Summary
该协议提出了一种标准化的方法,用于培养VX2细胞,并创建子宫内膜癌的正交VX2模型,在兔子中具有逆转淋巴结转移。正位子宫内膜癌模型对于对诊断淋巴结转移的新型成像模式进行临床前研究具有重要意义。
Abstract
子宫内膜癌是北美最常见的妇科恶性肿瘤,其发病率正在全球上升。治疗包括手术与或不辅助治疗取决于淋巴结参与由淋巴腺切除术确定。淋巴腺切除术是一种病态手术,在许多患者中尚未证明具有治疗作用,因此需要一种诊断淋巴结转移的新方法。为了测试新的成像剂,需要一个可靠的子宫内膜癌模型与逆转淋巴结转移。VX2子宫内膜癌模型在文献中经常被描述;然而,在模型建立方法方面存在着很大的差异。此外,没有研究报告使用培养的VX2细胞来创建这个模型,因为以前只使用在体内繁殖的细胞。本文介绍了建立VX2子宫内膜癌模型的标准化手术方法和术后监测方法,并报告首次使用培养的VX2细胞创建该模型。
Introduction
子宫内膜癌,或子宫内膜癌,是全球第二大最常见的妇科恶性肿瘤,也是发达国家最常见的恶性肿瘤1。子宫内膜癌的发病率稳步上升,在2005-2013年间每年上升2.3%,死亡率为1、2、3,相应上升2.2%。淋巴结转移的诊断是最重要的,因为正淋巴结的存在是生存4,5,6,7的强烈负预测,并可以指导管理辅助疗法8,9,10,11,12,13。淋巴结转移目前通过手术切除骨盆和腹部主要血管的淋巴组织进行诊断。这个程序,被称为淋巴腺切除术,是有争议的,因为冲突的生存数据从两个大型试验14,15,16,17,18和已知的术中15、19、20和术后发病风险21、22、23。由于目前的非侵入性成像模式没有所需的灵敏度和特异性来取代淋巴结解剖24,因此一直在推动开发新的诊断成像技术。为了在临床前环境中测试这些新技术,需要一个可靠的子宫内膜癌模型与逆转淋巴结转移。
兔子VX2肿瘤模型是一个成熟的模型,已被广泛用于研究多个人体固体器官肿瘤25,包括肺26,头颈部27,28,肝脏29,肾脏30,骨31,32,脑33,胰腺34和子宫35,36,37。VX2模型最初由基德和鲁斯38于1940年开发,成功移植了1933年Shope发现的棉尾兔辣椒瘤病毒。自那时以来,VX2模型一直维持在体内,需要连续通过白新西兰兔子40的四头肌。然而,最近,多个组已经成功地在体外40,41,42中生长VX2细胞,并证明了培养细胞系31的保留性。42,43.VX2肿瘤被组织学定义为肿瘤鳞状细胞癌44,并含有类似于腺癌26的腺体特征。肿瘤的特点是易于植入,快速生长和超血管44,45和可靠的转移,最常见的区域和遥远的淋巴结45。子宫血管和淋巴解剖46以及正交生长部位的相似性确保了兔子VX2癌的转移模式与人类子宫内膜癌的转移模式相仿,使VX2模型成为研究人类的可靠模型转移性疾病。此外,组织学特征,如异常微血管增殖47,以及免疫学48和基因相似性49,50人与兔子之间的表明肿瘤微环境可能反映人类子宫内膜癌。
多个小组已经报告使用VX2创建子宫内膜癌模型与逆转性转移与高报告成功率36,51,52;然而,在模型创建方法方面,当前文献中存在着显著的变化。细胞悬浮剂量低至4 x 105细胞/子宫角51和高达5 x 109细胞/子宫角37,53已报告没有标准共识所需的VX2细胞剂量。此外,还报告了多种接种方法,包括将肿瘤微手术植入子宫肌膜36,注射VX2细胞悬浮液37,44,52,53,在某些情况下,在接种前添加子宫角缝合52。最后,没有组报告使用培养的 VX2 单元格来创建此模型。因此,本研究的目的是展示VX2模型创建的成功标准化方法,并报告首次使用培养的VX2细胞创建子宫内膜癌模型与在兔子的逆转转移。
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Protocol
深腹壁闭合:识别腹膜切口的顶点,用组织钳子抓住腹膜、整管肌肉和筋膜。所有动物研究均在大学卫生网络动物资源中心(ARC)批准的设施中进行,并符合经批准的动物使用和护理协议(AUP #3994/#4299)。VX2细胞系是从大学健康网络的Aken博士实验室获得的。
1. 创建体外VX2细胞系
- 从兔子四头肌和小鼠侧翼生长中收获VX2肿瘤。
- 解冻冷冻VX2肿瘤块(1厘米x1厘米),用手术刀在培养板上切碎,并通过70μm过滤器应变,按顺序添加少量汉克斯平衡盐溶液(HBSS),以确保所有细胞在1mL的最终体积内紧张。
- 用0.9%磷酸盐缓冲盐水溶液计数细胞并稀释至浓度为1 x 107/mL,并放置在无菌管中的冰上。
注:肿瘤块是从实验室合作者从以前在兔子四头肌中传播VX2肿瘤中获得的。 - 用2-5%吸入的胶合物麻醉一只雌性新西兰白兔(体重2.5-3.5公斤),去除覆盖注射部位的毛皮,用化比酮-碘溶液清洗注射部位。将500 μL的制备VX2细胞悬浮液(5 x 106细胞/mL)注射到兔子的四头肌中。从第10天开始,对兔子进行临床监测肿瘤生长。
- 在肿瘤达到1-1.5厘米直径(用卡钳外部测量)后,使用兽医批准的方法对兔子实施安乐死。通过检查生命体征,包括心率和呼吸速率,确认安乐死。使用贝塔丁溶液清洁区域后,使用无菌仪器切除肿瘤。
- 在使用无菌仪器的生物安全柜中,使用手术刀将肿瘤切成小块(0.2厘米),放在10厘米的组织培养皿上。使用步骤 1.1.1 中所述的 1 mL HBSS 将肿瘤片段通过 70 μm 细胞过滤器。用0.9%盐碱溶液计数细胞并稀释,在200μL中获得7.5 x 105个细胞。
- 麻醉雄性NOD scid伽马小鼠(重量25克),在1升/分钟使用4%的亚夫兰,并使用2%的异常鲁兰维持麻醉。一旦小鼠被麻醉,使用27号针将步骤1.1.5中的200μL溶液注射到小鼠侧翼的皮下组织。
- VX2细胞在体外收获和传递
- 监测异种移植生长临床每周两次,直到肿瘤达到1厘米直径使用卡钳。
- 在用4%异法气体麻醉后,将小鼠置于CO2腔室或进行宫颈脱位,使小鼠安乐死。在生物安全柜的无菌条件下切除肿瘤。
- 在含有3 mL的Dulbeco的改性鹰培养基(DMEM)/哈姆的F12+10%胎儿牛血清(FBS)培养皿中,用手术刀切成1-2毫米的肿瘤。
- 将肿瘤片段在37°C的培养箱中不受干扰,在5%CO2的培养箱中持续两天,直到细胞开始从肿瘤片中生长出来。随后,每天通过光显微镜检查培养板,了解细胞的汇合。达到70%的汇合后,胰蛋白酶通过向烧瓶中加入1mL 0.05%的胰蛋白酶,并放回37°C培养箱5分钟。
- 用6 mL的DMEM/Ham的F12+10%FBS介质中和胰蛋白酶,在4°C下收集细胞和离心机5分钟,在300 x g下。去除上清液,并在 3.5 mL 的新 DMEM/Ham 的 F12 + 10% FBS 介质中重新悬浮颗粒。种子新鲜 6 厘米胶原蛋白 I 涂层板与 1.6 x 106细胞每板实现约 50% 细胞播种密度。
注:50%细胞密度是指连接时占据板表面积50%的细胞。 -
早期通过:重复上述过程(试孔、播种),直到细胞通过5次,然后用定量PCR测定用PCR评估细胞系纯度,以区分兔子基因组DNA与小鼠基因组DNA(见步骤1.3.1-1.3.4)。
注:8个通道后,细胞可以在非胶原涂层常规粘附组织培养板上繁殖。 - 以每瓶2 x106的浓度通过、试穿和冻结DMEM/HAM F12+30%FBS+10%DMSO中细胞的等分量。将细胞储存在液氮中,直到实验需要为止。
- 确认存活细胞的VX2来源:
- 从纯化的基因组小鼠和兔子DNA中创建标准固化(步骤 1.3.2 和步骤 1.3.3)。使用在LINE-1逆转录素元件的第二个开放读取帧内针对物种特定序列的引材料。
注: CRPV E6 的引信序列是:5' - GATCCGGACCAACAGG 和 5'-CCTGCCGTCCCTAT。使用了LINE-1逆转录元素。兔子线-1的引脚序列是:5'-TCAAGAAAAAAAAGTGC和5'-TTATATATATAACGTGT为小鼠LINE-1的引列序列是:5'-AATAGAAAGCCAATATATTATTGG和5'-CCTTGAAGATATATG - 要为 CRPV E6 创建标准曲线,请按照制造商的协议使用商业试剂盒来纯化 VX2 肿瘤细胞莱沙 (步骤 1.1.1)。使用商业测定定量这种DNA。在低 EDTA-TE 缓冲液中执行 6 次从 225 pg/μL 到 0.925 pg/μL 的串行稀释。要为小鼠基因组DNA创建标准曲线,请用低EDTA-TE缓冲液将100μg的商业小鼠基因组DNA稀释,从125 pg/μL稀释至0.0125 pg/μL。
- 将步骤 1.3.2 中各稀释溶液中的 4 μL 放入井中,并在 PCR 热循环器中运行样品。使用每次运行中的 Cq 值以及每口井的 DNA 量,使用热循环器软件自动阈值设置计算标准曲线。
- 使用标准 qPCR 程序在热循环器上执行 PCR 40 周期的 2 步循环 (98 °C 和 60°C)。建立阈值,并将增量 Ct 值设置为 >35,以确保兔子 VX2 细胞系中的小鼠污染最小。每种反应的总体积为10μL,包括5μL的2xMastermix,1μL的正向和反向引油,最终引油浓度在250nM反应,和4μL的DNA样品。
注:有关执行PCR的详情,请参阅参考资料54,55。阈值已建立,增量 Ct 值设置为 >35,以确保兔子 VX2 细胞系中的小鼠污染最小。QPCR 可靠检测的 VX2 DNA 推荐水平为 1-10 pg。
- 从纯化的基因组小鼠和兔子DNA中创建标准固化(步骤 1.3.2 和步骤 1.3.3)。使用在LINE-1逆转录素元件的第二个开放读取帧内针对物种特定序列的引材料。
2. VX2细胞培养和细胞悬浮物的产生
- 在水浴37°C下解冻含有VX2细胞(在步骤1.2.7中冷冻)的解冻小瓶1分钟,并将细胞转移到具有10mL培养基(1:1 DMEM/F-12 = 10%FBS和1%青霉素-链霉素)的圆锥离心管中。在107 x g下离心8分钟,丢弃上清液,并在9 mL的介质中重新悬浮细胞颗粒。
- 将重新悬浮的细胞转移到大型培养瓶中。在37°C下孵育细胞而不颤抖。每天使用光显微镜检查细胞的汇合,每三天更换培养培养。
- 为注射创建培养的VX2细胞悬浮液
- 胰蛋白酶化细胞通过加入3 mL 0.25%胰蛋白酶烧瓶一旦细胞达到80%汇合。将烧瓶放入培养箱(37°C)5分钟,将溶液转移到圆锥形离心管和离心机,在107 x g下8分钟,然后去除上清液。
- 用9 mL的磷酸盐缓冲盐水清洗细胞颗粒3次,离心机,并去除上清液,如上所示。用0.9%磷酸盐缓冲盐水溶液计数细胞,稀释至4 x 107细胞/mL,并放入无菌锥形离心管中。
- 在注射时创建体内传播的VX2细胞悬浮液
- 解冻冷冻 VX2 肿瘤块 (1 厘米 x 1 厘米),使用手术刀在培养板上切碎,并通过步骤 1.1.1 中的 70 μm 过滤器进行应变。按顺序添加少量 HBSS,以确保所有细胞在最终体积为 1 mL 时均处于紧绷状态。用0.9%磷酸盐缓冲盐水计数细胞并稀释至浓度为1 x107/mL,并放置在无菌管中的冰上。
注:肿瘤块是从实验室合作者从以前在兔子四头肌中传播VX2肿瘤中获得的。
- 解冻冷冻 VX2 肿瘤块 (1 厘米 x 1 厘米),使用手术刀在培养板上切碎,并通过步骤 1.1.1 中的 70 μm 过滤器进行应变。按顺序添加少量 HBSS,以确保所有细胞在最终体积为 1 mL 时均处于紧绷状态。用0.9%磷酸盐缓冲盐水计数细胞并稀释至浓度为1 x107/mL,并放置在无菌管中的冰上。
3. 外科模型建立
- 手术麻醉和术前准备
- 在计划外科手术前1小时使用注射丙丙丙酮(1毫克/千克IM)和梅洛西卡姆(0.2毫克/千克SQ)进行药物前治疗。用2-5%吸入的胶合物麻醉一只雌性新西兰白兔(体重2.5-3.5公斤),去除覆盖注射部位的毛皮,用化比酮-碘溶液清洗注射部位。
- 使用喉膜气道 (LMA) 对麻醉兔子进行插管,并用胶带固定到位,通过将吸入的异常剂量在 2-5% 之间进行硫化,从而保持深层麻醉。在整个过程中定期监测手术麻醉,检查生命体征(呼吸速率、毛细血管补充、氧气饱和度(如有),并监测疼痛迹象(运动、从刺激中退出、噪音)或光麻醉(运动,咀嚼LMA管)。
注意:这应该由有监测手术麻醉经验的人做。 - 在边缘背静脉放置一个22量表的耳静脉导管。在手术皮肤切口前10分钟静脉注射西法索林(20毫克/千克)。
- 在将兔子放在手术台上之前,将毛发夹在骨盆和腹部,然后将兔子放在手术台上的背摆位置。使用 3 步手术皮肤准备(贝塔丁肥皂、氯西丁溶液、贝塔丁溶液)清洁手术现场。在阴骨顶部标记土地后,用腹腔切除窗帘在手术场上下垂,使下腹部的5厘米x5厘米区域暴露。
- 腹腔切除术切口的创建和子宫角的鉴定
- 戴上手术帽和面罩。使用氯西丁或贝塔丁手术磨砂溶液擦洗手。使用无菌技术,穿上无菌长袍和无菌手术手套。
- 使用+ 11 刀片手术刀,通过兔子腹部的皮肤和皮下组织,使一个 2.5 厘米长的切口 1 厘米颅骨。切开筋膜,横向解剖成骨肌肉,露出潜在的围膜。在确保地下没有肠或其他腹部器官后,急剧进入腹膜。
- 找到识别膀胱的子宫角,并优雅地、后部和横向地在膀胱顶上扫过戴手套的手指。
注:如有必要,可以使用数字压力清空整个膀胱。一旦找到,通过腹部切口将子宫角带到腹壁上休息。 - 使用 3-0 编织的可吸收缝合线,对每个子宫角执行单个缝合,约 1.5-2.0 厘米远端的子宫。将缝合线正好内联放在子宫动脉上,这些动脉沿着每个喇叭的横向方向运行。将缝合线紧紧绑住远端子宫角(图1)。
- 肌膜VX2接种
- 使用 27 规格针头,将步骤 2.3.2(对于培养型 VX2 型号)或 2.4(用于体内传播的 VX2 型号)中先前制备的 VX2 细胞悬浮液的 0.5 mL 注射到每个子宫角近部(缝合部位之间)的子宫膜和子宫颈)。注射超过1分钟,并确保细胞没有被注射到底层子宫腔。使用吸入的胶质麻醉动物(2-5%)和一台带有贝恩电路的麻醉机
- 注射后对子宫内膜注射部位施加压力30s,以尽量减少细胞泄漏。检查注射和缝合部位有有有外塞,并将子宫角放回腹部。
- 关闭手术切口
- 深腹壁闭合:识别腹膜切口的顶点,用组织钳子抓住腹膜、整管肌肉和筋膜。
- 为此,通过将表面缝合到切口一侧的深部,将缝合缝合在切口的一个顶点,将缝合缝合到切口的另一面深到浅。打个结使用附加缝合线,使运行的针线垂直于切口通过腹壁的层沿切口从一侧到一侧逐步工作。系上缝合线并切掉。
- 表面腹壁闭合:使用埋藏运行下切面3-0可吸收的多丝缝合,识别皮肤切口和缝合腹部皮肤的顶点。将手术胶水涂在封闭的切口上,以对抗皮肤边缘。
- 为此,将缝合固定在切口的一个顶点处,在切口的一侧将缝合深到浅,将浅缝合到切口的另一侧。打个结使用附加缝合线,使皮肤层中的运行缝合线与切口沿切口从一侧到侧面的切口平行。系上缝合线并切掉。
- 深腹壁闭合:识别腹膜切口的顶点,用组织钳子抓住腹膜、整管肌肉和筋膜。
- 术后护理
- 从麻醉中醒来:一旦切口关闭,关闭离心,让兔子用面罩呼吸氧气,同时监测觉醒迹象(例如,自发运动、睁开眼睛和喉膜气道上的咀嚼运动)。一旦注意到这些迹象,就给兔子排泄,并通过面罩和温暖的毯子提供氧气,直到兔子保持警觉并能够独立坐。
- 术后监测:每天监测兔子两次,为期4天,手术后每天多监测10天。监测,评估他们的一般状况,他们的食物和水摄入量,尿液和粪便输出,疼痛评估,体重,生命体征(心率,呼吸率)和他们的手术部位寻找肿胀,红斑,放电或脱血。
- 术后疼痛控制:每天为术后48小时(0.2毫克/千克SQ)进行美乐西卡姆(0.2mg/kg SQ)治疗,然后根据需要根据疼痛评估进行治疗。术后立即服用丁丙诺啡,每12小时(0.01-0.05毫克/千克SQ)24小时,然后根据需要根据疼痛评估
- 抗生素(内罗沙辛5mg/kg IM)可每天在术后7天施用,以防止兽医建议的伤口感染。每天两次为脱水和软性食物或其他膳食补充剂提供皮下液体(15 mL 的 SQ),以便减肥。
4. 肿瘤生长监测
- 临床监测:从术后第14天开始,每2天监测兔子肿瘤生长的临床症状。肿瘤生长的临床症状包括口服量减少、嗜睡、腹部压痛、腹部明显肿块和切质萎缩。
- 成像和侵入性监测
- CT成像:在术后第21-28天,如3.1.1-3.1.2所述,对兔子进行预用药、麻醉和插管。将兔子置于临床前CT扫描仪的背侧位置,在施用10 mL静脉输液碘酚对比剂后获取骨盆和腹部的图像。
- 手术监测:在成像后将兔子转移到手术室,同时仍在普通麻醉下。位置、准备和窗帘兔子如步骤 3.1.4 所述,并通过前一个切口执行约 1.5 厘米长度的重复腹腔切除。识别和子宫角,并仔细检查肿瘤。关闭切口并提供术后护理,如步骤 3.5.2-3.5.4 所述。
- 兔子模型使用:如果在手术监测时发现兔子有肿瘤,请使用兔子宫内膜癌模型进行计划实验。使用从体内繁殖的细胞创建的兔子在接种后4周内进行额外的实验,并在接种后约5-6周使用从培养的VX2细胞创建的兔子模型,以解释肿瘤生长缓慢的原因。在肿瘤达到1-1.5厘米直径(用卡钳外部测量)后,使用兽医批准的方法对兔子实施安乐死。通过检查生命体征,包括心率和呼吸速率,确认安乐死。使用贝塔丁溶液清洁区域后,使用无菌仪器切除肿瘤。
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Representative Results
28只兔子被用于建立子宫内膜癌模型。在实验时,兔子的平均体重为2.83公斤(2.71-3.58公斤)。子宫肿瘤在21只兔子中成功生长,总体模型成功率为75%。在将子宫缝合纳入协议之前,成功率为57%,而添加子宫缝合后为81%。第7只兔子之后,由于最初的低模型成功率,在协议中加入了子宫缝合。五个模型是从培养的VX2细胞(在8只兔子中尝试,成功率为63%)和16个兔子模型从体内繁殖的细胞创建(尝试在22,73%的成功率)。在体内传播的VX2细胞模型中,所有动物都使用5 x 106的细胞剂量,从接种到实验的平均天数为29天(范围为24-31)。在由培养的VX2细胞创建的模型中,使用升级剂量协议来确定适当的接种剂量。2.5 x 106细胞和5 x 106细胞的剂量不成功,每个子宫角10 x 106细胞的剂量在一只兔子中成功,然而,肿瘤生长在从接种到实验的57天是缓慢的。从接种到实验,在4只兔子平均45天(范围36-51天)中,每子宫角20 x 106细胞获得成功,因此被确定为最佳注射剂量。此数据在表 1中汇总。在通道 5 之后的 PCR 分析中,培养的 VX2 细胞对于只识别微量小鼠 LI NE-1 的兔子 LINE-1 和 CRPV-E6 均具有很高的阳性(<0.01 pg/μL)。细胞随后在细胞培养中生长,然而,生长缓慢,平均时间为7天(6-9天),以达到烧瓶汇合。
所有模型都成功地导致了逆转淋巴结的转移转化(图2)。19只兔子有病理确认的淋巴结转移,11只有病理确认的外节点腹部转移。一只兔子没有明显的淋巴结被切除;然而,它具有高负担的腹内疾病,其中淋巴结转移假设,并在实验前死亡的一只兔子。肿瘤和转移淋巴结从培养的VX2细胞出现类似于肿瘤从体内传播的VX2细胞在组织学(图3),与密集的血氧素染色细胞入侵肌肉和形成腺状结构与许多病理线粒图。
使用一种新的成像剂,Porphysome,81淋巴结被识别在术中和手术切除组织学分析。74个淋巴结为左盆淋巴结,5个为右盆淋巴结,2个为右副主动脉淋巴结。与从培养的 VX2 肿瘤的兔子中取出的淋巴结相比,从体内传播的 VX2 肿瘤的兔子中取出的淋巴结明显更大,坏死性更大,并且更坏死,平均体积为 0.99 厘米3(范围 0.12 - 3.89),而 0.59 厘米3 (0.01 -2.92) (p=0.037)。此外,体内传播肿瘤的兔子比有培养细胞肿瘤的兔子有更大的坏死子宫肿瘤,平均长度为5.6厘米(4-6.8厘米),平均宽度为5.2厘米(3.3-9厘米),分别为3.6厘米(2-5厘米)和4.56厘米(3-7厘米)。最后,由体内繁殖的VX2细胞制成的兔子模型比由培养细胞制成的兔子模型具有更多的节点外腹部转移,其中91%的转移在体内繁殖的兔子体内。
图1:子宫缝合。黑色箭头 = 缝合线,红色箭头 = 子宫角。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:VX2肿瘤(A) 子宫内肿瘤.黑色箭头 = 肿瘤,红色箭头 = 子宫角 (B) 转移左盆淋巴结。黑色箭头 = 转移淋巴结。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:培养细胞VX2肿瘤的组成学(A) H&E 染色显示肿瘤渗透周围肌肉 (10 倍放大, 刻度棒 = 300 μm) (B) 潘西托卡丁染色显示密集染色肿瘤细胞对应于H&E (10x) 肿瘤区域放大倍率,比例 = 300 μm)。黑色箭头 = VX2 肿瘤。请点击此处查看此图的较大版本。
型号类型 | 体内VX2肿瘤模型 | 培养VX2肿瘤模型 |
成功型号的数量 | 16 | 5 |
尝试模型数 | 22* | 8 |
模型成功率 | 73% | 63% |
从接种到实验的时间 | 29 天 (24-31) | 45 天 (36-51) |
成功的注射剂量 | 1 x 107 | 40 x 106 |
(5x106每个子宫角) | (20 x 106每个子宫角) | |
总体成功率 | 75% | |
子宫缝合前的整体成功率 | 57% | |
子宫缝合后的整体成功率 | 81% |
表1:模型数据,包括实验条件、使用的动物数量和成功率。2只兔子最初用于培养细胞肿瘤模型,其中生长不成功,后来用于体内肿瘤模型
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Discussion
在此,我们报告了建立VX2子宫内膜癌模型的标准化手术方法,并报告了首次使用培养的VX2细胞创建此模型。肿瘤的切除率75%低于文献35、37、53、56所报告的100%;肿瘤的接受率是75%的。"37、53、56"的肿瘤取肿瘤率低于75%的发病率。然而,90%的病理确认淋巴结转移率与之前对该模型35、53的研究一致。
子宫缝合的加入使模型成功率从57%大幅提升至81%,我们认为这一步是手术方案不可分割的一部分。子宫缝合最初没有进行,因为相互矛盾的报告使用缝合在文献和关于子宫角从双边子宫动脉连接的血管化的关注。鉴于子宫缝合的加入,取针率显著提高,我们假设细胞悬浮液从注射部位泄漏可能是导致初始低成功率的原因之一。在子宫角的一小部分中,在解剖学上含有细胞悬浮液,确保细胞的高局部浓度暴露在子宫的血管中,这有可能改善肿瘤移植。此外,实验中未注意到子宫角坏死病例。确保细胞悬浮液被注射到肌膜也很重要,因为宫内或肌外注射也可能增加细胞悬浮液的损失。兔子的子宫肌膜非常薄,真正的肌膜内注射是困难的。因此,我们假设使用细胞基质支架(如 Matrigel)可以提高无意中注射到子宫腔的细胞的取舍率。尽管有这些潜在的局限性,我们相信细胞悬浮方法优于先前报告的显微外科方法36,其中肿瘤块移植到子宫膜,因为这种方法在技术上具有挑战性。相比之下,这里的方法很简单,融合了常用的技术,正因为这些原因,我们认为它是高度可重复的。
体内繁殖的VX2兔子模型被注射标准剂量5 x 106细胞每个子宫角,这是基于合作者的经验与VX2兔子模型。这种剂量明显低于文献中报告的,其中Harima等人的细胞剂量高达1×108,由52和5 x 109由黄37,53和徐35使用。鉴于建立模型的时间范围短,淋巴结和异常外转移率高,我们认为使用高剂量不会改善模型。高剂量可能促进更迅速和更具攻击性的肿瘤传播,这将损害模型的效用。83%的体内繁殖的VX2模型在实验时有超核疾病,这令人惊讶的是,其他组没有报告在30天腹部转移的发展。这种差异的一个可能解释可能是由于高压或高速注射导致更快速的远距离转移传播而无意的血管内接种27。因此,我们假设注射速度可能是转移速率的一个因素,这就是为什么我们建议在协议中缓慢注射速度。
相比之下,尽管注射剂量较高(每个子宫角20 x 106),但只有40%的培养VX2型兔子患上了超节点疾病,而且这些兔子的所有转移沉积物明显较小,坏死更少。我们没有任何文献可以直接比较结果,因为这是第一次报告使用培养的 VX2 单元格来创建此模型。然而,这些发现与其他培养的VX2肿瘤的研究是一致的,其中需要高接种剂量,肿瘤生长缓慢27,31。通过这个实验,我们确定了每个子宫角20 x 106细胞的最佳注射剂量,这利用不断升级的剂量协议,使80%的兔子有可靠的生长和转移。更高的培养VX2细胞剂量可能导致更快的转移传播,然而,随着VX2细胞在培养中缓慢生长,培养足够的细胞来尝试更高剂量是具有挑战性的。这是研究的一个局限,并已经确定这是今后调查的潜在领域。然而,我们认为培养细胞模型中生长速度较慢是有利的,因为我们相信它可能会更可靠地复制子宫内膜癌的临床方案,因为子宫内膜癌通常是一种生长缓慢的疾病,首先会转移至骨盆淋巴结,导致晚期远转移。在小鼠中传播 VX2 细胞的初始选择允许更快的周转和更便宜的维护成本;然而,细胞可以直接从兔子的四头肌中衍生出来。
我们认为,对肿瘤生长的体征和症状进行密切的术后监测是该协议的一个重要方面。根据我们的经验,一旦兔子发展为转移性疾病,它们就会迅速发展到临床上不卫生,最显著的是在体内传播的群体中。一只兔子在距离计划的实验日期仅延迟了2天之后,就死于转移性疾病,这突出说明了这种快速、积极的增长。虽然VX2模型建立的速度被认为是一种强度,因为类似的小鼠模型(即,HEC-1子宫内膜癌模型与淋巴结转移小鼠)可能需要长达两倍的时间建立57,这些发现也表明确定最佳实验时间至关重要。研究结果与先前的研究相关,即肿瘤生长和淋巴结扩大在术后2137,53天后显著增加;然而,我们相信,在使用的VX2细胞系方面会有变异性,并鼓励组了解其特定的实验时间。此时间线不适用于我们培养的 VX2 型号,并且已确定这是一个需要进一步研究的领域。为了确定肿瘤的生长,我们选择在协议期间同时使用非侵入性和侵入性肿瘤监测。然而,另一个未来方向可能是完善术后成像方案,以避免需要第二个侵入性程序。
总体而言,我们已经报告了一种简单、标准化的方法,以创建一种在兔子中具有子宫内膜淋巴病的子宫内膜癌模型。通过该协议,我们解决了VX2文献中细胞剂量、手术技术和术后模型监测方面的重大变异性。我们认识到,这项研究的进一步限制是,在使用VX2细胞系,而不是人类异种移植,我们并没有完全模仿人类癌症的肿瘤生物学和微环境。然而,我们希望其他组将使用培养的VX2细胞来创建他们的模型,因为我们相信这种细胞类型可能通过减缓生长和减少转移倾向,更可靠地模拟人类子宫内膜癌。我们鼓励其他组到这种快速和简单的子宫衍生的逆转淋巴结转移模型,以研究新的成像疗法,以帮助转移性子宫内膜癌患者。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由特里·福克斯研究所(PPG#1075)、加拿大健康研究所(基金会赠款#154326)、加拿大癌症学会研究所(704718)、加拿大自然科学和工程研究理事会资助,[阿纳达创新基金会和玛格丽特公主癌症基金会。
我要感谢玛格丽特·阿肯斯博士为建立初始VX2模型和冷冻VX2肿瘤块提供了初始VX2细胞。我要感谢马可·迪格拉帕帮助进行初始VX2细胞培养实验,并感谢丁丽丽帮助VX2细胞培养。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
11-blade scalpel, Sterile, Disposible | Aspen Surgical (VWR) | 80094-086 | |
22-gague ear vein catheter | CDMV | 14332 | |
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) | Covidien | 356718 | |
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon | Falcon | 352350 | |
Acepromazine (Atravet) | CDMV | 1047 | |
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) | CDMV | 4363 | |
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) | UHN Stores | 457955 | |
Buprenorphine | McGill University | ||
Cefazolin | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Chlorhexidine solution | CDMV | 119872 | |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes | Corning | 354450 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates | Corning | 354408 | brand not important |
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates | Corning | 354400 | brand not important |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL | Corning | 354234 | |
DMEM/HAM F12 1:1 | Life Technologies | 11320 | brand not important |
DMSO | Caledon Lab Chem | 1/10/4100 | |
Enrofloxacin (Baytril injectable) | CDMV | 11242 | |
Falcon Tube | Corning Centri-Star | 430828 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml | Life Technologies | 12483020 | brand/source not important |
Isoflurane | UHN in-patient pharmacy | No Cat # Needed | |
Isohexol contrast | GE Healthcare | 407141210 | |
Meloxicam (Metacam 0.5%) | CDMV | 104674 | |
Normal Saline | House Brand (UofT Medstore) | 1011 | |
PBS | Multicell or Sigma | 331-010-CL or D8537-500mL | |
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) | Corning-Cellgro | CA45000-652 | |
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) | T.C.M.F (Dr Bristow) | 28-Jan-11 | |
Surgical Glue (Tissue Adhesive) | 3M Vetbond | 14695B | |
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade | Sigma | T-6567-5X20UG | |
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml | Wisent Inc | 325-542-EL | brand not important |
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