Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Utredning av växt interaktioner mellan gemensamma utöka nätverk använder roteras kärnor

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59338
Automatic Translation
1,2, 2
1Department of Biology, North Central College, 2Department of Biology, University of Miami

Summary

De flesta växter inom samhällen sannolikt är sammankopplade med svampen utöka (AM) svampar, men medling växt interaktioner av dem har undersökts främst genom odling av växter med kontra utan mycorrhizas. Vi presenterar en metod för att manipulera gemensamma utöka nät bland utöka växter att undersöka deras konsekvenser för växt interaktioner.

Abstract

Svampen utöka (AM) svampar påverka växten mineral näringsupptag och tillväxt, därför de har potential att påverka växt interaktioner. Kraften i deras inflytande återfinns i extraradical mycelia som spridit sig bortom näringsmässig utarmning zoner nära rötterna för att slutligen interconnect individer inom ett gemensamt utöka nätverk (CMN). De flesta experiment, har dock undersökt rollen av AM svampar växt interaktioner av odling av växter med kontra utan utöka svampar, en metod som misslyckas att uttryckligen ta rollen som CMNs. Här föreslår vi en metod som manipulerar CMNs för att undersöka deras roll i växt interaktioner. Vår metod använder modifierade behållare med konisk botten med en nylon mesh eller hydrofoba materialet omfattar slitsade öppningar, 15N-gödselmedel och en näringsfattiga interstitiell sand. CMNs lämnas antingen intakt mellan samverkande individer, avhuggna genom rotation av behållare eller förhindras från att bilda av en solid barriär. Våra fynd tyder på att roterande behållare är tillräckligt för att störa CMNs och förhindra deras effekter på växt interaktioner mellan olika CMNs. Vår strategi är fördelaktigt eftersom det härmar aspekter av naturen, såsom plantor avlyssning till redan etablerade CMNs och användning av en svit av AM svampar som kan ge olika fördelar. Även om vårt experiment är begränsat till att undersöka växter på fröplanta scenen, kan växt interaktioner över CMNs upptäckas med våra förhållningssätt som därför kan tillämpas för att undersöka biologiska frågor om funktion av CMNs i ekosystem.

Introduction

Svampen utöka (AM) svampar biträtt växter i koloniseringen av mark 460 miljoner år sedan1 och idag, är de allestädes närvarande symbionter av de flesta växter2, att förse dem med viktiga mineral näringsämnen för tillväxt. De tunna, tråd-liknande hyfer AM svampar fodergrödor för mineraliska näringsämnen bortom näringsmässig utarmning zoner nära rötter, ofta möter och kolonisera rotsystem i angränsande växter i en ”gemensam utöka nätverk” (CMN). Gemensamma utöka nät också kan bilda när svamp germlings join etablerade nätverk3, eller när AM hyfer säkring (anastomose) med hawaiimonark hyfer4,5,6,7. Omfattningen av dessa extraradical hyfer i marken är enorm, med extraradical hyfer som utgör 20% till 30% av totala jord mikrobiella biomassan i prairie och betesmark jordar8 och stretching för 111 m·cm-3 i orörd gräsmark9 .

Gemensamma utöka nät partitionera mineral näringsämnen bland sammankopplade närliggande växter10,11,12,13. Växter kan få upp till 80% av deras fosfor och 25% av deras kväve krav från AM svampar, samtidigt som den ger upp till 20% av deras totala fast kol till svamparna i returnerar14. Senaste in vitro-roten orgel kulturarbete har funnit att CMNs prioriterat utbyter mineral näringsämnen med värd rötter som ger de flesta kol till svampar11,12. Dessutom olika arter av AM svampar kan skilja sig i deras kvalitet som symbiotiskt partner, med vissa svampar utbyta mer fosfor för mindre kol än andra15. Även om rot orgel kulturer är fördelaktigt modeller för att studera AM symbios eftersom de medför noggrant kontrollerade miljöer och förmågan att direkt Observera hyphal sammankopplingar, omfattar de inte photosynthesizing skott som påverkar viktiga fysiologiska processer såsom fotosyntes, transpiration och dagaktiva förändringar, såväl som som utgör kol och mineral näringsämne sjunker.

I naturen utnyttja plantor troligen redan etablerade CMNs. Tills nyligen, men har forskarna endast undersökt effekterna av AM svampar på växtnäring genom att odla växter med och utan AM svampar, ofta med en enda art av AM svamp. Även om detta arbete har varit oerhört informativ till vår förståelse av svampen mycorrhizas, har denna metod förbisett den potentiellt avgörande roll som CMNs kan ha i samspel mellan sammankopplade värdväxter. I synnerhet interagerar växter som är starkt beroende av AM svampar för tillväxt minimalt utan AM svampar16,17, möjligen confounding vår tolkning av AM svamp-medierade interaktioner när den används som ”kontroller' för baslinje referens.

Vi föreslår ett roterat-core tillvägagångssätt för utredning av CMNs roll i växt interaktioner och befolkningen strukturering. Vår strategi härmar komponenter i AM symbios i naturen eftersom hela växter join etablerade CMNs och alla växter odlas med AM svampar. Genom att ta bort roten interaktioner, fokuserar vår metodik specifikt på interaktioner medierade av AM svampar medan också spårning mineral näringsämnen rörlighet inom CMNs. Vår strategi bygger på tidigare arbete som har använt roterade kärnor både i fält och i växthuset för att förstå AM fungera realistiskt.

Metoden roterade core har etablerats i litteraturen som en metod att manipulera extraradical hyfer18,19,20,21, och det har haft flera reinkarnationer beroende på dess syfte över de senaste två decennierna. Inledningsvis, mesh väskor eller hinder så att i-tillväxt av hyfer användes för att ge rot-fria fack för att kvantifiera mängden svampen utöka hyfer i den jord22,23. Sedan, cylindriska kärnor av jord inneslutna i styv vattenledningar eller plast slangar med slots omfattas i nylon mesh genomträngliga av hyfer, men inte rötter, utvecklades. Dessa kunde enkelt roteras för att störa extraradical mycelia18,24,25. Roterade borrkärnorna placerades mellan växter och jord hyphal längder per gram jord18, 13C flöden extraradical mycelia24, eller fosfor upptaget från anläggningen kärnor var kvantifierade18. En annan användning av sådana kärnor var att odla växter inom dem i fältet för att minska kolonisering av rötter av AM svampar genom täta hyphal störningar som ett alternativ till sterilisering eller tillämpningen av fungicider, båda har indirekta effekter på mängden organiskt materia och andra mikrober18.

Metoden hyphal mesh barrier har använts för att undersöka näringsämne partitionerar och växt interaktioner över CMNs, men i rektangulära mikrokosmer istället för med roterade kärnor. Walder et al.26 undersökt samspelet mellan Linum usitatissimum (lin) och Sorghum bicolor (sorghum) genom att spåra mineral näringsämne för kol exchange med isotoper över CMNs av antingen av AM svampar Rhizophagus irregularis eller Funneliformis mosseae26. Mikrokosmos i deras studie omfattade växt fack åtskilda av mesh hinder, hyphal fack endast tillgänglig för utöka hyfer och märkta hyphal fack som innehöll radioaktiva och stabila isotoper. Som kontroller används studien behandlingar utan utöka svampar. Låt et al.27 används ett liknande tillvägagångssätt för att hitta fabriken signaler kunde bäras endast bland etablerade CMNs av F. mosseae när en växt var infekterad av svamp patogener. Också, likaså till Walder et al.26, Merrild et al.28 växte växter i enskilda delområden avgränsade med mesh för att undersöka anläggningens prestanda av Solanumlycopersicum (tomat) plantor kopplade av CMNs till en stor Cucumis sativus (gurka) växt som representerade en riklig kolkälla. De använde även behandlingar utan utöka svampar istället för att bryta CMNs28. I en andra, närstående experiment, kol för fosfor exchange undersöktes med hjälp av mesh väskor märkta med 32s. mikrokosmos med hyphal mesh hinder och CMN severing som behandling användes av Janos et al.29, som undersökt konkurrenskraftiga interaktioner mellan plantor av savanna trädslag Eucalyptus tetrodonta och transplantationer av regnskogen träd, Litsea glutinosa. I denna studie, Janos et al.29 lyfte fack som innehåller plantor några centimeter, rörligt lager av mesh mot varandra för att bryta hyphal sammankopplingar29.

Det sista steget i utvecklingen av metoden roterade kärna har varit att odla växter släpper kärnor som ligger inom krukor eller mikrokosmer20,30. Wyss30 används roterade kärnor för att få klarhet om extraradical AM mycel kan kolonisera Pinus elliottii plantor när de sprids från en givare eller 'sjuksköterska' AM värdväxt, Tamarindus indicaoch hur extraradical mycel av ectomycorrhizal svampar påverkar plantan prestation. Stora kommersiella tubulär fröplanta behållare (Tabell för material) i mikrokosmos var antingen fast plast (ingen CMNs) eller slitsade och täckt med en vattenavvisande membran. Slitsade fröplanta behållare var antingen inte roterade (intakt CMNs) eller roteras för att bryta etablerade CMNs. roterad kärnor med olika maskstorlek barriär storlekar användes av Babikova et al.20 för att undersöka belowground signalering via CMNs bland Vicia faba (bönor) växter. I deras studie, var en central givare växt i 30 cm diameter mesokosmosstudier sammankopplade genom rötter och hyfer (inget hinder) eller endast CMNs kan fastställas genom en 40 μm mesh. Centrala växter var avskurna från interaktioner med närliggande växter genom rotation av mesh-inneslutna kärnor eller CMNs förhindrades av en finmaskig 0,5 μm omsluter kärnan.

Här presenterar vi en metod som kombinerar aspekter av tidigare roterat-core metoder att undersöka påverkan av CMNs på direkt växt interaktioner kombinerat med stabil isotop spårning. Vår metod använder en 'mål växt' tillvägagångssätt, där centrala växten av intresse är omgiven av närliggande växter. Växter odlas inuti vridbar fröplanta behållare som är slitsade och täckt med nylon silk-avskärma mesh, hydrofoba membran, eller är icke-modifierade fast plast. Gemensamma utöka nät är avhuggna en gång i veckan eller hålls intakt, och 15N stabila isotoper spåra förflyttningarna av kväve från grannars roterade kärnor till den centrala mål anläggningen. Genom att jämföra växt storlek med mineral näringsämnen och stabil isotop upptag kan bedöma vi vilka växter kan gynna eller lider av CMNs i samspel mellan värdväxter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion och montering av vridbar kärnor

  1. Ändra kommersiella tubulär fröplanta behållare (senare kallad 'behållare'; Tabell över material) att ha 19 mm bred x 48 cm längd öppningar.
    1. Med en borr-press med en 19 mm hål såg utan en central, pilot twist drill, skär två hål, en ovanför annat, i sidorna av en behållare (2,5 cm diameter x 12,1 cm längd) så att hålen är ca 1 cm isär. Håll behållaren mot ett staket på drill press och har ett stopp med en kort dowel som passar inuti behållaren för att hålla den på plats under borrningen. Använda en behållare med flexibel plast för att förhindra sprickbildning.
    2. Skär den återstående tunn plastbit mellan hålen med sax, en Avbitartång eller tenn snips (för styv plast använder en sabel-såg) avlång för att göra en öppning ca 2 cm breda och 5 cm lång.
    3. Upprepa steg 1.1.1, 1.1.2 på motsatta sidan av behållaren.
  2. Täcka slots med nylon mesh eller hydrofoba membran (figur 1A).
    1. Skär nylon mesh med 40 μm porer i 9,5 x 8,5 cm bitar. Skär så många bitar som det finns behållare.
    2. Limma den nylon mesh externt på behållarna att täcka båda öppningarna med viss liten överlappning i tyg med hög hållfasthet, industriell Varmlimma.
    3. Om förebyggande av vatten rörelse behövs, är sådan som när du använder vattenlösliga näringsämnena eller stabila isotoper, täcka nylon mesh lagret med en vattenavvisande membran31,32 (Tabell för material) som tillåter svampen hyfer till pass, men endast förflyttning av vattenånga och inte flytande vatten.
    4. Placera den varmt lim runt öppningar på behållaren och längs långsidorna av nylon mesh. Rulla behållaren på tyget för att undvika att bränna fingrarna. Lägg ett lager med lim längs tygets kant där maskorna kanter överlappning. Tryck på kanten på lite kartong till fast försegla den. Alltid rulla konsekvent i en riktning som kommer att vara samma riktning av de färdiga behållarna i krukor eller mikrokosmer rotation så att överlappande mesh kanten inte pressas att potentiellt gräva i substratet.
    5. När limmet har svalnat, tejpa topp och botten ändarna av tyget till behållaren för att förhindra att lösa kanter och rippning med en flexibel tejp, såsom El-tejp.
  3. Använder samma band som i steg 1.2.5, täcka de små hålen på sidorna av koniska slutet (inte hålet på spetsen av botten) av varje behållare att förhindra rottillväxt ur behållaren i resten av potten/mikrokosmos.
  4. Förhindra förlust av jord samtidigt som dräneringen, placera glas marmor i botten av varje behållare.
  5. För en kontroll-behandling som inte involverar någon potential för en CMN till form mellan växter, använda solid, omodifierade behållare (figur 1A).

2. montering av krukor eller mikrokosmer att passa koniska ändar av behållarna

  1. Att säkerställa behållare stå upprätt i en fast position och har ordentlig dränering, vänd av en pott så att botten är vänd uppåt. Skär runt botten av potten, lämnar en liten läpp för support, med hjälp av en sabel-såg.
  2. Förberedelse av styrencellplast
    1. Skär polystyrenskum, ca 36 mm tjock, till samma diameter som botten av krukan med en bandsåg med en cirkel-skärning jigg.
    2. Borra hål i skummet med en drill press och 19 mm hål såg (utan en central twist drill) i mönstret som behållarna kommer att placeras.
    3. För ett mål växt experiment, borra ett hål i mitten med jämnt fördelade hål för angränsande individer som omger den. För en pott med 15,5 cm diameter hål utrymme sex 12 mm mellanrum runt omkretsen av en 11 cm diameter cirkel (figur 1B).
    4. Lägg ut hålen hexagonally eller i en kvadratisk matris (figur 1 c, D) för ett mikrokosmos experiment.

3. fyllning av behållare och krukor med jord och sand blandningar

  1. Välj en önskad jordblandningen och Lägg är svampen fält-samlas in eller pot-odlade inokulum till jorden genom att enhetligt blanda hackad rot bitar (1 – 2 cm lång) grundligt med jorden. Blanda önskad jorden med en infertila silica sand eller glaskulor för att sänka koncentrationen av mineral näringsämnen tillgängliga för växter.
  2. Placera de fyllda behållarna i borrade skum eller mikrokosmos botten och fylla interstitiell utrymme med en infertila substrat.
  3. Fyll interstitiell utrymmet mellan behållare med näringsfattiga kiselsand blandning med hjälp av en tratt för att hjälpa fylla små utrymmen. För att säkerställa tillräcklig dränering och efterlikna strukturen på smutsa, blanda medium partikelstorlek sand, såsom 6-20 grad, med liten partikelstorlek sand, såsom 30-65 klass, i en cementblandare.

4. fastställande av CMNs i hela krukor/mikrokosmos

  1. Plantera förbehandling ”sjuksköterska” växter av önskad art i varje behållare att upprätthålla AM svampar så att de kan spridas bland containrarna och fastställa CMNs.
  2. När alla behållare har etablerade plantor, bort skott genom klippning så att endast en person kvar i varje behållare.
  3. Låt 2-3 månader för växternas tillväxt och CMN etablering.

5. etablering av experimentanläggningar och behandlingar

  1. Sow experimentanläggningar genom sådd eller omplantering i behållare. Om sådd, vänta tills alla behållare ha en grodda fröplanta innan du tar bort förbehandling sjuksköterska växter av klippning sina skott. Om omplantering, klipp alla förbehandling växter innan omplantering experimentella plantor för att förhindra oavsiktliga effekter.
  2. Upprätta CMN behandlingar genom att antingen lämna behållarna inte flyttas under experimentet (intakt CMNs) eller rotera dem varje vecka att fysiskt bryta hyfer utvidgning bland de modifierade behållarna (avhuggna CMNs; Figur 1A). När bryta CMNs, rotera varje behållare genom en full rotation för att undvika att oavsiktligt ändra aboveground interaktioner, särskilt för heliotropic växter.
  3. Tungt vatten alla krukor eller mikrokosmer omedelbart efter rotation för att återupprätta kontakten mellan interstitiell substrat och sidorna av behållare.

6. spårning av mineral näringsämnen rörlighet över CMNs

  1. Gödslar närliggande växter med 0,5% 15N berikad KNO3 och NH4Cl.
  2. Gödsla mål individen med en 14N gödselmedel lika koncentration.

7. övervakning och underhåll av experiment

  1. Regelbundet (på minst månadsvis) åter randomize positionerna av krukor eller mikrokosmer under loppet av experimentet.
  2. Varje vecka mäta tillväxt, såsom höjd eller längsta blad längd (för gräs) för att övervaka när tillväxten börjar sakta, eftersom det är viktigt att skörda innan växterna blir rot-bundna.

8. skörden av experimentet

  1. Klipp alla aboveground vävnad och placera enskilda växter i märkta kuvert som identifierar deras behandling, kruka eller mikrokosmos och position.
  2. Torra aboveground vävnader vid 60 ° C till konstant vikt. Mät på torr vikt varje växtvävnad.
  3. Låt jorden torka innan utvinna behållarna och skörd rötterna.
  4. Borsta försiktigt bort så mycket jord som möjligt från rotsystem och tvätta dem i en kastrull vatten eller under en skonsam ström av vatten på en sil med 250 micron porstorlek.
  5. Låt rötterna för att lufttorka och väger hela rotsystemet.
  6. Klipp rotsystemet måfå och lagra roten fragment i 50% etanol. När de är färgade33, använda dessa fragment för kvantifiering av roten kolonisation med den stödlinje korsning metod34.
  7. Re väger återstående rotsystemet och förvara den i en märkt papper kuvert torka vid 60 ° C för bedömning av torrvikt. Använd följande ekvation för att beräkna vikten på hela rotsystemet:

Equation 1

9. mineral näringsämnen och stabil isotopanalyser

  1. Gruppera plantor av biomassa i ”decilerna” eller 10 grupper, ”octiles” eller 8 grupper, ”kvartiler” eller fyra grupper, etc. efter rang-beställning dem av vikt om vävnad kvantiteten är för låg för minimikrav för matsmältningen att bestämma mineral näringsämne koncentrationer.
  2. Skicka foliar prover till ett kontrakterade laboratorium för mineraliska näringsämnen och stabil isotopanalyser (Tabell för material).
    1. Beskriva isotopiska överflöd med hjälp av följande sedvanliga uttrycket:
      Equation 1
      där R betecknar den 15N /14N kvot av ett prov eller av standarden som är atmosfäriska N.
    2. Använd den icke-modifierade, fast behållare behandling att tjäna som en kontroll för bakgrunden 15N nyckeltal i följande massbalans ekvation när kvantifiera mängden 15N tas upp av en target växt i avhuggna eller intakt CMN behandlingar:
      Equation 1
      där δ15N representerar det isotopiska överflödet av mål, grannar och målet växter för ingen CMN behandling och x representerar (som en decimal bråk) procent kväve erhålls genom target växten från granne behållare där etiketten lagts. Värden för δ15Ngrannar erhålls för varje mål växtens blandats grannar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att avgöra hur CMNs kan påverka anläggningens prestanda genom näringsämnen partitionering, växte vi Conopsea gerardii Vitman, en dominerande prairie gräs, i ett mål växt experiment med 6 jämnt fördelade grannar och intakt, avhuggna, eller ingen CMNs. Vi hittade att bryta eller förhindra CMNs minskade mål aboveground torr vikter (figur 2), vilket tyder på att intakt CMNs främjas växters tillväxt. Växter med avhuggna CMNs och förhindrade CMNs reagerade framför allt på samma sätt som deras behandlingar, vilket tyder på att rotationen behållare en gång i veckan var framgångsrika i att mildra effekterna av CMNs. Avhuggna CMN behandling, men kan vara att föredra som kontroll eftersom den nylon mesh (som var övertäckt av ett vattenavvisande membran i detta experiment) i både intakta och avhuggna behandlingar kan påverka vatten dynamik som smutsa av slitsade behållare (roterat eller inte) torkar snabbare än i icke-modifierade behållare.

Konkurrens, där tillväxten av en individ dämpar tillväxten av en annan närliggande individ, upptäcktes i intakt CMN behandling men inte i den avhuggna eller inga CMNs behandlingar. Vi hittade att endast när CMNs var intakt mål och summerade granne storlekar har ett negativt samband framgår av linjär regression (figur 3). Den avhuggna och inga CMNs behandlingar skiljer sig inte från varandra, och tillsammans, deras backar skilde sig inte signifikant från noll. Därför de avsevärt skilde sig från negativa lutningen av intakt CMNs behandling (figur 3). Vi fann dessutom att Gini koefficienter, ett mått på storleken ojämlikhet som sträcker sig från noll till en i vilken noll återspeglar en perfekt lika storlek distribution, varierade mellan behandlingar. Intakt CMNs behandling hade den största ojämlikhet10,35,36. Ojämlikhet i storlek påverkas av konkurrensen inom populationer, särskilt när stora individer dominerar resurs förvärvet, därmed oproportionerligt undertrycka tillväxten av små individer, även känd som asymmetriska konkurrens37 , 38.

Om mineral näringsämnen var tillväxten-begränsa och CMNs bidrog till bestämdes hårdnande konkurrens för dessa näringsämnen genom jämförelser av mineral näringsrika blad vävnad koncentrationer kontra anläggningen storlek. Av alla mineral näringsämnen bedömas, fann vi att endast Mn leaf vävnad koncentrationer var positivt associerade med målet växt aboveground torr vikter över alla behandlingar, med inga signifikanta skillnader bland backarna, tyder på att Mn kan ha begränsad tillväxt bland alla behandlingar (figur 4). Dock påverkades regression fodrar höjder, som föreslår att skillnader i genomsnittliga koncentrationer bland behandlingar, CMN severing och förebyggande. Menar foliar N koncentrationer påverkades inte signifikant av CMN behandlingar, men halten N minskade signifikant med aboveground torrvikt av målet växter, vilket tyder på en potential 'utspädning effect av anläggningen storlek på vävnad N39, 40. N var därför inte sannolikt tillväxt-begränsa mineral näringsinnehållet i vårt experiment. I en annan liknande experiment, menar foliar P var påverkas signifikant av CMN behandling, men visade också en utspädningseffekt jämfört med plantera storlek för växter med intakt CMNs35.

För att undersöka om CMNs differentially partitionera mineral näringsämnen bland sammankopplade individer, bedömde vi växt målvävnaden för 15N i leaf vävnader kontra anläggningen storlek. Vi hade lagt 15N-etikett endast till grannar behållare. Vi fann att målet växter med intakt CMNs hade högre 15N koncentrationer jämfört med båda andra behandlingar, som inte skiljer sig från varandra (bild 5A). Även om målet aboveground torrvikt var associerade med mängden kväve som erhålls från grannars behållare under både intakta och avhuggna CMNs behandlingar, hade intakt CMNs en starkt positiv, betydligt annorlunda lutning från det av de avhuggna CMNs behandling (figur 5B). Dessa resultat tyder på att stora växter, potentiellt med riklig photosynthate, erhålls fler 15N från CMNs att nå in i angränsande behållare än gjorde små mål individer. Våra resultat tyder också på att hydrofoba membranet framgångsrikt förhindrat gratis vatten (och efterföljande 15N) rörlighet inom krukor.

I ett annat roteras-core mål växt experiment, guava (Psidium guajava) trädplantor odlades i stora plantor behållare inbäddade i stora krukor och alla (inklusive stora krukor) fylldes med samma relativt näringsrika jord blandning. När CMNs var avskurna genom rotation i avsaknad av grannar, växters tillväxt avsevärt minskas till samma storlek som växter inom fast behållare, vilket tyder på att roterad växter helt enkelt hade minskad tillgång till full jord volymen av de stora krukorna (figur 6 ). När målet växter hade ett antal grannar, anläggningen storlek minskade till liknande storlekar, och några statistiskt påvisbara effekten av severing CMNs försvann (figur 6).

I ett fältförsök med roteras-kärnor tillverkade av PVC-rör, undersökt en av oss påverkan av extraradical mycel på anläggningens prestanda i ett fältförsök med Soapberry (Sapindus saponaria L.) plantor (figur 7). Även om extraradical mycel bortom rör hade liten effekt på växters tillväxt under tretton månaders experimentet, minskas bryta det genom rotation av rören foliar N, P och Cu koncentrationer betydligt (med 25% eller mer).

Figure 1
Figur 1. Experimentera setup av containrar i intakt, avhuggna, eller kontroll behandlingar (A), krukor i en mål-växt experimentera (B) eller mikrokosmos med sexkantiga (C) eller rektangulär (D) layouten av containrar. Mörka ovala fläckar på modifierade behållare är en öppning in i behållaren täckt med en 40 µm nylon mesh för svamp hyfer penetrera (A). Gemensamma utöka nät förblir intakta med ingen rotation av behållarna, undertrckande vid rotation eller hindras från att upprätta med en solid plastbehållare (A). I ett mål växten potten experiment, kan containrar placeras in i en skum botten som placerar dem (B). För ett mikrokosmos experiment, kan botten genom lade ut i en hexagonala matris med sex ekvidistanta, närmaste grannar för varje 'mål' enskilda (C) eller i en kvadratisk matris med fyra närmaste grannar och ytterligare fyra, något mer avlägsen, diagonal grannar för varje 'mål' (D). Panel B ändras från Weremijewicz et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Menar (± SE) aboveground och belowground torr vikt (g) av målet Conopsea gerardii individer bland vanliga utöka nätverket behandlingar. Aboveground torr vikter visas som positiva värden ovanför x-axeln och belowground torr vikter är positiva värden under x-axeln. Aboveground torrvikt barer toppas av samma bokstav skiljer sig inte av Tukeys ärligt signifikant skillnad post hoc- test på ɑ = 0,05. Belowground torr vikter skilde sig inte mellan behandlingar och således är inte toppas av bokstäver. Denna siffra är modifierad från Weremijewicz et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Totala granne (g) kontra målet växt aboveground torr vikt (g) för Conopsea gerardii växter. Växter med intakt gemensamma utöka nät (CMNs) representeras av mörka trianglar och en heldragen linje, med avhuggna CMNs av grå rutor och en streckad linje och ingen CMNs av vita diamanter och en prickad linje. Denna siffra är modifierad från Weremijewicz et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Rikta aboveground torr vikt (g) kontra foliar mangan koncentrationer (µg·g-1) av Conopsea gerardii. Växter med intakt gemensamma utöka nät (CMNs) representeras av mörka trianglar och en heldragen linje, med avhuggna CMNs av grå rutor och en streckad linje, och med ingen CMN genom vita diamanter och en prickad linje. Denna siffra är modifierad från Weremijewicz et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Δ15N (‰) ± SE målet Conopsea gerardii individer (A) med intakt gemensamma utöka nät (CMNs, stång), avhuggna CMNs (grå staplar), och ingen CMN (vita staplar) och procent kväve, erhållet från granne behållare jord av växter med intakt CMNs i omgivande sol (trianglar) eller skugga (grå rutor) kontra målet aboveground torrvikt (g; (B). barer toppas av samma bokstav i panel A skiljer sig inte av Tukeys ärligt signifikant skillnad post hoc-test på ɑ = 0,05. Dessa siffror ändras från Weremijewicz et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Menar (± SE) aboveground och belowground torr vikt (g) av målet Psidium guajava individer bland vanliga utöka nätverk (CMNs) och granne behandlingar. Längs x-axeln, en ingen granne behandling representeras av ”0N”, en granne genom ”1N”, etc., medan en kontroll behandling med ingen CMNs (inokulerade fast behållare och inga grannar) representeras av ljus skuggning och bokstaven ”C”. Biomassa av växter med intakt CMNs representeras av solid barer, medan de med avhuggna CMNs är hachured. Aboveground torr vikter visas som positiva värden ovanför x-axeln och belowground torr vikter är positiva värden under x-axeln. Barer som toppas av samma bokstav skiljer sig inte av Tukeys ärligt signifikant skillnad post hoc- test på ɑ = 0,05. Aboveground och belowground torr vikter av kontroll behandling jämfördes endast med intakt och avhuggna CMN behandlingar med inga grannar (indikeras av grekiska bokstäver) eftersom kontrollen inte innehöll grannar som ytterligare en faktor i behandlingen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Förlängning av metoden roterade core till ett fältförsök (A) och representativa 13-månad-gammal Sapindus saponaria L. plantor med intakt (inte roterat) och avhuggna (roterat) gemensamma utöka nät (B). Polyvinylklorid rör (9 cm diameter x 20 cm höjd) borrades med en hål-såg att ha fyra 5,3 cm diameter hål två emot parvis. Hålen täcktes med en nylon silk-avskärma mesh med 30 µm porer genom vilken extraradical mycel kan förlänga både från och till kärnor som fylldes med jord från webbplatsen plantering (A). Gemensamma utöka nät hölls intakt eller avhuggna genom rotation med hjälp av en stor rörtång. Ståndpunkter paras roterade och icke-roteras kärnor (ca 20 cm mellanrum) markeras av flaggor varje 2 m längs fem sprickbildningsområde i experimental tomt ligger i en Litchi grove (A). Tecken på störningar av extraradical mycel minska N, P och Cu upptag framgår av chlorotic växterna märkt ”roterade” visas i B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Våra resultat bekräftar att vår roterade core metod kraftigt kan fokusera på rollen som CMNs i belowground växt interaktioner. I området i närheten finns det flera kritiska steg i protokollet, dock som om ändrats, har potential att påverka förmågan att upptäcka CMN effekter. Det är viktigt att fylla interstitiell området omgivande behållarna med näringsfattiga medium. I vår misslyckade, roteras-core mål växt experiment med guava trädplantor, även om det var en markant minskning av målet tillväxt i närvaro av ett antal grannar, observerades inga effekter av CMNs på belowground konkurrensen upptäckt, förmodligen på grund av mineraliska näringsämnen tillgänglighet i hela krukor. Däremot garanterar användningen av näringsfattiga medium mellan roterade kärnor att hyfer måste nå in i angränsande behållare som ofta fylls med både hyfer och rötter (speciellt när man arbetar med root-intensiva gräs). Extraradical hyfer i angränsande behållare således direkt konkurrerar med rotsystem och måste partitionera mineral näringsämnen förvärvats från sådana 'fläckar' bland växter ansluten till en CMN. En annan viktig komponent i att göra belowground interaktioner kan upptäckas är att undvika aboveground konkurrens. Vårt guava experiment visade att effekten av ytterligare jord volymåtkomst uppenbart när målet växterna hade inga grannar i huvudsak blev utslagen när målet plantor var skuggad av grannar. Med hjälp av gräs som mestadels växer lodrätt eller begränsande fröplanta leaf kronor att förhindra överlappning skulle bidra till att mildra aboveground interaktioner.

Användning av något styv behållare i stället för mesh väskor, är kritiska för att upprätthålla en lång experiment med användarvänlighet bryta CMNs genom rotation. I ett tidigt försök på en CMN experiment, försöker dra en kniv mellan mesh väskor att bryta CMNs inte bara resulterat i skadade väskor som rötter kunde sticka ut men också tycktes gynnsamt öka jord luftning vilket resulterar i dramatiskt förbättrad växternas tillväxt när CMNs var ogiltiga. Eftersom metoden med roterade core flyttar försiktigt varje behållare i ett invariant position (tack vare stödjande position hålen längst ned i potten eller mikrokosmos), minimerar det omgivande substrat störningar och potentiella luftning. Det är dock helt avgörande, att grundligt vatten krukor efter rotationen av behållare att återvända låg-fertilitet, interstitiell sand substrat för att nära kontakta behållarna.

Den föreslagna rotera core-metoden kan ändras i ett antal sätt att besvara en rad frågor angående funktion CMNs och extraradical mycelia. Exempelvis kan mängden kol tillgänglig för värdväxter att tillhandahålla CMNs minskas genom skuggning10. Skugga duk virad runt modifierade fröplanta beskyddare att omringa enskilda behållare lyckades minska kol etablering till CMNs och thus, 15N upptag från CMNs10. Dessutom befolkningsstruktur kan undersökas i stora mikrokosmos (figur 1 c, D) bestående av många växter, var och en i en individuell, roterade behållare. Det är viktigt att Observera dock att försiktighet måste iakttas för att undvika pseudoreplication41 när du gör detta. Enskilda växter är absolut inte 'replikerar' eftersom de inte är oberoende av de andra växterna i ett mikrokosmos. I stället är hela experimentella enheten (potten eller mikrokosmos) en kopia, vilket är varför vi använde i genomsnitt eller uppgick till granne växt storlekar per pott innan du kör analyser av variancen eller Linjära regressioner.

Vår inställning kan ändras för fältstudier att utesluta rot konkurrens och undersöka påverkan av intakt CMNs. Av att behållare med PVC röret bitar med stora hål täckt med nylon Silk mesh, roterade kärnor tål tuffa fältförhållanden, liksom i Soapberry experimentet. Liknar vårt guava potten experiment, men effekten av severing potentiella CMNs kunde inte skiljas från helt enkelt begränsa volymen jord som mineral näringsämnen kunde förvärvas.

Vår metod ger en kontrollerad, noggrann jämförelse av växter interagerar över CMNs kontra utöka växter som inte är envist sammankopplade (i stället för växter som helt saknar mycorrhizas). Därför det härmar aspekter av naturen, såsom plantor gå med etablerade CMNs samt användning av en svit av AM svampar. Senaste arbete har visat att olika AM svampen arter kan vara av olika kvalitet partners till växter, och att närvaron av en andra art av AM svamp på ett rotsystem kan framkalla en 'samarbetsovilliga' svampen art att ge mer fosfor i utbyte mot kol än när enbart på de rotsystem42. Dessutom kan olika arter av svampar ge fördelar än mineral näringsämne förvärv att plantera värdar, till exempel torka och salthalt tolerans eller skydd från patogener2. Dessa resultat understryker vikten av att använda en svit av svampar för att etablera CMNs. Trots sin realism, en iögonfallande begränsning av vår strategi är experiment varaktighet. Behållare eller PVC-rör storlek begränsar hur lång tid innan växter bli root bunden och tenderar därför att begränsa fokus till endast plantor eller unga plantor. Dock skickar vi att det finns stor flexibilitet i utformningen av mål-växt roteras-core experiment där endera eller båda mål och grannar kan manipuleras i en mängd olika sätt att förstå rollerna som CMNs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka de två anonyma granskarna för deras förslag. Vi tackar också många studenter som har hjälpt till med att konstruera krukor, mikrokosmos, och slitsade behållare och som har hjälpt med att upprätthålla och skörd experiment. Vi tackar också North Central College för start medel (JW) och nuvarande faciliteter, samt Ashley Wojciechowski för att erhålla ett North Central College Richter bidrag stödja ett experiment med dessa metoder. En del av detta arbete finansierades av National Science Foundation avhandling förbättring utbildningsbidrag (DEB-1401677).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Commercial tubular seedlings container (called 'containers' in the manuscript) Stuewe and Sons, Inc Ray Leach Cone-tainer ™ RLC3U
Course glass beads Industrial Supply, Inc. 12/20 sieve Size #1
Course silica sand Florida Silica Sand 6/20 50lb bags None
Fine glass beads Black Beauty Black Beauty FINE Crushed Glass Abrasive (50 lbs) BB-Glass-Fine
Hydrophobic membrane Gore-tex None None
Large commercial tubular seedling containers Stuewe and Sons, Inc. Deepot ™ D16L
Medium silica sand Florida Silica Sand 30/65 50 lb bags None
Nylon mesh Tube Lite Company, Inc. Silk screen LE7-380-34d PW YEL 60/62 SEFAR LE PECAP POLYESTER
Soil and foliar nutrient analysis facility Kansas State University Soil Testing Lab None None
Stable isotope core facility University of Miami None None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (25), 11841-11843 (1994).
  2. Smith, S. E., Read, D. J. Mycorrhizal Symbiosis. , 3 edn, Academic Press. (2008).
  3. Giovannetti, M., Avio, L., Sbrana, C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 41-67 (2015).
  4. Giovannetti, M., Sbrana, C. Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth. Vol. 328. Nato Science Series, Sub-Series I: Life and Behavioural Sciences. Cresti, A., Heath, M., Geitmann, I. B. , 221-231 (2001).
  5. Giovannetti, M., Sbrana, C., Avio, L., Strani, P. Patterns of below-ground plant interconnections established by means of arbuscular mycorrhizal networks. New Phytologist. 164 (1), 175-181 (2004).
  6. Avio, L., Pellegrino, E., Bonari, E., Giovannetti, M. Functional diversity of arbuscular mycorrhizal fungal isolates in relation to extraradical mycelial networks. New Phytologist. 172 (2), 347-357 (2006).
  7. Giovannetti, M., et al. At the root of the wood wide web: self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signaling & Behavior. 1 (1), 1-5 (2006).
  8. Miller, R., Kling, M. J. The importance of integration and scale in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant and Soil. 226 (2), 295-309 (2000).
  9. Miller, R., Jastrow, J., Reinhardt, D. R. External hyphal production of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi in pasture and tallgrass prairie communities. Oecologia. 103 (1), 17-23 (1995).
  10. Weremijewicz, J., Sternberg, L. dS. L. O., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify competition by preferential mineral nutrient allocation to large host plants. New Phytologist. , (2016).
  11. Fellbaum, C. R., et al. Fungal nutrient allocation in common mycorrhizal networks is regulated by the carbon source strength of individual host plants. New Phytologist. 203 (2), 646-656 (2014).
  12. Lekberg, Y., Hammer, E. C., Olsson, P. A. Plants as resource islands and storage units--adopting the mycocentric view of arbuscular mycorrhizal networks. FEMS Microbiol Ecol. 74 (2), 336-345 (2010).
  13. Jakobsen, I., Hammer, E. C. Mycorrhizal Networks. , Springer. 91-131 (2015).
  14. Jakobsen, I., Rosendahl, L. Carbon flow into soil and external hyphae from roots of mycorrhizal cucumber plants. New Phytologist. 115 (1), 77-83 (1990).
  15. Kiers, E. T., et al. Reciprocal rewards stabilize cooperation in the mycorrhizal symbiosis. Science. 333 (6044), 880-882 (2011).
  16. Hartnett, D. C., Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T. Mycorrhizal influence on intra- and interspecific neighbour interactions among co-occuring prairie grasses. Journal of Ecology. 81 (4), 787-795 (1993).
  17. Hetrick, B. A. D., Wilson, G. W. T., Todd, T. C. Differential responses of C3 and C4 grasses to mycorrhizal symbiosis, phosphorus fertilization, and soil microorganisms. Canadian Journal of Botany. 68 (3), 461-467 (1990).
  18. Johnson, D., Leake, J. R., Read, D. J. Novel in-growth core system enables functional studies of grassland mycorrhizal mycelial networks. New Phytologist. 152 (3), 555-562 (2001).
  19. Leake, J. R., et al. Networks of power and influence: the role of mycorrhizal mycelium in controlling plant communities and agroecosystem functioning. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 82 (8), 1016-1045 (2004).
  20. Babikova, Z., et al. Underground signals carried through common mycelial networks warn neighbouring plants of aphid attack. Ecology Letters. 16 (7), 835-843 (2013).
  21. Schüepp, H., Miller, D. D., Bodmer, M. A new technique for monitoring hyphal growth of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi through soil. Transactions of the British Mycological Society. 89 (4), 429-435 (1987).
  22. Miller, D. D., Bodmer, M., Schüepp, H. Spread of endomycorrhizal colonization and effects on growth of apple seedlings. New Phytologist. 111 (1), 51-59 (1989).
  23. Jakobsen, I., Gazey, C., Abbott, L. K. Phosphate transport by communities of arbuscular mycorrhizal fungi in intact soil cores. New Phytologist. 149 (1), 95-103 (2001).
  24. Johnson, D., Leake, J., Ostle, N., Ineson, P., Read, D. J. In situ 13CO2 pulse‐labelling of upland grassland demonstrates a rapid pathway of carbon flux from arbuscular mycorrhizal mycelia to the soil. New Phytologist. 153 (2), 327-334 (2002).
  25. Johnson, D., Leake, J., Read, D. J. Transfer of recent photosynthate into mycorrhizal mycelium of an upland grassland: short-term respiratory losses and accumulation. of 14C. Soil Biology and Biochemistry. 34 (10), 1521-1524 (2002).
  26. Walder, F., et al. Mycorrhizal networks: Common goods of plants shared under unequal terms of trade. Plant Physiology. 159 (June 2012), 789-797 (2012).
  27. Song, Y. Y., et al. Interplant communication of tomato tlants through underground common mycorrhizal networks. Plos One. 5 (10), e13324 (2010).
  28. Merrild, M. P., Ambus, P., Rosendahl, S., Jakobsen, I. Common arbuscular mycorrhizal networks amplify competition for phosphorus between seedlings and established plants. New Phytologist. 200 (1), 229-240 (2013).
  29. Janos, D. P., Scott, J., Aristizábal, C., Bowman, D. M. J. S. Arbuscular-mycorrhizal networks inhibit Eucalyptus tetrodonta seedlings in rain forest soil microcosms. Plos One. 8 (2), e57716 (2013).
  30. Wyss Lozano Hoyos, T. Pinus elliottii var. densa Seedling Performance Reflects Ectomycorrhizas, Soil Nutrient Availability and Root Competition. , (2010).
  31. Mäder, P., Vierheilig, H., Alt, M., Wiemken, A. Boundries between soil compartments formed by microporous hydrophobic membranes (GORE-TEX) can be crossed by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi but not by ions in the soil solution. Plant and Soil. 152, 201-206 (1993).
  32. Mäder, P., et al. Transport of 15N from a soil compartment separated by a polytetrafluoroethylene membrane to plant roots via the hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 146 (1), 155-161 (2000).
  33. Brundrett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture. , (1996).
  34. McGonigle, T. P., Miller, M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L., Swan, J. A. A new method which gives an objective-measure of colonization of roots by vesicular arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist. 115 (3), 495-501 (1990).
  35. Weremijewicz, J., Janos, D. P. Common mycorrhizal networks amplify size inequality in Andropogon gerardii monocultures. New Phytologist. 198 (1), 203-213 (2013).
  36. Weremijewicz, J., O’Reilly, L. dS. L., Janos, D. P. Arbuscular common mycorrhizal networks mediate intra-and interspecific interactions of two prairie grasses. Mycorrhiza. , 1-13 (2017).
  37. Weiner, J. Asymmetric competition in plant populations. Tree. 5 (11), 360-364 (1990).
  38. Damgaard, C., Weiner, J. Describing inequality in plant size or fecundity. Ecology. 81 (4), 1139-1142 (2000).
  39. Johnson, C. R., Joiner, J. N., Crews, C. E. Effects of N, K, and Mg on growth and leaf nutrient composition of 3 container grown woody ornamentals inoculated with mycorrhizae. Journal of the American Society for Horticultural Science. 105 (2), 286-288 (1980).
  40. Estrada-Luna, A. A., Davies, F. T., Egilla, J. N. Mycorrhizal fungi enhancement of growth and gas exchange of micropropagated guava plantlets (Psidium guajava L.) during ex vitro acclimatization and plant establishment. Mycorrhiza. 10 (1), 1-8 (2000).
  41. Hurlbert, S. H. Pseudoreplication and the design of ecological field experiments. Ecological Monographs. 54 (2), 187-211 (1984).
  42. Argüello, A., et al. Options of partners improve carbon for phosphorus trade in the arbuscular mycorrhizal mutualism. Ecology Letters. 19 (6), 648-656 (2016).

Tags

Miljövetenskap fråga 145 gemensamma utöka nät konkurrens extraradical mycel underlättande utöka svampar växt interaktioner växt-smutsa feedback roterade core
Utredning av växt interaktioner mellan gemensamma utöka nätverk använder roteras kärnor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weremijewicz, J., Janos, D. P.… More

Weremijewicz, J., Janos, D. P. Investigation of Plant Interactions Across Common Mycorrhizal Networks Using Rotated Cores. J. Vis. Exp. (145), e59338, doi:10.3791/59338 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter