Summary
Maggior parte delle piante all'interno delle comunità probabilmente sono collegati tra loro da funghi (AM) micorrizici arbuscolari, ma mediazione delle interazioni pianta da loro è stato studiato principalmente da coltivazione di piante con rispetto senza micorrize. Presentiamo un metodo per modificare reti mycorrhizal comuni tra piante micorrizate per indagare le conseguenze per le interazioni pianta.
Abstract
(AM) micorrizici arbuscolari influenzano la crescita e l'assorbimento dei nutrienti minerali della pianta, quindi, hanno il potenziale per influenzare le interazioni pianta. Il potere della loro influenza è in extraradical Miceli che si diffondono di là di zone di svuotamento nutriente nei pressi di radici di interconnettere, in definitiva, gli individui all'interno di una rete comune micorrizici (CMN). Maggior parte degli esperimenti, tuttavia, hanno studiato il ruolo dei funghi AM nelle interazioni pianta da coltivazione di piante con rispetto senza funghi micorrizici, un metodo che non riesce ad affrontare in modo esplicito il ruolo di CMNs. Qui, vi proponiamo un metodo che manipola CMNs per studiare il loro ruolo nelle interazioni pianta. Il nostro metodo utilizza modificate contenitori con fondo conico con una maglia di nylon e/o materiale idrofobico che coprono con intaglio aperture, il fertilizzante 15N e una sabbia interstiziale dei sostanza-poveri. CMNs sono lasciato sia intatto tra individui interagenti, interrotta mediante rotazione dei contenitori, o impedito formando una barriera solida. I nostri risultati suggeriscono che contenitori di rotazione è sufficiente per interrompere CMNs e impedire che i loro effetti sulle interazioni pianta su CMNs. Il nostro approccio è vantaggioso perché imita gli aspetti della natura, come piantine toccando in CMNs già stabilita e l'uso di una suite di funghi AM che può fornire diversi benefici. Anche se il nostro esperimento è limitato a indagare le piante nella fase del semenzale, interazioni pianta attraverso CMNs possono essere rilevati tramite il nostro approccio che quindi può essere applicato su questioni biologiche sul funzionamento di CMNs negli ecosistemi.
Introduction
(AM) micorrizici arbuscolari assistita piante nella colonizzazione della terra 460 milioni anni fa1 e oggi, sono simbionti onnipresente della maggior parte delle piante2, fornendo loro le sostanze nutrienti minerali vitali per la crescita. Le ife sottili, filiformi di funghi AM foraggio per nutrienti minerali di là di zone di svuotamento nutriente vicino radici, spesso incontrando e colonizzando i sistemi della radice delle vicine piante in una "rete micorrizici comune" (CMN). Reti mycorrhizal comuni possono formare anche quando germlings fungine join stabilito reti3, o quando sto IFE fusibile (anastomotizzare) con ife conspecifici4,5,6,7. La portata di queste ife extraradical nel terreno è enorme, con extraradical IFE che costituiscono il 20% al 30% della biomassa microbica del suolo totale nella prateria e terreni di pascolo8 e si estende per m·cm 111-3 in pascolo indisturbato9 .
Reti mycorrhizal comuni partizione nutrienti minerali tra interconnessi vicine piante10,11,12,13. Piante possono ricevere fino a 80% di loro fosforo e 25% del loro fabbisogno di azoto da funghi AM, fornendo al contempo fino al 20% del loro totale carbonio ai funghi in fisso ritorno14. Recente lavoro di cultura in vitro radice dell'organo ha trovato che CMNs preferenzialmente scambio di nutrienti minerali con radici di host che forniscono la maggior parte del carbonio ai funghi11,12. Inoltre, diverse specie di funghi AM possono differire nella loro qualità come partner simbiotico, con alcuni funghi lo scambio più fosforo per meno carbonio rispetto ad altri15. Anche se colture d'organo radice sono utili modelli per lo studio la simbiosi AM perché presentano ambienti accuratamente controllati e la possibilità di osservare direttamente le interconnessioni ifale, essi non includono fotosintesi germogli che interessano importanti processi fisiologici come la fotosintesi, traspirazione e variazioni diurne, anche come costituenti carbonio e minerali nutrienti affonda.
In natura, piantine più probabile attingere CMNs già stabilita. Fino a poco tempo, tuttavia, gli scienziati hanno solo esaminato l'impatto dei funghi AM sulla nutrizione delle piante da coltivazione di piante con e senza funghi AM, spesso con una singola specie di fungo AM. Anche se questo lavoro è stato tremendamente informativo alla nostra comprensione di micorrize arbuscolari, questo metodo ha trascurato il ruolo potenzialmente cruciale che CMNs possono avere nelle interazioni tra piante ospiti interconnessi. In particolare, piante che dipendono fortemente dai funghi AM per crescita interagiscono minimamente senza AM funghi16,17, possibilmente confondendo la nostra interpretazione delle interazioni di fungo-mediata AM quando utilizzato come 'controlli' per baseline riferimento.
Noi proponiamo un approccio ruotato-core per indagine sul ruolo di CMNs nelle interazioni pianta e strutturazione della popolazione. Il nostro approccio imita componenti della simbiosi AM in natura perché intere piante join stabilita che CMNs e tutte le piante sono coltivate con funghi AM. Rimuovendo le interazioni di radice, la nostra metodologia si concentra in particolare sulle interazioni mediate da funghi AM mentre si tracciano anche nutriente minerale movimento all'interno di CMNs. Il nostro approccio si basa sul precedente lavoro che ha utilizzato Core ruotati sia nel campo e in serra per capire AM funzionamento realisticamente.
Il metodo di base ruotato è stato stabilito nella letteratura come un metodo per manipolare le ife extraradical18,19,20,21, e ha avuto diverse reincarnazioni a seconda del suo scopo sopra negli ultimi due decenni. Inizialmente, i sacchetti della maglia o barriere permettendo in crescita di ife sono state utilizzate per fornire privo di radice scomparti per quantificare l'importo di ife micorrizici arbuscolari nel suolo22,23. Quindi, nuclei cilindrici di terreno racchiuso in tubi rigidi di acqua o di plastica della tubazione con slot coperto in una rete di nylon penetrabile da ife, ma non le radici, sono stati sviluppati. Questi potrebbe facilmente essere ruotati per interrompere Miceli extraradical18,24,25. I nuclei ruotati sono stati collocati tra piante e suolo ifale lunghezze per grammo di terreno18, 13C flussi di Miceli extraradical24, o l'assorbimento di fosforo dai nuclei di stabilimento-libera sono stati quantificati18. Un altro uso di tali nuclei era far crescere le piante all'interno di essi nel campo per ridurre la colonizzazione delle radici dai funghi AM attraverso frequenti interruzioni ifale come alternativa alla sterilizzazione o l'applicazione dei fungicidi, entrambi i quali hanno effetti indiretti sul suolo organico questione e altri microbi18.
L'approccio di barriera ifale maglia è stato utilizzato per indagare il partizionamento dei nutrienti e interazioni della pianta attraverso CMNs, ma in microcosmi rettangolari anziché con core ruotati. Walder et al.26 studiato le interazioni tra usitatissimum di Linum (lino) e sorgo bicolore (sorgo) tracciando nutrienti minerali per lo scambio di carbonio utilizzando isotopi attraverso CMNs di uno dei funghi AM Rhizophagus irregularis o Funneliformis mosseae26. I microcosmi nei propri scomparti di pianta studio comprendeva separati da mesh barriere, ifale scomparti accessibili solo ai hyphae micorrizici e con etichettate scompartimenti hyphal che conteneva gli isotopi radioattivi e stabili. Come controlli, lo studio utilizzato trattamenti senza funghi micorrizici. Canzone et al.27 usato un approccio simile per trovare quella pianta segnali potrebbero essere trasportati solo tra CMNs stabilito di F. mosseae quando una pianta è stata infettata da un agente patogeno fungoso. Inoltre, analogamente a Walder et al.26, Merrild et al.28 è cresciuto piante in singoli compartimenti separati da maglia per indagare le prestazioni dell'impianto delle piantine di Solanum lycopersicum (pomodoro) collegati da CMNs a un grande Cucumis sativus pianta (cetriolo) che hanno rappresentato una fonte di carbonio abbondante. Utilizzavano anche trattamenti senza funghi micorrizici invece di troncare CMNs28. In un esperimento in secondo luogo, correlato, carbonio per lo scambio di fosforo è stato esaminato usando sacchetti della maglia etichettati con 32P. microcosmi con maglia ifale barriere e CMN severing come trattamento sono state usate da Janos et al29, che ha studiato competitivo interazioni tra piantine delle specie arboree savana Eucalyptus tetrodonta e trapianti dell'albero della foresta pluviale, Litsea glutinosa. In quanto Studio, Janos et al.29 sollevato scomparti contenenti piantine di pochi centimetri, scorrevole strati di maglia uno contro l'altro per rompere le interconnessioni ifale29.
Il passaggio finale nell'evoluzione del metodo ruotato core è stato far crescere le piante all'interno di nuclei che sono all'interno di vasi o microcosmi20,30. Wyss30 utilizzato Core ruotati per accertare se il micelio AM extraradical potrebbe colonizzare semenzali di Pinus elliottii quando si diffondono da un donatore o pianta ospite 'infermiere' AM, Tamarindus indicae come extraradical micelio di ectomicorrizici funghi influenza le prestazioni del semenzale. Contenitori di grande commerciale semenzale tubolare (Tabella materiali) all'interno di microcosmi erano entrambi plastica solida (nessun CMNs) o fessurati e coperti con una membrana idrofobica. Con intaglio semenzale contenitori erano entrambi non ruotato (CMNs intatto) o ruotato per sever stabilito CMNs. ruotata nuclei con barriera di maglie di diverse dimensioni sono stati utilizzati da barretta et al.20 per indagare necromassa segnalazione attraverso CMNs tra Vicia FABA piante (fagiolo). Nel loro studio, una pianta centrale donatore in 30 cm diametro mesocosmi fu collegata da radici e IFE (nessuna barriera) o solo da CMNs stabilito attraverso una maglia di 40 μm. Impianti centrali furono recisi da interazioni con le piante vicine attraverso la rotazione dei nuclei racchiuso in maglia o CMNs sono stati impediti da una maglia fine 0,5 μm che racchiude il nucleo.
Qui, presentiamo un metodo che combina aspetti dei precedenti approcci ruotato-core per esaminare l'influenza di CMNs sulle interazioni pianta diretto combinato con l'analisi degli isotopi stabili. Il nostro metodo utilizza un approccio «impianto di destinazione», in cui la pianta centrale di interesse è circondata da piante vicine. Le piante sono coltivate all'interno di contenitori di semenzale ruotabile che sono fessurati e coperti con maglia di nylon del silk-screen, membrana idrofobica, o sono di plastica solida non modificato. Reti mycorrhizal comuni sono reciso una volta a settimana o mantenute intatte, e isotopi stabili 15N traccia il movimento di azoto da nuclei ruotato dei vicini all'impianto di destinazione centrale. Confrontando le dimensioni dell'impianto con assorbimento dell'isotopo stabile e nutrienti minerali, valutiamo quali piante possono beneficiare o soffrono di CMNs nelle interazioni tra piante ospiti.
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Protocol
1. costruzione e montaggio di nuclei ruotabile
- Modificare contenitori commerciali semenzale tubolare (successivamente chiamato 'contenitori'; Tabella materiali) per avere 19 mm di larghezza x aperture lunghezza 48cm.
- Utilizzando un trapano con un foro di 19 mm visto senza una punta centrale, pilota, taglia due fori, uno sopra l'altro, ai lati di un contenitore (diametro 2,5 cm x 12,1 cm di lunghezza) in modo che i fori sono circa 1 cm di distanza. Tenere il contenitore contro una recinzione sulla pressa di trivello e hanno una fermata con un breve tassello che si inserisce all'interno del contenitore per aiutare a tenerlo in posizione durante la perforazione. Utilizzare un contenitore di plastica flessibile per evitare fessurazioni.
- Tagliare il pezzo restante sottile di plastica tra i fori con forbici, un filo di lama o forbici (per plastica rigida utilizzare una sega a sciabola) per fare uno allungata apertura circa 2 cm di larghezza e 5 cm di lunghezza.
- Ripetere i passaggi da 1.1.1-1.1.2 sul lato opposto del contenitore.
- Non coprire le aperture con rete di nylon e/o membrana idrofobica (Figura 1A).
- Maglia di nylon con 40 μm pori tagliate a pezzi di 9,5 x 8,5 cm. Tagliare a pezzi come molti come ci sono contenitori.
- Incollare la rete di nylon esternamente su contenitori per coprire entrambe le aperture con qualche leggera sovrapposizione nel tessuto con colla a caldo ad alta resistenza, industriale.
- Se è necessaria la prevenzione del movimento dell'acqua, tali come quando si utilizza sostanze nutrienti solubili in acqua o isotopi stabili, coprire lo strato di maglia di nylon con una membrana idrofobica31,32 (Tabella materiali) che permette sono ife del fungo a Pass, ma solo il movimento del vapore acqueo e acqua non liquida.
- Posto la colla a caldo intorno alle aperture sul contenitore e lungo i bordi lunghi di maglia di nylon. Rotolare il contenitore sul tessuto per evitare di bruciare le dita. Aggiungere uno strato di colla lungo il bordo del tessuto dove la maglia bordi si sovrappongono. Premere il bordo su qualche cartone per sigillarlo con fermezza. Avvolgere sempre costantemente in una direzione che sarà la stessa direzione della rotazione dei contenitori finiti all'interno di vasi o microcosmi in modo che il bordo della mesh sovrapposte non sarà spinto a potenzialmente scavare nel substrato.
- Una volta che la colla si è raffreddata, nastro l'estremità superiore e inferiore del tessuto al contenitore per evitare bordi sciolti e ripping utilizzando un nastro flessibile, ad esempio un nastro da elettricista.
- Usando lo stesso nastro come al punto 1.2.5, coprire i piccoli fori sui lati dell'estremità conica (non il foro all'estremità della parte inferiore) di ciascun contenitore per prevenire la crescita di radice dal contenitore nel resto del vaso/microcosmo.
- Per evitare la perdita di terreno fornendo al drenaggio, pongono una biglia di vetro nella parte inferiore di ogni contenitore.
- Per un trattamento di controllo che non comporta alcun potenziale per un CMN a forma tra le piante, utilizzare contenitori solidi, non modificati (Figura 1A).
2. montaggio del POT o microcosmi per inserire le estremità coniche dei contenitori
- Affinché i contenitori in posizione verticale in posizione fissa e hanno corretto drenaggio, capovolgere una pentola in modo che il fondo è rivolto verso l'alto. Tagliare intorno alla parte inferiore della pentola, lasciando un piccolo labbro per il supporto, utilizzando una sega a sciabola.
- Preparazione di polistirene espanso
- Taglio polistirolo espanso, circa 36 mm di spessore, per lo stesso diametro del fondo della pentola utilizzando una sega a nastro con un jig circle-taglio.
- Eseguire i fori nella schiuma utilizzando una pressa di trivello e 19 mm foro visto (senza un trivello di torsione centrale) nel modello in cui saranno posizionati i contenitori.
- Per un esperimento di impianto di destinazione, un foro centrale con fori equidistanti per i vicini gli individui che lo circondano. Per una pentola con un diametro di cm 15,5, spazio sei fori 12 mm intorno alla circonferenza di un cerchio del diametro di 11 cm (Figura 1B).
- Stendere i fori hexagonally o in una matrice quadrata (Figura 1, D) per un esperimento di microcosmo.
3. riempimento dei contenitori e vasi con miscele di terra e sabbia
- Selezionare una miscela di terreno desiderato e aggiungere sto fungo campo-raccolte o coltivate in vaso inoculo al suolo mescolando uniformemente tritato pezzi di radice (1 – 2 cm di lunghezza) accuratamente con il terreno. Mischiare il terriccio desiderato con una infertile silice sabbia o perline di vetro per diminuire la concentrazione di nutrienti minerali disponibili alle piante.
- Posizionare i contenitori riempiti in schiuma o microcosmo fondo forato e riempire lo spazio interstiziale con un substrato infertile.
- Riempire lo spazio interstiziale tra contenitori con miscela di sabbia silicea di sostanza-poveri utilizzando un imbuto per assistere in piccoli spazi di riempimento. Per garantire un adeguato drenaggio e imitare la texture del terreno, mescolare sabbia di granulometria media, come grado 6-20, con sabbia di granulometria piccola, come grado 30-65, in una betoniera.
4. istituzione di CMNs tutto pentole/microcosmi
- Impianto di pretrattamento 'infermiere' piante delle specie desiderate in ogni contenitore a sostenere funghi AM affinché possano diffondersi tra i contenitori e stabilire CMNs.
- Quando tutti i contenitori hanno stabilito i semenzali, rimuovere germogli di ritaglio in modo che solo un individuo rimane in ogni contenitore.
- Consentire 2-3 mesi per la crescita delle piante e istituzione di CMN.
5. istituzione di impianti sperimentali e trattamenti
- Seminare piante sperimentali di semina o di trapianto in contenitori. Se la semina, attendere che tutti i contenitori hanno un semenzale germinato prima di rimuovere impianti di pretrattamento infermiera fissando il loro germogli. Se un trapianto, clip tutto pre-trattamento piante prima del trapianto sperimentale piantine per evitare effetti indesiderati competitivi.
- Stabilire trattamenti CMN o lasciando i contenitori non spostati per tutta la durata dell'esperimento (intatto CMNs) o ruotandole settimanale di recidere fisicamente IFE che si estende tra i contenitori modificati (CMNs mozzata; Figura 1A). Quando severing CMNs, ruotare ogni contenitore attraverso una rotazione completa per non alterare involontariamente interazioni aboveground, particolarmente per le piante ruderali.
- Acqua fortemente tutte le pentole o microcosmi immediatamente dopo la rotazione per ristabilire il contatto tra il substrato interstiziale e i lati dei contenitori.
6. il tracciamento del movimento dei nutrienti minerale attraverso CMNs
- Fertilizzare le piante vicine con 0,5% 15N arricchita KNO3 e NH4Cl.
- Fertilizzare l'individuo di destinazione con un fertilizzante 14N di pari concentrazione.
7. monitoraggio e manutenzione dell'esperimento
- Regolarmente (a almeno mensile) ri-randomizzare le posizioni dei vasi o microcosmi nel corso dell'esperimento.
- Settimanale misurare la crescita, come l'altezza o lunghezza (per erbe) più lunga foglia per monitorare quando crescita inizia a rallentare, perché è importante raccogliere prima le piante diventano radice-limite.
8. raccolta dell'esperimento
- Tutto il tessuto aboveground di clip e inserire singole piante in buste con etichettate che identificano il loro trattamento, pot o microcosmo e posizione.
- A secco aboveground tessuti a 60 ° C fino a peso costante. Misurare il peso a secco di ogni tessuto vegetale.
- Permetta che il terreno si asciughi prima di estrarre i contenitori e le radici di raccolta.
- Spazzolare delicatamente come molto del terreno come possibile da sistemi della radice e lavarli in una vaschetta d'acqua o sotto un leggero getto d'acqua su un setaccio di formato del poro di 250 micron.
- Consentire le radici asciugare e pesare l'intero sistema della radice.
- Il sistema della radice di clip a casaccio e memorizzare i frammenti di radice in etanolo al 50%. Dopo che si sono macchiati33, è possibile utilizzare questi frammenti per la quantificazione della colonizzazione di radice utilizzando il metodo di intersezione della griglia34.
- Ripesare il restante sistema di radice e riporlo in una busta di carta con etichetta asciugare a 60 ° C per la valutazione del peso secco. Utilizzare la seguente equazione per calcolare il peso dell'intero sistema di radice:
9. analisi isotopiche minerali nutrienti e stabile
- Raggruppare i semenzali di biomassa in "decili" o 10 gruppi, "octiles" o 8 gruppi, "quartili" o quattro gruppi, ecc dopo rango-ordinando loro di peso se la quantità di tessuto è troppo bassa per i requisiti minimi per la digestione determinare minerali nutrienti concentrazioni.
- Invia fogliari campioni ad un laboratorio contratto per analisi dell'isotopo stabile e nutrienti minerali (Tabella materiali).
- Descrivere abbondanza isotopica utilizzando la seguente espressione abituale:
dove R rappresenta il 15N /14N rapporto di un campione o dello standard che è n atmosferico. - Uso non modificato, trattamento solido contenitore per servire come un controllo per rapporti di 15N sfondo nella seguente equazione di bilancio di massa quando quantificare l'importo di 15N ripreso da un impianto di destinazione in reciso o intatto CMN trattamenti:
dove δ15N rappresenta l'abbondanza isotopica di obiettivi, i vicini e piante bersaglio in nessun trattamento CMN e x rappresenta (come frazione decimale) l'azoto delle percentuali ottenute dall'impianto di destinazione da contenitori vicino a cui è stato aggiunto l'etichetta. Valori di δ15Nvicini sono ottenuti per i vicini composte di ogni impianto di destinazione.
- Descrivere abbondanza isotopica utilizzando la seguente espressione abituale:
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Representative Results
Per determinare come CMNs possono influenzare le prestazioni dell'impianto tramite il partizionamento dei nutrienti, siamo cresciuti Andropogon gerardii Vitman, un'erba di prateria dominante, in un esperimento di pianta di destinazione con 6 vicini equidistanti e intatto, mozzata o nessun CMNs. Abbiamo trovato che severing o prevenire CMNs diminuita pesi a secco fuori terra di obiettivi (Figura 2), suggerendo che intatto CMNs promosso la crescita delle piante. Piante con CMNs mozzata e impedito CMNs in particolare ha risposto allo stesso modo ai loro trattamenti, suggerendo che la rotazione dei contenitori una volta a settimana è riuscita a mitigare gli effetti del CMNs. Il trattamento di CMN mozzato, tuttavia, può essere comodo come un controllo perché la rete di nylon (che era ricoperto da una membrana idrofobica in questo esperimento) nei trattamenti recisa ed intatti può influenzare la dinamica dell'acqua come il terreno di contenitori con intaglio (ruotato o non) essiccazione più rapidamente che in contenitori non modificato.
Concorrenza, in cui la crescita di un individuo sopprime la crescita di un altro nelle vicinanze di individuo, è stato rilevato nel trattamento CMN intatto ma non nella mozzata o trattamenti non CMNs. Abbiamo trovato che solo quando CMNs erano intatti era target e sommati prossimo dimensioni hanno un rapporto negativo come dimostrato da regressione lineare (Figura 3). La mozzata e trattamenti non CMNs non hanno differito da uno altro, e insieme, loro pendii non hanno differito significativamente da zero. Quindi, essi differiscono in modo significativo dal versante negativo del trattamento CMNs intatto (Figura 3). Inoltre, abbiamo trovato che i coefficenti di Gini, una misura di disuguaglianza di dimensione che varia da zero a uno in cui zero riflette una distribuzione di dimensioni perfettamente uguali, hanno differito da fra i trattamenti. Il trattamento di CMNs intatto ha avuto il più grande disuguaglianza10,35,36. Disuguaglianze di dimensione sono interessate dalla concorrenza all'interno delle popolazioni, specialmente quando grandi individui dominano acquisizione di risorse, quindi sproporzionato sopprimere la crescita di piccoli individui, noto anche come concorrenza asimmetrica37 , 38.
Se nutrienti minerali sono stati limitazione della crescita, e se CMNs contribuito a un'intensificazione della concorrenza per quelle sostanze nutrienti è stata determinata attraverso comparazioni di concentrazioni nel tessuto di minerali nutrienti foglia rispetto alle dimensioni della pianta. Di tutti i nutrienti minerali valutati, abbiamo trovato che solo concentrazioni nel tessuto di foglia Mn sono stati associati positivamente con i pesi a secco fuori terra di destinazione pianta sopra tutti i trattamenti, con nessuna differenza significativa tra pendii, suggerendo che potrebbe essere limitato Mn crescita tra tutti i trattamenti (Figura 4). Tuttavia, le elevazioni di linea di regressione, che suggeriscono differenze nelle concentrazioni medie fra i trattamenti, hanno risentite di CMN recisione e prevenzione. Dire le concentrazioni N fogliare non sono state colpite significativamente dai trattamenti di CMN, ma N concentrazione diminuita significativamente con aboveground peso di piante bersaglio, suggerendo un potenziale effetto di diluizione delle dimensioni dell'impianto su tessuto N39, a secco 40. Pertanto, N non era probabilmente il nutriente minerale limitazione della crescita nel nostro esperimento. In un altro esperimento simile, dire P fogliare era significativamente influenzata dal trattamento CMN, ma inoltre ha mostrato un effetto di diluizione rispetto per dimensione per le piante con intatto CMNs35delle piante.
Per esaminare se CMNs differenzialmente partizione nutrienti minerali fra gli individui interconnessi, abbiamo valutato il tessuto vegetale di destinazione per 15N nei tessuti fogliari rispetto alle dimensioni della pianta. Avevamo aggiunto 15N-etichetta solo ai contenitori di vicini di casa. Abbiamo trovato che piante bersaglio con intatto CMNs avevano più alte concentrazioni di 15N rispetto ad altri trattamenti di entrambi, che non hanno differito da uno altro (Figura 5A). Anche se il target del peso asciutto fuori terra è stata associata con la quantità di azoto ottenuto dai contenitori vicini rispetto ai trattamenti di CMNs reciso ed intatti, intatto CMNs aveva un pendio fortemente positivo, significativamente differente da quello del CMNs mozzata trattamento (figura 5B). Questi risultati indicano che le grandi piante, potenzialmente con abbondanti photosynthate, ottenuti più 15N da CMNs raggiungendo nella vicina contenitori che hanno fatto gli individui bersaglio piccolo. Anche i nostri risultati indicano che la membrana idrofobica ha evitato con successo l'acqua gratuita (e successivi 15N) movimento all'interno di vasi.
In un altro esperimento di pianta ruotato-core target, piantine di albero di guava (Psidium guajava) sono state coltivate in contenitori grandi semenzale incorporati all'interno di vasi di grandi dimensioni, e tutti (compresi i grandi vasi) sono stati riempiti con lo stesso suolo relativamente ricco di sostanze nutritive miscela. Quando CMNs furono recisi dalla rotazione in assenza dei vicini, crescita delle piante ha diminuito significativamente per la stessa dimensione come piante all'interno dei contenitori solidi, suggerendo che semplicemente ruotati piante avevano ridotto accesso al volume del terreno pieno di grandi vasi (Figura 6 ). Quando piante bersaglio avevano un numero qualsiasi dei vicini, dimensione dell'impianto è diminuito a dimensioni simili, e qualsiasi effetto statisticamente rilevabile di severing CMNs scomparso (Figura 6).
In un esperimento sul campo utilizzando ruotato-core con tubo in PVC, uno di noi studiato l'influenza del micelio extraradical sulle prestazioni dell'impianto in un esperimento sul campo con i semenzali Soapberry (Sapindus saponaria L.) (Figura 7). Anche se extraradical micelio oltre tubi ha avuto scarso effetto sulla crescita delle piante durante l'esperimento di tredici mesi, dividente e dalla rotazione dei tubi ridotto fogliare N, P e Cu concentrazioni sostanzialmente (da 25% o più).
Figura 1. Sperimentare l'installazione di contenitori in intatto, reciso, o controllo trattamenti (A), vasi in un impianto di destinazione sperimentare (B), o microcosmi con un layout quadrato o esagonale (C) (D) di contenitori. Macchie scure ovale su contenitori modificate sono un'apertura nel contenitore coperto con una maglia di nylon di 40 µm per i hyphae fungosi di penetrare (A). Reti mycorrhizal comuni rimangono intatte senza rotazione dei contenitori, sono reciso da rotazione o sono impedite di stabilire con un contenitore di plastica solido (A). In un esperimento di pentola pianta di destinazione, i contenitori possono essere inseriti in un fondo di schiuma che li posiziona (B). Per un esperimento del microcosmo, il fondo può da posato fuori in una matrice esagonale con sei equidistante, vicini per ogni 'target' individuale (C), o in una matrice quadrata con quattro più vicini e altri quattro, leggermente più distanti, diagonale vicini per ogni 'bersaglio' (D). Pannello B viene modificato da Weremijewicz et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Dire (± SE) aboveground e necromassa pesi (g) di destinazione Andropogon gerardii individui tra trattamenti micorrizici rete comuni a secco. Aboveground pesi a secco vengono visualizzati come valori positivi sopra l'ascissa e necromassa pesi a secco sono valori positivi sotto l'ascissa. Barre di peso a secco fuori terra sormontati dalla stessa lettera non differiscono dalla prova di post-hoc di Tukey onestamente differenza significativa alle ɑ = 0,05. Necromassa pesi a secco non hanno differito fra i trattamenti e così, non sono sormontati da lettere. Questa figura è stata modificata da Weremijewicz et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Prossimo totale (g) rispetto al bersaglio pianta aboveground peso a secco (g) per le piante di Andropogon gerardii . Piante con reti mycorrhizal comuni intatte (CMNs) sono rappresentati da triangoli scuri e una linea continua, con CMNs mozzata di quadrati grigi e una linea tratteggiata e con nessun CMNs di diamanti bianchi e una linea tratteggiata. Questa figura è stata modificata da Weremijewicz et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Pesi a secco fuori terra (g) di destinazione contro le concentrazioni di manganese fogliare (µg·g-1) di Andropogon gerardii. Piante con reti mycorrhizal comuni intatte (CMNs) sono rappresentati da triangoli scuri e una linea continua, con CMNs mozzata di quadrati grigi e una linea tratteggiata e con nessun CMN di diamanti bianchi e una linea tratteggiata. Questa figura è stata modificata da Weremijewicz et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 5. Δ15N (‰) ± SE di individui di destinazione Andropogon gerardii (A) con reti mycorrhizal comuni intatte (CMNs; barre nere), non Mozzate CMNs (barre grigie) e nessun CMN (barre bianche) e la percentuale azoto ottenuti dal suolo contenitore vicino dalle piante con CMNs intatto ambiente (triangoli) o tonalità (quadrati grigi) rispetto al target del peso asciutto fuori terra (g; B). bar sormontato dalla stessa lettera in pannello A non differiscono dalla prova di post-hoc di Tukey onestamente differenza significativa alle ɑ = 0,05. Queste figure vengono modificate da Weremijewicz et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Dire (± SE) aboveground e necromassa secco pesi (g) di destinazione Psidium guajava individui tra reti mycorrhizal comuni (CMNs) e trattamenti per il prossimo. Lungo l'ascissa, un nessun trattamento prossimo è rappresentato da "0N", un vicino di "1N", ecc., mentre un trattamento di controllo con nessun CMNs (inoculate contenitore solido e senza vicini) è rappresentato da leggera ombreggiatura e la lettera "C". Biomassa delle piante con intatto CMNs sono rappresentate da barre piene, mentre quelli con mozzata CMNs sono tratteggiate. Pesi a secco fuori terra sono indicati come valori positivi sopra l'ascissa e necromassa pesi a secco sono valori positivi sotto l'ascissa. Bar sormontato dalla stessa lettera non differiscono dalla prova di post-hoc di Tukey onestamente differenza significativa alle ɑ = 0,05. Aboveground e necromassa pesi a secco del trattamento controllo sono stati confrontati solo con trattamenti CMN recisa ed intatti con nessun vicini (indicato da lettere greche) perché il controllo non ha incluso i vicini come fattore supplementare nel trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 7. Estensione del metodo core ruotato per un esperimento sul campo (A) e 13 il mese-vecchio rappresentanza Sapindus saponaria L. piantine con intatta (non ruotata) e reciso reti mycorrhizal comuni (ruotate) (B). Tubi di cloruro di polivinile (9cm diametro x 20 cm di altezza) sono stati perforati con una sega per avere quattro fori di diametro di 5,3 cm in due coppie di opposte. I fori sono stati coperti con una rete di nylon serigrafato con 30 µm pori attraverso cui micelio extraradical potrebbe estendere sia da e verso i nuclei che sono stati riempiti con terreno dal sito d'impianto (A). Reti mycorrhizal comuni sono state mantenute intatti o mozzata di rotazione utilizzando una chiave a tubo grande. Posizioni di accoppiato ruotato e nuclei non ruotata (circa 20 cm di distanza) sono contrassegnati da bandiere ogni 2 m lungo cinque transetti nella trama sperimentale situata in un boschetto di Lychee (A). Prova della perturbazione del micelio extraradical riduzione di N, P e Cu assorbimento è indicato dalle piante chlorotic etichettate "ruotato" mostrato in B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I nostri risultati confermano che il nostro metodo di nucleo ruotato acutamente può concentrarsi sul ruolo di CMNs nelle interazioni pianta necromassa. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, tuttavia, che se alterati, hanno il potenziale di influenzare la capacità di rilevare gli effetti CMN. È fondamentale per riempire i contenitori circostante zona interstiziale con un mezzo di sostanza-poveri. Nel nostro esperimento infruttuoso, ruotato-core target di pianta con piantine di albero di guaiava, anche se c'era una profonda riduzione della crescita di destinazione in presenza di qualsiasi numero di vicini, senza effetti di CMNs necromassa concorrenza sono stati rilevati, probabilmente a causa delle disponibilità di nutrienti minerali in tutto le pentole. Al contrario, l'uso di un mezzo di sostanza-poveri tra ruotati core assicura che IFE devono raggiungere nella vicina contenitori che spesso sono riempiti con ife e radici (soprattutto quando si lavora con le erbe di radice-intensivo). IFE extraradical in contenitori vicini così in concorrenza diretta con sistemi della radice e devono partizione nutrienti minerali acquisite da tali 'patch' tra piante collegati ad un CMN. Un altro componente fondamentale nel rendere necromassa interazioni rilevabili è di evitare la concorrenza fuori terra. Il nostro esperimento di guava ha rivelato che l'effetto di accesso al volume di terreno supplementare evidente quando le piante di destinazione non avevano nessun vicini essenzialmente è stato eliminato quando piantine di destinazione erano all'ombra dei vicini. Utilizzando erbe che crescono verticalmente o il vincolo corone foglia semenzale per evitare sovrapposizione contribuirebbe a mitigare interazioni aboveground.
L'uso di contenitori un po' rigidi invece di sacchetti della maglia, è fondamentale per mantenere un lungo esperimento con facilità di abbandonare CMNs mediante rotazione. In un tentativo iniziale di un esperimento CMN, cercando di tirare un coltello tra borse della maglia per recidere CMNs provocato non solo borse danneggiate da cui radici potrebbero sporgere ma anche sembravano favorevole aumentare l'aerazione del suolo con conseguente crescita delle piante notevolmente migliorate quando CMNs furono recisi. Perché l'approccio di nucleo ruotato delicatamente si muove ogni contenitore in posizione invariabile (grazie al supporto fori posizione nella parte inferiore del pot o microcosmo), minimizza circostante substrato rottura e aerazione potenziale. È assolutamente critico, tuttavia, all'acqua accuratamente i vasi dopo la rotazione dei contenitori per restituire il sottostrato di sabbia bassa fertilità, interstiziale per contattare strettamente i contenitori.
Il metodo proposto ruotato core può essere modificato in un numero di modi per rispondere a una serie di domande riguardanti il funzionamento del CMNs ed extraradical Miceli. Ad esempio, la quantità di carbonio disponibile per piante ospiti fornire CMNs può essere ridotto di ombreggiatura10. Ombra panno avvolto intorno Protezioni di semenzale modificate per circondare singoli contenitori era riuscito a ridurre il carbonio di provisioning di CMNs e, quindi, l'assorbimento 15N da CMNs10. Inoltre, la struttura della popolazione possa essere studiato in microcosmi grandi (Figura 1, D) composto da molte piante, ciascuno in un singolo contenitore ruotato. È importante notare, tuttavia, che si deve prestare attenzione per evitare pseudoreplication41 quando farlo. Singole piante sono certamente non 'replica' perché non sono indipendenti delle altre piante in un microcosmo. Invece, l'intera unità sperimentale (pentola o microcosmo) è una replica, motivo per cui abbiamo usato vicino media o ammontano a taglie dell'impianto per vaso prima di eseguire l'analisi della varianza o regressioni lineari.
Il nostro approccio può essere modificato per studi sul campo escludere la concorrenza di radice e studiare l'influenza del CMNs intatto. Da contenitori di sostituzione con pezzi di tubo in PVC con fori di grandi dimensioni coperti con serigrafia in nylon mesh, ruotati core in grado di sopportare condizioni di campo duro, come l'esperimento Soapberry. Simile al nostro esperimento di pentola di guava, tuttavia, l'effetto di severing CMNs potenziali non potrebbe essere distinta da semplicemente limitando il volume di terreno da cui potrebbero essere acquistate nutrienti minerali.
Il nostro approccio fornisce un confronto controllato, attento delle piante che interagiscono attraverso CMNs contro piante micorrizate che non sono interconnessi con insistenza (invece di piante completamente carente micorrize). Quindi, imita gli aspetti della natura, come piantine unendo stabilito CMNs, nonché l'utilizzo di una suite di funghi AM. Recenti lavori hanno dimostrato che diverse specie di funghi AM può essere partner di diverse qualità di piante, e che la presenza di una seconda specie del fungo AM su un sistema della radice può indurre una specie di fungo 'Melina' per fornire più fosforo in cambio di carbonio rispetto a quando da solo sulla radice sistema42. Inoltre, diverse specie di funghi possono fornire prestazioni diverse dai nutrienti minerali acquisizione per piantare i padroni di casa, come la siccità e la salinità tolleranza o la protezione da agenti patogeni2. Questi risultati sottolineano l'importanza di utilizzare una suite di funghi per stabilire CMNs. nonostante il suo realismo, una limitazione cospicua del nostro approccio è durata dell'esperimento. Le dimensioni dei contenitori o tubi in PVC limitano la lunghezza del tempo prima che le piante diventano radice limitata e quindi tende a limitare la messa a fuoco a solo piantine o giovani alberelli. Tuttavia, ci sottomettiamo che c'è una notevole flessibilità nella progettazione di esperimenti ruotato-core target-pianta in cui uno o entrambi gli obiettivi e i vicini possono essere manipolati in una vasta gamma di modi per comprendere i ruoli di CMNs.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i due revisori anonimi per i loro suggerimenti. Ringraziamo anche i numerosi laureandi che hanno contribuito con la costruzione di vasi, microcosmi e fessurati contenitori e che hanno assistito con il mantenimento e la raccolta di esperimenti. Ringraziamo anche North Central College per avvio fondi (JW) e strutture attuali, come pure Ashley Wojciechowski per l'ottenimento di un esperimento utilizzando questi metodi di supporto una sovvenzione North Central College Richter. Parte di questo lavoro è stato finanziato da un National Science Foundation tesi miglioramento borsa di dottorato (DEB-1401677).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) | Stuewe and Sons, Inc | Ray Leach Cone-tainer ™ | RLC3U |
| Course glass beads | Industrial Supply, Inc. | 12/20 sieve | Size #1 |
| Course silica sand | Florida Silica Sand | 6/20 50lb bags | None |
| Fine glass beads | Black Beauty | Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) | BB-Glass-Fine |
| Hydrophobic membrane | Gore-tex | None | None |
| Large commercial tubular seedling containers | Stuewe and Sons, Inc. | Deepot ™ | D16L |
| Medium silica sand | Florida Silica Sand | 30/65 50 lb bags | None |
| Nylon mesh | Tube Lite Company, Inc. | Silk screen | LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER |
| Soil and foliar nutrient analysis facility | Kansas State University Soil Testing Lab | None | None |
| Stable isotope core facility | University of Miami | None | None |
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