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Cancer Research

Un modello di cancro endometriale ortotopico con retroperitoneale Lmphadenopatia fatta da cellule VX2 in vivo propagate e coltivate

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per far crescere le cellule VX2 in coltura e per creare un modello ortotopico VX2 di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali nei conigli. I modelli di cancro endometriali ortotopici sono importanti per lo studio preclinico di nuove modalità di imaging per la diagnosi delle metastasi dei linfonodi.

Abstract

Il cancro dell'endometrio è la malignità ginecologica più comune in Nord America e l'incidenza è in aumento in tutto il mondo. Il trattamento consiste in un intervento chirurgico con o senza terapia adiuvante a seconda del coinvolgimento del linfonodo determinato dalla linfadenectomia. La linfodenectomia è una procedura morbosa, che non è stata dimostrata avere un beneficio terapeutico in molti pazienti, e quindi è necessario un nuovo metodo per diagnosticare le metastasi dei linfonodi. Per testare nuovi agenti di imaging, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali. Il modello di cancro endometriale VX2 è stato descritto frequentemente nella letteratura; tuttavia, esiste una variazione significativa rispetto al metodo di stabilimento del modello. Inoltre, non sono stati riportati studi sull'uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello in quanto solo le cellule propagate in vivo sono state utilizzate in precedenza. Qui, vi presentiamo un metodo chirurgico standardizzato e un metodo di monitoraggio post-operatorio per la creazione del modello di cancro endometriale VX2 e riferiamo sul primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare questo modello.

Introduction

Il cancro dell'endometrio, o cancro del rivestimento dell'utero, è la seconda malignità ginecologica più comune al mondo e la malignità più comune nelle nazioni sviluppate1. L'incidenza del cancro endometriale è aumentata costantemente, aumentando del 2,3% all'anno tra il 2005 e il 2013 con un corrispondente aumento del 2,2% della mortalità1,2,3. La diagnosi delle metastasi dei linfonodi è fondamentale in quanto la presenza di linfonodi positivi è un forte predittore negativo di sopravvivenza4,5,6,7 e può guidare la somministrazione di terapia adiuvante8,9,10,11,12,13. Le metastasi dei linfonodi sono attualmente diagnosticate rimuovendo chirurgicamente il tessuto linfatico sovrastante i principali vasi sanguigni del bacino e dell'addome. Questa procedura, nota come linfodenectomia, è controversa a causa di dati di sopravvivenza contrastanti da due grandi prove14,15,16,17,18 e il noto rischio di15,19,20 e morbilità post-operatoria21,22,23. Poiché le attuali modalità di imaging non invasivo non hanno la sensibilità e la specificità necessarie per sostituire la dissezionen. 24dei linfonodi, c'è stata una spinta a sviluppare nuove tecniche di imaging diagnostico. Per testare queste nuove tecniche in un ambiente preclinico, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali.

Il coniglio VX2 modello tumorale è un modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato per studiare più tumori dell'organo solido umano25 tra cui polmone26, testa e collo27,28, fegato29, rene30, osso31,32, cervello33, pancreas34 e utero35,36,37. Il modello VX2 è stato originariamente sviluppato nel 1940 da Kidd e Rous38 trapiantando con successo un papilloma di coniglio di cotone scoperto da Shope nel 193339. Da quel momento, il modello VX2 è stato mantenuto in vivo, richiedendo il passaggio seriale nel muscolo quadricipite dei conigli bianchi della Nuova èelanda40. Più recentemente, tuttavia, più gruppi sono cresciuti con successo cellule VX2 in vitro40,41,42 e dimostrato la tumorigeneità mantenuta della linea cellulare coltivata31, 42,43. I tumori VX2 sono istologicamente definiti come carcinomi a cellule squamose anaplastiche44 e contengono caratteristiche ghiandolari che assomigliano adenocarcinoma26. I tumori sono caratterizzati da facilità di impianto, rapida crescita e ipervascolarizzazione44,45 e metastatizza in modo affidabile, più comunemente ai linfonodi regionali e distanti45. Le somiglianze nell'anatomia vascolare e linfatica uterina46 così come il sito di crescita ortotopica assicurano che il modello metastatico del coniglio VX2 carcinoma mimi quello del cancro endometriale umano, rendendo il modello VX2 un modello affidabile per lo studio umano malattia metastatica. Inoltre, caratteristiche istologiche come la proliferazione microvascolare anormale47 , così come immunologiche48 e somiglianze genetiche49,50 tra gli esseri umani e i conigli suggeriscono che il tumore microambiente può riflettere quello del cancro dell'endometrio umano.

Più gruppi hanno riferito sull'uso di VX2 per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali con un alto tasso riportato di successo36,51,52; tuttavia, esiste una variazione significativa all'interno della letteratura attuale rispetto al metodo di creazione del modello. Dosi di sospensione cellulare a partire da 4 x 105 cellule / corno uterino51 e fino a 5 x 109 cellule / corno uterino37,53 sono stati segnalati con nessun consenso standard sulla dose cellulare VX2 richiesta. Inoltre, una varietà di metodi di inoculazione sono stati segnalati tra cui l'impianto micro-chirurgico del tumore nel miometrio uterino36, iniezione di sospensione cellulare VX237,44,52 , 53 e in alcuni casi, l'aggiunta di corno uterino sutura prima dell'innoculazione52. Infine, nessun gruppo ha segnalato l'uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di dimostrare un metodo standardizzato di successo di creazione del modello VX2 e di segnalare il primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali in un coniglio.

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Protocol

Chiusura profonda della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la forza del tessuto della fascia. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti nelle strutture approvate dall'Animal Resource Center (ARC) dell'University Health Network e in conformità con i protocolli approvati per l'uso e la cura degli animali (AUP #3994/#4299). La linea cellulare VX2 è stata ottenuta dal Dr. Aken's Lab presso l'University Health Network.

1. Creazione della linea cellulare VX2 in vitro

  1. Raccogliere il tumore VX2 dal muscolo quadricep coniglio e la crescita nel fianco del topo.
    1. Scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati (1 cm x 1 cm), macinata su una piastra di coltura utilizzando una lama del bisturi e sforzare attraverso un filtro di 70 m aggiungendo piccole quantità di Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in sequenza per garantire che tutte le cellule siano tese per un volume finale di 1 mL.
    2. Contare le cellule e diluire con 0.9% fosfato soluzione salina tamponata ad una concentrazione di 1 x 107/ mL e mettere sul ghiaccio in un tubo sterile.
      NOTA: I blocchi tumorali sono stati ottenuti da un collaboratore di laboratorio dalla precedente propagazione dei tumori VX2 nei muscoli del quadricipite del coniglio.
    3. Anestesizzare un coniglio bianco neozelandese femmina (peso 2,5-3,5 kg) con 2-5% isoflurane inalato, rimuovere la pelliccia sovrastante il sito di iniezione e pulire il sito di iniezione con soluzione povidone-iodio. Iniettare 500 l della sospensione cellulare VX2 preparata (5 x 106 cellule/mL) nel muscolo quadricipite del coniglio. Monitorare clinicamente il coniglio per la crescita del tumore a partire dal giorno 10.
    4. Eutanasia i conigli dopo i tumori raggiungono 1-1,5 cm di diametro (misurato esternamente con pinze) utilizzando un metodo approvato dal veterinario. Confermare l'eutanasia controllando i segni vitali, tra cui la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Accisa il tumore utilizzando strumenti sterili dopo la pulizia dell'area con soluzione betadina.
    5. In un armadio di sicurezza biologica utilizzando strumenti sterili, tritare il tumore in piccoli pezzi (0,2 cm) su un piatto di coltura del tessuto di 10 cm utilizzando una lama del bisturi. Passare i frammenti tumorali attraverso un colino cellulare di 70 m utilizzando 1 mL di HBSS come descritto al punto 1.1.1. Contare le celle e diluire utilizzando la soluzione salina dello 0,9% per ottenere 7,5 x 105 celle in 200 .
    6. Anestetizza i topi gamma di fantascientino maschi NOD (peso 25 g) utilizzando il 4% di isoflurane a 1 L/min e mantieni l'anestesia utilizzando 2% isoflurane. Una volta che i topi sono anestesizzati, iniettare 200 l della soluzione dal punto 1.1.5 nel tessuto sottocutaneo del fianco del topo utilizzando un ago calibro 27.
  2. Raccolta e passaggio di cellule VX2 in vitro
    1. Monitorare la crescita dello xenotrapianto clinicamente due volte alla settimana fino a quando i tumori raggiungono 1 cm di diametro utilizzando pinze.
    2. Topi eutanasi mettendo in una camera di CO2 o eseguendo lussazione cervicale dopo l'anestesizzazione con 4% di gas isoflurane. Tumori delle accise in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica.
    3. Mito i tumori con un bisturi in pezzi da 1-2 mm in un piatto di coltura tissutale di 6 cm contenente 3 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Il siero bovino fetale FBS (FBS) di Dulbecco.
    4. Lasciare i frammenti tumorali indisturbati in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con 5% di CO2 per due giorni fino a quando le cellule iniziano a crescere dai pezzi tumorali. Successivamente, controllare quotidianamente le lastre coltivate mediante microscopia leggera per la confluenza cellulare. Una volta raggiunta il 70% di confluenza, provare le cellule aggiungendo 1 mL dello 0,05% di trypsin al flacone e rimettendo indietro nell'incubatrice a 37 gradi per 5 min.
    5. Neutralizzare la trypsin a 6 mL di F12 di DMEM/Ham: mezzo FBS del 10%, raccogliere le cellule e centrifugare a 4 gradi centigradi per 5 min a 300 x g. Rimuovere il pellet supernatante e sospendi di nuovo in 3,5 mL del nuovo supporto F12 di F12/Ham del nuovo DMEM/Ham. Seme fresco 6 cm collagene I piastre rivestite con 1,6 x 106 cellule per piastra per ottenere circa 50% densità di semina cellulare.
      NOTA: la densità delle cellule del 50% si riferisce alle cellule che occupano il 50% della superficie della piastra quando sono attaccate.
    6. Passaggio anticipato: Ripetere il processo di cui sopra (provare, semina) fino a quando le cellule sono state passate 5 volte e quindi valutare la purezza della linea cellulare con PCR utilizzando un test PCR quantitativo per distinguere il DNA genomico del coniglio dal DNA genomico del topo (vedere passo 1.3.1-1.3.4).
      NOTA: Dopo 8 passaggi, le cellule possono essere propagate su piastre di coltura tissutali aderenti regolari non rivestite.
    7. Passaggio, provare e congelare le cellule in DMEM/HAM F12-30% FBS-10% DMSO ad una concentrazione di 2 x 106 per fiala. Conservare le cellule in azoto liquido fino a quando necessario per gli esperimenti.
  3. Conferma dell'origine VX2 delle cellule sopravvissute:
    1. Creare una cura standard dal DNA purificato di topi e conigli (Passaggio 1.3.2 e Passo 1.3.3). Utilizzare primer che prendono di mira sequenze specifiche della specie all'interno del secondo frame di lettura aperto dell'elemento retrotrasposon LINE-1.
      NOTA: le sequenze di primer per CRPV E6 sono: 5'- GATCCTGGACCACCAGTGe 5'-CCTGCCGGTCCCTCTCTTTAT. Sono stati utilizzati gli elementi retrotraposon line-1. Sequenze di primer per coniglio LINE-1 sono: 5'-TCAGGAAccAGAAGAAGTATGC e 5'-TTGATTTTTGAATGACCCAGTGT Primer per mouse LINE-1 sono: 5'-AATGGAAGCCAACATTCAGTGG e 5'-CCTTTTTTAccAGTATCAT
    2. Per creare una curva standard per CRPV E6, purificare il lisato delle cellule tumorali VX2 (Passaggio 1.1.1) utilizzando un kit commerciale seguendo il protocollo del produttore. Quantificare questo DNA utilizzando un saggio commerciale. Eseguire 6 diluizioni seriali da 225 pg/l a 0,925 pg/L in un buffer EDTA-TE basso. Per creare una curva standard per il DNA genomico del topo, diluire 100 g di DNA genomico di topo commerciale in un buffer EDTA-TE basso in 5 diluizioni da 125 pg/L fino a 0,0125 pg/L.
    3. Collocare 4 l.l da ogni soluzione diluita dai campioni del passaggio 1.3.2 in pozze ed eseguire i campioni in un termociclista PCR. Utilizzare i valori Cq di ogni esecuzione insieme agli importi di DNA per bene per calcolare una curva standard utilizzando le impostazioni di soglia automatica del software termociclista.
    4. Utilizzare le procedure qPCR standard per eseguire la PCR con 40 cicli di ciclismo in 2 fasi (98 e 60 gradi centigradi) su un termociclore. Stabilire i valori di soglia e impostare i valori Delta Ct su >35 per garantire che vi sia una contaminazione minima del mouse nella linea cellulare VX2 del coniglio. Il volume totale di ogni reazione era di 10 gradi, composto da 5 luna di 2x Mastermix, 1 luna di primer inversi con concentrazione finale di primer in reazione a 250 nM e 4 L di campione di DNA.
      NOTA: Vedere i riferimenti54,55 per informazioni dettagliate sull'esecuzione di PCR. Vengono stabiliti i valori di soglia e i valori Di Superficie delta vengono impostati su >35 per garantire una contaminazione minima del mouse nella linea cellulare VX2 del coniglio. Il livello consigliato di DNA VX2 per un rilevamento affidabile da parte di qPCR è 1-10 pg.

2. Coltura cellulare VX2 e creazione di sospensioni cellulari

  1. Scongelare le fiale contenenti cellule VX2 (congelate al punto 1.2.7) in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 1 minuto e trasferire le cellule in un tubo centrifuga conico con 10 mL di mezzo di coltura (1:1 DMEM/F-12 - 10% FBS e 1% Penicillina-streptomycin). Centrifuga per 8 min a 107 x g, scartare il supernatante e ri-sospendere il pellet cellulare in 9 mL di supporto.
  2. Trasferire le celle ri-sospese in una grande fiaschetta di coltura. Incubare le cellule senza agitare a 37 gradi centigradi. Controllare quotidianamente le cellule per la confluenza utilizzando la microscopia leggera e cambiare i media di coltura ogni tre giorni.
  3. Creazione di sospensione cellulare VX2 coltivata per l'iniezione
    1. Orpsinize cellule aggiungendo 3 mL di 0.25% trypsin a fiaschetta una volta che le cellule hanno raggiunto 80% confluenza. Mettere il flacone nell'incubatrice (37 gradi centigradi) per 5 min. Trasferire la soluzione in un tubo centrifuga conico e centrifugare per 8 min a 107 x g e quindi rimuovere il supernatante.
    2. Lavare i pellet cellulari 3 volte con 9 mL di fosfato tamponato salino, centrifugare e rimuovere supernatante come sopra. Contare le cellule e diluire con 0.9% fosfato soluzione salina tamponata ad una concentrazione di 4 x 107 cellule / mL e mettere in un tubo centrifuga conico sterile sul ghiaccio.
  4. Creazione di sospensione cellulare VX2 propagata in vivo per l'iniezione
    1. Scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati (1 cm x 1 cm), macinata su una piastra di coltura utilizzando una lama del bisturi e sforzare attraverso un filtro di 70 m come nel passo 1.1.1. Aggiungere piccole quantità di HBSS in sequenza per garantire che tutte le celle siano tese per un volume finale di 1 mL. Contare le cellule e diluire con 0.9% fosfato tamponato salina ad una concentrazione di 1 x107/ mL e mettere sul ghiaccio in un tubo sterile.
      NOTA: I blocchi tumorali sono stati ottenuti da un collaboratore di laboratorio dalla precedente propagazione dei tumori VX2 nei muscoli del quadricipite del coniglio.

3. Stabilimento del modello chirurgico

  1. Istituzione di anestesia chirurgica e preparazione pre-operatoria
    1. Pre-medicate femmina bianco conigli neozelandesi (2.5-3.5 kg) 1 h prima della procedura chirurgica pianificata utilizzando iniezioni di acepromazina (1 mg/kg IM) e meloscama (0,2 mg/kg SQ). Anestesizzare un coniglio bianco neozelandese femmina (peso 2,5-3,5 kg) con 2-5% isoflurane inalato, rimuovere la pelliccia sovrastante il sito di iniezione e pulire il sito di iniezione con soluzione povidone-iodio.
    2. Intubate anestized conigli utilizzando una maschera laciloga levigo (LMA) e fissare in posizione con nastro adesivo, mantenendo l'anestesia profonda titando la dose isoflurane inalata tra il 2-5%. Monitorare regolarmente l'anestesia chirurgica durante la procedura controllando i segni vitali (frequenza respiratoria, ricarica capillare, saturazione dell'ossigeno se disponibile) e il monitoraggio dei segni che suggeriscono il dolore (movimento, ritiro da stimoli, rumori) o della luce anestesia (movimento, masticazione su tubo LMA).
      NOTA: Questo dovrebbe essere fatto da qualcuno con esperienza di monitoraggio dell'anestesia chirurgica.
    3. Posizionare un catetere orecchio-vena calibro 22 nella vena dorsale marginale. Somministrare la cefazolina (20 mg/kg) per via endovenosa 10 minuti prima dell'incisione chirurgica cutanea.
    4. Tagliare i capelli sopra il bacino e l'addome prima di posizionare il coniglio sul tavolo operatorio, quindi posizionare i conigli in posizione dorsale sul tavolo operatorio. Pulire il campo chirurgico utilizzando una preparazione chirurgica della pelle in 3 fasi (sapone betadine, soluzione di clorlessidina, soluzione betadine). Drappo il campo chirurgico con tende laparotomia dopo aver segnato il terreno la parte superiore dell'osso pubico, lasciando una zona di 5 cm x 5 cm dell'addome inferiore esposto.
  2. Creazione dell'incisione della laparotomia e identificazione delle corna uterine
    1. Indossare un berretto chirurgico e maschera facciale. Scrub mani utilizzando clorhesidina o betadina soluzione scrub chirurgico. Utilizzando una tecnica sterile, mettere su un abito sterile e guanti chirurgici sterili.
    2. Utilizzando un bisturi da 11 lame, fai un'incisione lunga 2,5 cm e un cranio del pube della simfisi attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo dell'addome del coniglio. Incise la fascia di retto e sezionare lateralmente i muscoli del retto per esporre il peritoneo sottostante. Inserire il peritoneo bruscamente dopo aver assicurato che il sottosuolo è libero da intestinale o altri organi addominali.
    3. Individuare le corna uterine identificando la vescica urinaria e spazzando un dito guantato in modo superiore, posteriore e lateralmente sopra l'apice della vescica.
      NOTA: Se necessario, la vescica piena può essere svuotata utilizzando la pressione digitale. Una volta individuato, porta le corna uterine attraverso l'incisione addominale a poggiare sulla parete addominale.
    4. Utilizzando una sutura traciata assorbibile 3-0, eseguire una singola legatura di sutura di ogni corno uterino di circa 1,5-2,0 cm distale alle cervice. Posizionare la sutura appena mediale alle arterie uterine, che corrono lungo l'aspetto laterale di ogni corno. Legare le suture comodamente per occludere le corna uterine disstese (Figura 1).
  3. Inoculazione Miometriale VX2
    1. Utilizzando un ago da 27 calibro, iniettare 0,5 mL della sospensione cellulare VX2 precedentemente preparata dal passaggio 2.3.2 (per il modello VX2 coltivato) o 2,4 (per il modello VX2 propagato in vivo) nel miometrio di ogni corno uterino proximal al sito di sutura (tra il sito di sutura e la cervice). Iniettare più di 1 minuto e assicurarsi che le cellule non vengano iniettate nella cavità uterina sottostante. Anestesizzare gli animali che utilizzano isoflurane inalato (2-5%) e una macchina anestetica con un circuito Bain.
    2. Applicare la pressione al sito di iniezione del miometrio per 30 s dopo l'iniezione per ridurre al minimo la perdita di cellule. Ispezionare i siti di iniezione e sutura per l'emostasi e riporre le corna uterine nell'addome.
  4. Chiusura dell'incisione chirurgica
    1. Chiusura profonda della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la forza del tessuto della fascia.
      1. Per fare questo, ancorare la sutura ad un apice dell'incisione suturando superficiale a profondo su un lato dell'incisione e profondo a superficiale dall'altro. Legare un nodo. Utilizzando la sutura attaccata, rendere i punti di corsa perpendicolari all'incisione attraverso gli strati della parete addominale lavorando passo-saggio lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare la sutura e tagliare.
    2. Chiusura superficiale della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione cutanea e suturare la pelle addominale utilizzando sutura polifilatura subcuticolare 3-0 assorbenata a 3-0 sepolta. Applicare la colla chirurgica all'incisione chiusa per opporsi ai bordi della pelle.
      1. Per fare questo, ancorare la sutura ad un apice dell'incisione, suturando da profondità a superficiale su un lato dell'incisione e superficiale al profondo dall'altro. Legare un nodo. Utilizzando le suture attaccate, rendere i punti di corsa nello strato dermico paralleli all'incisione lavorando passo-saggio lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare la sutura e tagliare.
  5. Assistenza post-operatoria
    1. Risveglio dall'anestesia: Spegnere l'isoflurane una volta che l'incisione è chiusa e lasciare che il coniglio respiro ossigeno per maschera durante il monitoraggio per i segni di risveglio (ad esempio, movimenti spontanei, apertura degli occhi e movimenti di masticazione sulle vie aeree maschera largole). Espatriare il coniglio una volta che questi segni sono noti e fornire ossigeno da maschera e una coperta calda fino a quando i conigli sono attenti e in grado di sedersi in modo indipendente.
    2. Monitoraggio post-operatorio: monitorare i conigli due volte al giorno per 4 giorni e ogni giorno per altri 10 giorni post-operatori. Per monitorare, valutare le loro condizioni generali, la loro assunzione di cibo e acqua, urina e produzione fecale, valutazione del dolore, peso, segni vitali (frequenza cardiaca, frequenza respiratoria) e il loro sito chirurgico alla ricerca di gonfiore, erithema, scarico o dehiscenza.
    3. Controllo del dolore post-operatorio: Somministrare la Melossicam quotidianamente (0,2 mg/kg SQ) per 48 h post-operatori e quindi in base alla valutazione del dolore. Somministrare immediatamente la buprenorfina post-operatoria e ogni 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) per 24 ore e poi, se necessario, in base alla valutazione del dolore
    4. Gli antibiotici (enrofloxacin 5mg/kg IM) possono essere somministrati quotidianamente per sette giorni post-operatori per prevenire l'infezione della ferita come raccomandato dal veterinario. Somministrare i fluidi sottocutanei (15 mL di SQ) due volte al giorno come necessario per la disidratazione e cibi morbidi o altri integratori alimentari sono forniti ogni giorno come necessario per la perdita di peso.

4. Monitoraggio della crescita tumorale

  1. Monitoraggio clinico: Monitorare i conigli ogni 2 giorni per i segni clinici di crescita del tumore a partire dal giorno post-operatorio 14. I segni clinici di crescita del tumore possono includere diminuzione dell'assunzione orale, letargia, tenerezza addominale, massa addominale palpabile e perdita di cecotrofia.
  2. Imaging e monitoraggio invasivo
    1. Ct imaging: Il giorno post-operatorio 21-28, pre-medicare, anthetizzare e intubare i conigli come descritto in precedenza nel 3.1.1-3.1.2. Posizionare i conigli in una posizione dorsale in uno scanner TC preclinico e ottenere immagini del bacino e dell'addome dopo la somministrazione di 10 mL di agente di contrasto iohexol endovenoso.
    2. Monitoraggio chirurgico: Trasferire i conigli in sala operatoria dopo l'imaging mentre sono ancora in anestesia generale. Posizionare, preparare e drappeggiare i conigli come descritto in precedenza al punto 3.1.4 ed eseguire una ripetizione della laparotomia incisione di circa 1,5 cm attraverso l'incisione precedente. Identificare le corna uterine e guardare attentamente per il tumore. Chiudere l'incisione e fornire cure post-operatorie come descritto in precedenza nel passaggio 3.5.2-3.5.4.
    3. Uso del modello di coniglio: Se si scopre che i conigli hanno tumori al momento del monitoraggio chirurgico, utilizzare modelli di cancro endometriali del coniglio per esperimenti pianificati. Utilizzare conigli creati da cellule in vivo propagate per ulteriori esperimenti a 4 settimane di post-inoculazione e utilizzare modelli di coniglio creati da cellule VX2 coltivate a circa 5-6 settimane dopo l'inoculazione per tenere conto della crescita del tumore più lenta. Eutanasia i conigli dopo i tumori raggiungono 1-1,5 cm di diametro (misurato esternamente con pinze) utilizzando un metodo approvato dal veterinario. Confermare l'eutanasia controllando i segni vitali, tra cui la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. Accisa il tumore utilizzando strumenti sterili dopo la pulizia dell'area con soluzione betadina.

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Representative Results

Ventotto conigli sono stati utilizzati per la creazione del modello di cancro dell'endometriale. I conigli avevano un peso medio di 2,83 kg (2,71-3,58 kg) al momento dell'esperimento. I tumori uterini sono cresciuti con successo in 21 conigli per un tasso di successo generale del modello del 75%. Prima dell'inclusione della sutura uterina nel protocollo, il tasso di successo era del 57% rispetto all'81% dopo l'aggiunta della sutura uterina. La sutura uterina è stata aggiunta al protocollo dopo il coniglio 7th in risposta al tasso di successo iniziale a basso modello. Sono stati creati cinque modelli da cellule VX2 coltivate (tentate in 8 conigli, tasso di successo del 63%), e 16 modelli di coniglio sono stati creati da cellule in vivo propagate (tentate in 22, 73% tasso di successo). Nei modelli creati da cellule VX2 in vivo propagate, una dose di cellule di 5 x 106 per corno uterino è stata utilizzata in tutti gli animali e il numero medio di giorni dall'inoculazione all'esperimento è stato di 29 giorni (intervallo 24-31). Nei modelli creati da cellule VX2 coltivate, è stato utilizzato un protocollo di dose crescente per determinare la dose di inoculazione appropriata. Dosi di 2,5 x 106 cellule e 5 x 106 cellule per corno uterino non hanno avuto successo e una dose di 10 x 106 cellule per corno uterino ha avuto successo in un coniglio tuttavia, la crescita del tumore è stata lenta a 57 giorni dall'inoculazione all'esperimento. Una dose di 20 x 106 cellule per corno uterino ha avuto successo in 4 conigli in un tempo medio di 45 giorni (intervallo 36 - 51 giorni) da inoculazione a sperimentare ed è stato quindi determinato come la dose di iniezione ottimale. Questi dati sono riepilogati nella Tabella 1. Nell'analisi PCR dopo il passaggio 5, le cellule VX2 coltivate sono state altamente positive sia per Rabbit LINE-1 che per CRPV-E6, con solo tracce di topo LI NE-1 (<0.01 pg/ Le cellule sono state successivamente coltivate nella coltura cellulare, tuttavia, la crescita è stata lenta con un tempo medio di 7 giorni (6-9 d) per raggiungere la confluenza di fiasche.

Tutti i modelli hanno portato con successo alla trasformazione metastatica dei linfonodi retroperitoneali (Figura 2). Diciannove conigli avevano metastasi di linfonodi patologicamente confermate e 11 avevano metastasi addominali extranodali confermate patologicamente. Un coniglio non ha rimosso i linfonodi distinti; tuttavia, aveva un alto carico di malattia intra-addominale in cui si ipotizzavano le metastasi dei linfonodi, e un coniglio morì prima dell'esperimento. I tumori e i linfonodi metastatici delle cellule VX2 coltivate sono apparsi simili ai tumori delle cellule VX2 in vivo sull'istologia (Figura 3), con cellule colorate di ematossina dense che invadono il muscolo e formano strutture simili alla ghiandolare con molte cifre mitotiche patologiche.

Utilizzando un nuovo agente di imaging, il Porphysome, 81 linfonodi sono stati identificati intraoperatori e rimossi chirurgicamente per l'analisi istologica. 74 linfonodi erano linfonodi pelvici, 5 erano linfonodi pelvici destro e 2 erano linfonodi para-aortici destro. I linfonodi rimossi dai conigli con tumori VX2 propagati in vivo erano significativamente più grandi e più necrotici di quelli rimossi dai conigli con tumori VX2 coltivati con un volume medio di 0,99 cm3 (gamma 0,12 - 3,89) contro 0,59 cm3 (0,01 - 2,92) (p-0,037). Inoltre, i conigli con tumori propagati in vivo avevano tumori uterini più grandi più necrotici rispetto ai conigli con tumori cellulari coltivati con una lunghezza media di 5,6 cm (4-6,8 cm) e una larghezza media di 5,2 cm (3,3 - 9 cm) contro 3,6 cm (2-5 cm) e di 4,56 cm (3-7 cm) rispettivamente. Infine, i modelli di coniglio realizzati con cellule VX2 propagate in vivo avevano più metastasi addominali extra-nodali rispetto ai modelli di coniglio fatti da cellule coltivate con il 91% di tutte le metastasi trovate nei conigli propagati in vivo.

Figure 1
Figura 1: Sutura uterina. Freccia nera - suture, freccia rossa e corna uterine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: tumore VX2 (A) Tumore intrauterino. Freccia nera - tumore, freccia rossa , corna uterine (B) Linfonodi pelvici sinistra metastatici. Freccia nera- linfonodi metastatici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Istologia del tumore VX2 delle cellule coltivate (A) La colorazione H&E dimostra l'infiltrazione tumorale del muscolo circostante (10 volte l'ingrandimento, la barra della scala - 300 m) (B) La colorazione densa di Pancytokeratin dimostra le cellule tumorali che macchiano in modo infiltrato corrispondenti alle aree del tumore su H&E (10x ingrandimento, scala: 300 m). Freccia nera - tumore VX2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di modello Modello tumorale VX2 in vivo Modello tumorale VX2 coltivato
Numero di modelli di successo 16 5
Numero di modelli tentati 22* 8
Tasso di successo del modello 73% 63%
Tempo che va dall'inoculazione all'esperimento 29 giorni (24-31) 45 giorni (36-51)
Dose di iniezione riuscita 1 x 107 40 x 106
(5x106 per corno uterino) (20 x 106 per corno uterino)
Tasso di successo complessivo 75%
Tasso di successo complessivo prima della sutura uterina 57%
Tasso di successo complessivo dopo la sutura uterina 81%

Tabella 1: modellare i dati, incluse le condizioni sperimentali, il numero di animali utilizzati e la percentuale di successo. 2 conigli utilizzati inizialmente per modelli di tumori cellulari coltivati in cui la crescita non ha avuto successo sono stati successivamente utilizzati per modelli di tumore in vivo

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Discussion

Qui, abbiamo segnalato un metodo chirurgico standardizzato per la creazione di un modello di cancro dell'endometrio VX2 e riportato sul primo uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Il tumore prendere tasso di 75% è inferiore al 100% percentuale tasso precedentemente riportato nella letteratura35,37,53,56; tuttavia, il tasso del 90% di metastasi di linfonodi patologicamente confermate è coerente con gli studi precedenti di questo modello35,53.

L'inclusione della sutura uterina ha aumentato significativamente il tasso di successo del modello dal 57% all'81% e consideriamo questo passaggio parte integrante del protocollo chirurgico. La sutura uterina non è stata inizialmente eseguita a causa di rapporti contrastanti sull'uso della sutura nella letteratura e delle preoccupazioni riguardanti la devascolizzazione del corno uterino dalla legatura dell'arteria uterina bilaterale. Dato il significativo miglioramento del tasso di assunzione con l'aggiunta di suturgamento uterino, ipotizziamo che la perdita della sospensione cellulare lontano dal sito di iniezione possa aver contribuito al basso tasso di successo iniziale. Anatomicamente contenente la sospensione cellulare in una piccola porzione del corno uterino assicura che un'alta concentrazione locale di cellule è esposto alla vascolatura del miometrio che probabilmente migliora l'innesto tumorale. Inoltre, nessun caso di necrosi del corno uterino è stato notato nell'esperimento. Garantire che la sospensione cellulare viene iniettata nel miometrio è anche importante come iniezioni intrauterine o extra-miometriali può anche aumentare la perdita di sospensione cellulare. Il miometrio uterino nei conigli è estremamente sottile e la vera iniezione intra-miometriale è difficile. Per questo motivo, ipotizziamo che l'uso di uno scaffold di matrice cellulare come Matrigel possa migliorare il tasso di assunzione di cellule che vengono inavvertitamente iniettate nella cavità uterina. Nonostante queste potenziali limitazioni, crediamo che il metodo di sospensione cellulare sia superiore ai metodi microchirurgici precedentemente segnalati36 in cui i blocchi tumorali sono innestati sul miometrio uterino in quanto questo metodo è tecnicamente impegnativo. In confronto, il metodo qui è semplice, incorpora tecniche di uso comune ed è per questi motivi, crediamo che sia altamente riproducibile.

I modelli di coniglio VX2 propagati in vivo sono stati iniettati con una dose standard di 5 x 106 cellule per corno uterino che si basava sull'esperienza di un collaboratore con i modelli di coniglio VX2. Questa dose è significativamente inferiore a quella riportata nella letteratura in cui sono state utilizzate dosi cellulari fino a 1 x 108 da Harima et al.52 e 5 x 109 da Huang37,53 e Xu35. Dato il breve lasso di tempo in cui è stato stabilito il modello e l'alto tasso di linfonodo e metastasi extra-nodali, non crediamo che l'uso di una dose più elevata avrebbe migliorato il modello. Una dose più elevata può aver promosso ancora più rapida e aggressiva diffusione del tumore che comprometterebbe l'utilità del modello. L'83% dei modelli VX2 propagati in vivo ha avuto una malattia extra-nodale al momento dell'esperimento e questo è sorprendente che altri gruppi non abbiano segnalato lo sviluppo di metastasi addominali a 30 giorni. Una possibile spiegazione di questa differenza potrebbe essere l'inoculazione intravascolareinvolontaria 27 a causa dell'alta pressione o dell'iniezione ad alta velocità che può provocare una diffusione metastatica a distanza più rapida. Ipotizziamo quindi che la velocità di iniezione possa essere un fattore nella velocità delle metastasi, motivo per cui si consiglia una velocità di iniezione lenta nel protocollo.

Comparativamente, nonostante la dose di iniezione più elevata (20 x 106 per corno uterino), solo il 40% dei conigli modello VX2 coltivati ha sviluppato malattie extranodali e tutti i depositi metastatici erano notevolmente più piccoli e meno necrotici in questi conigli. Non abbiamo alcuna letteratura con cui confrontare direttamente i risultati in quanto questo è il primo uso segnalato di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Tuttavia, i risultati sono coerenti con gli studi di altri tumori VX2 colti in cui erano necessarie dosi elevate di inoculazione e la crescita del tumore è stata notata per essere lenta27,31. Attraverso questo esperimento, abbiamo identificato la dose di iniezione ottimale di 20 x 106 cellule per corno uterino che ha provocato una crescita affidabile e metastasi nell'80% dei conigli utilizzando un protocollo di dose crescente. È possibile che una dose ancora più elevata di cellule VX2 coltivate si traduca in una diffusione metastatica più rapida tuttavia, poiché le cellule VX2 sono cresciute lentamente in coltura, è stato difficile coltura abbastanza cellule per tentare una dose più elevata. Si tratta di una limitazione dello studio che ha identificato questo come un potenziale settore per le indagini future. Tuttavia, riteniamo che il tasso di crescita più lento nel modello cellulare a coltura sia vantaggioso in quanto riteniamo che possa replicare lo scenario clinico del cancro dell'endometrio in modo più affidabile, poiché il cancro dell'endometrio è generalmente una malattia a crescita lenta che metastatizza prima di linfonodi pelvici e si traduce in metastasi tardo-lontane. La scelta iniziale di propagare le cellule VX2 nei topi ha permesso un turnaround più veloce e costi di manutenzione meno costosi; tuttavia, in alternativa, le cellule potrebbero essere state derivate direttamente dal muscolo quadricipite dei conigli.

Crediamo che lo stretto monitoraggio post-operatorio per i segni e sintomi della crescita del tumore sia un aspetto importante del protocollo. Nella nostra esperienza, una volta che i conigli sviluppano la malattia metastatica, progrediscono rapidamente fino ad essere clinicamente malessere, in particolare nel gruppo in vivo propagato. Questa rapida e aggressiva crescita è stata evidenziata dalla morte di un coniglio per malattia metastatica dopo un ritardo di soli 2 giorni dalla data dell'esperimento pianificato. Mentre la velocità di stabilimento del modello VX2 è stata considerata una forza, in quanto modelli murini simili (cioè il modello di carcinoma endometriale HEC-1 con metastasi di linfonodi nei topi) possono richiedere fino al doppio del tempo per stabilire57, questi risultati dimostrano anche che la determinazione della tempistica sperimentale ottimale è fondamentale. I risultati sono correlati a studi precedenti in cui la crescita tumorale e l'allargamento del linfonodo sono aumentati in modo significativo dopo la giornata post-operatoria 2137,53; tuttavia crediamo che ci sarà variabilità rispetto alla linea cellulare VX2 utilizzata e incoraggiare i gruppi a capire la loro specifica tempistica sperimentale. Questa linea temporale non vale per i nostri modelli VX2 colti e hanno identificato questo come un'area che richiede ulteriori studi. Per essere certi della crescita del tumore, abbiamo scelto di utilizzare sia il monitoraggio del tumore non invasivo che invasivo durante il protocollo. Tuttavia, un'altra direzione futura potrebbe essere quella di perfezionare il protocollo di imaging post-operatorio per evitare la necessità di una seconda procedura invasiva.

Nel complesso, abbiamo segnalato un metodo semplice e standardizzato per creare un modello di cancro endometriale con linfofino retroperitoneale nei conigli. Attraverso questo protocollo, abbiamo affrontato la significativa variabilità all'interno della letteratura VX2 per quanto riguarda la dose cellulare, la tecnica chirurgica e il monitoraggio del modello post-operatorio. Riconosciamo che un'ulteriore limitazione dello studio è che nell'utilizzo di una linea cellulare VX2 invece di uno xenotrapianto umano non stiamo completamente imitando la biologia tumorale e il microambiente del cancro umano. Tuttavia, speriamo che altri gruppi utilizzino cellule VX2 coltivate per creare i loro modelli, poiché crediamo che questo tipo di cellula possa modellare il cancro dell'endometrio umano in modo più affidabile attraverso la sua crescita più lenta e la ridotta propensione a metastasi. Incoraggiamo altri gruppi a questo modello facile e veloce di metastasi di linfonodi retroperitoneal derivati uterini a studiare nuove terapie di imaging per aiutare i pazienti con cancro endometriale metastatico.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dal Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dal Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dal Canadian Cancer Society Research Institute (704718), dal Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada, Fondazione per l'Innovazione e Principessa Margaret Cancer Foundation.

Vorrei ringraziare il Dr. Marguerite Akens per aver fornito le cellule VX2 iniziali per la creazione del modello VX2 iniziale e i blocchi tumorali VX2 congelati. Vorrei ringraziare Marco DiGrappa per aver contribuito a eseguire esperimenti iniziali di coltura cellulare VX2 e Lili Ding per aver contribuito con la coltura cellulare VX2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

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Ricerca sul cancro Numero 151 Cancro Endometriale Modello di cancro ortotopico linea cellulare VX2 Lymphadhadenopathy Modello di coniglio Modello chirurgico Coltura cellulare
Un modello di cancro endometriale ortotopico con retroperitoneale Lmphadenopatia fatta da cellule VX2 in vivo propagate e coltivate
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