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Untersuchung der Pflanze Interaktionen netzübergreifend gemeinsame Mykorrhiza mit gedrehten Kerne

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59338
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Biology, North Central College, 2Department of Biology, University of Miami

Summary

Die meisten Pflanzen innerhalb der Gemeinschaften, die wahrscheinlich durch arbuskulären Mykorrhizapilze (AM) miteinander verbunden sind, sondern Vermittlung von Pflanze-Interaktionen von ihnen wurde vor allem durch wachsende Pflanzen mit vs. ohne Mykorrhizen untersucht. Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur gemeinsamen Mykorrhiza Netze unter Mykorrhiza Pflanzen zu untersuchen, deren Folgen für die Pflanze-Interaktionen zu manipulieren.

Abstract

Arbuskulären Mykorrhiza (AM) Pilze zu beeinflussen, mineralische Nährstoffaufnahme der Pflanze und das Wachstum, daher, sie haben das Potenzial, Pflanze-Interaktionen zu beeinflussen. Die Macht ihres Einflusses findet in extraradical Myzelien, die darüber hinaus Nährstoffverarmung Zonen verteilt in der Nähe von Wurzeln, Personen innerhalb eines gemeinsamen Mykorrhiza-Netzwerks (CMN) letztlich miteinander zu verbinden. Die meisten Experimente haben allerdings die Rolle des AM-Pilze in Pflanze-Interaktionen durch den Anbau von Pflanzen mit vs. ohne Mykorrhiza-Pilze, eine Methode, die nicht explizit die Rolle der CMNs untersucht. Hier schlagen wir eine Methode, die CMNs um ihre Rolle in der Pflanze-Interaktionen zu untersuchen manipuliert. Unsere Methode nutzt modifizierte Container mit konischen Böden mit einem Nylon-Mesh und/oder hydrophoben Material über geschlitzte Öffnungen, 15N-Dünger und nährstoffarme interstitielle Sand. CMNs sind entweder Links intakt zwischen interagierenden Individuen, abgetrennt durch Rotation von Containern oder daran gehindert, durch eine feste Barriere bilden. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass rotierende Behälter ausreichend ist, um CMNs zu stören und zu verhindern, dass ihre Auswirkungen auf Pflanze-Interaktionen über CMNs. Unser Ansatz ist vorteilhaft, weil es imitiert Aspekte der Natur, wie Sämlinge Erschließung bereits etablierten CMNs und die Verwendung einer Reihe von AM-Pilze, die vielfältigen Vorteile bieten kann. Obwohl unser Experiment zur Untersuchung von Pflanzen an den Keimlings begrenzt ist, können Pflanzen Interaktionen über CMNs mit unserem Ansatz die biologische Fragen über das Funktionieren der CMNs in Ökosystemen zu untersuchen daher angewendet werden können erkannt werden.

Introduction

Arbuskulären Mykorrhiza (AM) Pilze Pflanzen in der Besiedlung des Landes 460 Millionen Jahren unterstützt1 und heute sind sie allgegenwärtig Symbionten von den meisten Pflanzen2, Wachstum mit lebenswichtigen Mineralstoffen vorsieht. Die dünnen, fadenförmigen Hyphen von Pilzen AM Futter für mineralische Nährstoffe über Nährstoffverarmung Zonen in der Nähe von Wurzeln, oft zu begegnen und besiedeln die Wurzelsysteme der Pflanzen in einem "gemeinsamen Mykorrhiza Netzwerk" benachbarten (CMN). Gemeinsamen Mykorrhiza Netze können auch bilden, wenn Pilz Germlings Join Netzwerke3 etablierte, oder wenn Hyphen bin verschmelzen (anastomosieren) mit Sicht Hyphen4,5,6,7. Das Ausmaß dieser extraradical Hyphen im Boden ist enorm, mit extraradical Hyphen bilden 20 % bis 30 % der gesamten Boden mikrobielle Biomasse in Prärie und Weide Böden8 und stretching für 111 M·cm-3 in ungestörten Grünland9 .

Gemeinsamen Mykorrhiza Netze partitionieren mineralische Nährstoffen zwischen miteinander verbundenen benachbarten Pflanzen10,11,12,13. Pflanzen erhalten bis zu 80 % ihrer Phosphor und 25 % von ihren Stickstoffbedarf von AM-Pilze, gleichzeitig bis zu 20 % ihrer gesamten festen Kohlenstoff zu den Pilzen in14zurück. Aktuelle in-vitro-Wurzel Orgel Kultur arbeiten hat festgestellt, dass CMNs bevorzugt mineralische Nährstoffe mit Host Wurzeln auszutauschen, die die meisten Carbon zu den Pilzen11,12bieten. Darüber hinaus können verschiedene Arten von AM-Pilze in ihrer Qualität als Symbiosepartner, mit einigen Pilzen den Austausch mehr Phosphor für weniger Kohlenstoff als andere15abweichen. Zwar Wurzel Orgel Kulturen vorteilhaft Modelle für die Uhr Symbiose zu studieren, weil sie sorgfältig kontrollierten Umgebungen und die Fähigkeit, direkt beobachten Bodenaggregaten Zusammenhänge darstellen, enthalten sie photosynthetischen Triebe nicht die Auswirkungen auf wichtige physiologische Prozesse wie Photosynthese, Transpiration und tagaktiv Änderungen, Waschbecken sowie konstituierenden Kohlenstoff und Mineral-Nährstoff.

In der Natur erschließen Sämlinge höchstwahrscheinlich bereits etablierten CMNs. Bis vor kurzem, haben jedoch Wissenschaftler nur die Auswirkungen von AM-Pilze auf Pflanzenernährung untersucht durch den Anbau von Pflanzen mit und ohne AM-Pilze, oft mit einer einzigen Art von AM Pilz. Obwohl diese Arbeit enorm informativ zu unserem Verständnis der arbuskulären Mykorrhiza wurde, hat diese Methode die möglicherweise entscheidende Rolle übersehen, die CMNs in Interaktionen zwischen miteinander verbundenen Wirtspflanzen haben können. Vor allem interagieren Pflanzen, die stark abhängig von AM-Pilze für Wachstum sind minimal, ohne AM Pilze16,17, möglicherweise verwirrende unsere Interpretation AM Pilz-vermittelten Wechselwirkungen bei als "Bedienelemente" baseline Referenz.

Wir schlagen einen gedreht-Core-Ansatz zur Untersuchung der Rolle der CMNs in Pflanze-Interaktionen und Strukturierung der Bevölkerung. Unser Ansatz ahmt Komponenten AM Symbiose in der Natur, weil ganze Pflanzen Join etablierte CMNs und alle Pflanzen mit AM-Pilze angebaut werden. Durch das Entfernen der Wurzel Interaktionen, konzentriert sich unsere Methodik speziell auf Interaktionen von AM-Pilze gleichzeitig auch mineralische Nährstoffe Bewegung innerhalb CMNs vermittelt. Unser Ansatz baut auf früheren Arbeiten, die gedrehte Adern sowohl im Gewächshaus als auch im Bereich verwendet hat, um AM realistisch Funktionsweise zu verstehen.

Die gedrehte Kern-Methode wurde in der Literatur als eine Methode zu manipulieren, extraradical Hyphen18,19,20,21, und es hatte mehrere Reinkarnationen je nach Zielsetzung über den letzten zwei Jahrzehnten. Zunächst Netzbeutel oder Barrieren, so dass im Wachstum der Hyphen wurden zur Bereitstellung von Wurzel-freie Fächer um die Höhe der arbuskulären Mykorrhiza Hyphen in den Boden22,23zu quantifizieren. Dann entwickelten sich zylindrische Kerne des Bodens eingeschlossen in starre Wasserleitungen oder Kunststoff-Schläuche mit Schlitzen von Hyphen, aber keine Wurzeln in einem Nylon-Mesh durchlässig abgedeckt. Diese könnte leicht gedreht werden, um extraradical Myzelien18,24,25stören. Die gedrehten Adern wurden zwischen Pflanzen und Boden Bodenaggregaten Längen pro Gramm Boden18, 13C Fluten extraradical Myzelien24oder Phosphoraufnahme von Pflanze-freie Kerne waren quantifizierte18. Eine andere Verwendung von solcher Kerne wollte wachsen Pflanzen in ihnen im Feld zur Besiedlung der Wurzeln zu reduzieren, indem Sie AM-Pilze durch häufige Bodenaggregaten Unterbrechung als Alternative zur Sterilisation oder die Anwendung von Fungiziden, die indirekte Auswirkungen auf die organischen Böden haben Materie und andere Mikroben-18.

Bodenaggregaten Netz Barriere Ansatz wurde zur Untersuchung Nährstoff Partitionierung und Pflanzen Interaktionen über CMNs, aber in rechteckigen Mikrokosmen statt mit gedrehten Kerne. Walder Et Al.26 untersucht Wechselwirkungen zwischen Linum Usitatissimum (Lein) und Sorghum bicolor (Hirse) durch Verfolgung der mineralischen Nährstoff für Austausch von Kohlenstoff über CMNs entweder AM-Pilze Rhizophagus Isotope Irregularis oder Funneliformis Mosseae26. Die Mikrokosmen in ihrer Studie umfasste Pflanze Fächer getrennt durch mesh Barrieren, Bodenaggregaten Fächer nur zugänglich für Mykorrhiza Hyphen und beschrifteten Bodenaggregaten Fächer, die stabile und radioaktive Isotope enthalten. Als Steuerelemente die Studie Behandlungen ohne Mykorrhiza-Pilzen eingesetzt. Song Et Al.27 verwendet einen ähnlichen Ansatz, um die Pflanze zu finden, die Signale nur bei etablierten CMNs F. Mosseae durchgeführt werden können, wenn eine Pflanze durch pilzliche Erreger infiziert war. Auch Netz ähnlich Walder Et Al.26, Merrild Et Al.28 Pflanzen in einzelnen Fächern getrennt durch wuchs, Anlagenleistung von Solanum Lycopersicum (Tomate) Sämlinge durch CMNs verbunden, um eine große Cucumis zu untersuchen Sativus (Gurke) Pflanze, die eine reiche Kohlenstoffquelle vertreten. Sie benutzten auch Behandlungen ohne Mykorrhiza-Pilze statt Abbruch CMNs28. In einem zweiten, Verwandte Experiment wurden Carbon für Phosphor Austausch wurde geprüft mit Mesh-Taschen mit 32s. Mikrokosmen mit Bodenaggregaten Netz Barrieren beschriftet und CMN severing als Behandlung von Janos Et Al.29, der wettbewerbsfähig untersucht Wechselwirkungen zwischen Sämlinge der Savanne Baumarten Eucalyptus Tetrodonta und Transplantationen von Regenwald Baum, Litsea Glutinosa. In diesem Studie, Janos Et Al.29 Fächer mit Sämlinge wenige Zentimeter, Schiebe-Schichten von Masche Bodenaggregaten Verbindungen29brechen gegeneinander aufgehoben.

Der letzte Schritt in der Evolution der gedrehten Kern Methode bestand darin, wachsen Pflanzen im Inneren Kerne, die in Töpfen oder Mikrokosmen20,30. Wyss30 verwendet gedrehte Kerne, um festzustellen, ob extraradical AM Myzel Pinus Elliottii Sämlinge besiedeln könnte bei der Verbreitung von einem Spender oder "Krankenschwester" AM Wirtspflanze, Tamarindus Indicaund wie extraradical Myzel von Ektomykorrhiza Pilze Einflüsse Sämling Leistung. Große kommerzielle röhrenförmigen Sämling-Container (Table of Materials) in Mikrokosmen waren entweder Vollkunststoff (keine CMNs) oder geschlitzt und mit einer hydrophoben Membran abgedeckt. Geschlitzte Sämling-Container wurden entweder nicht gedreht (intakt CMNs) oder so gedreht, dass um etablierte CMNs. gedreht Kerne mit verschiedenen Netz-Barriere zu trennen, die Größen von Babikova Et Al.20 verwendet wurden, um zu untersuchen, unterirdischer Signalisierung durch CMNs unter Vicia Faba (Bohne) Pflanzen. In ihrer Studie wurde eine zentrale Spender-Werk in 30 cm Durchmesser Mesokosmen Wurzeln und Hyphen (kein Hindernis) oder nur durch CMNs gegründet durch ein 40 μm-Netz miteinander verbunden. Zentralanlagen wurden getrennt von Interaktionen mit benachbarten Pflanzen durch Rotation der Netz-geschlossenen Kerne oder CMNs von einem feinmaschigen 0,5 μm umschließt den Kern gehindert wurden.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, die vorherige gedreht-Core Ansätze zu prüfen, den Einfluss der CMNs auf direkte Pflanze Interaktionen kombiniert mit stabilen Isotopen Tracing miteinander verbindet. Unsere Methode verwendet einen "Ziel-Anlage"-Ansatz, in dem das zentrale Werk des Interesses von benachbarten Pflanzen umgeben ist. Pflanzen sind nicht veränderten Vollkunststoff oder innen drehbaren Sämling-Container, die sind geschlitzt und mit Nylon-Siebdruck-Mesh, hydrophoben Membran bedeckt gewachsen sind. Gemeinsamen Mykorrhiza Netze sind einmal in der Woche getrennt intakt gehalten oder stabile Isotope 15N Spur der Bewegung von Stickstoff von Nachbarn gedrehte Adern zum Leitziel Werk. Vergleicht man die Größe des Werks mit mineralischen Nährstoffen und stabilen Isotop Aufnahme, bewerten wir welche Pflanzen können profitieren oder leiden an CMNs in Interaktionen zwischen Wirtspflanzen.

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Protocol

1. Aufbau und Montage der drehbaren Kerne

  1. Ändern von kommerziellen röhrenförmigen Sämling-Container (später genannt "Container"; Tabelle der Materialien) 19 mm breit x 48 cm Länge Öffnungen haben.
    1. Mit eine Bohrmaschine mit einem 19 mm Loch sah ohne zentrale, pilot Spiralbohrer, zwei Löcher, eins über dem anderen, in den Seiten eines Containers (2,5 cm Durchmesser x 12,1 cm Länge) geschnitten, damit die Löcher ca. 1 cm auseinander sind. Halten Sie den Behälter gegen einen Zaun auf der Bohrmaschine und haben Sie eine Haltestelle mit kurzen Zapfen, die im Inneren des Behälters passen zu helfen, während des Bohrens in Position zu halten. Verwenden Sie einen Behälter mit flexiblem Kunststoff, um Rissbildung zu verhindern.
    2. Schneiden die verbleibenden dünnere Stück Plastik zwischen den Löchern mit Schere, Seitenschneider oder Blechschere (für starre Kunststoff verwenden eine Säbel-Säge) länglich zu einem Öffnung ca. 2 cm breit und 5 cm lang.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1, 1.1.2 auf der gegenüberliegenden Seite des Behälters.
  2. Decken Sie die Schlitze mit Nylon-Mesh und/oder hydrophoben Membran (Abbildung 1A).
    1. Schneiden Sie Nylon-Mesh mit 40 μm Poren in 9,5 x 8,5 cm Stücke. Schneiden Sie so viele Stücke wie Container.
    2. Kleben Sie die Nylon-Netzgewebe extern auf den Containern um beide Öffnungen mit etwas Überstand in das Gewebe mit hoher Festigkeit, industrielle Heißkleber zu decken.
    3. Wenn die Verhinderung der Bewegung des Wassers benötigt wird, bin so wie bei der Verwendung von wasserlöslichen Nährstoffe oder stabile Isotope, die Nylon Mesh Schicht mit einem hydrophoben Membran31,32 (Table of Materials) abdecken, die ermöglicht Pilz Hyphen übergeben Sie, sondern nur die Bewegung von Wasserdampf und nicht flüssiges Wasser.
    4. Ort der Heißkleber um die Öffnungen für den Container und entlang den langen Kanten von Nylon-Netzgewebe. Rollen Sie den Behälter auf den Stoff zu vermeiden, Finger verbrennen. Fügen Sie eine Schicht Kleber entlang der Stoffkante, wo das Netz überlappen Kanten. Drücken Sie den Rand auf einige Kartons zu fest versiegeln. Rollen Sie immer konstant in eine Richtung, die die gleiche Drehrichtung der fertigen Container in Töpfe oder Mikrokosmen werden, so dass die überlappenden Netzkante nicht potentiell in das Substrat Graben geschoben werden.
    5. Sobald der Klebstoff abgekühlt ist, kleben Sie die oberen und unteren Enden des Gewebes auf den Container, lose Kanten und Rippen mit einem flexiblen Band, wie z. B. Elektriker Band zu verhindern.
  3. Mit dem gleichen Band wie in Schritt 1.2.5, decken Sie die kleinen Löcher an den Seiten des konischen Ende (nicht das Loch an der Spitze des unteren) jedes Behälters Wurzelwachstum aus dem Behälter in den Rest des Pot/Mikrokosmos zu verhindern.
  4. Um Bodenverlust zu verhindern und gleichzeitig Entwässerung, setzen Sie einen Glas Marmor am unteren Rand jedes Containers.
  5. Verwenden Sie für eine Kontrolle der Behandlung, die nicht mögliche für eine CMN zwischen Pflanzen solide, unveränderten Behälter (Abbildung 1A).

2. Montage der Töpfe oder Mikrokosmen, die konischen Enden der Container passen

  1. Container in einer festen Position aufrecht stehen und haben richtige Drainage, einen Topf umdrehen, so dass die Unterseite nach oben zu gewährleisten. Um den Boden des Topfes, verlassen eine kleine Lippe für Unterstützung, mit einem Säbel-Säge geschnitten.
  2. Vorbereitung von Polystyrol-Hartschaum
    1. Geschnitten Sie Polystyrol-Hartschaum, ca. 36 mm dick, auf den gleichen Durchmesser wie der Boden des Topfes mit einer Bandsäge mit einem Kreis-Schnittvorrichtung.
    2. Bohrungen in den Schaum mit einer Bohrmaschine und 19 mm Loch sah (ohne zentrale Spiralbohrer) in das Muster, in dem die Container positioniert werden.
    3. Für ein Ziel-Pflanze-Experiment eine zentrale Bohrung mit gleichmäßig angeordneten Löchern für benachbarte Personen um ihn herum. Platz sechs Löcher für einen Topf mit einem Durchmesser von 15,5 cm 12 mm auseinander, um den Umfang der ein 11 cm Durchmesser-Kreis (Abbildung 1 b).
    4. Legen Sie die Löcher, Hexagonal oder in quadratischer Anordnung (Abbildung 1, D) für ein Mikrokosmos-Experiment.

(3) Befüllung der Container und Töpfe mit Erde und Sand-Gemische

  1. Wählen Sie eine gewünschte Erdmischung und fügen bin Pilz Feld-gesammelt oder Topf kultiviert Inokulum auf den Boden durch gleichmäßig mischen gehackte Wurzel-Stücke (1 – 2 cm lang) gründlich mit dem Boden. Mischen Sie den gewünschten Boden mit einem unfruchtbaren Kieselsäure Sand oder Glas Perlen um die Konzentration von mineralischen Nährstoffe pflanzenverfügbar zu verringern.
  2. Positionieren Sie die gefüllten Behälter in gebohrten Schaum oder Mikrokosmos unten und füllen Sie den Zwischenraum mit einem unfruchtbaren Substrat.
  3. Füllen Sie den Zwischenraum zwischen Containern mit nährstoffarmen Quarzsand-Mischung mit einem Trichter, bei der kleine Räume zu füllen. Auf ausreichende Drainage zu gewährleisten und die Textur des Bodens zu imitieren, mittlere Partikelgröße Sand, z. B. 6-20 Grad, mit kleiner Partikelgröße Sand, z. B. 30-65 Grad, in einen Betonmischer mischen.

4. Einrichtung der CMNs in Töpfen/Mikrokosmen

  1. Pflanzen Sie Vorbehandlung "Krankenschwester" die gewünschten Arten in jedem Behälter, AM-Pilze zu erhalten, so dass sie können die Container verteilt und CMNs zu etablieren.
  2. Wenn alle Container Sämlinge hergestellt haben, entfernen Sie Triebe durch clipping, so, dass nur eine Person in jedem Container bleibt.
  3. 2-3 Monate für Pflanzenwachstum und CMN Einrichtung zu ermöglichen.

5. Einrichtung von Versuchseinrichtungen und Behandlungen

  1. Säen Sie experimentelle Pflanzen durch Aussaat oder Pflanzung in Containern. Aussaat, warten Sie bis alle Container gekeimten Sämling haben bevor Sie Vorbehandlung Krankenschwester Pflanzen durch Zuschneiden ihrer Triebe entfernen. Wenn Umpflanzen, clip alle Vorbehandlung Pflanzen vor der Verpflanzung experimentelle Sämlinge um unerwünschte Wirkungen zu verhindern.
  2. CMN Behandlungen zu etablieren, indem entweder verlassen die Container nicht für die Dauer des Experiments (intakt CMNs) verschoben oder drehen sie wöchentliche Hyphen Erweiterung unter der modifizierten Container (abgetrennte CMNs; physisch zu durchtrennen Abbildung 1A). Bei der CMNs trennte, drehen Sie jeden Container durch eine volle Umdrehung zur Vermeidung unbeabsichtigt verändern oberirdische Interaktionen, besonders nach Südskandinavien Pflanzen.
  3. Stark Wasser alle Töpfe oder Mikrokosmen sofort nach der Drehung zum Kontakt zwischen dem interstitiellen Substrat und die Seiten der Container wiederherzustellen.

6. Verfolgung von mineralischen Nährstoffen Bewegung über CMNs

  1. Benachbarten Pflanzen düngen mit 0,5 % angereichert 15N KNO3 und NH4Cl.
  2. Düngen Sie das Ziel-Individuum mit einem 14N-Dünger von gleicher Konzentration.

7. Überwachung und Wartung des Experiments

  1. Regelmäßig (bei mindestens einmal pro Monat) zufällig wieder die Positionen der Töpfe oder Mikrokosmen im Laufe des Experiments.
  2. Wöchentlich wie Höhe zu messen oder längste Blatt Länge (für Gräser) um zu überwachen, wenn Wachstum beginnt zu verlangsamen, weil es wichtig ist zu ernten, bevor die Pflanzen Wurzeln gebunden werden.

8. Ernte des Experiments

  1. Clip-alle oberirdisches Gewebe und Einzelpflanzen in beschriftete Umschläge, die ihre Behandlung, Topf oder Mikrokosmos und Position zu identifizieren.
  2. Trocknen Sie oberirdische Gewebe bei 60 ° C zur Gewichtskonstanz. Das Trockengewicht von jedes Pflanzengewebe zu messen.
  3. Lassen Sie die Erde zu trocknen, bevor die Container zu extrahieren und Ernte der Wurzeln.
  4. Vorsichtig Bürsten Sie ab, so viel wie möglich von der Wurzelsysteme beschmutzen und Sie sie in einer Pfanne Wasser oder unter einem sanften Strahl des Wassers auf ein Sieb von 250 µm Porengröße waschen.
  5. Lassen Sie die Wurzeln an der Luft trocknen und wiegen das ganze Wurzelsystem.
  6. Schneiden Sie das Wurzelsystem planlos und speichern Sie die Wurzel-Fragmente in 50 % igem Ethanol. Nachdem sie33gefärbt sind, verwenden Sie diese Fragmente für die Quantifizierung der Wurzel Kolonisation mit Gitternetzlinie Schnittpunkt-Methode34.
  7. Erneut wiegen Sie die restlichen Wurzelsystem und bewahren Sie es an eine beschriftete Papierumschlag bei 60 ° C zur Beurteilung der Trockengewicht trocknen. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um das Gewicht des gesamten Wurzelsystems zu berechnen:

Equation 1

9. mineralischen Nährstoffen und stabilen Isotop Analysen

  1. Gruppieren Sie die Sämlinge von Biomasse in "Dezile" oder 10 Gruppen, "Octiles" oder 8 Gruppen, "Quartile" oder vier Gruppen, etc. nach Rang-bestellen sie nach Gewicht wenn die Gewebe-Menge zu niedrig für die Mindestanforderungen für die Verdauung ist, mineralische Nährstoffe bestimmen Konzentrationen.
  2. Senden Sie Blatt-Proben zu einem vertraglich vereinbarten Labor für mineralischen Nährstoffen und stabilen Isotopen-Analysen (Table of Materials).
    1. Beschreiben Sie isotopischen Überfluß mit dem folgenden üblichen Ausdruck:
      Equation 1
      wo R repräsentiert 15N /14N Verhältnis einer Probe oder von der Norm, die atmosphärische N.
    2. Benutzen die nicht veränderten, solide Container Behandlung dienen als Kontrolle für Hintergrund- 15N-Verhältnisse in der folgenden Gleichung der Massenbilanz bei der Quantifizierung des Betrags von 15N von einem Ziel-Werk in aufgegriffen durchtrennt oder intakt CMN Behandlungen:
      Equation 1
      wo δ15N stellt die isotopische Fülle Ziele, Nachbarn und Ziel-Pflanzen in der keine CMN-Behandlung und x dar (als Dezimalbruch) Prozent Stickstoff erhalten von der Ziel-Pflanze vom Nachbar Container Label hinzugefügt wurde. Werte für δ15NNachbarn werden für jedes Ziel Werk Compositing Nachbarn erhalten.

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Representative Results

Um festzustellen, wie CMNs Anlagenleistung durch Nährstoff Partitionierung beeinflussen können, sind wir gewachsen Andropogon Gerardii Vitman, eine dominante Präriegras in einem Ziel-Pflanze-Experiment mit 6 gleichmäßig verteilte Nachbarn und intakt, abgetrennten, oder keine CMNs. Wir fanden, dass Durchtrennung oder Verhinderung CMNs vermindert Ziele oberirdische trockene Gewichte (Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass intakte CMNs Pflanzenwachstum gefördert. Pflanzen mit abgetrennten CMNs und verhindert CMNs reagierte insbesondere ähnlich wie bei ihren Behandlungen, was darauf hindeutet, dass die Rotation der Container einmal pro Woche bei der Milderung der Auswirkungen der CMNs erfolgreich war. Die abgetrennte CMN-Behandlung darf bevorzugt, da eine Kontrolle jedoch weil die Nylon-Mesh (die von einer hydrophoben Membran in diesem Experiment überlagert wurde) intakt und abgetrennte Behandlungen Wasserdynamik wie der Boden des geschlitzten Container (gedreht beeinflussen können oder auch nicht) trocknen schneller als im Container nicht geändert.

Wettbewerb, in dem das Wachstum eines einzelnen das Wachstum von einem anderen nahe gelegenen Individuum unterdrückt, wurde in der intakten CMN Behandlung aber nicht in der abgetrennten oder keine CMNs Behandlungen festgestellt. Wir fanden, dass nur als CMNs intakt waren Ziel und summierte Nachbar Größen haben eine negative Beziehung, wie gezeigt durch lineare Regression (Abbildung 3). Die abgetrennten und keine CMNs Behandlungen nicht voneinander unterscheiden, und zusammen, ihre Pisten unterschieden sich nicht signifikant von Null. Daher unterschieden sich deutlich von der negativen Steigung der intakten CMNs Behandlung (Abbildung 3). Darüber hinaus fanden wir, dass Gini-Koeffizienten, ein Maß für die Größe-Ungleichheit, die von Null auf eins in die Null reicht eine vollkommen gleich Größenverteilung, unterschieden sich zwischen den Behandlungen widerspiegelt. Die intakte CMNs Behandlung hatte die größte Ungleichheit10,35,36. Größe Ungleichheiten sind von Wettbewerb innerhalb von Populationen, betroffen, besonders wenn große Individuen Ressourcenbeschaffung, dominieren dabei überproportional unterdrücken das Wachstum von kleinen Personen, auch bekannt als asymmetrische Wettbewerb37 , 38.

Ob mineralische Nährstoffe Wachstum begrenzt waren und CMNs beigetragen wurde die Intensivierung des Wettbewerbs für diese Nährstoffe durch Vergleiche von mineralischen Nährstoffen Blatt Gewebe Konzentrationen im Vergleich zu Anlagengröße bestimmt. Von allen mineralischen Nährstoffen beurteilt fanden wir, dass nur Mn Blatt Gewebe Konzentrationen waren positiv assoziiert mit Ziel Pflanze oberirdisch trocken Gewichte über alle Behandlungen mit keine signifikanten Unterschiede zwischen hängen, was darauf hindeutet, dass Mn begrenzt haben kann Wachstum bei allen Behandlungen (Abbildung 4). Dennoch, Regression Linie lagen, die mittlere Konzentrationsunterschieden unter Behandlungen vorschlagen, CMN durchtrennen und Prävention betroffen waren. Blattdünger N-Konzentrationen wurden nicht nennenswert von CMN Behandlungen, sondern N Konzentration deutlich abgenommen, mit oberirdischen Trockengewicht der Ziel-Pflanzen, was ein Potential "Verdünnung-Effekt" der Anlagengröße auf Gewebe N39, 40. N sei daher nicht wahrscheinlich das Wachstum begrenzen mineralischen Nährstoff in unserem Experiment. In einem anderen ähnlichen Experiment meine Blatt-P wurde durch CMN Behandlung stark beeinträchtigt, sondern zeigte auch ein Verwässerungseffekt im Vergleich zu Größe für Anlagen mit intakten CMNs35Pflanzen.

Erforschen, sofern CMNs differentiell mineralische Nährstoffen zwischen miteinander verbundenen Individuen partitionieren, untersuchten wir Ziel Pflanzengewebe für 15N Blatt Gewebe gegen die Größe des Werks. Wir hatten 15N-Label nur Nachbarn Container hinzugefügt. Wir fanden, dass Ziel Pflanzen mit intakten CMNs höhere 15N-Konzentrationen im Vergleich zu den beiden anderen Behandlungen, die nicht (Abbildung 5A) voneinander unterscheiden. Obwohl oberirdische trocken Zielgewicht mit der Menge an Stickstoff von Nachbarn Container über intakt und abgetrennte CMNs Behandlungen erhalten verbunden war, hatte intakt CMNs Abhanges stark positiv, signifikant verschieden von derjenigen der abgetrennten CMNs Behandlung (Abb. 5 b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Großanlagen, potenziell mit reichlich Photosynthate mehr 15N CMNs gewonnenen ins benachbarte Container als kleines Ziel Einzelpersonen haben erreichen. Auch unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die hydrophobe Membran erfolgreich freies Wasser (und nachfolgenden 15N) verhindert Bewegung in Töpfen.

In einem anderen gedreht Kernzielgruppe Pflanze Experiment Guave (Guave Guajava) Baum-Setzlinge wurden in großen Sämling-Container eingebettet in große Töpfe, und alle (auch für große Töpfe) füllten sich mit dem gleichen relativ nährstoffreichen Boden Mischung. Bei der CMNs durch Rotation in der Abwesenheit des Nachbarn getrennt waren, das Pflanzenwachstum erheblich vermindert, die gleiche Größe wie Pflanzen in festen Behältern, was darauf hindeutet, dass gedrehte Pflanzen einfach Zugriff auf das volle Boden Volumen der großen Töpfe (Abbildung 6 reduziert hatte ). Als Ziel Pflanzen beliebig vieler Nachbarn hatte, Anlagengröße sank auf ähnliche Größen und jede statistisch nachweisbare Wirkung der Durchtrennung der CMNs verschwunden (Abbildung 6).

In einem Feldexperiment mit gedreht-Kernen aus PVC-Rohr untersucht von uns den Einfluss der extraradical Myzel auf Anlagenleistung in einem Feldexperiment mit Soapberry (Sapindus Saponaria L.) Sämlinge (Abbildung 7). Obwohl extraradical Myzel über Rohre wenig Wirkung auf das Pflanzenwachstum während des Experiments von dreizehn Monaten hatte, reduziert trennte es durch Drehen der Rohre Blattdünger N, P und Cu Konzentrationen erheblich (um 25 % oder mehr).

Figure 1
Abbildung 1: Experimentieren Sie Setup von Containern in intakt, durchtrennt, oder Kontrolle Behandlungen (A), Töpfe in einer Ziel-Anlage (B) oder Mikrokosmen mit einem sechseckigen (C) oder quadratisch (D) Layout Container zu experimentieren. Ovale Pigmentflecken auf modifizierten Container sind eine Öffnung in den Behälter mit einem 40 µm-Nylon-Netzgewebe für pilzliche Hyphen durchdringen (A) bedeckt. Gemeinsamen Mykorrhiza Netzwerke mit keine Rotation der Container intakt bleiben, werden durch Rotation durchtrennt oder sind daran gehindert, mit einem festen Kunststoff-Behälter (A). In einem Ziel Pflanze Topf Experiment können Container in einem Schaum-Boden platziert werden, die sie (B) positioniert. Für ein Mikrokosmos Experiment kann unten durch verlegt, in einer hexagonalen Anordnung mit sechs äquidistant, nächste Nachbarn für jedes einzelne "Ziel" (C) oder in quadratischer Anordnung mit vier nächsten Nachbarn und vier weitere, etwas weiter entfernten, diagonal Nachbarn für jedes "Ziel" (D). Zentrale B wird von Weremijewicz Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Meine (± SE) Ober- und unterirdischer trocknen Gewicht (g) von Andropogon Gerardii Einzelpersonen unter gemeinsamen Mykorrhiza Netzwerk Behandlungen. Oberirdischen trockene Gewichte werden als positive Werte über der Abszisse dargestellt und unterirdisch trockenen Gewichte sind positive Werte unterhalb der Abszisse. Oberirdische Trockengewicht Bars gekrönt durch den gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht von Tukey ehrlich signifikanter Unterschied Post-hoc- Test bei ɑ = 0,05. Unterirdischer trockene Gewichte unterschieden sich nicht zwischen den Behandlungen und sind somit nicht gekrönt von Buchstaben. Diese Zahl wird von Weremijewicz Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Total Nachbar (g) versus Ziel Pflanze oberirdische trocken Gewicht (g) für Pflanzen Andropogon Gerardii . Pflanzen mit intakten gemeinsamen Mykorrhiza Netze (CMNs) werden durch dunkle Dreiecke und eine durchgezogene Linie, mit abgetrennten CMNs von grauen Quadrate und eine gestrichelte Linie und keine CMNs mit weißen Diamanten und eine gepunktete Linie dargestellt. Diese Zahl wird von Weremijewicz Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. Ziel oberirdische trocken Gewicht (g) im Vergleich zu Blatt-Mangan Konzentrationen (µG·g-1) von Andropogon Gerardii. Pflanzen mit intakten gemeinsamen Mykorrhiza Netze (CMNs) sind vertreten durch dunkle Dreiecke und eine durchgezogene Linie, mit abgetrennten CMNs von grauen Quadrate und eine gestrichelte Linie und keine CMN weißen Diamanten und eine gepunktete Linie. Diese Zahl wird von Weremijewicz Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5. Δ15N (‰) ± SE von Andropogon Gerardii Einzelpersonen (A) mit intakten gemeinsamen Mykorrhiza Netze (CMNs, schwarze Balken), durchtrennt CMNs (graue Balken), und keine CMN (weiße Balken) und Prozent Stickstoff gewonnen aus dem nächsten Container Boden durch Pflanzen mit intakte CMNs in ambient Sonne (Dreiecke) oder im Schatten (grauen Quadraten) versus Ziel oberirdische Trockengewicht (g; (B). Bars, gekrönt durch den gleichen Buchstaben in zentrale A unterscheiden sich nicht von Tukey ehrlich signifikanter Unterschied Post-hoc-Test bei ɑ = 0,05. Diese Zahlen werden von Weremijewicz Et Al.10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6. Meine (± SE) Ober- und unterirdischer trocknen Gewicht (g) der Guave Guajava Einzelpersonen unter gemeinsamen Mykorrhiza Netze (CMNs) und Nachbar-Behandlungen. Entlang der Abszisse, kein Nachbar Behandlung ist vertreten durch "0N", ein Nachbar von "1N", etc., während eine Kontrollbehandlung mit keine CMNs (beimpften solide Container und keine Nachbarn) durch leichte Schattierung und der Buchstabe "C" dargestellt wird. Biomasse von Pflanzen mit intakten CMNs werden durch ausgefüllte Balken dargestellt, während diejenigen mit abgetrennten CMNs hachured sind. Oberirdische trockene Gewichte werden als positive Werte über der Abszisse dargestellt und unterirdisch trockenen Gewichte sind positive Werte unterhalb der Abszisse. Bars, gekrönt durch den gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht von Tukey ehrlich signifikanter Unterschied Post-hoc- Test bei ɑ = 0,05. Ober- und unterirdisch trockenen Gewichte von der Steuerung der Behandlung wurden nur mit intakten und abgetrennte CMN Behandlungen ohne Nachbarn (durch griechische Buchstaben gekennzeichnet) verglichen, weil das Steuerelement nicht Nachbarn als zusätzlicher Faktor bei der Behandlung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7. Erweiterung der gedrehten Kern-Methode, um ein Feldexperiment (A) und repräsentative 13-Monate-alten Sapindus Saponaria L. Sämlinge mit intakten (nicht gedreht) und durchtrennt (gedrehte) gemeinsame Mykorrhiza Netze (B). Polyvinylchlorid Rohre (9 cm Durchmesser X 20 cm Höhe) wurden mit einer Lochsäge vier 5,3 cm Durchmesser Löcher in zwei gegen Paare haben gebohrt. Die Löcher wurden mit einem Nylon-Siebdruck-Mesh mit 30 µm-Poren bedeckt die extraradical Myzel durchdringen konnte, aus und in den Kernen gefüllt mit Erde aus der Pflanzungsgebiet (A). Gemeinsamen Mykorrhiza Netze wurden intakt oder abgetrennten durch Rotation mit einer großen Rohrzange gehalten. Positionen der gepaart gedreht und nicht gedrehten Kerne (ca. 20 cm auseinander) sind gekennzeichnet durch Flaggen alle 2 m entlang fünf Transekte in der experimentellen Handlung befindet sich in einem Lychee-Hain (A). Hinweise auf die Störung der extraradical Myzel, die Reduzierung von N, P und Cu Aufnahme zeigt die chlorotische Pflanzen mit der Bezeichnung "gedreht" in Bgezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Unsere Ergebnisse bestätigen, dass unsere gedrehte Kern-Methode stark auf die Rolle der CMNs in unterirdischer Pflanze Interaktionen konzentrieren kann. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll, jedoch, die verändert, Potenzial, die Fähigkeit zu CMN Auswirkungen erkennen zu beeinflussen. Es ist entscheidend für die interstitielle Bereich umgebenden Behälter mit einem nährstoffarmen Medium zu füllen. In unserem erfolglosen, gedreht-Kern Ziel Pflanze Experiment mit Guave Baumsetzlingen, zwar gab es eine deutliche Reduktion der Wachstum in Anwesenheit beliebig vieler Nachbarn, keine Beeinflussung der CMNs unterirdischer Wettbewerb wurden erkannt, wahrscheinlich aufgrund der mineralische Nährstoffverfügbarkeit in die Töpfe. Im Gegensatz dazu sorgt die Verwendung eines nährstoffarmen Mediums zwischen gedrehte Kernen Hyphen erreichen müssen, ins benachbarte Container, die oft mit Hyphen und Wurzeln gefüllt sind (vor allem beim Arbeiten mit Wurzel-Intensive Gräser). Extraradical Hyphen in benachbarten Behältern so stehen in direktem Wettbewerb mit Wurzel-Systeme und müssen partitionieren mineralische Nährstoffe von solchen "Patches" unter den Pflanzen verbunden mit einem CMN erworben. Eine weitere kritische Komponente bei der Herstellung unterirdischer Interaktionen nachweisbar ist, oberirdische Wettbewerb zu vermeiden. Unser Guave-Experiment ergab, dass die Wirkung von zusätzlichen Boden Volumen Zugang deutlich, wenn die Ziel-Pflanzen keine Nachbarn hatten im wesentlichen beseitigt wurde, wenn Ziel Sämlinge von Nachbarn beschattet wurden. Verwendung von Gräsern, die meist vertikal wachsen oder einschränkende Sämling Blatt Kronen, um Überschneidungen zu vermeiden würde dazu beitragen, um oberirdische Interaktionen zu mildern.

Die Verwendung von etwas festen Behältern statt Netzbeutel, ist von entscheidender Bedeutung bei der Aufrechterhaltung einer langen Experiments mit Leichtigkeit neid'schen CMNs durch Rotation. Einen frühen Versuch ein CMN-Experiment, versuchen, ein Messer zwischen Mesh-Taschen, CMNs trennen ziehen nicht nur führte in beschädigten Säcken aus denen Wurzeln herausragen könnte aber auch schien Bodenbelüftung wiederum dramatisch verbesserte Pflanzenwachstum positiv zu erhöhen wenn CMNs wurden abgebrochen. Da die gedrehte Core-Ansatz sanft jeden Container in eine Invariante Position (Dank der unterstützenden Stellung Löcher an der Unterseite der Topf oder Mikrokosmos) bewegt, minimiert es umgebenden Substrat Störungen und mögliche Belüftung. Es ist jedoch unabdingbar, die Töpfe gründlich nach Drehung der Container wieder niedrige Fruchtbarkeit, interstitielle Sand Substrat um die Container eng wenden Sie sich an Wasser.

Die vorgeschlagenen gedrehte Kern-Methode kann in eine Reihe von Möglichkeiten zur Beantwortung eine Vielzahl von Fragen rund um das Funktionieren der CMNs und extraradical Myzelien geändert werden. Beispielsweise kann die Menge an Kohlenstoff für Wirtspflanzen CMNs bieten durch Schattierung10reduziert werden. Schatten Tuch umwickelt modifizierte Sämling Protektoren einzukreisen Einzelbehältnissen war erfolgreich bei Verringerung der Kohlenstoff-Bereitstellung CMNs und somit 15N Aufnahme von CMNs10. Darüber hinaus Bevölkerungsstruktur untersucht werden kann, in großen Mikrokosmen (Abbildung 1, D) bestehend aus vielen Pflanzen, jeweils in einem individuellen, gedrehte Behälter. Es ist wichtig, beachten jedoch, dass darauf geachtet werden muss, um Pseudoreplication41 zu vermeiden, wenn Sie dies tun. Einzelpflanzen sind sicherlich nicht "repliziert", weil sie nicht unabhängig von den anderen Pflanzen in einem Mikrokosmos. Stattdessen wird die gesamte experimentelle Einheit (Topf oder Mikrokosmos) replizieren, weshalb wir im Durchschnitt oder summierten Nachbar Anlagengrößen pro Topf vor dem Ausführen Analysen der Varianz oder lineare Regressionen verwendet.

Unser Ansatz kann für Feldstudien ausschließen Wurzelkonkurrenz und untersuchen den Einfluss des intakten CMNs geändert werden. Durch Substitution Behälter mit PVC Rohrstücke mit großen Löchern bedeckt mit Nylon Siebdruck mesh, gedrehte Adern widersteht rauen Feldbedingungen, wie das Soapberry-Experiment. Ähnlich wie bei unserer Guave Topfversuch, könnte jedoch die Wirkung der Durchtrennung potenzielle CMNs nicht unterschieden werden einfach zu beschränken das Boden Volumen aus dem mineralische Nährstoffen erworben werden konnten.

Unser Ansatz bietet einen kontrollierten, sorgfältigen Vergleich der Pflanzen Interaktion über CMNs versus Mykorrhiza Pflanzen, die nicht anhaltend (statt Pflanzen völlig fehlt Mykorrhizen) miteinander verbunden sind. Daher, es ahmt Aspekte der Natur, wie Sämlinge Beitritt etabliert CMNs sowie die Verwendung einer Reihe von AM-Pilze. Aktuelle Arbeit hat gezeigt, dass verschiedene AM Pilzarten unterschiedlicher Qualitätspartner für Pflanzen und, dass das Vorhandensein einer zweiten Art der AM Pilz auf eine Wurzel-System eine "unkooperativ" Pilzarten zu mehr Phosphor als Gegenleistung für hervorrufen können Kohlenstoff als allein auf das Wurzelsystem42. Darüber hinaus können verschiedene Arten von Pilzen Vorteile außer mineralischen Nährstoffen Erwerb, Gastgeber, wie Trockenheit und Salzgehalt Toleranz oder Schutz vor Krankheitserregern2Pflanzen bieten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der mit einer Suite von Pilzen, um CMNs. abweichend von seinem Realismus zu etablieren, eine auffällige Einschränkung unseres Ansatzes ist Experiment Dauer. Die Größe der Container oder PVC-Rohre begrenzt die Länge der Zeit, bis die Pflanzen Wurzeln gebunden werden und damit tendenziell Fokus auf nur Sämlinge oder junge Bäumchen zu beschränken. Dennoch geben wir, dass erhebliche Flexibilität bei der Gestaltung von Ziel-Anlage gedreht-Core Experimente, in denen eine oder beide Ziele und Nachbarn in einer Vielzahl von Möglichkeiten zu verstehen, die Rolle der CMNs manipuliert werden können.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir möchten die zwei anonymen Gutachtern für ihre Vorschläge bedanken. Wir danken auch die zahlreichen Studenten, die mit dem konstruieren Töpfe, Mikrokosmen, geholfen haben und Behälter gesteckt und haben, die mit Pflege und Ernte von Experimenten unterstützt. Wir danken auch North Central College für Start-up Mittel (JW) sowie aktuelle Einrichtungen und Ashley Wojciechowski für Erhalt einer North Central College Richter Finanzhilfe ein Experiment mit diesen Methoden zu unterstützen. Teil dieser Arbeit wurde durch ein National Science Foundation Doctoral Dissertation Verbesserung Grant (DEB-1401677) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) Stuewe and Sons, Inc Ray Leach Cone-tainer ™ RLC3U
Course glass beads Industrial Supply, Inc. 12/20 sieve Size #1
Course silica sand Florida Silica Sand 6/20 50lb bags None
Fine glass beads Black Beauty Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) BB-Glass-Fine
Hydrophobic membrane Gore-tex None None
Large commercial tubular seedling containers Stuewe and Sons, Inc. Deepot ™ D16L
Medium silica sand Florida Silica Sand 30/65 50 lb bags None
Nylon mesh Tube Lite Company, Inc. Silk screen LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER
Soil and foliar nutrient analysis facility Kansas State University Soil Testing Lab None None
Stable isotope core facility University of Miami None None

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References

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Weremijewicz, J., Janos, D. P. Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores. J. Vis. Exp. (145), e59338, doi:10.3791/59338 (2019).

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