Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methode om te groeien VX2 cellen in de cultuur en om een orthotopic VX2 model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen bij konijnen te creëren. Orthotopic endometriumkanker modellen zijn belangrijk voor de pre-klinische studie van nieuwe beeldvormings modaliteiten voor de diagnose van lymfeklier metastasen.

Abstract

Endometriumkanker is de meest voorkomende gynecologic maligniteit in Noord-Amerika en de incidentie stijgt wereldwijd. De behandeling bestaat uit chirurgie met of zonder adjuvante therapie, afhankelijk van de lymfeklier-betrokkenheid zoals bepaald door lymfadenectomie. Lymfadenectomie is een morbide procedure, waarvan niet is aangetoond dat het een therapeutisch voordeel heeft bij veel patiënten, en daarom is een nieuwe methode vereist om lymfeklier metastasen te diagnosticeren. Om nieuwe beeldvormings middelen te testen, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen nodig. Het VX2 endometriumkanker model is vaak beschreven in de literatuur; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie met betrekking tot de methode van model inrichting. Bovendien, geen studies hebben gemeld over het gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken als alleen cellen die zijn gekweekt in vivo eerder zijn gebruikt. Hierin presenteren we een gestandaardiseerde chirurgische methode en post-operatieve bewakingsmethode voor de oprichting van het VX2 endometriumkanker model en rapporteren over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken.

Introduction

Endometriumkanker, of kanker van de bekleding van de baarmoeder, is de tweede meest voorkomende gynecologic maligniteit wereldwijd en de meest voorkomende maligniteit in ontwikkelde landen1. De incidentie van endometriumkanker is gestaag toegenomen en stijgt met 2,3% per jaar tussen 2005-2013 en een overeenkomstige toename van 2,2% in sterfte1,2,3. De diagnose van lymfeklier metastasen is van het grootste belang omdat de aanwezigheid van positieve lymfeklieren een sterke negatieve voorspeller is van overleving4,5,6,7 en kan leiden tot de toediening van adjuvante therapie8,9,10,11,12,13. Lymfeklier metastasen worden momenteel gediagnosticeerd door chirurgisch verwijderen van het lymfeweefsel boven de grote bloedvaten in het bekken en de buik. Deze procedure, bekend als een lymfadenectomie, is controversieel als gevolg van conflicterende overlevings gegevens van twee grote proeven14,15,16,17,18 en de bekende risico van intra-operatieve15,19,20 en postoperatieve morbiditeit21,22,23. Aangezien de huidige niet-invasieve beeldvormings modaliteiten niet de vereiste gevoeligheid en specificiteit hebben om lymfeklier dissectie24te vervangen, is er een duw geweest om nieuwe diagnostische beeldvormingstechnieken te ontwikkelen. Om deze nieuwe technieken te testen in een pre-klinische setting, is een betrouwbaar model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfeklier metastasen vereist.

Het konijn VX2 tumor model is een gevestigde model dat uitgebreid is gebruikt voor het bestuderen van meerdere menselijke solide orgel tumoren25 met inbegrip van Long26, hoofd ennek 27,28, lever29, nier30, bot31,32, hersenen33, alvleesklier34 en baarmoeder35,36,37. Het VX2 model werd oorspronkelijk ontwikkeld in 1940 door Kidd en Rous38 door het succesvol verplanten van een Cottontail konijn papillomavirus virus ontdekt door shope in 193339. Sinds die tijd is het VX2-model in vivo gehandhaafd, waarbij seriële passage in de quadriceps spier van witte Nieuw-Zeelandse konijnen40nodig is. Meer recent echter, meerdere groepen hebben succesvol gegroeid VX2 cellen in vitro40,41,42 en toonde de behouden tumorigenecity van de gekweekte cellijn lijn31, 42,43. VX2 tumoren zijn histologisch gedefinieerd als anaplastisch plaveiselcel carcinomen44 en bevatten klierweefsel kenmerken die lijken op adenocarcinoom26. Tumoren worden gekenmerkt door het gemak van implantatie, snelle groei en Hyper-vasculariteit44,45 en betrouwbaar metastasize, meestal op regionale en verre lymfeklieren45. Overeenkomsten in de baarmoeder vasculaire en lymfatische anatomie46 evenals de orthotopic groeiplaats zorgen ervoor dat het metastatische patroon van konijn VX2 carcinoom dat van humaan endometriumkanker nabootst, waardoor het VX2 model een betrouwbaar model is voor het bestuderen van menselijke gemetastaseerde ziekte. Bovendien suggereren histologische kenmerken zoals abnormale microvasculaire proliferatie47 , evenals immunologische48 en genetische gelijkenissen49,50 tussen mensen en konijnen dat de tumor micro-omgeving kan weerspiegelen die van humaan endometriumkanker.

Meerdere groepen hebben gerapporteerd over het gebruik van VX2 te maken van een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen met een hoge gerapporteerde succespercentage36,51,52; Er bestaat echter een aanzienlijke variatie in de huidige literatuur met respect voor de methode van model creatie. Cel schorsing doses zo laag als 4 x 105 cellen/baarmoeder hoorn51 en zo hoog als 5 x 109 cellen/baarmoeder hoorn37,53 zijn gemeld met geen standaard consensus over de vereiste VX2 cellulaire dosis. Ook is er een verscheidenheid aan inoculatie methoden gemeld, waaronder micro-chirurgische implantatie van tumor in de baarmoeder myometrium36, injectie van VX2 celsuspensie37,44,52 , 53 en in sommige gevallen, de toevoeging van baarmoeder hoorn voorafgaand aan de en52. Ten slotte hebben geen groepen het gebruik van gekweekte VX2 cellen gemeld om dit model te maken. Het doel van deze studie is dus om een succesvolle gestandaardiseerde methode van VX2 model creatie te demonstreren en het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen te rapporteren om een model van endometriumkanker met retroperitoneale metastasen in een konijn te creëren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Diepe buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de peritoneale incisie en pak het peritoneum, rectus spier en fascia met weefsel Tang. Alle dierproeven zijn uitgevoerd in een Animal Resource Center (ARC) goedgekeurde faciliteiten van het universitair gezondheidsnetwerk en in overeenstemming met de goedgekeurde protocollen voor dieren gebruik en zorg (AUP #3994/#4299). VX2 cellijn werd verkregen uit het lab van Dr. Aken in het universitair gezondheidsnetwerk.

1. creatie van in vitro VX2 cellijn

  1. Oogst de VX2 tumor van konijn quadricep spier en groei in muis flank.
    1. Ontdooien bevroren VX2 tumor blokken (1 cm x 1 cm), gehakt op een kweek plaat met behulp van een scalpel blad en stam door een 70 μm filter door kleine hoeveelheden Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) opeenvolgend toe te voegen om ervoor te zorgen dat alle cellen worden gespannen voor een laatste volume van 1 ml.
    2. Tel cellen en Verdun met 0,9% fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 1 x 107/ml en plaats op ijs in een steriele buis.
      Opmerking: tumor blokken werden verkregen uit een laboratorium medewerker uit eerdere vermeerdering van VX2 tumoren in de spieren van de quadriceps van het konijn.
    3. Anesthetiseer een vrouwelijk wit Nieuw-Zeelandse konijn (gewicht 2,5-3,5 kg) met 2-5% geïnhaleerde Isofluraan, verwijder de vacht boven de injectieplaats en reinig de injectieplaats met Povidon-jodiumoplossing. Injecteer 500 μL van de bereide VX2 celsuspensie (5 x 106 cellen/ml) in de spier van de quadriceps van het konijn. Monitor het konijn klinisch voor tumorgroei vanaf dag 10.
    4. Euthanaseren de konijnen na tumoren bereiken 1-1,5 cm in diameter (extern gemeten met remklauwen) met behulp van een door de dierenarts goedgekeurde methode. Bevestig euthanasie door het controleren van vitale functies inclusief hartslag en ademhalingsfrequentie. Accijns de tumor met behulp van steriele instrumenten na het schoonmaken van het gebied met Betadine oplossing.
    5. In een biologische veiligheidskast met behulp van steriele instrumenten, gehakt de tumor in kleine stukjes (0,2 cm) op een 10 cm weefselcultuur schotel met behulp van een scalpel Blade. Geef de tumor fragmenten door een celzeef van 70 μm met 1 mL HBSS zoals beschreven in stap 1.1.1. Tel cellen en Verdun met 0,9% zoutoplossing om 7,5 x 105 cellen in 200 μL te verkrijgen.
    6. Anesthetize mannelijke NOD scid gamma muizen (gewicht 25 g) met behulp van 4% Isofluraan op 1 L/min en anesthesie onderhouden met 2% Isofluraan. Injecteer, zodra de muizen verdoiliseerd zijn, 200 μL van de oplossing van stap 1.1.5 in het subcutane weefsel van de muis flank met een 27 gauge naald.
  2. Oogsten en doorgangen van VX2 cellen in vitro
    1. Controleer xenotransplantaat groei klinisch tweemaal per week totdat tumoren 1 cm in diameter bereiken met behulp van remklauwen.
    2. Euthanaseren muizen door het plaatsen in een co2 kamer of het uitvoeren van cervicale dislocatie na anesthesie met 4% Isofluraan gas. Accijnzen tumoren onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast.
    3. Mince tumoren met een scalpel in 1-2 mm stukken in een 6 cm weefselkweek schotel met 3 mL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM)/Ham's F12 + 10% foetaal runderserum (FBS) media.
    4. Laat tumor fragmenten ongestoord in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende twee dagen totdat cellen beginnen te groeien uit de tumor stukjes. Controleer vervolgens gecultiveerde platen dagelijks door lichte microscopie voor celconfluentie. Bij het bereiken van 70% confluentie, trypsinize cellen door toevoeging van 1 mL 0,05% trypsine aan de kolf en terug te brengen in de 37 ° c broedplaats voor 5 min.
    5. Neutraliseer trypsine met 6 mL DMEM/Ham's F12 + 10% FBS medium, verzamel cellen en centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 300 x g. Verwijder supernatant en re-Suspend pellet in 3,5 mL van nieuwe DMEM/Ham van F12 + 10% FBS media. Verse zaden 6 cm collageen I gecoate platen met 1,6 x 106 cellen per plaat om ongeveer 50% celseeding dichtheid te bereiken.
      Opmerking: 50% celdichtheid verwijst naar de cellen die 50% van het oppervlak van de plaat innemen als ze zijn bevestigd.
    6. Vroege passage: Herhaal het bovenstaande proces (trypsinizing, seeding) totdat de cellen 5 keer zijn gepasseerde en evalueer vervolgens de zuiverheid van de cellijn met PCR met behulp van een kwantitatieve PCR-test om het konijn genomisch DNA te onderscheiden van muizen genomisch DNA (zie stap 1.3.1-1.3.4).
      Opmerking: na 8 passages kunnen cellen worden vermeerderd op niet-collageen gecoate regelmatig hecht weefselkweek platen.
    7. Passage, trypsinize en Vries aliquots van cellen in DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO bij een concentratie van 2 x 106 per injectieflacon. Bewaarcellen in vloeibare stikstof totdat dit nodig is voor experimenten.
  3. Bevestiging van VX2 oorsprong van overlevende cellen:
    1. Maak een standaard kuur van gezuiverde genomische muis en konijn-DNA (stap 1.3.2 en stap 1.3.3). Gebruik primers die soortspecifieke sequenties binnen het tweede open Lees frame van de lijn-1 retrotransposon element.
      Opmerking: primer sequenties voor CRPV E6 zijn: 5 '-GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5 '-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. De lijn-1 retrotransposon elementen werden gebruikt. Primer sequenties voor Rabbit LINE-1 zijn: 5 '-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC en 5 '-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT primer sequenties voor muis lijn-1 zijn: 5 '-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG en 5 '-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
    2. Om een standaard curve voor CRPV E6 te maken, zuiveren VX2 tumorcel lysaat (stap 1.1.1) met behulp van een commerciële Kit volgens het Protocol van de fabrikant. Kwantificeer dit DNA met behulp van een commerciële assay. Voer 6 seriële verdunningen uit van 225 PG/μL tot 0,925 PG/μL in een lage EDTA-TE-buffer. Om een standaard curve voor de muis genomisch DNA te maken, Verdun 100 μg commercieel muis genomisch DNA in een lage EDTA-TE buffer in 5 verdunningen van 125 PG/μL tot 0,0125 PG/μL.
    3. Plaats 4 μL van elke verdunde oplossing uit de monsters van stap 1.3.2 in putten en voer monsters uit in een PCR-Thermocycler. Gebruik de CQ-waarden van elke run samen met de DNA-bedragen per well om een standaard curve te berekenen met behulp van de automatische drempel instellingen van de Thermocycler-software.
    4. Gebruik standaard qPCR-procedures om PCR uit te voeren met 40 cycli van 2-stappen fietsen (98 °C en 60 °C) op een Thermocycler. Stel drempelwaarden vast en zet Delta CT-waarden op > 35 om ervoor te zorgen dat er minimale muis verontreiniging is in de VX2 cellijn van Rabbit. Het totale volume van elke reactie was 10 μL, bestaande uit 5 μL van 2x Mastermix, 1 μL forward + reverse primers met de uiteindelijke primer concentratie in reactie op 250 nM en 4 μL DNA-monster.
      Opmerking: Raadpleeg de referenties54,55 voor meer informatie over het uitvoeren van PCR. Drempelwaarden worden vastgesteld en Delta CT-waarden worden ingesteld op > 35 om ervoor te zorgen dat er minimale muis besmetting is in de VX2 cellijn van Rabbit. Het aanbevolen niveau van VX2-DNA voor betrouwbare detectie door qPCR is 1-10 pg.

2. VX2 celcultuur en creatie van celsuspensie

  1. Ontdooien injectieflacons met VX2 cellen (bevroren in stap 1.2.7) in een waterbad van 37 °C gedurende 1 minuut en brengen cellen over naar een conische centrifugebuis met 10 mL kweekmedium (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS en 1% Penicileen-streptomycine). Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 107 x g, gooi het supernatant weg en onderbreek de celpellet in 9 ml media.
  2. Breng opnieuw geschorste cellen over naar een grote kweek kolf. Inincuberen cellen zonder te schudden bij 37 °C. Controleer cellen dagelijks voor samenvloeiing met behulp van lichte microscopie en verander cultuur media om de drie dagen.
  3. Creatie van gekweekte VX2 celsuspensie voor injectie
    1. Trypsinize cellen door toevoeging van 3 mL 0,25% trypsine aan de kolf zodra cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt. Plaats de kolf in een incubator (37 °C) gedurende 5 min. Transfer oplossing naar een conische centrifugebuis en Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 107 x g en verwijder vervolgens supernatant.
    2. Was de celpellets 3 keer met 9 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing, centrifugeer en verwijder supernatant zoals hierboven beschreven. Tel de cellen en Verdun met 0,9% fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 4 x 107 cellen/ml en plaats in een steriele conische centrifugebuis op ijs.
  4. Creatie van in vivo gepropageerde VX2 celsuspensie voor injectie
    1. Ontdooien bevroren VX2 tumor blokken (1 cm x 1 cm), gehakt op een kweek plaat met behulp van een scalpel blad en stam door een 70 μm filter zoals in stap 1.1.1. Voeg kleine hoeveelheden HBSS opeenvolgend toe om ervoor te zorgen dat alle cellen worden gespannen voor een laatste volume van 1 mL. Tel cellen en Verdun met 0,9% fosfaatgebufferde zoutoplossing tot een concentratie van 1 X107/ml en plaats op ijs in een steriele buis.
      Opmerking: tumor blokken werden verkregen uit een laboratorium medewerker uit eerdere vermeerdering van VX2 tumoren in de spieren van de quadriceps van het konijn.

3. chirurgische model inrichting

  1. Oprichting van chirurgische anesthesie en pre-operatieve voorbereiding
    1. Pre-medicate vrouwelijke witte Nieuw-Zeelandse konijnen (2,5-3,5 kg) 1 uur voorafgaand aan de geplande chirurgische ingreep met behulp van injecties van Acepromazine (1 mg/kg IM) en Meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anesthetiseer een vrouwelijk wit Nieuw-Zeelandse konijn (gewicht 2,5-3,5 kg) met 2-5% geïnhaleerde Isofluraan, verwijder de vacht boven de injectieplaats en reinig de injectieplaats met Povidon-jodiumoplossing.
    2. Intuberen verdoving konijnen met behulp van een laryngeale masker luchtweg (LMA) en veilig in plaats met tape, behoud van diepe anesthesie door het titreren van de geïnhaleerde Isofluraan dosis tussen 2-5%. Monitor chirurgische anesthesie regelmatig gedurende de hele procedure door het controleren van vitale functies (ademhalingsfrequentie, capillaire navulling, zuurstofverzadiging indien beschikbaar) en monitoring voor tekenen die wijzen op pijn (beweging, terugtrekking uit stimuli, geluiden) of licht anesthesie (beweging, kauwen op LMA buis).
      Opmerking: dit moet worden gedaan door iemand met ervaring controle chirurgische anesthesie.
    3. Plaats een 22-gauge oorader katheter in de marginale dorsale ader. Toediening van cefazolin (20 mg/kg) intraveneus 10 min voorafgaand aan de chirurgische huid incisie.
    4. Knip het haar over het bekken en de buik voordat u het konijn op de operatietafel plaatst en plaats de konijnen vervolgens in een rugpositie op de werktafel. Reinig het chirurgische veld met een 3-stappen chirurgische huid voorbereiding (Betadine zeep, chloorhexidine oplossing, Betadine oplossing). Draperen het chirurgische veld met laparotomie gordijnen na het land-markering van de bovenkant van het schaambeen, waardoor een gebied van 5 cm x 5 cm van de onderbuik blootgesteld.
  2. Oprichting van de laparotomie incisie en identificatie van de baarmoeder hoorns
    1. Zet een chirurgische dop en gezichtsmasker. Schrobben van de handen met behulp van chloorhexidine of Betadine chirurgische scrub oplossing. Gebruik steriele techniek, op een steriele jurk en steriele chirurgische handschoenen.
    2. Met behulp van een # 11-Blade scalpel, maken een 2,5 cm lange incisie 1 cm craniale aan de symphyse schaambeen via huid en onderhuidse weefsel van de buik van het konijn. Incise de rectus fascia en ontleden de rectus spieren lateraal om het onderliggende peritoneum bloot. Betreed het peritoneum scherp na te zorgen dat de ondergrond helder is van darm of andere buikorganen.
    3. Zoek de baarmoeder hoorns die de urineblaas identificeren en veeg een gegloeide vinger superiorly, posteriorly en lateraal over de Apex van de blaas.
      Opmerking: indien nodig kan de volledige blaas worden geleegd met behulp van digitale druk. Eenmaal gelegen, breng de baarmoeder hoorns door de buik incisie om te rusten op de buikwand.
    4. Met behulp van een 3-0 gevlochten absorbeerbare hechtdraad, voeren een enkele hechting ligatie van elke baarmoeder hoorn ongeveer 1,5-2,0 cm distale aan de Herde cervices. Plaats de hechtmiddel gewoon mediaal aan de baarmoeder slagaders, die langs het laterale aspect van elke hoorn lopen. Bind de hechtingen strak om de distale baarmoeder hoorns te occluden (Figuur 1).
  3. Myometrial VX2 inoculatie
    1. Injecteer met een naald van 27 gauge 0,5 mL van de eerder bereide VX2 celsuspensie van ofwel stap 2.3.2 (voor gekweekte VX2 model) of 2,4 (voor in vivo VX2 model) in het myometrium van elke baarmoeder hoorn proximale naar de hecht plaats (tussen de hecht plaats en de cervix). Injecteer meer dan 1 minuut en zorg ervoor dat de cellen niet in de onderliggende baarmoederholte worden geïnjecteerd. Anesthetiseer dieren met geïnhaleerde Isofluraan (2-5%) en een verdovings machine met een Bain-circuit.
    2. Breng gedurende 30 sec. na de injectiedruk aan op de injectieplaats myometrial om de lekkage van cellen te minimaliseren. Inspecteer de injectie-en hecht plaatsen voor hemostase en plaats de baarmoeder hoorns terug in de buik.
  4. Het sluiten van de chirurgische incisie
    1. Diepe buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de peritoneale incisie en pak het peritoneum, rectus spier en fascia met weefsel Tang.
      1. Om dit te doen, verankeren van de hechting op een toppunt van de incisie door te hechten oppervlakkig tot diep aan de ene kant van de incisie en diep tot oppervlakkig aan de andere. Binden een knoop. Met behulp van de bijgevoegde hechtdraad, maak lopende steken loodrecht op de incisie door de lagen van de buikwand werken stap-verstandig langs de incisie van de zijkant naar de zijkant. Bind de hecht en snijd.
    2. Oppervlakkige buikwand sluiting: Identificeer de Apex van de huid incisie en hecht de buikhuid met behulp van begraven lopende subcuculaire 3-0 absorbeerbare poly-filament hecht. Breng chirurgische lijm aan op de gesloten incisie om de huid randen tegen te gaan.
      1. Om dit te doen, verankeren van de hechting op een toppunt van de incisie, door diep te hechten aan de oppervlakkige aan de ene kant van de incisie en oppervlakkig tot diep op de andere. Binden een knoop. Gebruik de bijgevoegde hechtingen, maak lopende steken in de dermale laag parallel aan de incisie stap-Wise langs de incisie van de zijkant naar de zijkant. Bind de hecht en snijd.
  5. Postoperatieve zorg
    1. Ontwaken uit de anesthesie: Schakel de Isofluraan uit zodra de incisie is gesloten en laat het konijn de zuurstof door het masker ademen tijdens het monitoren op verschijnselen van ontwaken (bijv. spontane bewegingen, oogopening en kauw bewegingen op de luchtweg van het laryngeaal masker). Extubate het konijn zodra deze tekenen worden genoteerd en leveren zuurstof door masker en een warme deken totdat de konijnen alert zijn en in staat om zelfstandig te zitten.
    2. Post-operatieve monitoring: monitor konijnen twee keer per dag gedurende 4 dagen en dagelijks gedurende een extra 10 dagen post-operatief. Om te controleren, hun algemene toestand, hun voedsel-en water inname, urine en fecale output, pijn beoordeling, gewicht, vitale functies (hartslag, ademhalingsfrequentie) en hun chirurgische plaats op zoek naar zwelling, erytheem, afscheiding of dehiscentie te beoordelen.
    3. Postoperatieve pijn controle: toedienen Meloxicam dagelijks (0,2 mg/kg SQ) voor 48 h post-operatief en vervolgens indien nodig op basis van pijn beoordeling. Beheer buprenorfine onmiddellijk na de operatief en elke 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) voor 24 uur en vervolgens indien nodig op basis van de pijn beoordeling
    4. Antibiotica (enrofloxacine 5mg/kg IM) kunnen dagelijks gedurende zeven dagen na het operatief worden toegediend om een wondinfectie te voorkomen, zoals aanbevolen door uw dierenarts. Toedienen van subcutane vloeistoffen (15 mL SQ) tweemaal daags indien nodig voor uitdroging en zacht voedsel of andere voedingssupplementen worden dagelijks verstrekt als nodig is voor gewichtsverlies.

4. tumor groei monitoring

  1. Klinische monitoring: monitor konijnen elke 2 dagen voor klinische tekenen van tumorgroei beginnend op de postoperatieve dag 14. Klinische tekenen van tumorgroei kunnen omvatten verminderde orale inname, lethargie, abdominale tederheid, voelbare abdominale massa en verlies van cecotrofie.
  2. Beeldvorming en invasieve monitoring
    1. CT-beeldvorming: op postoperatieve dag 21-28, pre-medicaat, anesthetize en intuberen konijnen zoals eerder beschreven in 3.1.1-3.1.2. Plaats konijnen in een dorsale positie in een preklinisch CT-scanner en verkrijg beelden van het bekken en de buik na toediening van 10 mL intraveneus iohexol contrastmiddel.
    2. Chirurgische controle: Breng konijnen over naar de operatiekamer na beeldvorming terwijl het nog onder algemene verdoving is. Positie, prep en draperen konijnen zoals eerder beschreven in stap 3.1.4 en voer een herhaalde laparotomie incisie ongeveer 1,5 cm in lengte door de vorige incisie. Identificeer de en de baarmoeder hoorns en zorgvuldig onderzoeken voor tumor. Sluit de incisie en zorg voor postoperatieve verzorging zoals eerder beschreven in stap 3.5.2-3.5.4.
    3. Konijn model gebruik: als konijnen worden gevonden om tumoren te hebben op het moment van chirurgische controle, gebruik konijn endometriumkanker modellen voor geplande experimenten. Gebruik konijnen gemaakt van in vivo gepropageerde cellen voor aanvullende experimenten bij 4 weken na inoculatie en gebruik konijnen modellen gemaakt van gekweekte VX2 cellen bij ongeveer 5-6 weken na inoculatie om rekening te kunnen maken met langzamere tumorgroei. Euthanaseren de konijnen na tumoren bereiken 1-1,5 cm in diameter (extern gemeten met remklauwen) met behulp van een door de dierenarts goedgekeurde methode. Bevestig euthanasie door het controleren van vitale functies inclusief hartslag en ademhalingsfrequentie. Accijns de tumor met behulp van steriele instrumenten na het schoonmaken van het gebied met Betadine oplossing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Achtentwintig konijnen werden gebruikt voor de creatie van het endometriumkanker model. Konijnen hadden een gemiddeld gewicht van 2,83 kg (2.71-3.58 kg) op het moment van het experiment. Baarmoeder tumoren succesvol gegroeid in 21 konijnen voor een algemeen model succespercentage van 75%. Voordat de baarmoeder in het protocol werd opgenomen, bedroeg het slagingspercentage 57% in vergelijking met 81% na toevoeging van baarmoeder-hechten. Baarmoeder hechten werd toegevoegd aan het protocol na de 7e konijn in reactie op de initiële lage model succespercentage. Vijf modellen werden gemaakt van gekweekte VX2 cellen (geprobeerd in 8 konijnen, 63% slagingspercentage) en 16 konijnen modellen werden gemaakt van in vivo gekweekte cellen (geprobeerd in 22, 73% slagingspercentage). In modellen die zijn gemaakt uit in vivo VX2 cellen, werd een celdosis van 5 x 106 per baarmoeder hoorn gebruikt bij alle dieren en het gemiddelde aantal dagen vanaf de inoculatie tot het experiment was 29 dagen (bereik 24-31). In modellen gemaakt van gekweekte VX2 cellen, werd een escalerend dosis protocol gebruikt om de juiste inoculatie dosis te bepalen. Doses van 2,5 x 106 cellen en 5 x 106 cellen per baarmoeder hoorn waren mislukt en een dosis van 10 x 106 cellen per baarmoeder hoorn was succesvol in een konijn echter, tumorgroei was traag op 57 dagen van inoculatie om te experimenteren. Een dosis van 20 x 106 cellen per baarmoeder hoorn was succesvol in 4 konijnen in een gemiddelde tijd van 45 dagen (bereik 36-51 dagen) van inoculatie tot experiment en werd dus bepaald als de optimale injectie dosis. Deze gegevens worden samengevat in tabel 1. Op PCR-analyse na passage 5 waren de gekweekte VX2 cellen zeer positief voor zowel Rabbit LINE-1 als CRPV-E6, met alleen sporen van muis LI NE-1 werd geïdentificeerd (< 0,01 PG/μL). Cellen werden vervolgens in celkweek gekweekt, de groei was traag met een gemiddelde tijd van 7 dagen (6-9 d) om de kolf confluentie te bereiken.

Alle modellen resulteerden met succes in de gemetastaseerde transformatie van de retroperitoneale lymfeklieren (Figuur 2). Negentien konijnen hadden pathologisch bevestigde lymfeklier metastasen en 11 hadden pathologisch bevestigde extra-Nodale abdominale metastasen. Eén konijn had geen afzonderlijke lymfeklieren verwijderd; echter, het had een hoge last van intra-abdominale ziekte waarbij lymfeklier metastasen werden verondersteld, en een konijn stierf voorafgaand aan het experiment. Tumoren en gemetastaseerde lymfeklieren uit gekweekte VX2 cellen verschenen vergelijkbaar met tumoren uit in vivo VX2 cellen op histologie (Figuur 3), met dichte hematoxyline gekleurd cellen binnenvallende spieren en vorming van klier achtige structuren met veel pathologische mitotische figuren.

Met behulp van een nieuwe Imaging-agent werden de Porphysome, 81 lymfeklieren intra-operatief geïdentificeerd en chirurgisch verwijderd voor histologische analyse. 74 lymfeklieren waren linkerbekken lymfeklieren, 5 waren rechter bekken lymfeklieren en 2 waren rechter para-aorta lymfeklieren. Lymfeklieren verwijderd uit konijnen met in vivo gekweekte VX2 tumoren waren significant groter en meer necrotisch dan die van konijnen verwijderd met gekweekte VX2 tumoren met een gemiddeld volume van 0,99 cm3 (bereik 0,12-3,89) versus 0,59 cm3 (0,01- 2,92) (p = 0.037). Ook konijnen met in vivo gekweekte tumoren hadden grotere necrotische uteriene tumoren dan konijnen met gekweekte celtumoren met een gemiddelde lengte van 5,6 cm (4-6,8 cm) en een gemiddelde breedte van 5,2 cm (3,3-9 cm) versus 3,6 cm (2-5 cm) en 4.56 cm (3-7 cm) respectievelijk. Tot slot hadden konijnen modellen gemaakt van in vivo VX2 cellen meer extra Nodale abdominale metastasen dan konijnen modellen gemaakt van gekweekte cellen met 91% van alle metastasen die in vivo gekweekte konijnen werden aangetroffen.

Figure 1
Figuur 1: baarmoeder suturing. Zwarte pijl = hechtingen, rode pijl = baarmoeder hoorns. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: VX2 tumor A) intra-uteriene tumor. Zwarte pijl = tumor, rode pijl = baarmoeder hoorns (B) gemetastaseerde linkerbekken lymfeklieren. Zwarte pijl = gemetastaseerde lymfeklieren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Histologie van gekweekte cel VX2 tumor A) H & E kleuring demonstreert tumorinfiltratie van omringende spieren (10x vergroting, schaalbalk = 300 μm) (B) pancytokeratin kleuring toont dicht kleuring tumorcellen overeenkomend met gebieden van tumor op H & E (10x vergroting, schaal = 300 μm). Zwarte pijl = VX2 tumor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Model type In vivo VX2 tumor model Gekweekte VX2 tumor model
Aantal geslaagde modellen 16 5
Aantal pogingen tot modellen 22 8
Succespercentage van model 73% 63%
Tijd van inoculatie tot experiment 29 dagen (24-31) 45 dagen (36-51)
Succesvolle injectie dosis 1 x 107 40 x 106
(5x106 per baarmoeder hoorn) (20 x 106 per baarmoeder hoorn)
Algemeen succespercentage 75%
Algemeen succespercentage voorafgaand aan baarmoeder-hechten 57%
Het totale succespercentage na de baarmoeder 81%

Tabel 1: model gegevens, waaronder experimentele omstandigheden, het aantal gebruikte dieren en het slagingspercentage. 2 konijnen aanvankelijk gebruikt voor gekweekte cel tumoren modellen waarin groei werd niet succesvol werden vervolgens gebruikt voor in vivo tumor modellen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hierin hebben we een gestandaardiseerde chirurgische methode voor de oprichting van een VX2 endometriumkanker model gerapporteerd en gerapporteerd over het eerste gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken. De tumor nemen tarief van 75% is lager dan de 100% percentage eerder gerapporteerd in de literatuur35,37,53,56; echter, thw 90% snelheid van pathologisch bevestigde lymfeklier metastasen is consistent met eerdere studies van dit model35,53.

De opname van uteriene deel het succespercentage van het model aanzienlijk verhoogd van 57% naar 81% en we beschouwen deze stap als een integraal onderdeel van het chirurgische protocol. Baarmoeder hechten werd in eerste instantie niet uitgevoerd als gevolg van conflicterende rapporten van het gebruik van het deel in de literatuur en bezorgdheid over de devascularisatie van de baarmoeder Hoorn van de ligatie van bilaterale baarmoeder slagader. Gezien de aanzienlijke verbetering in het nemen van het percentage van de baarmoeder, veronderstellen we dat lekkage van de celsuspensie weg van de injectieplaats kan hebben bijgedragen aan de initiële lage slagings graad. Anatomisch bevattende de celsuspensie in een klein deel van de baarmoeder hoorn zorgt ervoor dat een hoge lokale concentratie van cellen wordt blootgesteld aan de vasculatuur van het myometrium die waarschijnlijk de tumor engraftment verbetert. Bovendien werden geen gevallen van baarmoeder hoorn necrose opgemerkt in het experiment. Ervoor zorgen dat de celsuspensie in het myometrium wordt geïnjecteerd, is ook belangrijk omdat intra-uteriene of extra-myometriale injecties ook het verlies van celsuspensie kunnen verhogen. Het baarmoeder myometrium bij konijnen is extreem dun en de echte intra-myometriale injectie is moeilijk. Daarom veronderstellen we dat het gebruik van een cellulaire matrix-steiger zoals Matrigel de Take-rate van cellen die onbedoeld in de baarmoederholte worden geïnjecteerd, kan verbeteren. Ondanks deze mogelijke beperkingen, geloven wij dat de celsuspensie methode superieur is aan eerder gemelde microchirurgische methoden36 waarin tumor blokken op het baarmoeder myometrium worden geënt, omdat deze methode technisch uitdagend is. In vergelijking, de methode is hier eenvoudig, bevat veelgebruikte technieken en het is om deze redenen, wij geloven dat het zeer reproduceerbaar.

De in vivo gepropageerde VX2 konijnen modellen werden geïnjecteerd met een standaard dosis van 5 x 106 cellen per baarmoeder hoorn die was gebaseerd op de ervaring van een COLLABORATEUR met VX2 konijn modellen. Deze dosis is significant lager dan gerapporteerd in de literatuur waarin de celdoses zo hoog als 1 x 108 door Harima et al.52 en 5 x 109 door beide Huang37,53 en Xu35 werden gebruikt. Gezien het korte tijdsbestek waarin het model werd vastgesteld en de hoge snelheid van zowel lymfeklieren als extra-noïdale metastasen, geloven we niet dat het gebruik van een hogere dosis het model zou hebben verbeterd. Een hogere dosis kan hebben bevorderd nog snellere en agressieve tumor verspreiding die afbreuk zou doen aan het nut van het model. 83% van de in vivo gepropageerde VX2-modellen had op het moment van het experiment een extra Nodale ziekte en dit is verrassend dat andere groepen de ontwikkeling van abdominale metastasen niet op 30 dagen hebben melden. Een mogelijke verklaring voor dit verschil kan zijn onbedoelde intra-vasculaire inoculatie27 als gevolg van hoge druk of hoge snelheid injectie die kan resulteren in een snellere verre metastatische spreiding. We veronderstellen dus dat de snelheid van de injectie een factor kan zijn in de snelheid van metastasen, daarom bevelen we een langzame injectiesnelheid aan in het protocol.

Relatief, ondanks de hogere injectie dosis (20 x 106 per baarmoeder hoorn), ontwikkelde slechts 40% van de gekweekte VX2 model konijnen extra Nodale ziekte en alle gemetastaseerde deposito's waren merkbaar kleiner en minder necrotisch bij deze konijnen. We hebben geen literatuur waarmee direct de resultaten te vergelijken als dit is de eerste gerapporteerde gebruik van gekweekte VX2 cellen om dit model te maken. Echter, de bevindingen zijn consistent met studies van andere gekweekte VX2 tumoren waarin hoge inoculatie doses nodig waren en tumorgroei werd opgemerkt traag27,31. Door dit experiment hebben we de optimale injectie dosis van 20 x 106 cellen per baarmoeder hoorn geïdentificeerd, wat resulteerde in een betrouwbare groei en metastasen in 80% van de konijnen met behulp van een escalerend dosis protocol. Het is mogelijk dat een nog hogere dosis van gekweekte VX2 cellen zou resulteren in snellere metastatische spreiding, maar naarmate de VX2 cellen langzaam toenam in cultuur, was het uitdagend om genoeg cellen te kweken om een hogere dosis te proberen. Dit is een beperking van de studie en hebben dit geïdentificeerd als een potentieel gebied voor toekomstig onderzoek. We beschouwen echter de langzamere groeisnelheid in het gekweekte celmodel als voordelig omdat we denken dat het het klinische scenario van endometriumkanker betrouwbaarder kan repliceren, omdat endometriumkanker over het algemeen een trage groei ziekte is die eerst metastasizes de lymfeklieren van het bekken en resulteert in laat-verre metastasen. De eerste keuze voor het propageren van de VX2 cellen in muizen toegestaan voor een snellere ommekeer, en minder dure onderhoudskosten; maar als alternatief konden de cellen rechtstreeks uit de quadriceps spier van konijnen zijn afgeleid.

Wij zijn van mening dat de nauwe postoperatieve controle op tekenen en symptomen van tumorgroei een belangrijk aspect van het protocol is. In onze ervaring, zodra konijnen gemetastaseerde ziekte ontwikkelen, komen ze snel naar klinisch onwel, met name in de in vivo gepropageerde groep. Deze snelle, agressieve groei werd benadrukt door de dood van één konijn van gemetastaseerde ziekte na een vertraging van slechts 2 dagen vanaf de geplande experiment datum. Terwijl de snelheid van VX2 model inrichting is beschouwd als een sterkte, als vergelijkbare Muismodellen (dat wil zeggen, HEC-1 endometrium carcinoom model met lymfeklier metastasen in muizen) kan tot twee keer zo lang duren om57vast te stellen, deze bevindingen tonen ook aan dat het bepalen van de optimale experimentele timing voorop staat. De bevindingen correleren met eerdere studies waarin tumorgroei en de uitbreiding van de lymfeklieren aanzienlijk toenam na de postoperatieve dag 2137,53; We geloven echter dat er variabiliteit is met betrekking tot de VX2 cellijn die wordt gebruikt en groepen aanmoedigen om hun specifieke experimentele timing te begrijpen. Deze tijdlijn geldt niet voor onze gekweekte VX2 modellen en hebben dit geïdentificeerd als een gebied dat verder onderzoek vereist. Om zeker te zijn over tumorgroei, we kozen voor het gebruik van zowel niet-invasieve en invasieve tumor monitoring tijdens het protocol. Een andere toekomstige richting kan echter zijn om het postoperatieve beeldvormings protocol te verfijnen om te voorkomen dat er een tweede invasieve ingreep nodig is.

Over het algemeen hebben we een eenvoudige, gestandaardiseerde methode gerapporteerd om een model van endometriumkanker met retroperitoneale lymfadenopathie bij konijnen te creëren. Via dit protocol hebben we de significante variabiliteit binnen de VX2 literatuur aangepakt met betrekking tot de celdosis, chirurgische techniek en post-operatieve model monitoring. We erkennen dat een verdere beperking van de studie is dat bij het gebruik van een VX2 cellijn in plaats van een menselijke xenotransplantaatmodellen is we niet volledig nabootsen van de tumor biologie en micro-omgeving van menselijke kanker. We hopen echter dat andere groepen gekweekte VX2 cellen zullen gebruiken om hun modellen te maken, omdat we geloven dat dit celtype menselijk endometriumkanker betrouwbaarder kan modelleren door zijn langzamere groei en verminderde neiging tot metastasize. We moedigen andere groepen aan dit snelle en eenvoudige model van baarmoeder afgeleide retroperitoneale lymfeklier metastasen aan om nieuwe beeldvormings therapieën te bestuderen om patiënten met gemetastaseerd endometriumkanker te helpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd gefinancierd door het Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), het Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), het Canadian Cancer Society Research Institute (704718), natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad van Canada, Stichting сanada voor innovatie en Prinses Margaret Cancer Foundation.

Ik wil Dr. Marguerite Akens bedanken voor het leveren van de initiële VX2 cellen voor de oprichting van het oorspronkelijke VX2 model en de bevroren VX2 tumor blokken. Ik wil Marco DiGrappa bedanken voor het helpen bij het uitvoeren van initiële VX2 Cell Culture experimenten en Lili ding voor het helpen met VX2 celcultuur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109 (2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49 (2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859 (2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Tags

Kankeronderzoek probleem 151 endometriumkanker Orthotopic kanker model VX2 cellijn lymfadenopathie konijn model chirurgisch model celcultuur
Een Orthothematisch endometriumkanker model met Retroperitoneale lymfadenopathie gemaakt van in vivo gepropageerd en gekweekte VX2 cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., … More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter