Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Ортотопические эндометрия рака модель с ретроперитонеальной лимфаденопатии Сделано из In Vivo распространяется и культивированных VX2 клеток

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

Этот протокол представляет собой стандартизированный метод для выращивания клеток VX2 в культуре и создания ортотопической модели VX2 рака эндометрия с ретроперитонеальными лимфатическими метастазами у кроликов. Ортотопические модели рака эндометрия имеют важное значение для доклинического исследования новых методов визуализации для диагностики метастаз лимфатических узлов.

Abstract

Рак эндометрия является наиболее распространенным гинекологических злокачественных новообразований в Северной Америке и заболеваемость растет во всем мире. Лечение состоит из хирургии с или без адъювантной терапии в зависимости от участия лимфатических узлов, как это определено лимфаденэктомии. Лимфаденэктомия является болезненной процедурой, которая не была показана, чтобы иметь терапевтическую пользу у многих пациентов, и, таким образом, новый метод диагностики метастазов лимфатических узлов не требуется. Для тестирования новых агентов визуализации необходима надежная модель рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами лимфатических узлов. Модель рака эндометрия VX2 часто описывается в литературе; однако существуют значительные различия в отношении метода создания моделей. Кроме того, никаких исследований не сообщалось об использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели, поскольку только клетки, распространяемые in vivo, ранее использовались. В этом виде мы представляем стандартизированный хирургический метод и метод послеоперационного мониторинга для создания модели рака эндометрия VX2 и сообщаем о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели.

Introduction

Рак эндометрия, или рак слизистой оболочки матки, является вторым наиболее распространенным гинекологических злокачественных новообразований во всем мире и наиболее распространенных злокачественных новообразований в развитых странах1. Заболеваемость раком эндометрия неуклонно растет, увеличившись на 2,3% в год в период 2005-2013 годов с соответствующим 2,2% увеличение смертности1,2,3. Диагноз метастазах лимфатических узлов имеет первостепенное значение, так как наличие положительных лимфатических узлов является сильным отрицательным предиктором выживания4,5,6,7 и может направлять администрирование адъювантная терапия8,9,10,11,12,13. Метастазовые лимфатические узлы в настоящее время диагностируются хирургическим путем удаления лимфатических тканей, лежащих в основных кровеносных сосудов в тазе и животе. Эта процедура, известная как лимфаденэктомия, является спорным из-за противоречивых данных выживания из двух больших испытаний14,15,16,17,18 и известных риск внутриоперационной15,19,20 и послеоперационной заболеваемости21,22,23. Поскольку современные неинвазивные методы визуализации не обладают необходимой чувствительностью и специфичностью для замены рассечения лимфатических узлов24,был предотврачив разработку новых методов диагностической визуализации. Для проверки этих новых методов в доклинических условиях требуется надежная модель рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами лимфатических узлов.

Модель опухоли кролика VX2 является устоявшейся моделью, которая широко используется для изучения нескольких опухолей твердых органов человека25, включая легкие26,голову и шею27,28, печень29, почки30, кости31,32, мозг33, поджелудочная железа34 и матка35,36,37. Модель VX2 была первоначально разработана в 1940 году Кидд и Рус38 путем успешной трансплантации хлопчатобумажный вирус папилломы кролика обнаружили Shope в 193339. С тех пор модель VX2 поддерживается in vivo, требуя серийного прохождения в четырехглавой мышце белых новозеландских кроликов40. Совсем недавно, однако, несколько групп успешно выросли VX2 клетки в пробирке40,41,42 и продемонстрировали сохраненные tumorigenecity культивированных клеточной линии31, 42,43. Опухоли VX2 гистологически определены как анапластические плоскоклеточные карциномы44 и содержат железистые особенности, которые напоминают аденокарциному26. Опухоли характеризуются простотой имплантации, быстрым ростом и гиперваскулярностью44,45 и надежно метастазируют, чаще всего в региональные и отдаленные лимфатические узлы45. Сходства в маточных сосудистой и лимфатической анатомии46, а также ортотопический рост сайта обеспечить, чтобы метастатическая картина рака кролика VX2 имитирует, что из рака эндометрия человека, что делает модель VX2 надежной моделью для изучения человека метастатического заболевания. Кроме того, гистологические особенности, такие как аномальная микрососудистая пролиферация47 , а также иммунологические48 и генетические сходства49,50 между людьми и кроликами предполагают, что опухоль микроокружение может отражать рак эндометрия человека.

Несколько групп сообщили об использовании VX2 для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальной метастазы с высоким уровнем сообщили успеха36,51,52; однако в нынешней литературе существуют значительные различия в отношении метода создания модели. Сотовые дозы подвески как низко как 4 х 105 клеток / матки рога51 и выше, чем 5 х 109 клеток / матки рога37,53 были зарегистрированы без стандартного консенсуса по требуемой дозы VX2 клеточной. Кроме того, различные методы прививки были зарегистрированы в том числе микро-хирургической имплантации опухоли в миометрию матки36, инъекция VX2 клеточной суспензии37,44,52 , 53 и в некоторых случаях, добавление зашвы роговой матки зашивания до инноциуляции52. Наконец, ни одна группа не сообщила об использовании культивированных ячеек VX2 для создания этой модели. Таким образом, цель этого исследования состоит в том, чтобы продемонстрировать успешный стандартизированный метод создания модели VX2 и сообщить о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальными метастазами в кролике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Глубокое закрытие брюшной стенки: Определите вершину брюшного разреза и похитить брюшную мышцу, ректусную мышцу и фасцию с помощью щипц. Все исследования на животных были проведены в Центре ресурсов животных (ARC), утвержденных объектов сети здравоохранения университета и в соответствии с утвержденными протоколами использования и ухода за животными (AUP #3994/#4299). Линия клеток VX2 была получена из лаборатории доктора Акена в университетской сети здравоохранения.

1. Создание линии клеток in vitro VX2

  1. Урожай опухоли VX2 из кролика четырехглавой мышцы и роста в мышином фланге.
    1. Оттепель замороженных блоков опухоли VX2 (1 см х 1 см), фарш на культурной пластине с помощью скальпеля лезвия и процедить через 70 мкм фильтр, добавив небольшое количество Хэнкс сбалансированное решение соли (HBSS) последовательно, чтобы обеспечить все клетки напряжены для окончательного объема 1 мл.
    2. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатбуферизированного солейного раствора до концентрации 1 х 107/мли поместите на лед в стерильной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые блоки были получены от сотрудника лаборатории от предыдущего распространения опухолей VX2 в мышцах кроличьего квадрицепса.
    3. Анестезить самку белого новозеландского кролика (вес 2,5-3,5 кг) с 2-5% ингаляционным изофрураном, удалить мех над местом инъекции и очистить место инъекции с помощью повидон-йодного раствора. Введите 500 л подготовленной подвески клеток VX2 (5 х 106 клеток/мл) в четырехглавую мышцу кролика. Мониторинг кролика клинически для роста опухоли, начиная с 10-го дня.
    4. Эвтаназия кроликов после опухоли достигает 1-1,5 см в диаметре (измеряется внешне с калиперами) с помощью ветеринарного утвержденного метода. Подтвердите эвтаназию, проверяя жизненно важные признаки, включая частоту сердечных приступов и частоту дыхания. Акциз опухоли с помощью стерильных инструментов после очистки области с бетадин раствором.
    5. В шкафу биологической безопасности с использованием стерильных инструментов, фарш опухоли на мелкие кусочки (0,2 см) на 10 см ткани культуры блюдо с помощью скальпеля лезвия. Передайте фрагменты опухоли через 70 мкм клеточный ситечко, используя 1 мл HBSS, как описано в шаге 1.1.1. Подсчитайте клетки и разбавьте с помощью 0,9% соленового раствора для получения 7,5 х 105 ячеек в 200 Л.
    6. Анестезия мужской NOD scid гамма мышей (вес 25 г) с использованием 4% изофлуран на 1 л / мин и поддерживать анестезию с помощью 2% изофлуран. После того, как мыши обезглавлены, введите 200 л раствора со ступени 1.1.5 в подкожную ткань мышкой фланга с помощью 27 калибровочных игл.
  2. Сбор и пропуск клеток VX2 в пробирке
    1. Монитор ксенотрансплантата роста клинически два раза в неделю, пока опухоли достигают 1 см в диаметре с помощью калиперов.
    2. Эвтаназия мышей путем размещения в камере CO2 или выполнения вывихшей шейки матки после анестезии с 4% изофлуран газа. Акцизные опухоли в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности.
    3. Опухоли фарша с кальпелью на 1-2 мм в 6 см ткани культуры блюдо, содержащее 3 мл Dulbecco в модифицированных Eagle Medium (DMEM) / Хэм F12 "10% сыворотки для крупного рогатого скота (FBS) сми.
    4. Оставьте фрагменты опухоли нетронутыми в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 в течение двух дней, пока клетки не начнут расти из опухолевых кусочков. Впоследствии, проверить культивированные пластины ежедневно световой микроскопии для клеточной слоивости. По достижении 70% сплава, trypsinize клеток, добавив 1 мл 0,05% трипсина в колбу и размещение обратно в 37 КС инкубатор в течение 5 мин.
    5. Нейтрализовать трипсин с 6 мл DMEM / Ham's F12 и 10% FBS среды, собирать клетки и центрифуги при 4 КК в течение 5 мин при 300 х г. Удалите супернатант и повторно приостановить гранулы в 3,5 мл новых DMEM / Хэм F12 - 10% FBS средств массовой информации. Семена свежего 6 см коллагена я покрытием пластин ы 1,6 х 106 клеток на тарелку для достижения примерно 50% плотность посева клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 50% плотность клеток относится к клеткам, занимая 50% площади поверхности пластины при прикреплении.
    6. Раннее прохождение: Повторите выше процесс (трипсинизации, посева), пока клетки были проходят 5 раз, а затем оценить чистоту клеточной линии с ПЦР с помощью количественного ПЦР анализ различать кролика геномной ДНК от мыши геномной ДНК (см. шаг 1.3.1-1.3.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 8 проходов, клетки могут распространяться на неколлагена покрытием регулярных приверженцев ткани культуры пластин.
    7. Прохождение, trypsinize и заморозить aliquots клеток в DMEM / HAM F12'30% FBS'10%DMSO в концентрации 2 х 106 за флакон. Храните клетки в жидком азоте до тех пор, пока не потребуются для экспериментов.
  3. Подтверждение происхождения VX2 выживших клеток:
    1. Создайте стандартное лекарство от очищенной геномной мыши и ДНК кролика (Шаг 1.3.2 и Шаг 1.3.3). Используйте грунтовки, которые нацелены на конкретные по зыгню видов во время второго открытого чтения элемента ретротранспозон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер последовательности для CRPV E6 являются: 5'- GATCCTGGCAACCAGTGand 5'-CCTGCCGGTTGATTAT. Использовались элементы ретротранспозонов LINE-1. Праймер последовательности для кролика LINE-1: 5'-TCAGGAACCCCAGAAGTATGC и 5'-TTGATTTCTTGAATGACCCAGTGTGTGTГ Егерь последовательности для мыши LINE-1 являются: 5'-AATGGAAGCCACATTCACGTGИи и 5'-CCTTCCTTT
    2. Чтобы создать стандартную кривую для CRPV E6, очистите lysate опухолевых клеток VX2 (Шаг 1.1.1) с помощью коммерческого комплекта, следуя протоколу производителя. Количественная эта ДНК с помощью коммерческого анализа. Выполните 6 серийных разбавлений от 225 пг/Зл до 0,925 пг/Л в низком буфере EDTA-TE. Чтобы создать стандартную кривую для геномной ДНК мыши, разбавьте 100 мкг коммерческой геномной ДНК мыши в низком буфере EDTA-TE в 5 разбавлениях от 125 пг/Л до 0,0125 пг/Л.
    3. Поместите 4 qL от каждого разбавленного раствора из образцов с ступени 1.3.2 в скважинах и запустите образцы в термоцикле ПЦР. Используйте значения Cq от каждого запуска вместе с суммами ДНК в скважине, чтобы вычислить стандартную кривую, используя настройки автоматического порога программного обеспечения thermocycler.
    4. Используйте стандартные процедуры qPCR для выполнения ПЦР с 40 циклами 2-ступенчатого цикла (98 градусов по Цельсию и 60 градусов по Цельсию) на термоциклере. Установите пороговые значения, и установить значения дельты Ct на йgt;35, чтобы обеспечить минимальное загрязнение мыши в линии клеток кролика VX2. Общий объем каждой реакции составил 10 л, состоящий из 5 зл 2x Mastermix, 1 зл и обратных грунтовок с конечной концентрацией грунтовки в реакции на уровне 250 нм, и 4 Зл образца ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите ссылки54,55 для получения подробной информации о выполнении ПЦР. Пороговые значения устанавливаются, и значения дельты Ct устанавливаются на уровне йgt;35, чтобы обеспечить минимальное загрязнение мыши в линии клеток кролика VX2. Рекомендуемый уровень ДНК VX2 для надежного обнаружения qPCR составляет 1-10 пг.

2. Культура клеток VX2 и создание клеточной подвески

  1. Оттепель флаконы, содержащие vX2 клетки (замороженные в шаге 1.2.7) в водяной бане при 37 градусах По Цельсию в течение 1 минуты и перенесите клетки в коническую центрифугу трубки с 10 мл культуры среды (1:1 DMEM/F-12 и 10% FBS и 1% пенициллилин-стрептомицин). Центрифуга в течение 8 мин при 107 х г,отбросить супернатант и повторно приостановить клеточной гранулы в 9 мл носителей.
  2. Передача повторно приостановленных ячеек в большую культурную колбу. Инкубировать клетки без тряски при 37 градусах Цельсия. Проверяйте клетки ежедневно на наличие световой микроскопии и меняйте культуры носителей каждые три дня.
  3. Создание культивированных VX2 клеточной подвески для инъекций
    1. Трипсинизуйте клетки, добавив 3 мл 0,25% трипсина в колбу, как только клетки достигли 80% слияния. Поместите колбу в инкубатор (37 градусов по Цельсию) в течение 5 мин. Передача раствора в коническую центрифугу трубки и центрифуги в течение 8 мин при 107 х г, а затем удалить супернатант.
    2. Вымойте клетки гранулы 3 раза с 9 мл фосфата буферного солине, центрифуга и удалить супернатант, как указано выше. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатбуферизированного солейного раствора до концентрации 4 х 107 клеток/мл и поместите в стерильную конильную центрифугу трубки на льду.
  4. Создание in vivo распространяется VX2 клеточная подвеска для инъекций
    1. Оттепель замороженных блоков опухоли VX2 (1 см х 1 см), фарш на культурной пластине с помощью скальпеля лезвия и процедить через фильтр 70 мкм, как в шаге 1.1.1. Добавить небольшое количество HBSS последовательно, чтобы убедиться, что все клетки напряжены для окончательного объема 1 мл. Подсчитайте клетки и разбавьте 0,9% фосфатами буферногосолей до концентрации 1 x10 7/мл и поместите на лед в стерильной трубке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые блоки были получены от сотрудника лаборатории от предыдущего распространения опухолей VX2 в мышцах кроличьего квадрицепса.

3. Хирургическое создание модели

  1. Создание хирургической анестезии и предоперационной подготовки
    1. Предварительное медикаментозное самок белых новозеландских кроликов (2,5-3,5 кг) 1 ч до запланированной хирургической процедуры с использованием инъекций ацепромазина (1 мг/кг IM) и мелоксикама (0,2 мг/кг СЗ). Анестезить самку белого новозеландского кролика (вес 2,5-3,5 кг) с 2-5% ингаляционным изофрураном, удалить мех над местом инъекции и очистить место инъекции с помощью повидон-йодного раствора.
    2. Интубат обезболивайте кроликов с помощью ларинговой маски дыхательных путей (LMA) и безопасны на месте с лентой, поддерживая глубокую анестезию, одыщая ингаляционную дозу изофролана между 2-5%. Мониторинг хирургической анестезии регулярно на протяжении всей процедуры, проверяя жизненно важные признаки (скорость дыхания, капиллярная заправка, насыщение кислородом при наличии) и мониторинг признаков, указывающих на боль (движение, снятие стимулов, шумов) или света анестезия (движение, жевание на трубке LMA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано кем-то с опытом мониторинга хирургической анестезии.
    3. Поместите 22-калиберный катетер из ушей в маргинальную вену. Администрирование цефазолина (20 мг/кг) внутривенно 10 мин до хирургического разреза кожи.
    4. Закрепите волосы над тазом и животом до размещения кролика на операционном столе, а затем поместите кроликов в подошву на операционном столе. Очистите хирургическое поле с помощью 3-ступенчатой хирургической подготовки кожи (бетадин мыло, хлоргексидин раствор, бетадин решение). Drape хирургическое поле с лапаротомии шторы после посадки маркировки верхней части лобковой кости, в результате чего 5 см х 5 см области нижней части живота подвергаются.
  2. Создание разреза лапаротомии и идентификация рогов матки
    1. Наденьте хирургическую кепку и маску для лица. Скраб руки с помощью хлоргексидина или бетадина хирургического раствора скраб. Используя стерильную технику, наденьте стерильное платье и стерильные хирургические перчатки.
    2. Используя скальпель длиной 11-лезвия, сделайте разрез длиной 2,5 см черепа на симфизию лобка через кожу и подкожную ткань живота кролика. Резцы прямой фасции и вскрыть мышцы прямой кишки боковой подвергать основной перитонеум. Введите брюшной полости резко после обеспечения подповерхности очищается от кишечника или других органов брюшной полости.
    3. Найдите рога матки, идентифицирующие мочевой пузырь и подметающие палец в перчатках превосходно, заднее и боковое над вершиной мочевого пузыря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости, полный мочевой пузырь может быть опорожнен с помощью цифрового давления. После того, как расположен, принести рога матки через разрез брюшной полости, чтобы отдохнуть на брюшной стенке.
    4. Используя 3-0 плетеный абсорбируемый шов, выполните один шовную перевязку каждого рога матки примерно на 1,5-2,0 см дистального к шейке матки. Поместите шов просто медиаль носовой к артериям матки, которые проходят вдоль бокового аспекта каждого рога. Свяжите швы плотно, чтобы окклюзия дистальных рогов матки(рисунок 1).
  3. Прививка миомитрия VX2
    1. Используя 27-калиберную иглу, введите 0,5 мл ранее подготовленной подвески клеток VX2 с 2,3,2 (для культивированной модели VX2) или 2.4 (для in vivo, распространяемой модели VX2) в миометрию каждого рога матки, проксимального к месту шва (между местом шву (между местом шву (между местом шву (между местом шву (между местом шву (между местом швутки) и шейки матки). Вводят более 1 минуты и убедитесь, что клетки не вводятся в основной полости матки. Анестезия животных с использованием ингаляционных изофлюран (2-5%) и анестезиологическая машина с схемой Bain.
    2. Применить давление на место инъекции миометрия в течение 30 с после инъекции, чтобы свести к минимуму утечки клеток. Осмотрите места инъекций и швов на гемостаз и поместите рога матки обратно в брюшную полость.
  4. Закрытие хирургического разреза
    1. Глубокое закрытие брюшной стенки: Определите вершину брюшного разреза и похитить брюшную мышцу, ректусную мышцу и фасцию с помощью щипц.
      1. Для этого закрепите шов на одной вершине разреза, зашивая поверхностное до глубокого с одной стороны разреза и глубокое к поверхностному с другой. Завяжите узел. Используя прикрепленный шов, сделайте бегущими стежки перпендикулярно разрезу через слои брюшной стенки, работая шаг за шагом вдоль разреза из стороны в сторону. Свяжите шов и порез.
    2. Поверхностное закрытие брюшной стенки: Определите вершину разреза кожи и шов брюшной кожи с помощью похоронен работает подкатикулярный 3-0 поглощаемых поли-нитянити швут. Нанесите хирургический клей на закрытый разрез, чтобы противостоять краям кожи.
      1. Для этого закрепите шов на одной вершине разреза, зашивая глубоко поверхностно ею с одной стороны разреза и поверхностно до глубины с другой. Завяжите узел. Используя прикрепленные швы, сделайте бегущий стежк в дермальном слое параллельно разрезу, работая поэтапно вдоль разреза из стороны в сторону. Свяжите шов и порез.
  5. Послеоперационный уход
    1. Пробуждение от анестезии: Выключите изофлуран, как только разрез закрыт, и пусть кролик дыхание кислорода с помощью маски при мониторинге признаков пробуждения (например, спонтанные движения, открытие глаз и жевание движений на ларингальной маски дыхательных путей). Extubate кролика, как только эти признаки отмечены и обеспечить кислородом с помощью маски и теплое одеяло, пока кролики не начеку и в состоянии сидеть самостоятельно.
    2. Послеоперационный мониторинг: мониторинг кроликов два раза в день в течение 4 дней и ежедневно в течение дополнительных 10 дней после операции. Для мониторинга, оценить их общее состояние, их потребление пищи и воды, мочи и фекальных выход, оценка боли, вес, жизненно важные признаки (частота сердечных приступов, частота дыхания) и их хирургическое место ищет отек, эритема, разряда или дегистации.
    3. Послеоперационный контроль боли: Администрирование Meloxicam ежедневно (0,2 мг/кг СЗ) для 48 ч после операции, а затем по мере необходимости на основе оценки боли. Администрирование бупренорфин сразу после операции и каждые 12 ч (0,01-0,05 мг/кг СЗ) в течение 24 ч, а затем по мере необходимости на основе оценки боли
    4. Антибиотики (энрофлоксацин 5 мг/кг IM) могут вводиться ежедневно в течение семи дней после операции, чтобы предотвратить раневую инфекцию, как рекомендовано вашим ветеринаром. Администрирование подкожных жидкостей (15 мл СЗ) два раза в день, как это необходимо для обезвоживания и мягких продуктов питания или других пищевых добавок предоставляются ежедневно по мере необходимости для потери веса.

4. Мониторинг роста опухоли

  1. Клинический мониторинг: Мониторинг кроликов каждые 2 дня для клинических признаков роста опухоли, начиная с послеоперационного дня 14. Клинические признаки роста опухоли могут включать снижение перорального накопительного, вялость, брюшную нежность, ощутимую брюшную массу и потерю цекотрофии.
  2. Визуализация и инвазивный мониторинг
    1. КТ изображения: На послеоперационный день 21-28, предварительное лечение, анестезию, и интубировать кроликов, как ранее описано в 3.1.1-3.1.2. Расположите кроликов в подошвавом положении в доклиническом томографе и получите изображения таза и живота после введения 10 мл внутривенного контрастного агента иохесола.
    2. Хирургический мониторинг: Передача кроликов в операционную после визуализации в то время как еще под общим анестетиком. Позиция, prep и драпировка кроликов, как ранее описано в шаге 3.1.4 и выполнить повторный разрез лапаротомии примерно 1,5 см в длину через предыдущий разрез. Определите и рога матки и тщательно обследовать на опухоль. Закройте разрез и предоставьте послеоперационную помощь, как описано ранее в шаге 3.5.2-3.5.4.
    3. Использование модели кролика: Если кролики найдены, что имеют туморы во время хирургического мониторинга, то используйте модели рака endometrial кролика для запланированных экспериментов. Используйте кроликов, созданных из in vivo размножаемых клеток для дополнительных экспериментов на 4-недельный пост-прививки и использовать кролика модели, созданные из культивированных клеток VX2 примерно 5-6 недель после прививки для учета замедления роста опухоли. Эвтаназия кроликов после опухоли достигает 1-1,5 см в диаметре (измеряется внешне с калиперами) с помощью ветеринарного утвержденного метода. Подтвердите эвтаназию, проверяя жизненно важные признаки, включая частоту сердечных приступов и частоту дыхания. Акциз опухоли с помощью стерильных инструментов после очистки области с бетадин раствором.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двадцать восемь кроликов были использованы для создания модели рака эндометрия. На момент эксперимента средний вес кроликов составил 2,83 кг (2,71-3,58 кг). Опухоли матки успешно росли в 21 кроликов для общего успеха модели 75%. До включения маточных сшивок в протокол, показатель успеха составил 57% по сравнению с 81% после маточных сшивания был добавлен. Зашивание моты было добавлено в протокол после7-го кролика в ответ на первоначальный низкий показатель успеха модели. Пять моделей были созданы из культивированных клеток VX2 (попытка в 8 кроликов, 63% успеха) и 16 моделей кролика были созданы из in vivo размножаемых клеток (попытка в 22, 73% успеха). В моделях, созданных из in vivo размножающихся клеток VX2, клеточная доза 5 х 106 на рог матки была использована у всех животных и среднее количество дней от прививки до эксперимента было 29 дней (диапазон 24-31). В моделях, созданных из культивированных клеток VX2, для определения соответствующей дозы прививки использовался протокол об эскалации дозы. Дозы 2,5 х 106 клеток и 5 х 106 клеток на рог матки были неудачными и доза 10 х 106 клеток на рога матки был успешным в одном кролика однако, рост опухоли был медленным в 57 дней от прививки к эксперименту. Доза 20 х 106 клеток на рог матки была успешной в 4 кроликов в среднем время 45 дней (диапазон 36 - 51 дней) от прививки к эксперименту и, таким образом, определяется как оптимальная доза инъекции. Эти данные суммируются в таблице 1. На анализе PCR после прохождения 5, культивированные клетки VX2 были весьма положительными как для Кролика LINE-1, так и для CRPV-E6, и только с микроэлементами мыши LI NE-1 были определены (злт;0.01 pg/l). Клетки впоследствии были выращены в клеточной культуре, однако, рост был медленным со средним временем 7 дней (6-9 d) для достижения фляги ной.

Все модели успешно привели к метастатическому преобразованию ретроперитонеальных лимфатических узлов(рисунок 2). Девятнадцать кроликов имели патологически подтвержденные метастаза лимфатических узлов и 11 имели патологически подтвержденные вненозные метастазы брюшной полости. Один кролик не имел различные лимфатические узлы удалены; однако, оно имело высокое бремя внутрибрюшного заболевания в котором метастазы лимфатических узлов были предположены, и один кролик умер до эксперимента. Опухоли и метастатические лимфатические узлы из культивированных клеток VX2 оказались похожими на опухоли из in vivo размножаемых клеток VX2 по гистологии (Рисунок 3),с плотными окрашенными клетками гематоксилина, вторгающимися в мышцы и формирующими железоподобные структуры со многими патологические митотические фигуры.

С помощью нового агента изображений, Порфисом, 81 лимфатические узлы были определены внутриоперативно и хирургическим путем удалены для гистологического анализа. 74 лимфатических узла были левыми тазовых лимфатических узлов, 5 были правыми тазовыми лимфатическими узлами и 2 были правыми парааортическими лимфатическими узлами. Лимфатические узлы, удаленные у кроликов с опухолями v vivo, были значительно больше и некротические, чем у тех, которые были удалены из кроликов с культурными опухолями VX2 со средним объемом 0,99 см3 (диапазон 0,12 - 3,89) против 0,59 см3 (0,01 - 2.92) (р-0,037). Кроме того, у кроликов с размножаемыми опухолями in vivo было больше некротических опухолей матки, чем у кроликов со культивированными опухолями клеток со средней длиной 5,6 см (4-6,8 см) и средней шириной 5,2 см (3,3 - 9 см) против 3,6 см (2-5 см) и 4,56 см (3-7 см) соответственно. Наконец, кролик модели из in vivo размножается VX2 клетки были более экстра-нодальных метастазов брюшной полости, чем кролик модели из культивированных клеток с 91% всех метастазов, найденных в in vivo размножается кроликов.

Figure 1
Рисунок 1: Зашву на матки. Черная стрелка - швы, красная стрелка и рога матки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Опухоль VX2 (A) Внутриматочные опухоли. Черная стрелка - опухоль, красная стрелка и рога матки(B) Метастатические левые тазовые лимфатические узлы. Черная стрелка и метастатические лимфатические узлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Гистология культивированных клеток VX2 опухоли (A ) H и E окрашивание демонстрирует инфильтрацию опухоли окружающих мышц (10x увеличение, шкала бар 300 мкм) (B) Pancytokeratin окрашивание демонстрирует плотно окрашивания опухолевых клеток, соответствующих области опухоли на Н И E (10x увеличение, масштаб 300 мкм). Черная стрелка и опухоль VX2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Тип модели Модель опухоли In vivo VX2 Культурная модель опухоли VX2
Количество успешных моделей 16 5
Количество попыток моделей 22* 8
Коэффициент успешности модели 73% 63%
Время от прививки до эксперимента 29 дней (24-31) 45 дней (36-51)
Успешная доза инъекций 1 x 107 40 x 106
(5x106 на рог матки) (20 x 106 на рог матки)
Общий показатель успеха 75%
Общий показатель успеха до сшивания матки 57%
Общий коэффициент успеха после ухаживаний за маткой 81%

Таблица 1: Типовые данные, включая экспериментальные условия, количество используемых животных и показатель успешности. 2 кролика используемых первоначально для культивированных моделей туморов клетки в которых рост был неудачным затем были использованы для моделей тумора in vivo

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом мы сообщили о стандартизированном хирургическом методе для создания модели рака эндометрия VX2 и сообщили о первом использовании культивированных клеток VX2 для создания этой модели. Уровень опухоли 75% ниже, чем 100% процент ставка ранее сообщалось в литературе35,37,53,56; однако, thw 90% скорость патологически подтвержденных метастазах лимфатических узлов согласуется с предыдущими исследованиями этой модели35,53.

Включение маточных швов значительно увеличило показатель успешности модели с 57% до 81%, и мы считаем этот шаг неотъемлемой частью хирургического протокола. Зашивание маточных сил изначально не было выполнено из-за противоречивых сообщений об использовании швов в литературе и проблем, связанных с деваскуляризацией рогов матки от двусторонней перевязки артерий матки. Учитывая значительное улучшение ставки take rate с добавлением маточных сшивания, мы предполагаем, что утечка клеточной подвески от места инъекции, возможно, способствовали первоначальной низкой скорости успеха. Анатомически содержащая суспензию клетки в небольшой части утробного рога гарантирует, что высокая локальная концентрация клеток подвергается воздействию сосуды миометрия, что, вероятно, улучшает прививку опухоли. Кроме того, в эксперименте не было отмечено ни одно случаи некроза рогов матки. Обеспечение того, чтобы суспензия клеток вводится в миометрий также важно, как внутриматочные или экстра-миометрия инъекции могут также увеличить потерю клеточной суспензии. Миометрий матки у кроликов очень тонкий и истинная внутримиомидная инъекция трудно. Из-за этого, мы предполагаем, что использование клеточной матричной эшафот, таких как Matrigel может улучшить скорость принимать клетки, которые непреднамеренно вводят в полость матки. Несмотря на эти потенциальные ограничения, мы считаем, что метод суспензии клеток превосходит ранее сообщалось микрохирургических методов36, в которых опухолевые блоки привиты на миометрию матки, как этот метод является технически сложной задачей. Для сравнения, метод здесь прост, включает в себя широко используемые методы, и именно по этим причинам, мы считаем, что это будет высоко воспроизводимым.

In vivo распространяется VX2 кролика модели были введены со стандартной дозой 5 х 106 клеток на рог матки, которая была основана на опыте сотрудника с VX2 кролика моделей. Эта доза значительно ниже, чем сообщалось в литературе, в которой клеточные дозы выше, чем 1 х 108 Харима и др.52 и 5 х 109 как Хуан37,53 и Сюй35 были использованы. Учитывая короткие сроки, в которых модель была создана и высокая скорость как лимфатических узлов, так и вненозных метастаз, мы не считаем, что использование более высокой дозы улучшило бы модель. Более высокая доза, возможно, способствовала еще более быстрому и агрессивному распространению опухоли, что ухудшило бы полезность модели. 83% моделей in vivo, распространяемых vX2, имели экстра-нодальные заболевания во время эксперимента, и это удивительно, что другие группы не сообщали о развитии метастазов в животе в 30 дней. Возможным объяснением этой разницы может быть непреднамеренная внутрисосудистая прививка27 из-за высокого давления или высокой скорости инъекции, которая может привести к более быстрому удаленному метастатическому распространению. Таким образом, мы предполагаем, что скорость инъекций может быть фактором в скорости метастазах, поэтому мы рекомендуем медленную скорость инъекций в протоколе.

Сравнительно, несмотря на более высокую дозу впрыска (20 x 106 в утробном роге), только 40% из культивированных кроликов модели VX2 начали экстра-носовой болезни и все метастатические залежи были заметно более малы и более менее necrotic в этих кроликах. У нас нет никакой литературы, с которой можно было бы напрямую сравнить результаты, так как это первое зарегистрированное использование культивированных ячеек VX2 для создания этой модели. Тем не менее, результаты согласуются с исследованиями других культурных опухолей VX2, в которых высокие дозы прививки были необходимы и рост опухоли было отмечено, чтомедленный 27,31. В рамках этого эксперимента мы определили оптимальную дозу инъекций 20 х 106 клеток на рог матки, что привело к надежному росту и метастазам у 80% кроликов с помощью протокола эскалации дозы. Вполне возможно, что еще более высокая доза культивированных клеток VX2 приведет к более быстрому метастатическому распространению, однако, как клетки VX2 медленно росли в культуре, это было сложной для культуры достаточно клеток, чтобы попытаться более высокую дозу. Это является ограничением исследования и определили это в качестве потенциальной области для будущего исследования. Тем не менее, мы считаем, что более медленные темпы роста в модели культивируемых клеток, чтобы быть выгодным, как мы считаем, что может повторить клинический сценарий рака эндометрия более надежно, как рак эндометрия, как правило, медленно растущее заболевание, которое метастазирует первый тазовых лимфатических узлов и приводит к поздним отдаленным метастазам. Первоначальный выбор для распространения клеток VX2 у мышей позволил быстрее оборота, и менее дорогие расходы на техническое обслуживание; однако альтернативно, клетки смогли быть выведены сразу от мышцы quadriceps кроликов.

Мы считаем, что тесный послеоперационный мониторинг признаков и симптомов роста опухоли является важным аспектом протокола. По нашему опыту, как только кролики развивают метастатическое заболевание, они быстро прогрессируют до клинически плохого, особенно в группе in vivo, распространяемых. Этот быстрый, агрессивный рост был подчеркнут смертью одного кролика от метастатического заболевания после задержки всего на 2 дня с запланированной даты эксперимента. В то время как скорость создания модели VX2 считается прочностью, так как аналогичные модели мыши (т.е. модель рака ENCtrial HEC-1 с метастазами лимфатических узлов у мышей) может занять до двух раз дольше, чтобы установить57, эти выводы также демонстрируют определение оптимального экспериментального времени имеет первостепенное значение. Полученные результаты коррелируют с ранее проведенными исследованиями, в которых рост опухоли и увеличение лимфатических узлов значительно увеличились после послеоперационного дня 2137,53; однако мы считаем, что будет изменчивость по отношению к линии ячейки VX2 используется и поощрять группы, чтобы понять их конкретные экспериментальные сроки. Эта хронология не соответствует действительности для наших культурных моделей VX2 и определила это как область, которая требует дальнейшего изучения. Чтобы быть уверенными в росте опухоли, мы решили использовать как неинвазивный, так и инвазивный мониторинг опухолей во время протокола. Однако в будущем может быть уточнение послеоперационного протокола визуализации, чтобы избежать необходимости второй инвазивной процедуры.

В целом, мы сообщили простой, стандартизированный метод для создания модели рака эндометрия с ретроперитонеальной лимфадонопатии у кроликов. С помощью этого протокола мы рассмотрели значительную изменчивость в литературе VX2 в отношении дозы клеток, хирургической техники и послеоперационного мониторинга модели. Мы признаем, что еще одним ограничением исследования является то, что при использовании линии клеток VX2 вместо человеческого ксенотрансплантата мы не полностью имитируя биологию опухоли и микроокружение рака человека. Тем не менее, мы надеемся, что другие группы будут использовать культивированные клетки VX2 для создания своих моделей, поскольку мы считаем, что этот тип клеток может моделировать рак эндометрия человека более надежно через его медленный рост и снижение склонности к метастазированию. Мы призываем другие группы к этой быстрой и простой модели матки производных ретроперитонеальных метат лимфатических узлов для изучения новых методов визуализации, чтобы помочь пациентам с метастатическим раком эндометрия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было профинансировано Научно-исследовательским институтом Терри Фокса (PPG-1075), Канадским институтом исследований в области здравоохранения (Фонд Грант #154326), Канадским институтом исследований онкологического общества (704718), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады, Фонд инноваций ИАнада и Фонд принцессы Маргарет Рак.

Я хотел бы поблагодарить доктора Маргариту Акенс за предоставление первоначальных клеток VX2 для создания первоначальной модели VX2 и замороженных блоков опухоли VX2. Я хотел бы поблагодарить Марко DiGrappa за помощь в выполнении первоначальных экспериментов Культуры клеток VX2 и Лили Дин за помощь с культурой клеток VX2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109 (2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49 (2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859 (2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Tags

Исследования рака Выпуск 151 Рак эндометрия ортотопический рак модель VX2 клеточной линии Lymphadenopathy Кролик модель Хирургическая модель Клеточная культура
Ортотопические эндометрия рака модель с ретроперитонеальной лимфаденопатии Сделано из In Vivo распространяется и культивированных VX2 клеток
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., … More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter