Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En Ortotopisk endometriecancer model med retroperitoneal lymfadenopati fremstillet af in vivo opformeret og kulturperler VX2-celler

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

Denne protokol præsenterer en standardiseret metode til at dyrke VX2-celler i kulturen og til at skabe en ortotopisk VX2-model af endometriecancer med retroperitoneal lymfeknude metastaser hos kaniner. Ortotopiske endometriale Cancer modeller er vigtige for den prækliniske undersøgelse af nye billedbehandlings metoder til diagnosticering af lymfeknudemetastaser.

Abstract

Endometriecancer er den mest almindelige gynækolog malignitet i Nordamerika og forekomsten er stigende på verdensplan. Behandling består af kirurgi med eller uden adjuverende behandling afhængigt af lymfeknude involvering som bestemt af lymfadadenektomi. Lymfadadenektomi er en morbid procedure, som ikke har vist sig at have en terapeutisk fordel hos mange patienter, og dermed en ny metode til at diagnosticere lymfeknude metastaser er påkrævet. For at teste nye billedbehandlings midler er der behov for en pålidelig model af endometriecancer med retroperitoneal lymfeknude metastaser. Den VX2-endometriale Cancer model er blevet beskrevet hyppigt i litteraturen; der er dog betydelige forskelle med hensyn til metoden for etablering af modeller. Endvidere har ingen undersøgelser rapporteret om brugen af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model, da kun celler, der er formeret in vivo, tidligere er blevet anvendt. Heri, præsenterer vi en standardiseret kirurgisk metode og postoperativ overvågning metode til etablering af VX2-endometriecancer model og rapport om den første anvendelse af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model.

Introduction

Endometriecancer, eller kræft i slimhinden i livmoderen, er den næstmest almindelige gynækolog malignitet på verdensplan og den mest almindelige malignitet i udviklede nationer1. Forekomsten af endometriecancer er steget støt og stiger med 2,3% pr. år mellem 2005-2013 med en tilsvarende stigning i dødelighed på 2,2%1,2,3. Diagnosen lymfeknude metastaser er altafgørende, da tilstedeværelsen af positive lymfeknuder er en stærk negativ indikator for overlevelse4,5,6,7 og kan vejlede administrationen af adjuverende behandling8,9,10,11,12,13. Lymfeknude metastaser diagnosticeres i øjeblikket ved kirurgisk fjernelse af lymfevævet, der ligger over de store blodkar i bækkenet og maven. Denne procedure, kendt som en lymfadektomi, er kontroversiel på grund af modstridende overlevelse data fra to store forsøg14,15,16,17,18 og den kendte risiko for intra-operative15,19,20 og post-operative sygelighed21,22,23. Da nuværende ikke-invasive billedbehandlings metoder ikke har den nødvendige følsomhed og specificitet til at erstatte lymfeknude dissektion24, har der været et skub til at udvikle nye diagnostiske Imaging teknikker. For at afprøve disse nye teknikker i en præklinisk indstilling er en pålidelig model af endometriecancer med retroperitoneal lymfeknude metastaser påkrævet.

Kanin VX2-tumor model er en veletableret model, som har været anvendt i udstrakt grad at studere flere menneskelige solide organ tumorer25 herunder lunge26, hoved og nakke27,28, leveren29, nyre30, knogle31,32, hjernen33, bugspytkirtlen34 oguterus 35,36,37. Den VX2-model blev oprindeligt udviklet i 1940 af Kidd og Rous38 ved succesfuld Trans plantering af en cottontail kanin papilloma virus opdaget af shope i 193339. Siden den tid, VX2-model er blevet opretholdt in vivo, kræver seriel passage i quadriceps muskel af hvide New Zealand kaniner40. Mere for nylig dog, flere grupper har med succes vokset VX2-celler in vitro40,41,42 og påvist den bevarede tumorigenecity af den dyrkede cellelinje31, 42af43. VX2-tumorer er histologisk defineret som Anaplastisk planocellulært karcinomer44 og indeholder glandulære funktioner, der ligner adenokarcinom26. Tumorer er karakteriseret ved nem implantation, hurtig vækst og hyper-vaskularisering44,45 og pålideligt metastasize, mest almindeligt til regionale og fjerne lymfeknuder45. Ligheder i uterin vaskulær og lymfe anatomi46 samt den ortotopiske vækst site sikre, at det metastatiske mønster af kanin VX2-karcinom efterligner den humane endometriecancer, hvilket gør VX2-model en pålidelig model for at studere Human metastatisk sygdom. Desuden tyder histologiske egenskaber såsom unormal mikrovaskulær spredning47 , samt immunologisk48 og genetiske ligheder49,50 mellem mennesker og kaniner på, at tumoren mikromiljø kan afspejle den humane endometriecancer.

Flere grupper har rapporteret om brugen af VX2-til at skabe en model af endometriecancer med retroperitoneale metastaser med en høj rapporterede hastighed af succes36,51,52; der findes dog betydelige variationer i den nuværende litteratur med hensyn til model skabelens metode. Cellesuspension doser så lavt som 4 x 105 celler/uterine horn51 og så højt som 5 x 109 celler/uterine horn37,53 er blevet rapporteret uden standard konsensus om den krævede VX2-cellulære dosis. Samt, en række inokulering metoder er blevet rapporteret herunder mikro-kirurgisk implantation af tumor i uterin myometrium36, injektion af VX2-cellesuspension37,44,52 , 53 og i nogle tilfælde tilsætning af uterin horn suturering før innoculation52. Endelig har ingen grupper rapporteret brugen af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model. Således formålet med denne undersøgelse er at demonstrere en vellykket standardiseret metode til VX2-model skabelse og til at rapportere den første anvendelse af dyrkede VX2-celler til at skabe en model af endometriecancer med retroperitoneale metastaser i en kanin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyb abdominal væg lukning: identificere spidsen af peritonealdialyse indsnit og forstå peritoneum, rectus femoris muskler og fascia med væv pincet. Alle dyreforsøg blev udført i dyre ressource Center (ARC) godkendte faciliteter på universitetets sundhedsnetværk og i overensstemmelse med godkendte dyre brugs-og pleje protokoller (AUP #3994/#4299). VX2-Cell line blev hentet fra Dr. Aken Lab på University Health Network.

1. oprettelse af in vitro VX2-cellelinje

  1. Høst VX2-tumor fra kanin quadricep muskel og vækst i muse flanke.
    1. Tø frosne VX2-tumorblokke (1 cm x 1 cm), hakke på en kultur plade ved hjælp af en skalpel klinge og stamme gennem et 70 μm filter ved at tilføje små mængder af Hanks afbalanceret salt opløsning (HBSS) sekventielt at sikre, at alle celler er anstrengt for en endelig volumen på 1 mL.
    2. Tæl cellerne og fortyndes med 0,9% fosfat bufferet saltvandsopløsning til en koncentration på 1 x 107/ml og Anbring på is i et sterilt rør.
      Bemærk: tumor blokke blev opnået fra en lab samarbejdspartner fra tidligere formering af VX2-tumorer i kanin quadriceps muskler.
    3. Anæstetize en kvindelig hvid newzealandsk kanin (vægt 2,5-3,5 kg) med 2-5% inhaleret isofluran, Fjern pelsen, der ligger over injektionsstedet, og rengør injektionsstedet med povidon-jod-opløsning. Injicer 500 μL af den forberedte VX2--cellesuspension (5 x 106 celler/ml) ind i quadriceps-musklen på kanin. Overvåge kanin klinisk for tumorvækst starter på dag 10.
    4. Euthanize kaninerne efter tumorer nå 1-1.5 cm i diameter (målt eksternt med kalibre) ved hjælp af en dyrlæge godkendt metode. Bekræft eutanasi ved at kontrollere vitale tegn, herunder puls og respirationsfrekvens. Punktafgiftspligtige tumoren ved hjælp af sterile instrumenter efter rengøring af området med betadin-opløsning.
    5. I et biologisk sikkerhedskabinet ved hjælp af sterile instrumenter, hakker tumoren i små stykker (0,2 cm) på en 10 cm vævskultur skål ved hjælp af en skalpel klinge. Overføre tumor fragmenter gennem en 70 μm celle si ved hjælp af 1 ml hbss som beskrevet i trin 1.1.1. Tæl cellerne og fortyndes ved hjælp af 0,9% saltvandsopløsning for at opnå 7,5 x 105 celler i 200 μl.
    6. Bedøvelse mandlige NOD scid gamma mus (vægt 25 g) ved hjælp af 4% isofluran ved 1 L/min og opretholde anæstesi med 2% isofluran. Når musene er bedøvet, indsprøjtes 200 μL af opløsningen fra trin 1.1.5 i det subkutane væv i musens flanke ved hjælp af en 27 gauge nål.
  2. Høst og passaging af VX2-celler in vitro
    1. Overvåg xenograft-vækst klinisk to gange ugentligt, indtil tumorer når 1 cm i diameter ved hjælp af kalibre.
    2. Euthanize mus ved at placere i et CO2 kammer eller udføre cervikal dislokation efter bedøvelsen med 4% isofluran gas. Punkt tumorer under sterile forhold i et biologisk sikkerhedskabinet.
    3. Hakkekød med en skalpel i 1-2 mm stykker i en 6 cm vævskultur skål indeholdende 3 mL Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM)/Ham's F12 + 10% føtal bovine serum (FBS).
    4. Efterlad tumor fragmenter uforstyrret i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i to dage, indtil cellerne begynder at vokse ud fra tumor stykker. Derefter kontrollere dyrkede plader dagligt af lys mikroskopi for celle konfluency. Efter at have nået 70% konfluency, trypsinize celler ved at tilføje 1 mL 0,05% trypsin til kolben og placering tilbage i 37 °C inkubator i 5 min.
    5. Neutraliserer trypsin med 6 mL DMEM/Hams F12 + 10% FBS medium, Saml cellerne og centrifugeres ved 4 °C i 5 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet i 3,5 mL nye DMEM/skinke F12 + 10% FBS medier. Frø friske 6 cm kollagen I belagte plader med 1,6 x 106 celler pr. plade for at opnå ca 50% celle såning tæthed.
      Bemærk: 50% celletæthed refererer til cellerne, der tager op 50% af pladens overfladeareal, når de er fastgjort.
    6. Tidlig passaging: Gentag ovenstående proces (trypsinisering, såning), indtil cellerne er blevet urerne 5 gange, og Vurder derefter celle linjens renhed med PCR ved hjælp af en kvantitativ PCR-analyse for at skelne kanin genomisk DNA fra muse genomisk DNA (Se trin 1.3.1-1.3.4).
      Bemærk: efter 8 passager kan cellerne formeres på ikke-kollagen belagt regelmæssigt klæbemiddel vævskultur plader.
    7. Passage, trypsinize og fryse aliquoter af celler i DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO i en koncentration på 2 x 106 pr. hætteglas. Opbevar cellerne i flydende nitrogen, indtil det er nødvendigt for eksperimenter.
  3. Bekræftelse af VX2-oprindelse af overlevende celler:
    1. Opret en standard kur fra renset genomisk mus og kanin-DNA (trin 1.3.2 og trin 1.3.3). Brug primere, der er rettet mod artsspecifikke sekvenser inden for den anden åbne læse ramme i linje 1-retrogennem-elementet.
      Bemærk: primer-sekvenser for CRPV E6 er: 5 '-Gatcctggacccaaccagtgog 5 '-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Der blev anvendt linje 1-retroomsætter-elementer. Primer-sekvenser for kanin linje-1 er: 5 '-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC og 5 '-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT primer sekvenser for mus linje-1 er: 5 '-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG og 5 '-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
    2. For at oprette en standardkurve for crpv E6, rense VX2-tumor celle lysat (trin 1.1.1) ved hjælp af en kommerciel kit efter producentens protokol. Kvantificere dette DNA ved hjælp af en kommerciel analyse. Udfør 6 serielle fortyndinger fra 225 PG/μL til 0,925 PG/μL i lav EDTA-TE-buffer. For at skabe en standardkurve for mus genomisk DNA, fortyndes 100 μg kommercielt muse genomisk DNA i lav EDTA-TE buffer i 5 fortyndinger fra 125 PG/μL ned til 0,0125 PG/μL.
    3. Der placeres 4 μL fra hver fortyndet opløsning fra prøverne fra trin 1.3.2 i brønde, og der udtages prøver i en PCR-termo cycler. Brug CQ-værdierne fra hver løbetur sammen med DNA-beløbene pr. brønd til at beregne en standardkurve ved hjælp af termocycler softwarens Auto tærskelindstillinger.
    4. Brug standard qPCR-procedurer til at udføre PCR med 40 cyklusser af 2-trins cykling (98 °C og 60 °C) på en termo cycler. Fastsætte tærskelværdier og angive Delta CT-værdier på > 35 for at sikre, at der er minimal muse kontaminering i kanin VX2-celle linjen. Den samlede mængde af hver reaktion var 10 μL, bestående af 5 μL 2x mastermix, 1 μL fremadvendt + reverse primere med den endelige primer-koncentration i reaktion ved 250 nM og 4 μL DNA-prøve.
      Bemærk: se referencerne54,55 for detaljer om udførelse af PCR. Tærskelværdier er fastsat, og Delta CT værdier er sat til > 35 for at sikre, at der er minimal mus forurening i kanin VX2-cellelinje. Det anbefalede niveau af VX2-DNA til pålidelig detektion ved qPCR er 1-10 PG.

2. VX2-cellekultur og skabelse af cellesuspension

  1. Tø hætteglas indeholdende VX2-celler (frosset i trin 1.2.7) i et vandbad ved 37 °C i 1 minut og Overfør celler til et konisk centrifugeglas med 10 mL kulturmedium (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin). Centrifuge i 8 min ved 107 x g, kassér supernatanten og re-suspendere celle pellet i 9 ml medier.
  2. Overfør re-suspenderede celler til en stor dyrknings kolbe. Inkuber cellerne uden at ryste ved 37 °C. Kontroller cellerne dagligt for sammenløbet ved hjælp af let mikroskopi og Skift kultur medier hver tredje dag.
  3. Skabelse af kulturperler VX2-cellesuspension til injektion
    1. Trypsinize celler ved tilsætning af 3 mL 0,25% trypsin til kolbe, når cellerne er nået op på 80% sammenløbet. Placer kolben i inkubator (37 °C) i 5 min. Overfør opløsningen til et konisk centrifugeglas, og centrifuger i 8 min ved 107 x g og fjern derefter supernatanten.
    2. Celle pillerne vaskes 3 gange med 9 mL fosfat bufferet saltvand, centrifugeres og fjernes supernatanten som ovenfor. Tæl cellerne og fortyndes med 0,9% fosfat bufferet saltvandsopløsning til en koncentration på 4 x 107 celler/ml og placeres i et sterilt konisk centrifugeglas på is.
  4. Oprettelse af in vivo formeret VX2-cellesuspension til injektion
    1. Tø frosne VX2-tumorblokke (1 cm x 1 cm), hakning på en kultur plade ved hjælp af en skalpel klinge og stamme gennem et 70 μm filter som i trin 1.1.1. Tilføj små mængder HBSS sekventielt for at sikre, at alle celler er anstrengt for et endeligt volumen på 1 mL. Tæl cellerne og fortyndes med 0,9% fosfat bufferet saltvand til en koncentration på 1 x107/ml og Anbring på is i et sterilt rør.
      Bemærk: tumor blokke blev opnået fra en lab samarbejdspartner fra tidligere formering af VX2-tumorer i kanin quadriceps muskler.

3. kirurgisk model etablering

  1. Etablering af kirurgisk anæstesi og præ-operativ forberedelse
    1. Præmedicinere kvindelige hvide newzealandske kaniner (2,5-3,5 kg) 1 time før den planlagte kirurgiske procedure ved hjælp af injektioner af Acepromazin (1 mg/kg IM) og Meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anæstetize en kvindelig hvid newzealandsk kanin (vægt 2,5-3,5 kg) med 2-5% inhaleret isofluran, Fjern pelsen, der ligger over injektionsstedet, og rengør injektionsstedet med povidon-jod-opløsning.
    2. Intubate bedøvet kaniner ved hjælp af en larynx maske luftveje (LMA) og fastgør på plads med tape, opretholde dyb anæstesi ved at titrere den inhalerede isofluran dosis mellem 2-5%. Overvåg kirurgisk anæstesi regelmæssigt under hele proceduren ved at kontrollere vitale tegn (respiratorisk hastighed, kapillær refill, iltmætning hvis tilgængelig) og overvågning for tegn, der tyder på smerte (bevægelse, tilbagetrækning fra stimuli, lyde) eller lys anæstesi (bevægelse, tygge på LMA tube).
      Bemærk: dette bør gøres af en person med erfaring overvågning kirurgisk anæstesi.
    3. Anbring et 22-gauge-øvenerkateter i den marginale dorsalvene. Administration af cefazolin (20 mg/kg) intravenøst 10 min før kirurgisk indsnit i huden.
    4. Klip håret over bækkenet og maven, før du placerer kaninen på operationsbordet, og Placer derefter kaniner i en rygposition på operationsbordet. Rengør operationsfeltet med en 3-trins kirurgisk hudforberedelse (betadin-sæbe, chlorhexidin-opløsning, betadin-opløsning). Drape det kirurgiske felt med laparotomi draperer efter land-mærkning toppen af kønsbehåring knogle, forlader en 5 cm x 5 cm område af underlivet eksponeret.
  2. Skabelse af laparotomi indsnit og identifikation af livmoder horn
    1. Sæt på en kirurgisk hætte og ansigtsmaske. Skrub hænder ved hjælp af chlorhexidin eller betadin kirurgisk skrubbe opløsning. Brug steril teknik, sat på en steril kjole og sterile kirurgiske handsker.
    2. Ved hjælp af en # 11-klinge skalpel, lav en 2,5 cm lang indsnit 1 cm kranial til låsen pubis gennem huden og subkutane væv af kanin maven. Incise rectus femoris fascia og dissekere rectus femoris musklerne sideværts for at udsætte det underliggende peritoneum. Indtast bughinden skarpt efter sikring af underlaget er fri for tarm eller andre abdominale organer.
    3. Find livmoder hornene, der identificerer urinblæren og fejer en dykket finger superiorly, bagtil og sideværts over spidsen af blæren.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan hele blæren tømmes ved hjælp af digitalt tryk. Når placeret, bringe livmoder horn gennem abdominal indsnit at hvile på bugvæggen.
    4. Ved hjælp af en 3-0 flettet absorberbare sutur, udføre en enkelt sutur ligering af hver livmoder horn ca 1.5-2,0 cm distale til cervices. Placer suturen lige mediale til livmoder arterierne, som løber langs det laterale aspekt af hvert horn. Binde suturerne stramt til at sammenknytte de distale uterin horn (figur 1).
  3. Myometrial VX2-inokulation
    1. Ved hjælp af en 27-gauge nål indsprøjtes 0,5 mL af den tidligere fremstillede VX2-cellesuspension fra enten trin 2.3.2 (for kultur VX2-model) eller 2,4 (for in vivo-formeret VX2--model) ind i myometrium af hvert uterin horn proximalt til sutur stedet (mellem sutur stedet og livmoderhalsen). Injicér over 1 minut, og sørg for, at cellerne ikke injiceres i det underliggende uterin hulrum. Bedøvelse af dyr med inhaleret isofluran (2-5%) og en bedøvelses maskine med et Bain kredsløb.
    2. Tryk på det myometriale injektionssted i 30 s efter injektionen for at minimere lækage af celler. Undersøg injektions-og suturstederne for hæmostase, og Placer livmoder hornene tilbage i maven.
  4. Lukning af kirurgisk indsnit
    1. Dyb abdominal væg lukning: identificere spidsen af peritonealdialyse indsnit og forstå peritoneum, rectus femoris muskler og fascia med væv pincet.
      1. For at gøre dette, forankre suturen på en spids af snittet ved at suturere overfladisk til dybt på den ene side af snittet og dybt til overfladisk på den anden. Binde en knude. Ved hjælp af vedlagte sutur, gør at køre masker vinkelret på snittet gennem lagene af bugvæggen arbejder trinvise langs snittet fra side til side. Binde suturen og skære.
    2. Overfladisk abdominal væg lukning: identificere spidsen af huden indsnit og sutur abdominal hud ved hjælp af begravet kører subcutikel 3-0 absorberbare poly-filament sutur. Påfør kirurgisk lim til det lukkede snit til at modsætte huden kanter.
      1. For at gøre dette, forankre suturen på en spids af snittet, ved at suturere dybt til overfladisk på den ene side af snittet og overfladiske til dybe på den anden. Binde en knude. Ved hjælp af de vedlagte suturer, gøre kører masker i dermal lag parallelt med incisionen arbejder trinvise langs snittet fra side til side. Binde suturen og skære.
  5. Post operative pleje
    1. Opvågning fra anæstesi: Sluk for isofluran, når indsnittet er lukket og lad kaninen ånde ilt ved maske, mens overvågning for tegn på opvågnen (f. eks spontane bevægelser, øjenåbning og tygge bevægelser på larynx maske luftvejene). Extubate kaninen, når disse tegn er noteret og giver ilt ved maske og et varmt tæppe, indtil kaninerne er opmærksomme og i stand til at sidde selvstændigt.
    2. Postoperativ overvågning: Overvåg kaniner to gange dagligt i 4 dage og dagligt i yderligere 10 dage efter operationen. At overvåge, vurdere deres generelle tilstand, deres mad og vandindtag, urin og fækal udgang, smerte vurdering, vægt, vitale tegn (puls, respirationshastighed) og deres kirurgiske sted på udkig efter hævelse, erythema, udledning eller dehiscens.
    3. Postoperativ smertekontrol: Administrer meloxicam dagligt (0,2 mg/kg SQ) for 48 h postoperativt og derefter efter behov baseret på smerte vurdering. Buprenorphin administreres umiddelbart efter operationen og hver 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) i 24 timer og derefter efter behov baseret på smerte vurdering
    4. Antibiotika (enrofloxacin 5mg/kg IM) kan administreres dagligt i syv dage efter operativt for at forhindre sårinfektion som anbefalet af din dyrlæge. Administrere subkutane væsker (15 mL SQ) to gange om dagen efter behov for dehydrering og bløde fødevarer eller andre kosttilskud leveres dagligt efter behov for vægttab.

4. tumor vækst overvågning

  1. Klinisk monitorering: Monitor kaniner hver 2 dage for kliniske tegn på tumorvækst startende på post-operative dag 14. Kliniske tegn på tumorvækst kan omfatte nedsat oral indtagelse, sløvhed, abdominal ømhed, håndgribelig abdominal masse og tab af cecotrophy.
  2. Billeddannelse og invasiv overvågning
    1. CT-scanning: på postoperativ dag 21-28, præmedicinere, anæstetize og intubate kaniner som tidligere beskrevet i 3.1.1-3.1.2. Placer kaniner i en rygstilling i en præklinisk CT-scanner, og få billeder af bækkenet og maven efter administration af 10 mL intravenøst iohexolkontrast middel.
    2. Kirurgisk overvågning: Overfør kaniner til operationsstuen efter billeddannelse, mens de stadig er under generel anæstetika. Position, prep og drapere kaniner som tidligere beskrevet i trin 3.1.4 og udføre en gentagelse laparotomi indsnit ca. 1,5 cm i længden gennem den tidligere indsnit. Identificere og livmoder horn og omhyggeligt undersøge for tumor. Luk snittet og giv postoperative pleje som tidligere beskrevet i trin 3.5.2-3.5.4.
    3. Kanin model brug: Hvis kaniner er fundet at have tumorer på tidspunktet for kirurgisk overvågning, bruge kanin endometriecancer kræft modeller for planlagte eksperimenter. Brug kaniner skabt fra in vivo formeret celler til yderligere eksperimenter ved 4-ugers post-inokulation og bruge kanin modeller skabt fra dyrkede VX2-celler på ca 5-6 uger efter inokulation at tage højde for langsommere tumorvækst. Euthanize kaninerne efter tumorer nå 1-1.5 cm i diameter (målt eksternt med kalibre) ved hjælp af en dyrlæge godkendt metode. Bekræft eutanasi ved at kontrollere vitale tegn, herunder puls og respirationsfrekvens. Punktafgiftspligtige tumoren ved hjælp af sterile instrumenter efter rengøring af området med betadin-opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tyve-otte kaniner blev anvendt til oprettelse af endometriecancer model. Kaniner havde en gennemsnitsvægt på 2,83 kg (2.71-3.58 kg) på tidspunktet for forsøget. Uterine tumorer med succes voksede i 21 kaniner for en samlet model succesrate på 75%. Forud for optagelsen af uterin suturering i protokollen, succesraten var 57% sammenlignet med 81% efter uterin suturering blev tilføjet. Uterine suturering blev føjet til protokollen efter den 7th kanin som reaktion på den oprindelige lave model succesrate. Fem modeller blev skabt fra kulturperler VX2-celler (forsøgt i 8 kaniner, 63% succesrate) og 16 kanin modeller blev skabt fra in vivo formeret celler (forsøgt i 22, 73% succesrate). I modeller skabt fra in vivo formeret VX2-celler, en celle dosis på 5 x 106 per livmoder horn blev anvendt i alle dyr og det gennemsnitlige antal dage fra inokulation til eksperiment var 29 dage (interval 24-31). I modeller skabt fra dyrkede VX2-celler, en eskalerende dosis protokol blev anvendt til at bestemme den relevante inokulerings dosis. Doser på 2,5 x 106 celler og 5 x 106 celler pr. uterin horn var mislykket, og en dosis på 10 x 106 celler pr. uterin horn var vellykket i en kanin men, tumorvækst var langsom på 57 dage fra inokulation at eksperimentere. En dosis på 20 x 106 celler pr. uterin horn var vellykket i 4 kaniner i en gennemsnitlig tid på 45 dage (interval 36-51 dage) fra inokulation til at eksperimentere og blev således bestemt som den optimale injektion dosis. Disse data er opsummeret i tabel 1. På PCR-analyse efter passage 5 var de dyrkede VX2-celler meget positive for både kanin linje 1 og CRPV-E6 med kun spormængder af mus LI NE-1 blev identificeret (< 0,01 PG/μL). Celler blev efterfølgende dyrket i cellekultur væksten var dog langsom med en gennemsnitlig tid på 7 dage (6-9 d) for at opnå kolbens konfluency.

Alle modeller resulterede med succes i metastatisk omdannelse af retroperitoneale lymfeknuder (figur 2). Nitten kaniner havde patologisk bekræftet lymfeknudemetastaser og 11 havde patologisk bekræftet Extra-nodal abdominale metastaser. En kanin ikke havde adskilte lymfeknuder fjernet; Men, det havde en stor byrde af intra-abdominale sygdom, hvor lymfeknude metastaser blev antaget, og en kanin døde før forsøget. Tumorer og metastatiske lymfeknuder fra dyrkede VX2-celler syntes ligner tumorer fra in vivo formeret VX2-celler på histologi (figur 3), med tætte hæmatoxylin farvede celler invaderende muskler og danner glandular-lignende strukturer med mange patologiske mitotiske tal.

Ved hjælp af et nyt billedbehandlings middel blev Porphysome, 81 lymfeknuder identificeret intra-operativt og kirurgisk fjernet for histologisk analyse. 74 lymfeknuder blev venstre bækken lymfeknuder, 5 var højre bækken lymfeknuder og 2 var rigtige para-aorta lymfeknuder. Lymfeknuder fjernet fra kaniner med in vivo formeret VX2-tumorer var signifikant større og mere nekrotisk end dem fjernet fra kaniner med kulturperler VX2-tumorer med en gennemsnitlig volumen på 0,99 cm3 (interval 0,12-3,89) versus 0,59 cm3 (0,01- 2,92) (p = 0.037). Samt, kaniner med in vivo formeret tumorer havde større mere nekrotiske livmodertumorer end kaniner med dyrkede celle tumorer med en gennemsnitlig længde på 5,6 cm (4-6,8 cm) og gennemsnitlig bredde på 5,2 cm (3,3-9 cm) versus 3,6 cm (2-5 cm) og 4.56 cm (3-7 cm) hhv. Endelig havde kanin modeller fremstillet af in vivo-opformeret VX2--celler flere ekstra nodal-metastaser end kanin modeller fremstillet af dyrkede celler med 91% af alle metastaser fundet i in vivo-opformeret kaniner.

Figure 1
Figur 1: uterin suturering. Sort pil = suturer, rød pil = uterin horn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: VX2-tumor (A) intra-uterin tumor. Sort pil = tumor, rød pil = uterin horn (B) metastaserende venstre bækken lymfeknuder. Sort pil = metastaserende lymfeknuder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Histologi af kulturperler celle VX2-tumor (A) H & E farvning viser tumor infiltration af omgivende muskler (10x forstørrelse, Scale bar = 300 μm) (B) pancytokeratin farvning viser tæt farvning tumorceller svarende til områder af tumor på H & E (10x forstørrelse, skala = 300 μm). Sort pil = VX2-tumor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Model type In vivo VX2-tumor model Kultiveret VX2-tumor model
Antal vellykkede modeller 16 5
Antal forsøgte modeller 22 8
Model succesrate 73% 63%
Tid fra inokulation til eksperiment 29 dage (24-31) 45 dage (36-51)
Vellykket injektion dosis 1 x 107 40 x 106
(5x106 pr. livmoder horn) (20 x 106 pr. livmoder horn)
Samlet succesrate 75%
Samlet succesrate før uterin suturering 57%
Samlet succesrate efter uterin suturering 81%

Tabel 1: model data, herunder forsøgsbetingelser, antal anvendte dyr og succesrate. 2 kaniner anvendes oprindeligt for dyrkede celle tumorer modeller, hvor væksten var mislykket blev efterfølgende anvendt til in vivo tumormodeller

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri, vi har rapporteret en standardiseret kirurgisk metode til etablering af en VX2-endometriecancer model og rapporterede om den første brug af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model. Tumoren tager sats på 75% er lavere end 100% procentsats tidligere rapporteret i litteraturen35,37,53,56; men THW 90% af patologisk bekræftede lymfeknuder metastaser er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser af denne model35,53.

Optagelsen af uterin suturering betydeligt øget model succesrate fra 57% til 81%, og vi betragter dette skridt til at være en integreret del af den kirurgiske protokol. Livmoder suturering blev ikke oprindeligt udført på grund af modstridende rapporter om brugen af suturering i litteraturen og bekymringer vedrørende livmoder horn devaskularisering fra bilateral uterin arterie ligation. I betragtning af den betydelige forbedring i tage sats med tilsætning af uterin suturering, vi hypotese, at lækage af cellen suspension væk fra injektionsstedet kan have bidraget til den oprindelige lav succesrate. Anatomisk indeholder cellesuspensionen i en lille del af livmoder horn sikrer, at en høj lokal koncentration af celler er udsat for Vaskulaturen af myometrium, som sandsynligvis forbedrer tumor engraftment. Desuden blev der ikke konstateret tilfælde af uterin horn nekrose i forsøget. At sikre, at cellesuspensionen injiceres i myometrium er også vigtigt som intra-uterin eller Extra-myometriale injektioner kan også øge tabet af cellesuspension. Uterin myometrium i kaniner er ekstremt tynd og sand intra-myometrial injektion er vanskelig. På grund af dette, vi hypotese, at brugen af en cellulære matrix stilladset såsom Matrigel kan forbedre tage sats af celler, der uforvarende injiceres i livmoderhulen. På trods af disse potentielle begrænsninger, mener vi, at cellen suspension metode er bedre end tidligere rapporterede mikrokirurgiske metoder36 , hvor tumorblokke er podet på livmoder myometrium som denne metode er teknisk udfordrende. I sammenligning, metoden her er enkel, inkorporerer almindeligt anvendte teknikker, og det er af disse grunde, vi mener, at det er meget reproducerbare.

In vivo-opformeret VX2-kanin-modellerne blev injiceret med en standard dosis på 5 x 106 celler pr. uterin horn, som var baseret på en samarbejdspartners erfaring med VX2-kanin modeller. Denne dosis er signifikant lavere end rapporteret i litteraturen, hvor celle doser så højt som 1 x 108 af Harima et al.52 og 5 x 109 af både Huang37,53 og Xu35 blev anvendt. I betragtning af den korte tidsramme, hvor modellen blev etableret, og den høje hastighed af både lymfeknude og Extra-nodal metastaser, mener vi ikke, at brugen af en højere dosis ville have forbedret modellen. En højere dosis kan have fremmet endnu hurtigere og aggressiv tumor spredning, som ville forringe nytten af modellen. 83% af de in vivo-opformeret VX2--modeller havde ekstra nodal-sygdom på tidspunktet for forsøget, og dette er det overraskende, at andre grupper ikke rapportere udviklingen af abdominale metastaser på 30 dage. En mulig forklaring på denne forskel kan være utilsigtet intra-vaskulær inokulering27 på grund af højt tryk eller høj hastighed injektion, hvilket kan resultere i hurtigere Fjern metastaserende spredning. Vi har således en hypotese om, at hastigheden af injektionen kan være en faktor i hastigheden af metastaser, hvilket er grunden til, at vi anbefaler en langsom injektion hastighed i protokollen.

Forholdsvis, trods den højere injektion dosis (20 x 106 pr livmoder horn), kun 40% af de dyrkede VX2-model kaniner udviklet Extra-nodal sygdom og alle metastatiske aflejringer var mærkbart mindre og mindre nekrotisk i disse kaniner. Vi har ikke nogen litteratur, hvormed man direkte kan sammenligne resultaterne, da dette er den første rapporterede brug af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model. Men, resultaterne er i overensstemmelse med undersøgelser af andre dyrkede VX2-tumorer, hvor høje inokulering doser var påkrævet, og tumorvækst blev noteret for at være langsom27,31. Gennem dette eksperiment, vi har identificeret den optimale injektion dosis af 20 x 106 celler per livmoder horn, som resulterede i pålidelig vækst og metastaser i 80% af kaniner ved hjælp af en eskalerende dosis protokol. Det er muligt, at en endnu højere dosis af dyrkede VX2-celler ville resultere i hurtigere metastatisk spredning men da de VX2-celler voksede langsomt i kulturen, det var udfordrende at kulturen nok celler til at forsøge en højere dosis. Dette er en begrænsning af undersøgelsen og har identificeret dette som et potentielt område for fremtidig undersøgelse. Men vi betragter den langsommere vækst i den dyrkede celle model til at være fordelagtig, da vi mener, at det kan replikere det kliniske scenario af endometriecancer mere pålideligt, da endometriecancer generelt er en langsom voksende sygdom, der metastastørrelserne først at bækken lymfeknuder og resulterer i sene fjerne metastaser. Det oprindelige valg til at udbrede de VX2-celler i mus tilladt for en hurtigere turnaround, og billigere vedligeholdelsesomkostninger; men alternativt, cellerne kunne have været afledt direkte fra quadriceps muskel af kaniner.

Vi mener, at den tætte postoperative overvågning for tegn og symptomer på tumorvækst er et vigtigt aspekt af protokollen. Efter vores erfaring, når kaniner udvikler metastatisk sygdom, de fremskridt hurtigt at være klinisk ugodt, især i in vivo formeret gruppe. Denne hurtige, aggressive vækst blev fremhævet ved døden af en kanin fra metastatisk sygdom efter en forsinkelse på kun 2 dage fra den planlagte eksperiment dato. Mens hastigheden af VX2-model etablering er blevet betragtet som en styrke, som lignende musemodeller (dvs., HEC-1 endometriecancer karcinom model med lymfeknude metastaser i mus) kan tage op til dobbelt så lang tid at etablere57, disse resultater viser også denne bestemmelse af den optimale eksperimentelle timing er altafgørende. Resultaterne korrelerer med tidligere undersøgelser, hvor tumorvækst og lymfeknude udvidelse steg betydeligt efter postoperative dag 2137,53; men vi mener, at der vil variabilitet med hensyn til den VX2-cellelinje, der anvendes, og tilskynde grupper til at forstå deres specifikke eksperimentelle timing. Denne tidslinje gælder ikke for vores kultiverede VX2-modeller og har identificeret dette som et område, der kræver yderligere undersøgelse. For at være sikker på tumorvækst, vi valgte at bruge både ikke-invasiv og invasiv tumor overvågning i løbet af protokollen. Men en anden fremtidig retning kan være at forfine den postoperative Imaging protokol for at undgå behovet for en anden invasiv procedure.

Samlet set har vi rapporteret en enkel, standardiseret metode til at skabe en model af endometriecancer med retroperitoneal lymfadenopati hos kaniner. Gennem denne protokol har vi behandlet den betydelige variation i den VX2-litteratur med hensyn til celle dosis, kirurgisk teknik og postoperativ model overvågning. Vi erkender, at en yderligere begrænsning af undersøgelsen er, at ved hjælp af en VX2-cellelinje i stedet for en menneskelig xenograft er vi ikke helt efterligne tumor biologi og mikromiljø af menneskelig kræft. Men vi håber, at andre grupper vil bruge kultiverede VX2-celler til at skabe deres modeller, som vi mener, at denne celletype kan modellere menneskelig endometriecancer mere pålideligt gennem sin langsommere vækst og nedsat tilbøjelighed til metastasize. Vi opfordrer andre grupper til denne hurtige og nemme model af uterin afledte retroperitoneale lymfeknude metastaser til at studere nye Imaging behandlingsformer til at hjælpe patienter med metastatisk endometriecancer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), det canadiske Institut for sundhedsforskning (Foundation Grant #154326), den canadiske Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada, Сanada Foundation for innovation og prinsesse Margaret Cancer Foundation.

Jeg vil gerne takke Dr. Marguerite Akens for at give de indledende VX2-celler til etablering af den oprindelige VX2-model og de frosne VX2-tumorblokke. Jeg vil gerne takke Marco DiGrappa for at hjælpe med at udføre indledende VX2-cellekultur eksperimenter og Lili Ding for at hjælpe med VX2-cellekultur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109 (2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49 (2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859 (2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Tags

Kræftforskning endometriecancer Orthotopic Cancer model VX2-cellelinje lymfadenopati kanin model kirurgisk model cellekultur
En Ortotopisk endometriecancer model med retroperitoneal lymfadenopati fremstillet af in vivo opformeret og kulturperler VX2-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., … More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter