE-TEX) can be crossed by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi but not by ions in the soil solution. Plant and Soil. 152, 201-206 (1993).
- Mäder, P., et al. Transport of 15N from a soil compartment separated by a polytetrafluoroethylene membrane to plant roots via the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 146 (1), 155-161 (2000).
- Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture. , (1996).
- McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective-measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 115 (3), 495-501 (1990).
- Weremijewicz, J., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify size inequality in Andropogon gerardii monocultures. New Phytologist. 198 (1), 203-213 (2013).
- Weremijewicz, J., O’Reilly, L. dS. L., Janos, D. P. Arbuscular common mycorrhizal networks mediate intra-and interspecific interactions of two prairie grasses. Mycorrhiza. , 1-13 (2017).
- Weiner, J. Asymmetric competition in plant populations. Tree. 5 (11), 360-364 (1990).
- Damgaard, C., Weiner, J. Describing inequality in plant size or fecundity. Ecology. 81 (4), 1139-1142 (2000).
- Johnson, C. R., Joiner, J. N., Crews, C. E. Effects of N, K, and Mg on growth and leaf nutrient composition of 3 container grown woody ornamentals inoculated with mycorrhizae. Journal of the American Society for Horticultural Science. 105 (2), 286-288 (1980).
- Estrada-Luna, A. A., Davies, F. T., Egilla, J. N. Mycorrhizal fungi enhancement of growth and gas exchange of micropropagated guava plantlets (Psidium guajava L.) during ex vitro acclimatization and plant establishment. Mycorrhiza. 10 (1), 1-8 (2000).
- Hurlbert, S. H. Pseudoreplication and the design of ecological field experiments. Ecological Monographs. 54 (2), 187-211 (1984).
- Argüello, A., et al. Options of partners improve carbon for phosphorus trade in the arbuscular mycorrhizal mutualism. Ecology Letters. 19 (6), 648-656 (2016).
