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Cancer Research

Ein orthotopisches Endometriumkrebs-Modell mit retroperitonealer Lymphadenopathie made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340

Summary

Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode zum Wachstum von VX2-Zellen in Kultur dar und zur Erstellung eines orthotopischen VX2-Modells von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen bei Kaninchen. Orthotopische Endometriumkrebsmodelle sind wichtig für die präklinische Untersuchung neuartiger bildgebender Modalitäten für die Diagnose von Lymphknotenmetastasen.

Abstract

Endometriumkrebs ist die häufigste gynäkologische Malignität in Nordamerika und die Inzidenz steigt weltweit. Die Behandlung besteht aus einer Operation mit oder ohne adjuvante Therapie in Abhängigkeit von lymphen Knoten Beteiligung, wie durch Lymphadenektomie bestimmt. Lymphadenektomie ist ein morbides Verfahren, das bei vielen Patienten keinen therapeutischen Nutzen hat, und daher ist eine neue Methode zur Diagnose von Lymphknotenmetastasen erforderlich. Um neuartige Bildgebungsmittel zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich. Das Modell des VX2-Endometriumkarzinoms wurde häufig in der Literatur beschrieben; Hinsichtlich der Methode der Modelleinrichtung bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Darüber hinaus wurden keine Studien über die Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells berichtet, da bisher nur in vivo propagierte Zellen verwendet wurden. Hierbei stellen wir eine standardisierte chirurgische Methode und postoperative Überwachungsmethode zur Etablierung des VX2-Endometriumkrebsmodells vor und berichten über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells.

Introduction

Endometriumkrebs, oder Krebs der Gebärmutterschleimhaut, ist die zweithäufigste gynäkologische Malignität weltweit und die häufigste Malignität in entwickelten Ländern1. Die Inzidenz von Endometriumkrebs hat stetig zugenommen und ist zwischen 2005 und 2013 um 2,3 % pro Jahr gestiegen, wobei die Sterblichkeit entsprechend um 2,2 % gestiegen ist1,2,3. Die Diagnose von Lymphknotenmetastasen ist von größter Bedeutung, da das Vorhandensein positiver Lymphknoten ein starker negativer Vorhersagegeber für das Überleben4,5,6,7 ist und die adjuvante Therapie8,9,10,11,12,13. Lymphknotenmetastasen werden derzeit diagnostiziert, indem das Lymphgewebe, das über die wichtigsten Blutgefäße im Becken und Bauch liegt, operativ entfernt wird. Dieses Verfahren, bekannt als Lymphadenektomie, ist aufgrund widersprüchlicher Überlebensdaten aus zwei großen Studien14,15,16,17,18 und der bekannten Risiko einer intraoperativen15,19,20 und postoperativen Morbidität21,22,23. Da die aktuellen nicht-invasiven bildgebenden Modalitäten nicht über die erforderliche Empfindlichkeit und Spezifität verfügen, um lymphknotendissektion24zu ersetzen, wurde versucht, neue diagnostische Bildgebungstechniken zu entwickeln. Um diese neuartigen Techniken in einem präklinischen Umfeld zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich.

Das Kaninchen VX2 Tumormodell ist ein etabliertes Modell, das ausgiebig verwendet wurde, um mehrere menschliche solide Organtumoren25 einschließlich Lunge26, Kopf und Hals27,28, Leber29, Niere30, Knochen31,32, Gehirn33, Bauchspeicheldrüse34 und Gebärmutter35,36,37. Das VX2-Modell wurde ursprünglich 1940 von Kidd und Rous38 durch die erfolgreiche Transplantation eines Baumwollschwanz-Kaninchen-Papilloma-Virus von Shope im Jahr 1933entdeckt 39entwickelt. Seit dieser Zeit wurde das VX2-Modell in vivo beibehalten, was eine serielle Passage im Quadrizeps-Muskel von White New Zealand Kaninchen40erfordert. In jüngerer Zeit jedoch haben mehrere Gruppen erfolgreich VX2-Zellen in vitro40,41,42 angebaut und die zurückgehaltene Tumorigenität der kultivierten Zelllinie31 , 42,43. VX2-Tumoren sind histologisch als anaplastische Plattenepithelkarzinome44 definiert und enthalten Drüsenmerkmale, die dem Adenokarzinom26ähneln. Tumore zeichnen sich durch einfache Implantation, schnelles Wachstum und Hypervaskularität44,45 und zuverlässig metastasieren, am häufigsten auf regionale und entfernte Lymphknoten45. Ähnlichkeiten in der Gefäß- und Lymphanatomie46 sowie der orthotopischen Wachstumsstelle stellen sicher, dass das metastasierende Muster des Kaninchens VX2-Karzinom dem des menschlichen Endometriumkrebses nachahmt, was das VX2-Modell zu einem zuverlässigen Modell für die Untersuchung menschlicher metastasierende Erkrankung. Darüber hinaus deuten histologische Merkmale wie abnorme mikrovaskuläre Proliferation47 sowie immunologische48 und genetische Ähnlichkeiten49,50 zwischen Mensch und Kaninchen darauf hin, dass der Tumor Mikroumgebung kann die des menschlichen Endometriumkrebses widerspiegeln.

Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von VX2 berichtet, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen mit einer hohen gemeldeten Erfolgsrate36,51,52zu erstellen; In der aktuellen Literatur bestehen jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Methode der Modellerstellung. Zellsuspensionsdosen so niedrig wie 4 x 105 Zellen/Gebärmutterhorn51 und so hoch wie 5 x 109 Zellen/Uterushorn37,53 wurden ohne Standardkonsens über die erforderliche VX2 Zelldosis berichtet. Außerdem wurden eine Vielzahl von Impfmethoden berichtet, einschließlich mikrochirurgischer Implantation von Tumoren in das Uterusmyometrium36, Injektion von VX2-Zellsuspension37,44,52 , 53 und in einigen Fällen die Zugabe von Uterushorn-Nähte vor der Innokulation52. Schließlich haben keine Gruppen die Verwendung von kultivierten VX2-Zellen gemeldet, um dieses Modell zu erstellen. Der Zweck dieser Studie besteht also darin, eine erfolgreiche standardisierte Methode der VX2-Modellerstellung zu demonstrieren und die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zu melden, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen bei einem Kaninchen zu erstellen.

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Protocol

Tiefer Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie die Spitze des Peritonealschnitts und greifen Sie das Peritoneum, den Rectusmuskel und die Faszien mit Gewebezangen. Alle Tierstudien wurden in den vom Animal Resource Center (ARC) zugelassenen Einrichtungen des University Health Network und in Übereinstimmung mit zugelassenen Tiernutzungs- und Pflegeprotokollen (AUP #3994/#4299) durchgeführt. Die VX2-Zelllinie wurde aus Dr. Akens Labor am University Health Network gewonnen.

1. Erstellung von In-vitro-VX2-Zelllinie

  1. Ernten Sie den VX2-Tumor von Kaninchen Quadricep Muskel und Wachstum in Mausflanke.
    1. Gefrorene VX2-Tumorblöcke (1 cm x 1 cm) auftauen, mit einer Skalpellklinge auf einer Kulturplatte hacken und durch einen 70-mm-Filter steil ieren, indem man kleine Mengen Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) sequenziell hinzufügt, um sicherzustellen, dass alle Zellen für ein Endvolumen von 1 ml belastet werden.
    2. Zellen zählen und mit 0,9% Phosphat gepufferter Salinelösung auf eine Konzentration von 1 x 107/ml verdünnen und in einem sterilen Rohr auf Eis legen.
      HINWEIS: Tumorblöcke wurden von einem Labormitarbeiter aus der vorherigen Ausbreitung von VX2-Tumoren in Kaninchen-Quadrizeps-Muskeln erhalten.
    3. Anästhetisieren Sie ein weibliches weißes neuseeländisches Kaninchen (Gewicht 2,5-3,5 kg) mit 2-5% inhaliertem Isofluran, entfernen Sie das Fell über der Injektionsstelle und reinigen Sie die Injektionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung. Injizieren Sie 500 l der vorbereiteten VX2-Zellsuspension (5 x 106 Zellen/ml) in den Quadrizepsmuskel des Kaninchens. Überwachen Sie das Kaninchen klinisch auf Tumorwachstum ab Tag 10.
    4. Euthanisieren Sie die Kaninchen nach Tumoren erreichen 1-1,5 cm im Durchmesser (extern mit Sätteln gemessen) mit einer vom Tierarzt zugelassenen Methode. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie die Lebenszeichen einschließlich Herzfrequenz und Atemfrequenz überprüfen. Verbrauchen Sie den Tumor mit sterilen Instrumenten nach der Reinigung des Bereichs mit Betadin-Lösung.
    5. In einem biologischen Sicherheitsschrank mit sterilen Instrumenten den Tumor in kleine Stücke (0,2 cm) auf einer 10 cm Gewebekulturschale mit einer Skalpellklinge zerkleinern. Übergeben Sie die Tumorfragmente durch ein 70-m-Zellsieb mit 1 ml HBSS, wie in Schritt 1.1.1 beschrieben. Zählen Sie die Zellen und verdünnen Sie sie mit 0,9% Salinelösung, um 7,5 x 105 Zellen in 200 l zu erhalten.
    6. Anästhetisieren Sie männliche NOD-Scid-Gamma-Mäuse (Gewicht 25 g) mit 4% Isofluran bei 1 L/min und halten Sie anästhesie mit 2% Isofluran. Sobald Mäuse anästhesiert sind, injizieren Sie 200 l der Lösung ab Schritt 1.1.5 mit einer 27-Spur-Nadel in das subkutane Gewebe der Mausflanke.
  2. Ernte und Passierung von VX2-Zellen in vitro
    1. Überwachen Sie das Xenograft-Wachstum klinisch zweimal wöchentlich, bis Die Tumoren mit Sätteln einen Durchmesser von 1 cm erreichen.
    2. Euthanisieren Sie Mäuse, indem Sie sie in eineCO2-Kammer legen oder zervikale Dislokationen nach der Anästhesisierung mit 4% Isoflurangas durchführen. Verbrauche Tumore unter sterilen Bedingungen in einem biologischen Sicherheitsschrank.
    3. Mince Tumoren mit einem Skalpell in 1-2 mm Stücke in einer 6 cm Gewebekulturschale mit 3 ml Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham es F12+ 10% fetales Rinderserum (FBS) Medien.
    4. Lassen Sie Tumorfragmente ungestört in einem 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 für zwei Tage, bis die Zellen aus den Tumorstücken zu wachsen beginnen. Anschließend überprüfen Sie kultivierte Platten täglich durch Lichtmikroskopie auf Zellkonfluenz. Nach Erreichen von 70% Koninfluenza, Trypsinisieren Zellen durch Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin in den Kolben und wieder in den 37 °C Inkubator für 5 min.
    5. Trypsin mit 6 ml DMEM/Schinken F12 + 10% FBS-Medium neutralisieren, Zellen und Zentrifuge bei 4 °C für 5 min bei 300 x gsammeln. Entfernen Sie Überstand und setzen Sie Pellet in 3,5 ml der neuen DMEM/Ham F12 + 10% FBS-Medien wieder auf. Samen frische 6 cm Kollagen I beschichtete Platten mit 1,6 x 106 Zellen pro Platte, um etwa 50% Zellsaatdichte zu erreichen.
      HINWEIS: 50 % Zelldichte bezieht sich auf die Zellen, die 50 % der Oberfläche der Platte einnehmen, wenn sie befestigt sind.
    6. Frühe Spassierung: Wiederholen Sie den obigen Prozess (Trypsinisierung, Aussaat), bis die Zellen 5 Mal durchlaufen wurden, und bewerten Sie dann die Zelllinienreinheit mit PCR mithilfe eines quantitativen PCR-Tests, um die genomische DNA von Derichmaus von der genomischen DNA der Maus zu unterscheiden (siehe Schritt 1.3.1-1.3.4).
      HINWEIS: Nach 8 Passagen können Zellen auf nicht kollagenbeschichteten regulären, anhaftenden Gewebekulturplatten vermehrt werden.
    7. Durchgang, Trypsinisieren und Einfrieren von Aliquots von Zellen in DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO bei einer Konzentration von 2 x 106 pro Durchstechflasche. Speichern Sie Zellen in flüssigem Stickstoff, bis sie für Experimente benötigt werden.
  3. Bestätigung des VX2-Ursprungs von überlebenden Zellen:
    1. Erstellen Sie eine Standardkur aus gereinigter genomischer Maus- und Kaninchen-DNA (Schritt 1.3.2 und Schritt 1.3.3). Verwenden Sie Primer, die auf artspezifische Sequenzen im zweiten offenen Leserahmen des LINE-1-Retrotransposonelements abzielen.
      HINWEIS: Primer-Sequenzen für CRPV E6 sind: 5'- GATCCTGGACCCACAAGTGund 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Die LINE-1 Retrotransposon-Elemente wurden verwendet. Primer-Sequenzen für Kaninchen LINE-1 sind: 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC und 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Primer Sequenzen für Maus LINE-1 sind: 5'-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG und 5'-CCTTCTGACCAAGGTATCATTG
    2. Um eine Standardkurve für CRPV E6 zu erstellen, reinigen Sie VX2-Tumorzelllysat (Schritt 1.1.1) mit einem kommerziellen Kit nach dem Herstellerprotokoll. Quantifizieren Sie diese DNA mit einem kommerziellen Test. Führen Sie 6 serielle Verdünnungen von 225 pg/l bis 0,925 pg/L in niedrigem EDTA-TE-Puffer durch. Um eine Standardkurve für die genomische DNA der Maus zu erstellen, verdünnen Sie 100 g kommerzielle Mausgenom-DNA in niedrigem EDTA-TE-Puffer in 5 Verdünnungen von 125 pg/l bis zu 0,0125 pg/l.
    3. Legen Sie aus jeder verdünnten Lösung aus den Proben ab Schritt 1.3.2 4 l in Brunnen und führen Sie Proben in einem PCR-Thermocycler aus. Verwenden Sie die Cq-Werte aus jedem Lauf zusammen mit den DNA-Beträgen pro Bohrgut, um eine Standardkurve mit den Auto-Schwellenwerteinstellungen der Thermocycler-Software zu berechnen.
    4. Verwenden Sie standard qPCR-Verfahren, um PCR mit 40 Zyklen 2-stufigen Zyklus (98 °C und 60 °C) auf einem Thermocycler durchzuführen. Legen Sie Schwellenwerte fest, und legen Sie Delta-Ct-Werte auf >35 fest, um sicherzustellen, dass die VX2-Zelllinie des Kaninchens minimal kontaminiert ist. Das Gesamtvolumen jeder Reaktion betrug 10 l, bestehend aus 5 l 2x Mastermix, 1 l Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung mit endliegender Primerkonzentration in Reaktion bei 250 nM und 4 l DNA-Probe.
      HINWEIS: Weitere Informationen zur Ausführung von PCR finden Sie unter Verweise54,55. Schwellenwerte werden festgelegt, und Delta-Ct-Werte werden auf >35 festgelegt, um eine minimale Mauskontamination in der VX2-Zelllinie des Kaninchens zu gewährleisten. Der empfohlene VX2-DNA-Gehalt für eine zuverlässige Detektion durch qPCR beträgt 1-10 pg.

2. VX2-Zellkultur und Bildung von Zellsuspension

  1. Durchstechflaschen mit VX2-Zellen (in Schritt 1.2.7 eingefroren) in einem Wasserbad bei 37 °C für 1 Minute auftauen und Zellen in ein konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml Kulturmedium (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin) übertragen. Zentrifuge für 8 min bei 107 x g, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 9 ml Medien wieder auf.
  2. Übertragen Sie wieder suspendierte Zellen in einen großen Kulturkolben. Zellen ohne Schütteln bei 37 °C inkubieren. Überprüfen Sie Zellen täglich auf Zusammenfluss mittels Lichtmikroskopie und wechseln Sie kulturmedien alle drei Tage.
  3. Erstellung einer kultivierten VX2-Zellsuspension zur Injektion
    1. Trypsinize Zellen durch Zugabe von 3 ml von 0,25% Trypsin zu Kolben, sobald Zellen 80% Zusammenfluss erreicht haben. Kolben in Inkubator (37 °C) für 5 min legen. Lösung auf ein konisches Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge für 8 min bei 107 x g übertragen und dann überstand entfernen.
    2. Waschen Sie die Zellpellets 3 mal mit 9 ml Phosphat gepufferte Saline, Zentrifuge und entfernen Sie Überstand wie oben. Die Zellen zählen und mit 0,9% Phosphat gepufferter Salinelösung mit einer Konzentration von 4 x 107 Zellen/ml verdünnen und in ein steriles konisches Zentrifugenrohr auf Eis legen.
  4. Erstellung einer in vivo vermehrten VX2-Zellsuspension zur Injektion
    1. Gefrorene VX2-Tumorblöcke (1 cm x 1 cm) auftauen, mit einer Skalpellklinge auf einer Kulturplatte zerkleinern und durch einen 70-mm-Filter wie in Schritt 1.1.1 s. Fügen Sie kleine Mengen HBSS sequenziell hinzu, um sicherzustellen, dass alle Zellen für ein Endvolumen von 1 ml belastet sind. Zellen zählen und mit 0,9% Phosphat gepufferte Saline auf eine Konzentration von 1 x107/ml verdünnen und in einem sterilen Rohr auf Eis legen.
      HINWEIS: Tumorblöcke wurden von einem Labormitarbeiter aus der vorherigen Ausbreitung von VX2-Tumoren in Kaninchen-Quadrizeps-Muskeln erhalten.

3. Chirurgische Modelleinrichtung

  1. Einrichtung von chirurgischer Anästhesie und präoperativer Präparation
    1. Vormedikamentöse weibliche weiße neuseeländische Kaninchen (2,5-3,5 kg) 1 h vor dem geplanten chirurgischen Eingriff mit Injektionen von Acepromazin (1 mg/kg IM) und Meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anästhetisieren Sie ein weibliches weißes neuseeländisches Kaninchen (Gewicht 2,5-3,5 kg) mit 2-5% inhaliertem Isofluran, entfernen Sie das Fell über der Injektionsstelle und reinigen Sie die Injektionsstelle mit Povidon-Jod-Lösung.
    2. Intubierte anästhesierte Kaninchen mit einer Kehlkopfmaske (LMA) und sicher an Ort und Stelle mit Klebeband, Aufrechterhaltung einer tiefen Anästhesie durch Titierung der inhalativen Isofluran-Dosis zwischen 2-5%. Überwachen Sie die chirurgische Anästhesie während des gesamten Eingriffs regelmäßig, indem Sie die Vitalzeichen (Atemfrequenz, Kapillarnachfüllung, Sauerstoffsättigung, falls vorhanden) und die Überwachung auf Anzeichen, die auf Schmerzen hindeuten (Bewegung, Entzug von Reizen, Geräuschen) oder Licht, überprüfen. Anästhesie (Bewegung, Kauen auf LMA-Rohr).
      HINWEIS: Dies sollte von jemandem mit Erfahrung bei der Überwachung der chirurgischen Anästhesie durchgeführt werden.
    3. Legen Sie einen 22-Spur-Ohrveinkatheter in die marginale dorsale Vene. Cefazolin (20 mg/kg) 10 min intravenös verabreichen, bevor sie einen chirurgischen Hautschnitt aufwies.
    4. Schneiden Sie die Haare über das Becken und den Bauch, bevor Sie das Kaninchen auf den Operationstisch legen, und legen Sie die Kaninchen dann in eine dorsale Position auf den Operationstisch. Reinigen Sie das chirurgische Feld mit einer 3-stufigen chirurgischen Hautpräparat (Betadinseife, Chlorhexidinlösung, Betadinlösung). Das Operationsfeld mit Laparotomie-Vorhängen drapieren, nachdem die Oberseite des Schambeins auf dem Land markiert wurde, so dass ein 5 cm x 5 cm großer Bereich des Unterbauchs freigelegt wird.
  2. Erstellung des Laparotomieschnitts und Identifizierung der Gebärmutterhörner
    1. Setzen Sie eine chirurgische Kappe und Gesichtsmaske auf. Peeling Hände mit Chlorhexidin oder Betadine chirurgische Peeling-Lösung. Mit steriler Technik, setzen Sie ein steriles Kleid und sterile chirurgische Handschuhe.
    2. Machen Sie mit einem Skalpell von 11 Blatt einen 2,5 cm langen Schnitt von 1 cm Schädel zur Symphyse pubis durch haut- und unterkutanes Gewebe des Kaninchenbauchs. Incise die rectus fascia und sezieren Sie die Rectus-Muskeln seitlich, um das zugrunde liegende Peritoneum zu entlarven. Geben Sie das Peritoneum scharf ein, nachdem Sichergestellt ist, dass die Unterfläche frei von Darm oder anderen Bauchorganen ist.
    3. Finden Sie die Uterushörner, die die Harnblase identifizieren und einen gehandicapten Finger überlegen, nachträgig und seitlich über die Spitze der Blase fegen.
      HINWEIS: Bei Bedarf kann die volle Blase mit digitalem Druck entleert werden. Einmal lokalisiert, bringen Sie die Uterushörner durch den Bauchschnitt, um auf der Bauchwand zu ruhen.
    4. Führen Sie mit einer 3-0 geflochtenen resorbierbaren Naht eine einzige Nahtligation jedes Gebärmutterhorns von ca. 1,5-2,0 cm distal für die Cervices durch. Legen Sie die Naht nur medial auf die Gebärmutterarterien, die entlang der seitlichen Aspekt jedes Horns laufen. Binden Sie die Nähte eng, um die distalen Uterushörner zu verschließen (Abbildung 1).
  3. Myometriale VX2-Impfung
    1. Mit einer 27-Spur-Nadel 0,5 ml der zuvor vorbereiteten VX2-Zellsuspension von Schritt 2.3.2 (für kultiviertes VX2-Modell) oder 2,4 (für in vivo propagiertes VX2-Modell) in das Myometrium jedes Uterushornproximals in die Nahtstelle (zwischen der Nahtstelle) injizieren. und den Gebärmutterhals). Injizieren Sie über 1 Minute und stellen Sie sicher, dass Zellen nicht in die zugrunde liegende Gebärmutterhöhle injiziert werden. Anästhesisieren von Tieren mit inhaliertem Isofluran (2-5%) und eine Anästhesiemaschine mit Bain-Schaltung.
    2. Wenden Sie Druck auf die myometriale Injektionsstelle für 30 s nach der Injektion an, um das Auslaufen von Zellen zu minimieren. Inspizieren Sie die Injektions- und Nahtstellen auf Hämostase und legen Sie die Uterushörner wieder in den Bauch.
  4. Schließen des chirurgischen Schnitts
    1. Tiefer Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie die Spitze des Peritonealschnitts und greifen Sie das Peritoneum, den Rectusmuskel und die Faszien mit Gewebezangen.
      1. Um dies zu tun, verankern Sie die Naht an einem Scheitelpunkt des Einschnitts, indem Sie oberflächlich bis tief auf der einen Seite des Einschnitts und tief bis oberflächlich auf der anderen Seite nähten. Binden Sie einen Knoten. Mit der beigefügten Naht, machen Laufstiche senkrecht zum Schnitt durch die Schichten der Bauchwand arbeiten schrittweise entlang des Schnittes von Seite zu Seite. Binden Sie die Naht und schneiden.
    2. Oberflächlicher Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie den Scheitelpunkt des Hautschnitts und verschließen Sie die Bauchhaut mit vergrabenen untercuticularen 3-0 resorbierbaren Poly-Filament-Nähten. Tragen Sie chirurgischen Kleber auf den geschlossenen Schnitt auf, um die Hautränder zu widersetzen.
      1. Um dies zu tun, verankern Sie die Naht an einem Scheitelpunkt des Einschnitts, indem Sie tief bis oberflächlich auf der einen Seite des Einschnitts und oberflächlich bis tief auf der anderen Seite. Binden Sie einen Knoten. Mit den angehängten Nähten, machen Laufstiche in der dermalen Schicht parallel zum Schnitt, der schrittweise entlang des Schnittes von Seite zu Seite arbeitet. Binden Sie die Naht und schneiden.
  5. Postoperative Pflege
    1. Erwachen aus der Anästhesie: Schalten Sie das Isofluran aus, sobald der Schnitt geschlossen ist, und lassen Sie das Kaninchen Sauerstoff durch Maske atmen, während Sie auf Anzeichen des Erwachens (z. B. spontane Bewegungen, Augenöffnung und Kaubewegungen auf der Kehlkopfmaske Atemwege) achten. Extubieren Sie das Kaninchen, sobald diese Zeichen bemerkt werden, und liefern Sie Sauerstoff durch Maske und eine warme Decke, bis die Kaninchen wachsam sind und in der Lage sind, unabhängig zu sitzen.
    2. Postoperative Überwachung: Überwachen Sie Kaninchen zweimal täglich für 4 Tage und täglich für weitere 10 Tage nach der Operation. Zur Überwachung, bewertung ihres allgemeinen Zustands, ihrer Nahrungs- und Wasseraufnahme, Urin- und Fäkalienleistung, Schmerzbeurteilung, Gewicht, Vitalzeichen (Herzfrequenz, Atmungsrate) und ihrer chirurgischen Stelle auf der Suche nach Schwellung, Erythem, Entladung oder Dehiszenz.
    3. Postoperative Schmerzkontrolle: Verabreicht Meloxicam täglich (0,2 mg/kg SQ) für 48 h postoperativ und dann nach Bedarf auf der Grundlage der Schmerzbeurteilung. Buprenorphin sofort postoperativ und alle 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) für 24 h und dann nach Bedarf auf der Grundlage der Schmerzbeurteilung verabreichen
    4. Antibiotika (Enrofloxacin 5mg/kg IM) können täglich für sieben Tage postoperativ verabreicht werden, um Eine Wundinfektion zu verhindern, wie von Ihrem Tierarzt empfohlen. Verabreichen Sie subkutane Flüssigkeiten (15 ml SQ) zweimal täglich, wie für Dehydrierung und weiche Lebensmittel oder andere Nahrungsergänzungsmittel benötigt werden täglich zur Verfügung gestellt, wie für die Gewichtsabnahme erforderlich.

4. Tumorwachstumsüberwachung

  1. Klinische Überwachung: Überwachen Sie Kaninchen alle 2 Tage auf klinische Anzeichen von Tumorwachstum ab dem postoperativen Tag 14. Klinische Anzeichen von Tumorwachstum können verminderte orale Einnahme, Lethargie, Bauchzärtlichkeit, spürbare Bauchmasse und Verlust von Cekotrophie.
  2. Bildgebung und invasive Überwachung
    1. CT-Bildgebung: Am postoperativen Tag 21-28, vormedikat, anästhesieren und intubieren Kaninchen, wie zuvor in 3.1.1-3.1.2 beschrieben. Positionieren Sie Kaninchen in einer dorsalen Position in einem präklinischen CT-Scanner und erhalten Sie Bilder des Beckens und des Bauches nach der Verabreichung von 10 ml intravenösem Iohexol-Kontrastmittel.
    2. Chirurgische Überwachung: Überführen Sie Kaninchen nach der Bildgebung in den Operationssaal, während sie noch unter Vollnarkose stehen. Positionieren, präparieren und drapieren Kaninchen, wie zuvor in Schritt 3.1.4 beschrieben und führen Sie einen wiederholten Laparotomie-Einschnitt von etwa 1,5 cm Länge durch den vorherigen Schnitt durch. Identifizieren Sie die und die Gebärmutterhörner und sorgfältig auf Tumor zu untersuchen. Schließen Sie den Schnitt und bieten Sie eine postoperative Versorgung, wie zuvor in Schritt 3.5.2-3.5.4 beschrieben.
    3. Verwendung von Kaninchenmodellen: Wenn Kaninchen zum Zeitpunkt der chirurgischen Überwachung Tumore haben, verwenden Sie Kaninchen-Endometriumkrebsmodelle für geplante Experimente. Verwenden Sie Kaninchen, die aus in vivo vermehrten Zellen für zusätzliche Experimente nach der Inokulation erstellt wurden, und verwenden Sie Kaninchenmodelle, die aus kultivierten VX2-Zellen bei etwa 5-6 Wochen nach der Impfung erstellt wurden, um ein langsameres Tumorwachstum zu berücksichtigen. Euthanisieren Sie die Kaninchen nach Tumoren erreichen 1-1,5 cm im Durchmesser (extern mit Sätteln gemessen) mit einer vom Tierarzt zugelassenen Methode. Bestätigen Sie die Euthanasie, indem Sie die Lebenszeichen einschließlich Herzfrequenz und Atemfrequenz überprüfen. Verbrauchen Sie den Tumor mit sterilen Instrumenten nach der Reinigung des Bereichs mit Betadin-Lösung.

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Representative Results

28 Kaninchen wurden für die Erstellung des Endometriumkrebsmodells verwendet. Kaninchen hatten zum Zeitpunkt des Experiments ein Durchschnittsgewicht von 2,83 kg (2,71-3,58 kg). Uterustumoren wuchsen erfolgreich bei 21 Kaninchen für eine Gesamterfolgsrate von 75%. Vor der Aufnahme von Gebärmutternaht in das Protokoll betrug die Erfolgsrate 57% im Vergleich zu 81% nach der Gebärmutternaht. Uterine Nähte wurde dem Protokoll nach dem7. Kaninchen als Reaktion auf die anfängliche niedrige Modellerfolgsrate hinzugefügt. Fünf Modelle wurden aus kultivierten VX2-Zellen (versucht bei 8 Kaninchen, 63% Erfolgsrate) und 16 Kaninchenmodelle wurden aus in vivo propagandierten Zellen (versucht in 22, 73% Erfolgsrate) erstellt. In Modellen, die aus in vivo propagierten VX2-Zellen erstellt wurden, wurde bei allen Tieren eine Zelldosis von 5 x 106 pro Gebärmutterhorn verwendet und die durchschnittliche Anzahl von Tagen von der Impfung bis zum Experiment betrug 29 Tage (Bereich 24-31). In Modellen, die aus kultivierten VX2-Zellen erstellt wurden, wurde ein eskalierendes Dosisprotokoll verwendet, um die entsprechende Impfdosis zu bestimmen. Dosen von 2,5 x 106 Zellen und 5 x 106 Zellen pro Gebärmutterhorn waren erfolglos und eine Dosis von 10 x 106 Zellen pro Gebärmutterhorn war bei einem Kaninchen erfolgreich, jedoch war das Tumorwachstum bei 57 Tagen von der Impfung bis zum Experiment langsam. Eine Dosis von 20 x 106 Zellen pro Gebärmutterhorn war bei 4 Kaninchen in einer durchschnittlichen Zeit von 45 Tagen (Bereich 36 - 51 Tage) von der Impfung bis zum Experiment erfolgreich und wurde somit als optimale Injektionsdosis bestimmt. Diese Daten sind in Tabelle 1zusammengefasst. Bei der PCR-Analyse nach Durchgang 5 waren die kultivierten VX2-Zellen sowohl für Rabbit LINE-1 als auch für CRPV-E6 sehr positiv, wobei nur Spuren von Maus LI NE-1 identifiziert wurden (<0.01 pg/l). Die Zellen wurden in der Folge in der Zellkultur angebaut, das Wachstum war jedoch langsam mit einer durchschnittlichen Zeit von 7 Tagen (6-9 d), um die Koninfluenza des Kolbens zu erreichen.

Alle Modelle führten erfolgreich zur metastasierenden Transformation der retroperitonealen Lymphknoten (Abbildung 2). Neunzehn Kaninchen hatten pathologisch bestätigte Lymphknotenmetastasen und 11 hatten pathologisch bestätigte extra-nodale Abdominalmetastasen. Ein Kaninchen hatte keine unterschiedlichen Lymphknoten entfernt; Es hatte jedoch eine hohe Belastung durch intraabdominale Erkrankungen, bei denen Lymphknotenmetastasen angenommen wurden, und ein Kaninchen starb vor dem Experiment. Tumore und metastasierende Lymphknoten aus kultivierten VX2-Zellen erschienen ähnlich wie Tumoren aus in vivo vermehrten VX2-Zellen auf Histologie (Abbildung 3), mit dichten Hämatoxylin-gefärbten Zellen, die in den Muskel eindringen und drüsenähnliche Strukturen mit vielen pathologische mitotische Figuren.

Mit Hilfe eines neuartigen Bildgebungsmittels, dem Porphyso, wurden 81 Lymphknoten intraoperativ identifiziert und chirurgisch für die histologische Analyse entfernt. 74 Lymphknoten waren linke Beckenlymphknoten, 5 waren rechte Beckenlymphknoten und 2 waren rechte paraaortische Lymphknoten. Lymphknoten, die von Kaninchen mit in vivo vermehrten VX2-Tumoren entfernt wurden, waren signifikant größer und nekrotischer als solche, die von Kaninchen mit kultivierten VX2-Tumoren mit einem durchschnittlichen Volumen von 0,99 cm3 (Bereich 0,12 - 3,89) im Vergleich zu 0,59 cm3 (0,01 - 2,92) (p=0,037). Auch Kaninchen mit in vivo vermehrten Tumoren hatten größere nekrotische Gebärmuttertumoren als Kaninchen mit kultivierten Zelltumoren mit einer durchschnittlichen Länge von 5,6 cm (4-6,8 cm) und einer durchschnittlichen Breite von 5,2 cm (3,3 - 9 cm) gegenüber 3,6 cm (2-5 cm) bzw. 4,56 cm (3-7 cm). Schließlich hatten Kaninchenmodelle aus in vivo vermehrten VX2-Zellen mehr extra-nodale Bauchmetastasen als Kaninchenmodelle aus kultivierten Zellen mit 91 % aller Metastasen, die in in vivo vermehrten Kaninchen gefunden wurden.

Figure 1
Abbildung 1: Gebärmutternaht. Schwarzer Pfeil = Nähte, roter Pfeil = Gebärmutterhörner. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: VX2-Tumor (A) Intra-Uterine Tumor. Schwarzer Pfeil = Tumor, roter Pfeil = Gebärmutterhörner (B) Metastasierende linke Beckenlymphknoten. Schwarzer Pfeil = metastasierende Lymphknoten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Histologie des kultivierten Zell-VX2-Tumors (A) H&E-Färbung zeigt Tumorinfiltration des umgebenden Muskels (10x Vergrößerung, Skalenstange = 300 m) (B) Pancytokeratin-Färbung zeigt eine dichte Färbung von Tumorzellen, die Tumorbereichen auf H&E entsprechen (10x Vergrößerung, Skala = 300 m). Schwarzer Pfeil = VX2-Tumor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Modelltyp In vivo VX2 Tumormodell Kultiviertes VX2-Tumormodell
Anzahl der erfolgreichen Modelle 16 5
Anzahl der versuchten Modelle 22* 8
Modellerfolgsrate 73% 63%
Zeit von der Impfung bis zum Experiment 29 Tage (24-31) 45 Tage (36-51)
Erfolgreiche Injektionsdosis 1 x 107 40 x 106
(5x106 pro Gebärmutterhorn) (20 x 106 pro Gebärmutterhorn)
Gesamterfolgsquote 75%
Gesamterfolgsrate vor der Gebärmutternaht 57%
Gesamterfolgsrate nach Gebärmutternaht 81%

Tabelle 1: Modelldaten einschließlich Versuchsbedingungen, Anzahl der verwendeten Tiere und Erfolgsquote. 2 Kaninchen, die ursprünglich für kultivierte Zelltumoren verwendet wurden, bei denen das Wachstum erfolglos blieb, wurden später für In-vivo-Tumormodelle verwendet

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Discussion

Hierin haben wir über eine standardisierte chirurgische Methode zur Etablierung eines VX2-Endometriumkrebsmodells berichtet und über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen berichtet, um dieses Modell zu erstellen. Die Tumoraufnahmerate von 75% ist niedriger als die 100% Prozent Rate zuvor in der Literatur berichtet35,37,53,56; jedoch ist die Rate der pathologisch bestätigten Lymphknotenmetastasen um 90 % mit früheren Studien dieses Modellsübereinstimmt 35,53.

Die Einbeziehung von Uterus-Nähten erhöhte die Modellerfolgsrate signifikant von 57% auf 81%, und wir betrachten diesen Schritt als integralen Bestandteil des chirurgischen Protokolls. Uterine Nähte wurden zunächst nicht durchgeführt, weil widersprüchliche Berichte über die Verwendung von Naht in der Literatur und Bedenken in Bezug auf Uterushorn-Devaskularisation aus bilateraler Gebärmutterarterieligation. Angesichts der signifikanten Verbesserung der Aufnahmerate mit der Zugabe von Gebärmutternaht, Wir vermuten, dass Leckage der Zellsuspension weg von der Injektionsstelle zu der anfänglichen niedrigen Erfolgsrate beigetragen haben kann. Anatomisch die Zellsuspension in einem kleinen Teil des Gebärmutterhorns zu enthalten, stellt sicher, dass eine hohe lokale Konzentration von Zellen der Vaskulatur des Myometriums ausgesetzt ist, was wahrscheinlich die Tumorengraftierung verbessert. Darüber hinaus wurden im Experiment keine Fälle von Uterushornnekrose festgestellt. Sicherzustellen, dass die Zellsuspension in das Myometrium injiziert wird, ist auch wichtig, da in-uterine oder extramyometriale Injektionen auch den Verlust der Zellsuspension erhöhen können. Das Uterusmyometrium bei Kaninchen ist extrem dünn und eine echte intramyometriale Injektion ist schwierig. Aus diesem Grund vermuten wir, dass die Verwendung eines zellulären Matrixgerüsts wie Matrigel die Aufnahmerate von Zellen verbessern kann, die versehentlich in die Gebärmutterhöhle injiziert werden. Trotz dieser potenziellen Einschränkungen glauben wir, dass die Zellsuspensionsmethode den zuvor gemeldeten mikrochirurgischen Methoden36 überlegen ist, bei denen Tumorblöcke auf das Uterusmyometrium eingepfropft werden, da diese Methode technisch anspruchsvoll ist. Im Vergleich dazu ist die Methode hier einfach, beinhaltet gängige Techniken und es ist aus diesen Gründen, wir glauben, dass es sehr reproduzierbar ist.

Die in vivo vermehrten VX2-Kaninchenmodelle wurden mit einer Standarddosis von 5 x 106 Zellen pro Gebärmutterhorn injiziert, die auf den Erfahrungen eines Mitarbeiters mit VX2-Kaninchenmodellen beruhte. Diese Dosis ist signifikant niedriger als in der Literatur berichtet, in der Zelldosen so hoch wie 1 x 108 von Harima et al.52 und 5 x 109 von Huang37,53 und Xu35 verwendet wurden. Angesichts des kurzen Zeitrahmens, in dem das Modell etabliert wurde, und der hohen Rate von Lymphknoten und extra-nodalen Metastasen glauben wir nicht, dass die Verwendung einer höheren Dosis das Modell verbessert hätte. Eine höhere Dosis kann eine noch schnellere und aggressivere Tumorausbreitung gefördert haben, die den Nutzen des Modells beeinträchtigen würde. 83% der in vivo propagandierten VX2-Modelle hatten zum Zeitpunkt des Experiments eine extra-nodale Krankheit, und es ist überraschend, dass andere Gruppen die Entwicklung von Bauchmetastasen nach 30 Tagen nicht berichteten. Eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied könnte die unbeabsichtigte invaskuläre Impfung27 aufgrund von Hochdruck oder Hochgeschwindigkeitsinjektion sein, die zu einer schnelleren, entfernten metastasierenden Ausbreitung führen kann. Wir gehen daher davon aus, dass die Injektionsgeschwindigkeit ein Faktor in der Rate der Metastasen sein kann, weshalb wir eine langsame Injektionsgeschwindigkeit im Protokoll empfehlen.

Zum Vergleich: Trotz der höheren Injektionsdosis (20 x 106 pro Gebärmutterhorn) entwickelten nur 40% der kultivierten VX2-Modellkaninchen eine extra-nodale Krankheit und alle metastasierenden Ablagerungen waren bei diesen Kaninchen deutlich kleiner und weniger nekrotisch. Wir haben keine Literatur, mit der die Ergebnisse direkt verglichen werden können, da dies die erste gemeldete Verwendung von kultivierten VX2-Zellen ist, um dieses Modell zu erstellen. Jedoch, die Ergebnisse sind konsistent mit Studien von anderen kultivierten VX2-Tumoren, in denen hohe Impfdosen erforderlich waren und Tumorwachstum wurde festgestellt, dass langsam27,31. Durch dieses Experiment haben wir die optimale Injektionsdosis von 20 x 106 Zellen pro Gebärmutterhorn identifiziert, was zu zuverlässigem Wachstum und Metastasen bei 80% der Kaninchen mit einem eskalierenden Dosisprotokoll führte. Es ist möglich, dass eine noch höhere Dosis kultivierter VX2-Zellen zu einer schnelleren metastasierenden Ausbreitung führen würde, aber da die VX2-Zellen langsam in der Kultur wuchsen, war es eine Herausforderung, genügend Zellen zu kultitogen, um eine höhere Dosis zu versuchen. Dies ist eine Einschränkung der Studie und hat dies als einen potenziellen Bereich für zukünftige Untersuchungen identifiziert. Wir halten jedoch die langsamere Wachstumsrate im kultivierten Zellmodell für vorteilhaft, da wir glauben, dass es das klinische Szenario von Endometriumkrebs zuverlässiger replizieren kann, da Endometriumkrebs im Allgemeinen eine langsam wachsende Krankheit ist, die zuerst metastasiert, um die Beckenlymphknoten und führt zu spät entfernten Metastasen. Die anfängliche Wahl, die VX2-Zellen in Mäusen zu vermehren, ermöglichte einen schnelleren Turnaround und kostengünstigere Wartungskosten. Alternativ könnten die Zellen jedoch direkt aus dem Quadrizepsmuskel von Kaninchen abgeleitet worden sein.

Wir glauben, dass die enge postoperative Überwachung auf Anzeichen und Symptome des Tumorwachstums ein wichtiger Aspekt des Protokolls ist. Nach unserer Erfahrung entwickeln Kaninchen, sobald sie eine metastasierende Krankheit entwickeln, schnell zu klinisch unwohl, vor allem in der in vivo vermehrten Gruppe. Dieses schnelle, aggressive Wachstum wurde durch den Tod eines Kaninchens an einer metastasierenden Krankheit nach einer Verzögerung von nur 2 Tagen ab dem geplanten Versuchsdatum unterstrichen. Während die Geschwindigkeit des VX2-Modellaufbaus als Stärke angesehen wurde, da ähnliche Mausmodelle (d. h. heC-1-Endometriumkarzinommodell mit Lymphknotenmetastasen bei Mäusen) bis zu doppelt so lange dauern können, um57zu ermitteln, zeigen diese Ergebnisse dass die Bestimmung des optimalen experimentellen Timings von größter Bedeutung ist. Die Ergebnisse korrelieren mit früheren Studien, in denen Tumorwachstum und Lymphknotenvergrößerung nach dem postoperativen Tag 2137,53signifikant zunahmen; wir glauben jedoch, dass es Variabilität in Bezug auf die verwendete VX2-Zelllinie gibt und ermutigen Gruppen, ihr spezifisches experimentelles Timing zu verstehen. Diese Zeitleiste gilt nicht für unsere kultivierten VX2-Modelle und hat dies als einen Bereich identifiziert, der weiterer Untersuchungen bedarf. Um über das Tumorwachstum sicher zu sein, haben wir uns entschieden, während des Protokolls sowohl nicht-invasive als auch invasive Tumorüberwachung zu verwenden. Eine andere zukünftige Richtung könnte jedoch darin bestehen, das postoperative Bildgebungsprotokoll zu verfeinern, um die Notwendigkeit eines zweiten invasiven Verfahrens zu vermeiden.

Insgesamt haben wir eine einfache, standardisierte Methode zur Erstellung eines Modells von Endometriumkrebs mit retroperitonealer Lymphadenopathie bei Kaninchen berichtet. Mit diesem Protokoll haben wir die signifikante Variabilität innerhalb der VX2-Literatur in Bezug auf Zelldosis, chirurgische Technik und postoperative Modellüberwachung angesprochen. Wir erkennen an, dass eine weitere Einschränkung der Studie darin besteht, dass wir bei der Verwendung einer VX2-Zelllinie anstelle eines menschlichen Xenografts die Tumorbiologie und mikroumgebung von menschlichem Krebs nicht vollständig imitieren. Wir hoffen jedoch, dass andere Gruppen kultivierte VX2-Zellen verwenden werden, um ihre Modelle zu erstellen, da wir glauben, dass dieser Zelltyp menschlichen Endometriumkrebs durch sein langsameres Wachstum und seine verminderte Neigung zur Metastasen-Metastasen-Erkrankung zuverlässiger modellieren kann. Wir ermutigen andere Gruppen zu diesem schnellen und einfachen Modell von in der Gebärmutter abgeleiteten retroperitonealen Lymphknotenmetastasen, um neuartige bildgebende Therapien zu untersuchen, um Patienten mit metastasierendem Endometriumkrebs zu helfen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde vom Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dem Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dem Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Stiftung für Innovation und Prinzessin Margaret Cancer Foundation.

Ich möchte Dr. Marguerite Akens für die Bereitstellung der ersten VX2-Zellen für die Etablierung des ursprünglichen VX2-Modells und der gefrorenen VX2-Tumorblöcke danken. Ich möchte Marco DiGrappa für die Unterstützung bei der Durchführung erster VX2-Zellkulturexperimente und Lili Ding für die Unterstützung bei der VX2-Zellkultur danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

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Krebsforschung Ausgabe 151 Endometriumkrebs Orthotopisches Krebsmodell VX2-Zelllinie Lymphadenopathie Kaninchenmodell Chirurgisches Modell Zellkultur
Ein orthotopisches Endometriumkrebs-Modell mit retroperitonealer Lymphadenopathie made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells
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Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

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