Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En Orthotopic livmor Cancer modell med retroperitoneal lymfadenopati laget fra in vivo spredte og kultivert VX2 Cells

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

Denne protokollen presenterer en standardisert metode for å vokse VX2 celler i kultur og å skape en orthotopic VX2 modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser i kaniner. Orthotopic livmorkreft modeller er viktig for pre-klinisk studie av romanen Imaging modaliteter for diagnostisering av lymfeknuter metastaser.

Abstract

Livmorkreft er den vanligste Gynecologic kreft i Nord-Amerika og forekomsten er økende over hele verden. Behandling består av kirurgi med eller uten adjuvant behandling avhengig av lymfe node engasjement som bestemmes av lymfadenektomi. Lymfadenektomi er en sykelig prosedyre, som ikke har vist å ha en terapeutisk fordel hos mange pasienter, og dermed en ny metode for å diagnostisere lymfeknuter metastaser er nødvendig. For å teste romanen Imaging agenter, en pålitelig modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser er nødvendig. Den VX2 livmorkreft modellen har blitt beskrevet ofte i litteraturen; Imidlertid finnes betydelig variasjon med hensyn til metoden for modellen etablering. Videre har ingen studier rapportert om bruk av kulturperler VX2 celler for å lage denne modellen som bare celler overført in vivo har vært tidligere brukt. Heri, presenterer vi en standardisert kirurgisk metode og post-operative overvåking metode for etablering av VX2 livmorkreft modell og rapport om den første bruken av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen.

Introduction

Livmorkreft, eller kreft i slimhinnen i livmoren, er den nest vanligste Gynecologic kreft verden og den vanligste kreft i utviklede land1. Forekomsten av livmorkreft har stadig økt, stiger med 2,3% per år mellom 2005-2013 med en tilsvarende 2,2% økning i dødelighet1,2,3. Diagnostisering av lymfeknuter metastaser er viktig som tilstedeværelsen av positive lymfeknuter er en sterk negativ indikasjon på overlevelse4,5,6,7 og kan veilede administrasjonen av adjuvant behandling8,9,10,11,12,13. Lymfeknuter metastaser er for tiden diagnostisert ved kirurgisk fjerne lymfesystemet overliggende de store blodkarene i bekkenet og magen. Denne prosedyren, kjent som en lymfadenektomi, er kontroversiell på grunn av motstridende overlevelses data fra to store forsøk14,15,16,17,18 og den kjente risiko for intra-operative15,19,20 og postoperativ sykelighet21,22,23. Som dagens ikke-invasiv Imaging modaliteter ikke har den nødvendige følsomhet og spesifisitet til å erstatte lymfeknuter disseksjon24, har det vært et push for å utvikle nye diagnostiske Imaging teknikker. For å teste disse romanen teknikker i en pre-klinisk setting, en pålitelig modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser er nødvendig.

The Rabbit VX2 tumor modellen er en veletablert modell som har blitt brukt i stor utstrekning for å studere flere menneskelige solide organsvulster 25 inkludert lunge26, hode og nakke27,28, lever29, nyre30, Bone31,32, Brain33, bukspyttkjertel34 oglivmor 35,36,37. Det VX2 modell var opprinnelig bebygget inne 1940 av Kidd og Rous38 av med hell transplantere en smukken kanin papilloma virus oppdaget av Shope inne 193339. Siden det tid, det VX2 modell er blitt holdt inne Vivo, behøver føljetong passasje inne det quadriceps muskelen av hvit New Zealand kanin40. Flere nylig men flere grupper har blitt dyrket VX2 celler in vitro40,41,42 og demonstrerte beholdt tumorigenecity av kultivert cellelinje31, 42,43. VX2 svulster er histologisk definert som anaplastisk plateepitel celle kreftsvulster44 og inneholder kjertel funksjoner som ligne adenokarsinom26. Svulster kjennetegnes ved enkel implantation, rask vekst og Hyper-vascularity44,45 og pålitelig metastase, oftest til regionale og fjerne lymfeknuter45. Likheter i livmor vaskulær og lymfatisk anatomi46 samt orthotopic vekst området sikre at metastatisk mønster av kanin VX2 kreft etterligner at menneskets livmorkreft, noe som gjør VX2 modellen en pålitelig modell for å studere menneskelig metastatisk sykdom. Videre histologic funksjoner som unormal mikrovaskulær spredning47 , så vel som immunologiske48 og genetiske likheter49,50 mellom mennesker og kaniner tyder på at svulsten mikromiljøet kan gjenspeile at menneskets livmorkreft.

Flere grupper har rapportert om bruk av VX2 å lage en modell av livmorkreft med retroperitoneal metastaser med en høy rapportert rate av suksess36,51,52; Det finnes imidlertid betydelig variasjon innenfor gjeldende litteratur med hensyn til metoden for modell opprettelse. Cell suspensjon doser så lavt som 4 x10 5 celler/livmorhorn 51 og så høyt som 5 x 109 celler/livmor horn37,har53 blitt rapportert uten standard konsensus om den nødvendige VX2 Cellular dose. I tillegg har en rekke inoculation metoder er rapportert inkludert mikro-kirurgisk implantation av tumor inn i livmor myometriet36, injeksjon av VX2 celle suspensjon37,44,52 , 53 og i noen tilfeller, tilsetning av livmor horn suturing før innoculation52. Til slutt, ingen grupper har rapportert bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Således er hensikten med denne studien er å demonstrere en vellykket standardisert metode for VX2 modell opprettelse og å rapportere den første bruken av kultivert VX2 celler for å skape en modell av livmorkreft med retroperitoneal metastaser i en kanin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyp abdominal vegg lukking: Identifiser toppen av bukhulen snitt og ta tak i peritoneum, Rectus muskler og konsept med vev tang. Alle dyrestudier ble utført i Animal Resource Center (ARC) godkjent anlegg av University Health Network og i samsvar med godkjent dyr bruk og omsorg protokoller (AUP #3994/#4299). VX2 cellelinje ble innhentet fra Dr. Aken ' s Lab ved University Health Network.

1. opprettelse av in vitro VX2 cellelinje

  1. Høste VX2 svulst fra kanin quadricep muskelen og vekst i mus flanken.
    1. Tin frosne VX2 tumor blokker (1 cm x 1 cm), hakke på en kultur tallerken ved hjelp av en skalpell blad og press gjennom et 70 μm filter ved å legge små mengder Hanks balansert salt Solution (HBSS) sekvensielt for å sikre at alle celler er anstrengt for et endelig volum på 1 mL.
    2. Telle celler og fortynne med 0,9% fosfat bufret saltoppløsning til en konsentrasjon på 1 x 107/ml og sted på isen i et sterilt rør.
      Merk: tumor blokker ble innhentet fra en lab samarbeidspartner fra tidligere forplantning av VX2 svulster i kanin quadriceps muskler.
    3. Bedøve en kvinnelig hvit New Zealand kanin (vekt 2,5-3,5 kg) med 2-5% inhalert isoflurane, fjerne pelsen overliggende injeksjonsstedet og renser injeksjonsstedet med povidon-jod løsning. Injiser 500 μL av den tilberedte VX2 celle fjæringen (5 x 106 celler/ml) inn i den quadriceps muskelen til kaninen. Dataskjerm kaninen klinisk for svulst oppblomstringen igangsetting opp på dag 10.
    4. Euthanize kaniner etter svulster nå 1-1,5 cm i diameter (målt eksternt med markører) ved hjelp av en veterinær godkjent metode. Bekreft døds aktiv ved å sjekke vitale tegn inkludert hjertefrekvens og respirasjonsfrekvens. Avgiftsdirektoratet svulsten ved hjelp av sterile instrumenter etter rengjøring av området med Betadine løsning.
    5. I en biologisk sikkerhetskabinett ved hjelp av sterile instrumenter, hakke svulsten i små biter (0,2 cm) på en 10 cm vev kultur parabol ved hjelp av en skalpell blad. Passerer tumor fragmenter gjennom en 70 μm celle sil med 1 mL HBSS som beskrevet i trinn 1.1.1. Telle celler og fortynne bruke 0,9% saltvann løsning for å få 7,5 x 105 celler i 200 μL.
    6. Bedøve mannlige NOD scid gamma mus (vekt 25 g) med 4% isoflurane ved 1 L/min og vedlikeholde anestesi ved hjelp av 2% isoflurane. Når musene er anesthetized, injiserer 200 μL av oppløsningen fra trinn 1.1.5 inn i subkutan vev av musen flanken ved hjelp av en 27 gauge nål.
  2. Høsting og passaging av VX2 celler in vitro
    1. Overvåk xenograft vekst klinisk to ganger i uken til svulster nå 1 cm i diameter ved hjelp av markører.
    2. Euthanize mus ved å plassere i en CO2 kammer eller utføre cervical forvridning etter anesthetizing med 4% isoflurane gass. Avgiftsdirektoratet svulster under sterile forhold i en biologisk sikkerhetskabinett.
    3. Hakke svulster med en skalpell inn 1-2 mm brikker i en 6 cm vev kultur parabolen inneholder 3 mL Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM)/ham ' s F12 + 10% fosterets storfe serum (FBS) Media.
    4. La svulst fragmenter uforstyrret i en 37 ° c inkubator med 5% CO2 for to dager før cellene begynner å vokse ut fra tumor stykker. Deretter sjekker kulturperler plater daglig av lys mikroskopi for celle confluency. Ved å nå 70% confluency, trypsinize celler ved å legge 1 mL 0,05% Trypsin til flasken og plassere tilbake i 37 ° c inkubator i 5 min.
    5. Nøytralisere Trypsin med 6 mL DMEM/ham ' s F12 + 10% FBS medium, samle celler og sentrifuger ved 4 ° c i 5 min ved 300 x g. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i 3,5 mL nye DMEM/ham ' s F12 + 10% FBS Media. Seed frisk 6 cm kollagen jeg belagt plater med 1,6 x 106 celler per plate for å oppnå ca 50% celle seeding tetthet.
      Merk: 50% celle tetthet refererer til cellene som tar opp 50% av arealet av platen når den er vedlagt.
    6. Tidlig passaging: Gjenta prosessen ovenfor (trypsinizing, seeding) til cellene har blitt passert 5 ganger og deretter vurdere cellelinje renhet med PCR ved hjelp av en kvantitativ PCR-analysen for å skille kanin genomisk DNA fra mus genomisk DNA (se trinn 1.3.1-1.3.4).
      Merk: etter 8 passasjer, celler kan spres på ikke-kollagen belagt vanlige tilhenger vev kultur plater.
    7. Passage, trypsinize og fryse alikvoter av celler i DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO ved en konsentrasjon på 2 x 106 per hetteglass. Oppbevar celler i flytende nitrogen inntil nødvendig for eksperimenter.
  3. Bekreftelse av VX2 opprinnelse av overlevende celler:
    1. Lag en standard kur fra renset genomisk mus og kanin DNA (Step 1.3.2 og Step 1.3.3). Bruk primere som mål arter-spesifikke sekvenser innenfor den andre åpne lese ramme av LINE-1 retrotransposon element.
      Merk: primer sekvenser for CRPV E6 er: 5 '-GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5 '-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Retrotransposon-elementene LINE-1 ble brukt. Primer sekvenser for kanin linje-1 er: 5 '-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC og 5 '-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT primer sekvenser for muse linje-1 er: 5 '-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG og 5 '-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
    2. For å lage en standard kurve for CRPV E6, rens VX2 tumor celle lysat (trinn 1.1.1) ved hjelp av et kommersielt sett etter produsentens protokoll. Kvantifisere dette DNA ved hjelp av en kommersiell analysen. Utfør 6 seriell fortynninger fra 225 PG/μL til 0,925 PG/μL i lav EDTA-TE buffer. For å lage en standard kurve for mus genomisk DNA, fortynne 100 μg av kommersiell mus genomisk DNA i lav EDTA-TE buffer i 5 fortynninger fra 125 PG/μL ned til 0,0125 PG/μL.
    3. Plasser 4 μL fra hver fortynnet oppløsning fra prøvene fra trinn 1.3.2 i brønner og Kjør prøver i en PCR-thermocycler. Bruk cq verdier fra hver kjøre sammen med DNA beløp per brønn for å beregne en standard kurve ved hjelp av thermocycler programvare Auto-terskel innstillinger.
    4. Bruk standard qPCR-prosedyrer for å utføre PCR med 40 sykluser med 2-trinns sykling (98 ° c og 60 ° c) på en thermocycler. Etablere terskelverdier, og sette delta CT verdier på > 35 for å sikre at det er minimal mus forurensning i kanin VX2 cellelinje. Det totale volumet av hver reaksjon var 10 μL, bestående av 5 μL av 2x Mastermix, 1 μL av forover + Reverse primere med endelig primer konsentrasjon i reaksjon ved 250 nM, og 4 μL av DNA-prøve.
      Merk: se referanser54,55 for detaljer om utføring av PCR. Terskelverdier er etablert, og delta CT verdier er satt til > 35 for å sikre at det er minimal mus forurensning i kanin VX2 cellelinje. Det anbefalte nivået av VX2 DNA for pålitelig påvisning av qPCR er 1-10 PG.

2. VX2 cellekultur og etablering av celle suspensjon

  1. Tin hetteglass som inneholder VX2-celler (frosset i trinn 1.2.7) i et vannbad ved 37 ° c i 1 minutt og Overfør celler til et konisk sentrifugerør med 10 mL kultur medium (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS og 1% penicillin-Streptomycin). Sentrifuger for 8 min ved 107 x g, kast supernatanten og re-suspendere celle pellet i 9 ml medier.
  2. Overfør re-suspendert celler til en stor kultur kolbe. Ruge celler uten risting ved 37 ° c. Sjekk celler daglig for samløpet med lys mikroskopi og endre kultur Media hver tredje dag.
  3. Opprettelse av kultivert VX2 celle suspensjon til injeksjon
    1. Trypsinize celler ved å legge til 3 mL 0,25% Trypsin til kolbe når cellene har nådd 80% samløpet. Plasser flasken i inkubator (37 ° c) i 5 min. overførings løsning til et konisk sentrifugerør og sentrifuge for 8 min ved 107 x g og fjern deretter supernatanten.
    2. Vask celle pellets 3 ganger med 9 mL fosfat bufret saltvann, sentrifuger og fjern supernatanten som ovenfor. Telle cellene og fortynne med 0,9% fosfat bufret saltoppløsning til en konsentrasjon av 4 x 107 celler/ml og plasser i et sterilt konisk sentrifugerør på isen.
  4. Opprettelse av in vivo spredte VX2 celle suspensjon for injeksjon
    1. Tin frosne VX2 tumor blokker (1 cm x 1 cm), hakke på en kultur tallerken med en skalpell blad og press gjennom et 70 μm filter som i trinn 1.1.1. Legg til små mengder HBSS sekvensielt for å sikre at alle celler er anstrengt for et endelig volum på 1 mL. Telle celler og fortynne med 0,9% fosfat bufret saltvann til en konsentrasjon av 1 x107/ml og sted på isen i et sterilt rør.
      Merk: tumor blokker ble innhentet fra en lab samarbeidspartner fra tidligere forplantning av VX2 svulster i kanin quadriceps muskler.

3. kirurgisk modell etablering

  1. Etablering av kirurgisk anestesi og pre-operative forberedelser
    1. Pre-medisinere hunn hvit New Zealand kaniner (2,5-3,5 kg) 1 h før den planlagte kirurgiske prosedyren ved hjelp av injeksjoner av acepromazine (1 mg/kg IM) og meloksikam (0,2 mg/kg SQ). Bedøve en kvinnelig hvit New Zealand kanin (vekt 2,5-3,5 kg) med 2-5% inhalert isoflurane, fjerne pelsen overliggende injeksjonsstedet og renser injeksjonsstedet med povidon-jod løsning.
    2. Intubere anesthetized kaniner ved hjelp av en laryngeal maske luftveiene (LMA) og sikre på plass med tape, opprettholde dyp anestesi ved titrating inhalert isoflurane dose mellom 2-5%. Overvåk kirurgisk anestesi regelmessig gjennom hele prosedyren ved å sjekke vitale tegn (respirasjonsfrekvens, kapillær påfylling, oksygenmetning hvis tilgjengelig) og overvåking for tegn som tyder på smerte (bevegelse, tilbaketrekking fra stimuli, lyder) eller lys anestesi (bevegelse, tygge på LMA tube).
      Merk: Dette bør gjøres av noen med erfaring overvåking kirurgisk anestesi.
    3. Plasser et øre åre kateter med 22 spor i en marginal rygg vene. Administrer cefazolin (20 mg/kg) intravenøst 10 min før kirurgisk hud snitt.
    4. Clip håret over bekkenet og magen før du plasserer kaninen på operasjonsbordet, og deretter plassere kaniner i en rygg posisjon på operasjonsbordet. Rengjør operasjonsfeltet ved hjelp av en 3-trinns kirurgisk hud prep (Betadine såpe, klorheksidin løsning, Betadine løsning). Den kirurgiske feltet med laparotomy forheng etter land-merking toppen av skambenet, etterlot et 5 cm x 5 cm areal på nedre del av magen eksponert.
  2. Opprettelse av laparotomy snitt og identifisering av livmor hornene
    1. Sett på en kirurgisk lue og ansiktsmaske. Skrubb hender med klorheksidin eller Betadine kirurgisk skrubb løsning. Ved hjelp av steril teknikk, ta på en steril kappe og sterile kirurgiske hansker.
    2. Ved hjelp av en # 11-Blade skalpell, lage en 2,5 cm lange snitt 1 cm skallen til symphesis pubis gjennom hud og under Huds vev av kanin magen. Incise den Rectus konseptet og analysere Rectus musklene sideveis for å avdekke den underliggende peritoneum. Angi peritoneum kraftig etter å sikre asymmetrisk er klar av tarm eller andre abdominal organer.
    3. Finn livmor hornene identifisere urin blæren og feiende en hansker finger superiorly, posteriort og sidelengs over toppen av blæren.
      Merk: Hvis det er nødvendig, kan den fulle blæren tømmes ved hjelp av digitalt trykk. Når plassert, bringe livmor hornene gjennom abdominal snitt til å hvile på bukveggen.
    4. Ved hjelp av en 3-0 flettet absorberbare Sutur, utføre en enkelt Sutur ligation av hver livmor horn ca 1.5-2,0 cm til å cervices. Plasser Sutur bare midtre delen av livmor arteriene, som går langs den laterale aspektet av hvert horn. Fest sting perfekt for å tette det opp-over livmor hornene (figur 1).
  3. Myometrielle VX2 inoculation
    1. Ved hjelp av en 27-gauge nål, injisere 0,5 mL av tidligere forberedt VX2 celle suspensjon fra enten trinn 2.3.2 (for kultivert VX2 modell) eller 2,4 (for in vivo spredte VX2 modell) i myometriet av hver livmor horn proksimale til Sutur området (mellom Sutur området og livmorhalsen). Injiser over 1 minutt og sikre at cellene ikke blir injisert i det underliggende livmor hulrommet. Bedøve dyr bruker inhalert isoflurane (2-5%) og en bedøvelse maskin med en Bain krets.
    2. Påfør Trykk på myometrielle injeksjonssted for 30 s etter injeksjon for å minimere lekkasje av celler. Inspiser injeksjon og Sutur plass for hemostase og plassere livmor hornene tilbake i magen.
  4. Lukke kirurgisk snitt
    1. Dyp abdominal vegg lukking: Identifiser toppen av bukhulen snitt og ta tak i peritoneum, Rectus muskler og konsept med vev tang.
      1. For å gjøre dette, forankre Sutur på en Apex av snittet ved suturing overfladisk til dypt på den ene siden av snittet og dypt til overfladisk på den andre. Knyt en knute. Ved hjelp av vedlagte Sutur, gjør kjører masker vinkelrett på snittet gjennom lagene i bukveggen arbeider trinn-klok langs snittet fra side til side. Bind Sutur og kutt.
    2. Overfladisk bukvegg lukking: Identifiser Apex av huden snitt og Sutur mage huden ved hjelp av begravet kjører subcuticular 3-0 absorberbare Poly-filament Sutur. Påfør kirurgisk lim til lukket snitt for å motsette seg hud kantene.
      1. For å gjøre dette, forankre Sutur på en Apex av snittet, ved suturing dyp til overfladisk på den ene siden av snittet og overfladisk til dypt på den andre. Knyt en knute. Ved hjelp av vedlagte sting, gjør du kjører masker i dermal laget parallelt med snittet arbeider Step-klok langs snittet fra side til side. Bind Sutur og kutt.
  5. Post-operative omsorg
    1. Oppvåkning fra anestesi: slå av isoflurane når snittet er lukket og la kaninen pusten oksygen av masken mens overvåking for tegn på oppvåkning (f. eks spontane bevegelser, øye åpning og tygge bevegelser på laryngeal masken luftveiene). Ekstubere kaninen en gang disse underskriver er bemerket og skaffe oksygen av maske og en hjertelig teppe til det kanin er flyalarm og kjøpedyktig sitte på egen hånd.
    2. Postoperativ overvåkning: Overvåk kaniner to ganger om dagen i 4 dager og daglig for ytterligere 10 dager etter operativt. Å overvåke, vurdere deres generelle tilstand, deres mat og vanninntak, urin og avføring, smerte vurdering, vekt, vitale tegn (hjertefrekvens, åndedrett rate) og deres operasjons sted på jakt etter hevelse, erythema, utflod eller dehiscence.
    3. Post-operative smerte kontroll: administrere meloksikam daglig (0,2 mg/kg SQ) for 48 h post-operativt og deretter etter behov basert på smerte vurdering. Administrer buprenorfin umiddelbart etter operativt og hver 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) for 24 timer og deretter etter behov basert på smerte vurdering
    4. Antibiotika (enrofloksacin 5 mg/kg IM) kan administreres daglig i sju dager etter operativt for å hindre sårinfeksjon som anbefalt av veterinæren din. Administrere subkutan væsker (15 mL SQ) to ganger om dagen etter behov for dehydrering og myk mat eller andre kosttilskudd tilbys daglig etter behov for vekttap.

4. tumor vekst overvåking

  1. Klinisk overvåking: Monitor kaniner hver 2 dager for kliniske tegn på tumor vekst starter på post-operative dag 14. Kliniske tegn på tumor vekst kan inkludere redusert oral inntak, apati, abdominal ømhet, håndgripelig abdominal masse og tap av cecotrophy.
  2. Bildebehandling og invasiv overvåkning
    1. CT tenkelig: på post-operative dag 21-28, pre-medisinere, bedøve, og intubere kaniner som tidligere beskrevet i 3.1.1-3.1.2. Plasser kaniner i en rygg posisjon i en pre-klinisk CT-scanner og få bilder av bekkenet og magen etter administrering 10 mL av intravenøs iohexol kontrastmiddel.
    2. Kirurgisk overvåking: Overfør kaniner til operasjonsstuen etter bildebehandling mens du fremdeles er under generell bedøvelse. Posisjon, prep og gardin kaniner som tidligere beskrevet i trinn 3.1.4 og utføre en gjenta laparotomy snitt ca 1,5 cm i lengde gjennom forrige snitt. Identifiser og livmor hornene og nøye undersøke for tumor. Lukk snittet og gi postoperativ omsorg som tidligere beskrevet i trinn 3.5.2-3.5.4.
    3. Rabbit modell bruk: Hvis kaniner er funnet å ha svulster på tidspunktet for kirurgisk overvåking, bruk kanin livmorkreft modeller for planlagte eksperimenter. Bruk kanin skapt fra inne vivo spredt celler for i tillegg eksperimenter for 4-ukens stolpe-inoculation og bruk kanin modeller skapt fra kultivert VX2 celler for ca 5-6 ukens stolpe-inoculation å gjøre rede for senere svulst oppblomstringen. Euthanize kaniner etter svulster nå 1-1,5 cm i diameter (målt eksternt med markører) ved hjelp av en veterinær godkjent metode. Bekreft døds aktiv ved å sjekke vitale tegn inkludert hjertefrekvens og respirasjonsfrekvens. Avgiftsdirektoratet svulsten ved hjelp av sterile instrumenter etter rengjøring av området med Betadine løsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tyve-åtte kanin var anvendt for det kreasjon av det livmor kreften modell. Kaniner hadde en gjennomsnittlig vekt på 2,83 kg (2.71-3.58 kg) på tidspunktet for eksperimentet. Livmor tumorer hell vokste i 21 kaniner for en helhetlig modell suksess rate på 75%. Før inkludering av livmor suturing i protokollen, var suksessraten 57% sammenlignet med 81% etter livmor suturing ble lagt til. Livmor suturing ble lagt til protokollen etter 7th kanin som svar på den første lave modellen suksess rate. Fem modeller ble opprettet fra kultivert VX2 celler (forsøkt i 8 kaniner, 63% suksess rate) og 16 kanin modeller ble opprettet fra in vivo spredte celler (forsøkt i 22, 73% suksess rate). I modeller laget fra in vivo spredte VX2 celler, en celle dose på 5 x 106 per livmor horn ble brukt i alle dyr og gjennomsnittlig antall dager fra inoculation å eksperimentere var 29 dager (rekkevidde 24-31). I modeller laget fra kultivert VX2 celler, en eskalere dose protokollen ble brukt til å bestemme riktig inoculation dose. Doser på 2,5 x 106 celler og 5 x 106 celler per livmor horn mislyktes og en dose på 10 x 106 celler per livmor horn var vellykket i en kanin imidlertid tumorveksten var treg på 57 dager fra inoculation å eksperimentere. En dose på 20 x 106 celler per livmor horn var vellykket i 4 kaniner i en gjennomsnittlig tid på 45 dager (varierer 36-51 dager) fra inoculation å eksperimentere og ble dermed bestemt som den optimale injeksjon dose. Disse dataene er oppsummert i tabell 1. På PCR-analyse etter passering 5 var de kultivert VX2-cellene svært positive for både Rabbit LINE-1 og CRPV-E6 med kun spor av mus LI NE-1 ble identifisert (< 0,01 PG/μL). Celler ble senere dyrket i celle kulturen men veksten var treg med en gjennomsnittlig tid på 7 dager (6-9 d) for å oppnå kolbe confluency.

Alle modeller lyktes resulterte i metastatisk transformasjon av retroperitoneal lymfeknuter (figur 2). Nitten kaniner hadde patologisk bekreftet lymfe node metastaser og 11 hadde patologisk bekreftet ekstra-Nodal abdominal metastaser. En kanin hadde ikke distinkte lymfeknuter fjernet; men det hadde en høy byrde av intra-abdominal sykdom der lymfeknuter metastaser ble antatt, og en kanin døde før eksperimentet. Svulster og metastatisk lymfeknuter fra kultivert VX2 celler virket lik svulster fra in vivo spredte VX2 celler på histologi (Figur 3), med tette hematoksylin beiset celler invaderende muskel og forming kjertel-lignende strukturer med mange patologiske mitotisk tall.

Ved hjelp av en roman Imaging agent, den Porphysome, 81 lymfeknuter ble identifisert intra-operativt og kirurgisk fjernet for histologic analyse. 74 lymfeknuter ble forlatt bekken lymfeknuter, 5 var høyre bekken lymfeknuter og 2 var høyre para-aorta lymfeknuter. Lymfeknuter fjernet fra kaniner med in vivo spredte VX2 svulster var betydelig større og mer nekrotisk enn de som er fjernet fra kaniner med kultivert VX2 svulster med et gjennomsnittlig volum på 0,99 cm3 (Range 0,12-3,89) versus 0,59 cm3 (0,01- 2,92) (p = 0.037). Likeledes, kanin med inne vivo spredt svulst fikk større flere nekrotisk livmor svulst enn kanin med kultivert cellen svulst med en middel lengden 5.6 cm (4-6.8 cm) og middel bredde av 5.2 cm (3,3-9 cm) mot 3.6 cm (2-5 cm) og av 4.56 cm (3-7 cm) respectively. Til slutt, kanin modeller laget fra in vivo spredte VX2 celler hadde mer ekstra-Nodal abdominal metastaser enn kanin modeller laget av kulturperler celler med 91% av alle metastaser funnet i in vivo spredte kaniner.

Figure 1
Figur 1: livmor suturing. Svart pil = sting, rød pil = livmor horn. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: VX2 svulst (A) intra-livmor svulst. Svart pil = tumor, rød pil = livmor horn (B) metastatisk venstre bekken lymfeknuter. Svart pil = metastatisk lymfeknuter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Histologi av kultivert celle VX2 svulst (A) H & E flekker demonstrerer tumor infiltrasjon av omkringliggende muskel (10x forstørrelse, skala bar = 300 μm) (B) Pancytokeratin flekker demonstrerer tett farging tumorceller som tilsvarer områder av tumor på H & E (10x forstørrelse, Scale = 300 μm). Svart pil = VX2 svulst. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Modell type In vivo VX2 tumor modell Kultivert VX2 tumor modell
Antall vellykkede modeller 16 5
Antall forsøkte modeller 22 8
Suksess rate for modell 73 prosent 63 prosent
Tid fra inoculation til eksperiment 29 dager (24-31) 45 dager (36-51)
Vellykket injeksjon dose 1 x 107 40 x 106
(5x106 per livmor horn) (20 x 106 per livmor horn)
Samlet suksess rate 75 prosent
Samlet suksess rate før livmor suturing 57 prosent
Samlet suksess rate etter livmor suturing 81 prosent

Tabell 1: modell data inkludert eksperimentelle forhold, antall dyr som brukes, og suksess rate. 2 kaniner brukes i utgangspunktet for kultivert celle svulster modeller der veksten var mislykket ble senere brukt til in vivo tumor modeller

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri har vi rapportert en standardisert kirurgisk metode for etablering av en VX2 livmorkreft modell og rapportert om første bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Svulsten tar sats på 75% er lavere enn 100% prosentsats tidligere rapportert i litteraturen35,37,53,56; men THW 90% rate på patologisk bekreftet lymfeknuter metastaser er forenlig med tidligere studier av denne modellen35,53.

Inkluderingen av livmor suturing signifikant økt modellen suksess rate fra 57% til 81%, og vi anser dette trinnet for å være en integrert del av den kirurgiske protokollen. Livmor suturing ble ikke opprinnelig utført på grunn av motstridende rapporter om bruk av suturing i litteraturen og bekymringene om livmor horn devascularization fra bilaterale livmor arterien ligation. Gitt den betydelige forbedringen i ta rate med tillegg av livmor suturing, hypothesize vi at lekkasje av celle suspensjonen bort fra injeksjonsstedet kan ha bidratt til den første lave suksess rate. Anatomisk inneholder celle oppheng i en liten del av livmor Hornet sikrer at en høy lokal konsentrasjon av celler er eksponert for blodkar av myometriet som sannsynligvis forbedrer tumor engraftment. Videre, ingen tilfeller av livmor horn nekrose ble notert i eksperimentet. Sikre at cellen suspensjonen injiseres i myometriet er også viktig som intra-livmor eller ekstra-myometrielle injeksjoner kan også øke tap av celle suspensjon. Livmor myometriet i kaniner er ekstremt tynn og sann intra-myometrielle injeksjon er vanskelig. På grunn av dette, hypothesize vi at bruk av en mobilnettet matrise stillas som Matrigel kan forbedre ta rate av celler som er utilsiktet injiseres i livmor hulrom. Til tross for disse potensielle begrensningene, tror vi at celle fjæringen metoden er overlegen tidligere rapportert mikrokirurgisk metoder36 der tumor blokkene er podet på livmor myometriet som denne metoden er teknisk utfordrende. Til sammenligning metoden her er enkel, inkorporerer brukte teknikker og det er av disse grunner, tror vi det å være svært reproduserbar.

The in vivo spredte VX2 kanin modeller ble injisert med en standard dose på 5 x 106 celler per livmor horn som var basert på en samarbeidspartner erfaring med VX2 kanin modeller. Denne dosen er betydelig lavere enn det som er rapportert i litteraturen der celle doser så høyt som 1 x10 8 av Harima et al.52 og 5 x 109 av både Huang37,53 og Xu35 ble brukt. Gitt den korte tidsrammen der modellen ble etablert og den høye frekvensen av både lymfeknuter og ekstra Nodal metastaser, tror vi ikke at bruk av en høyere dose ville ha bedret modellen. En høyere dose kan ha fremmet enda raskere og aggressiv tumor spredning som ville svekke nytten av modellen. 83% av in vivo spredte VX2-modeller hadde ekstra Nodal sykdom på tidspunktet for eksperimentet, og dette er det overraskende at andre grupper ikke rapporterer utviklingen av abdominal metastaser på 30 dager. En mulig forklaring på denne forskjellen kan være utilsiktet intra-vaskulær inoculation27 på grunn av høyt trykk eller høyhastighets injeksjon som kan resultere i raskere Fjern metastatisk spredning. Vi hypothesize dermed at hastigheten på injeksjon kan være en faktor i frekvensen av metastaser som er grunnen til at vi anbefaler en langsom injeksjon hastighet i protokollen.

Relativt, til tross for høyere injeksjon dose (20 x 106 per livmor horn), bare 40% av den kultivert VX2 modell kaniner utviklet ekstra-Nodal sykdom og alle metastatisk innskudd var merkbart mindre og mindre nekrotisk i disse kaniner. Vi har ikke noen litteratur som å direkte sammenligne resultatene som dette er den første rapporterte bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Men funnene er i samsvar med studier av andre kultivert VX2 svulster der høye inoculation doser var nødvendig og tumor vekst ble bemerket å være langsom27,31. Gjennom dette eksperimentet, har vi identifisert den optimale injeksjons dosen på 20 x 106 celler per livmor horn som resulterte i pålitelig vekst og metastaser i 80% av kaniner ved hjelp av en økende dose protokoll. Det er mulig at en enda høyere dose av kultivert VX2 celler vil resultere i raskere metastatisk spredning imidlertid som VX2 cellene vokste langsomt i kultur, var det utfordrende å kultur nok celler til å forsøke en høyere dose. Dette er en begrensning av studien og har identifisert dette som et potensielt område for fremtidig etterforskning. Men vi anser tregere vekst i kultivert celle modell for å være fordelaktig som vi tror det kan gjenskape klinisk scenario av livmorkreft mer pålitelig, som livmorkreft er generelt en langsom voksende sykdom som metastasizes første til å bekken lymfeknuter og resulterer i sene fjerne metastaser. Det første valget for å spre VX2 cellene i mus tillatt for en raskere behandlingstid, og rimeligere vedlikeholdskostnader; men alternativt kunne cellene ha blitt avledet direkte fra quadriceps muskelen av kaniner.

Vi tror at den nære postoperativ overvåkingen av tegn og symptomer på tumor vekst er en viktig del av protokollen. I vår erfaring, når kaniner utvikle metastatisk sykdom, de utvikler seg raskt til å være klinisk uvel, særlig i in vivo spredte gruppen. Denne raske, aggressive veksten ble fremhevet av dødsfallet til en kanin fra metastatisk sykdom etter en forsinkelse på bare 2 dager fra den planlagte eksperiment datoen. Mens hastigheten på VX2 modellen etablering har blitt betraktet som en styrke, som lignende mus modeller (dvs. HEC-1 livmorkreft modell med lymfe node metastaser i mus) kan ta opptil dobbelt så lang tid å etablere57, disse funnene også demonstrere at fastsettelse av optimal eksperimentell timing er viktig. Funnene samsvarer med tidligere studier hvor tumor vekst og utvidelse av lymfeknuter økte betraktelig etter postoperativ dag 2137,53; men vi tror at det vil variasjon med hensyn til VX2 cellelinjen brukes og oppmuntre grupper til å forstå deres spesifikke eksperimentelle timing. Denne tidslinjen holder ikke sant for våre kultivert VX2 modeller og har identifisert dette som et område som krever videre studier. For å være sikker på tumor vekst, valgte vi å bruke både ikke-invasiv og invasiv tumor overvåking under protokollen. En annen fremtidig retning kan imidlertid være å avgrense den postoperativ bilde protokollen for å unngå behovet for en annen invasiv prosedyre.

Samlet sett har vi rapportert en enkel, standardisert metode for å lage en modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfadenopati i kaniner. Gjennom denne protokollen har vi adressert den betydelige variasjonen innenfor VX2 litteratur med hensyn til celle dose, kirurgisk teknikk og postoperativ modell overvåkning. Vi erkjenner at en ytterligere begrensning av studien er at i å bruke en VX2 cellelinje i stedet for en menneskelig xenograft vi ikke helt etterligne svulsten biologi og mikromiljøet av menneskelig kreft. Men vi håper andre grupper vil bruke kultivert VX2 celler til å lage sine modeller som vi tror denne cellen type kan modellen menneskelige livmorkreft mer pålitelig gjennom sin tregere vekst og redusert tilbøyelighet til å metastase. Vi oppfordrer andre grupper til denne rask og enkel modell av livmor avledet retroperitoneal lymfe node metastaser å studere romanen Imaging terapier for å hjelpe pasienter med metastatisk livmorkreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), Canadian Cancer Society Research Institute (704718), naturvitenskap og engineering Research Council of Canada, Сanada Foundation for innovasjon og prinsesse Margaret Cancer Foundation.

Jeg vil gjerne takke Dr. Marguerite Akens for å gi den første VX2 cellene for etablering av den innledende VX2 modellen og den frosne VX2 tumor blokker. Jeg vil gjerne takke Marco DiGrappa for å bidra til å utføre første VX2 cellekultur eksperimenter og Lili Ding for å hjelpe med VX2 cellekultur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109 (2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49 (2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859 (2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Tags

Kreftforskning livmor Cancer Orthotopic kreft modell VX2 cellelinje lymfadenopati Rabbit modell kirurgisk modell Cell kultur
En Orthotopic livmor Cancer modell med retroperitoneal lymfadenopati laget fra in vivo spredte og kultivert VX2 Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., … More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter