Summary
Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van thiazole oranje voor de opsporing van DNA in gel elektroforese experimenten. Het gebruik van thiazole oranje kunt eliminatie van ethidiumbromide en fluorescentie detectie kan worden bereikt met UV of blauw licht.
Abstract
DNA gelelektroforese met behulp van agarose is een gemeenschappelijk instrument in moleculaire biologie laboratoria, waarmee een scheiding van de fragmenten van DNA door grootte. Na scheiding, is DNA gevisualiseerd door kleuring. Dit artikel laat zien hoe u thiazole oranje om vlek DNA. Thiazole oranje vergeleken gunstig met gemeenschappelijke kleuring methoden, in die zin dat het gevoelige, goedkope, prikkelbaar met UV- of blauw licht (monster om schade te voorkomen) en veiliger dan ethidiumbromide. Laboratoria die reeds uitgerust is om uit te voeren van de experimenten van DNA elektroforese gebruik van ethidiumbromide kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen in het algemeen overschakelen naar bestaande protocollen, met behulp van UV-licht voor detectie. Blauw-licht detectie om te voorkomen dat monster schade kan bovendien worden bereikt met een blauw-licht bron en emissie-filter. Labs reeds uitgerust voor blauw-licht detectie kunnen kleurstoffen met geen aanvullende wijzigingen eenvoudig overschakelen naar bestaande protocollen.
Introduction
Het doel van deze methode is om te identificeren van DNA in agarose gel met behulp van thiazole oranje (TO) voor de detectie van de fluorescentie. Door zijn lage kosten en gunstige veiligheidsprofiel, kan thiazole oranje bepaald voordeel in undergraduate onderwijs labs en onderzoeklaboratoria uitvoeren van moleculaire biologie, met name ligations en klonen ziet.
Ethidiumbromide blijft de meest voorkomende kleurstof voor opsporing van DNA in agarose gel. Dit is vooral omdat het zeer goedkoop kan worden verkregen en vereist alleen excitatie met UV-licht voor detectie. Beide ethidium bromide en thiazole oranje zijn goedkoop, met lage detectie limieten (1-2 ng/lane)1. Er zijn twee belangrijke nadelen aan ethidiumbromide, echter dat thiazole oranje verbetert.
Eerst, ethidiumbromide is een mutagen2 met speciale verwerking en verzending en over verwijdering eisen, terwijl thiazole oranje minder mutagene is (3-4 x minder mutageen in Ames-test)3,4 en kan worden over het algemeen afgezet met gemeenschappelijke chemisch afval.
Ten tweede vereist ethidiumbromide UV-licht voor detectie. Thiazole oranje ook UV-licht kunt gebruiken, indien gewenst, maar kan ook worden gedetecteerd met blauw licht. UV-licht, heeft terwijl gebruikte, een paar saillante nadelen. Ten eerste, het is schadelijk voor de menselijke huid en ogen. Hoewel UV-licht kan veilig gebruikt worden door daartoe opgeleide beroepsbeoefenaren, schade door een ongeluk huid of oog (functioneel vergelijkbaar met zonnebrand) uit laboratorium UV licht zijn niet ongewoon vooral met onervaren wetenschappers. Ten tweede, UV-licht is uiterst schadelijk voor DNA monsters5, waardoor het succes van downstream experimenten (zoals afbinding en transformatie)1,6,7. AAN maakt de ontdekking met blauw licht (λex, max = 510 nm (488 nm en 470 nm Toon ook sterke excitatie)), die veroorzaakt geen huid schade of DNA schade (hoewel een intens licht kan nog steeds schadelijk voor de ogen), sterk verminderen van de risico's voor zowel de wetenschapper en het monster.
Is niet het slechts fluorescente kleurstof alternatief voor ethidiumbromide; het voordeel is kosten. AAN werd ontdekt in de jaren 1980 als een Retikulocyt vlek8, en nut heeft gevonden in een aantal DNA gebaseerde fluorescentie experimenten9,10,11,12,13. Het is op dit moment verkocht door meerdere leveranciers. Is de bovenliggende compound van extra, duurder, blauw-licht-detecteerbare commerciële kleurstoffen en zich gedraagt als tijdens elektroforese, met behulp van UV- of blauw licht voor detectie1. Bovendien, terwijl andere kleurstoffen gevoeliger voor zeer lage concentraties van DNA dan EtBr of aan, voor generieke elektroforese experimenten zijn, dergelijke kleurstoffen zijn onbetaalbaar in vele contexten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van het gel
Opmerking: Voor de protocollen van de Elektroforese van het gel van de algemene, zie ook P.Y. Lee, et al.. 14.
- Meng agarose (~ 1% w/v, percentage kan worden gevarieerd voor bepaalde grootte scheidingen) in buffer (ongeveer 70 mL voor een mini gel (8 x 7 cm)). Buffers zijn vaak TAE (tris-acetaat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM acetaat, 1 mM EDTA, pH ongeveer 8,6) of FSME (tris-boraat-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM boraat, 2 mM EDTA, pH ongeveer 8.3)).
- Thiazole oranje toevoegen om een eindconcentratie van 1.3 μg/mL.
- Ontbinden thiazole oranje in DMSO te maken van een stamoplossing 10.000 x (13 mg/mL). Terwijl niet bijzonder lichtgevoelig, slaat u aan in de donkere wanneer niet in gebruik. Deze oplossing is stabiel bij kamertemperatuur voor ~ maanden; langdurige opslag kan worden bereikt door bevriezing aliquots (DMSO zal bevriezen in een standaard koelkast). Zorg ervoor dat volledig smelten en resuspendeer een bevroren oplossing vóór gebruik.
Opmerking: De gel kan ook worden gekleurd met aan na elektroforese (zie stap 2.6). Terwijl een verbeterde veiligheidsprofiel heeft over ethidiumbromide, standaard moleculaire biologie laboratorium veiligheid voorzorgsmaatregelen dienen te worden gehandhaafd.
- Ontbinden thiazole oranje in DMSO te maken van een stamoplossing 10.000 x (13 mg/mL). Terwijl niet bijzonder lichtgevoelig, slaat u aan in de donkere wanneer niet in gebruik. Deze oplossing is stabiel bij kamertemperatuur voor ~ maanden; langdurige opslag kan worden bereikt door bevriezing aliquots (DMSO zal bevriezen in een standaard koelkast). Zorg ervoor dat volledig smelten en resuspendeer een bevroren oplossing vóór gebruik.
- Het mengsel van agarose, buffer en thiazole oranje te ontbinden agarose magnetron (ongeveer 60 s). Deze stap wordt vaak genoemd "smelten". Swirl (5 s) ontbinding hulp indien nodig.
Opmerking: Als u wilt kunnen ook worden toegevoegd na de magnetron als de voorkeur. - Laat de agarose oplossing afkoelen kort voordat het gieten in gel gieten apparatuur met een passende kam.
- Laat de oplossing agarose te stollen in een gel.
2. veilig laden en uitvoeren van het gel
- Plaats de gel in de Elektroforese van het apparaat als niet reeds heden.
- Voeg lopende buffer (TAE of FSME als boven) ter dekking van het oppervlak van de gel.
- Laden van DNA-monsters (gewoonlijk 10 μL) met behulp van een laden kleurstof. Omvatten een DNA sizing ladder voor referentie.
- Bevestig de cover en elektroden (de gel moet worden uitgevoerd naar de rode anode (positieve)).
- Toepassen van spanning (meestal ~ 100V voor een mini gel, hoewel grootte van gel vereist een gemodificeerde spanning Voorkom beschadiging van de gel) totdat laden kleurstof heeft reisde de juiste afstand (ongeveer 4-7 cm voor een mini gel, hoewel afstand, afhankelijk variëren kan nauwkeurige applicatie).
Opmerking: Net als ethidiumbromide en vele andere DNA-bindende kleurstoffen, worden thiazole oranje is positief geladen. Bijgevolg zal deze kleurstoffen migreren in de tegenovergestelde richting van de electrophoresing van DNA. Voor monsters die ver beneden de gel voor verbeterde scheiding worden uitgevoerd, zal de kleurstof uiteindelijk scheiden van de kleinere fragmenten van DNA, resulterend in zwakke kleuring. In dergelijke gevallen moet de gel zoals in stap 2.6 worden gekleurd. Deze situatie is niet uniek voor aan, om het even welk positief geladen kleurstof die omkeerbaar met DNA interageert zal vertonen dit gedrag (met inbegrip van ethidiumbromide, tot, e.a.). - Als is niet toegevoegd voor gieten (stap 1.2) gel, stain door de gel in de buffer met thiazole oranje onder te dompelen.
- Genoeg buffer (TAE of FSME) voor te bereiden waarin 1.3 μg/mL thiazole oranje volledig dekken de gel en geniet van de gel met zachte agitatie, totdat de bands volledig zijn gedetecteerd (ongeveer 20 min).
3. visualisatie van thiazole oranje agarose gel (UV transilluminator)
- Het verwijderen van de gel van de Elektroforese van het apparaat en plaats op een UV-transilluminator.
Let op: UV-licht is schadelijk voor huid en ogen. Zorg ervoor dat passende ogen (bril) en gezicht (gelaatsscherm) bescherming te dragen. Handen moeten handschoenen en lange mouwen gedragen moeten worden. - Indien gewenst, uitgesneden gewenst DNA bands uit de gel (voor verdere vertering of afbinding, bijvoorbeeld). De gel aan UV-licht voor zo kort een tijdsduur mogelijk bloot tijdens de besnijdenis. UV-licht (ongeacht DNA kleurstof) beschadigt DNA.
- Het uittreksel van DNA van het segment van de gel met een beschikbaar kit of protocol15.
4. visualisatie van thiazole oranje agarose gel (blauw-licht transilluminator of zaklamp)
- Het verwijderen van de gel van de Elektroforese van het apparaat en plaats op een blauw-licht transilluminator (~ 470 nm maximale emissie golflengte). U kunt ook een blauwe LED (~ 470 nm) zaklamp kan worden omgeleid naar de gel (hetzij van boven of onder).
Opmerking: Terwijl de gevoeligheid is lager een transilluminator blauw-licht met ethidiumbromide, gekleurd met ethidiumbromide DNA kan worden opgespoord met behulp van dit protocol blauw-licht. - Een amber emissie filter (~ 560 nm longpass, bril of vierkant) gebruiken voor het filteren van blauw licht, waardoor de visualisatie van de fluorescentie van DNA: thiazole oranje complexen.
Opmerking: Zonder de amber emissie-filter is het zeer moeilijk op te sporen van DNA bands als gevolg van de intensiteit van blauw-licht excitatie bron.
Let op: Hoewel blauw licht de mogelijkheid ontbreekt om acuut schade toebrengen aan weefsels (tegenover elkaar stellende UV), langdurige blootstelling aan intens blauw licht ogen kan beschadigen en amber emissie bril of filter moet worden gebruikt. - Indien gewenst knip gewenste DNA bands uit de gel voor verdere toepassingen.
Opmerking: Omdat blauw licht DNA niet beschadigt, het is niet nodig om snel uitknippen bands (zoals wanneer met behulp van UV excitatie in stap 3.2). - Het uittreksel van DNA van het segment van de gel met een beschikbaar kit of protocol15.
5. de Fotolader
- Passende excitatie en emissie instellingen te selecteren in de gel-imaging apparatuur. De excitatie en uitstoot van thiazole oranje (λex, max = 510 nm (488 nm en 470 nm Toon ook sterke excitatie, naast sterke excitatie bij UV-golflengtes); λem = 527 nm) zijn vrijwel identiek aan blauw-licht-detecteerbare gemeenschappe kleurstoffen, zodat de instrumenten kunnen hebben vooraf ingestelde instellingen voor het filter dat kunnen worden gebruikt.
Opmerking: Sommige instellingen voor het filter voor blauw-licht-detecteerbare commerciële kleurstoffen eigenlijk gebruik schadelijk UV-licht voor excitatie, dus wees voorzichtig als imaging vóór snijden banden. Gebruik een blauw-licht excitatie bron indien mogelijk als DNA banden zal worden weggesneden na imaging. - Bij het ontbreken van een imaging systeem met passende filters, een oranje filter tussen de camera en de gel/blauw-licht excitatie-bron te plaatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thiazole oranje maakt detectie van DNA, zonder gebruik van ethidiumbromide en zonder gebruik te maken van DNA-schadelijk UV-licht. Ethidiumbromide is bekend als mutageen, dus het wegwerken van het lab voordeel kan opleveren. UV-licht beschadigt DNA en verlaagt transformatie-efficiëntie aanzienlijk, terwijl blauw licht DNA niet beschadigt. Detectiegrenzen lijken tussen ethidiumbromide, thiazole oranje en een gemeenschappelijke, blauw-licht-detecteerbare commerciële DNA kleurstof (Figuur 1, Zie Tabel van materialen), met de detectiegrens voor alle drie kleurstoffen worden ~ 1-2 ng/lane in een mini gel 1.
Voor gemeenschappelijke toepassingen zoals snijden een restrictie-enzym verteerd band is thiazole oranje bijzonder geschikt. Detectie van DNA met blauw-licht excitatie is robuust en eenvoudig, en de wetenschapper niet hoeft te haasten accijnzen DNA zoals ze zou doen als opsporen met UV-licht. Een plasmide werd gesneden met de enzymen van de beperking te isoleren een insert (Figuur 2, een gel is verbeelde drie verschillende manieren). De insert is eenvoudig aantoonbaar met aan met blauw licht naast UV, waardoor downstream toepassingen optreden zonder angst voor schade aan het DNA van UV-blootstelling.
Figuur 1 . Detectie van DNA met thiazole oranje, een gemeenschappelijk blauw-licht-detecteerbare commerciële DNA kleurstof en ethidiumbromide met blauw of UV-licht. Gel segment afbeeldingen vertegenwoordigen de twee-voudige verdunning van een 120-ng band van DNA in de gel (band is een band 3.0 kb uit 2-log ladder). Dit cijfer is gewijzigd van O'Neil, et al.1, gereproduceerd met toestemming. Zie O'Neil, et al.,1 voor volledige details van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Meerdere afbeeldingen van de dezelfde thiazole oranje gebeitste agarose gel van een beperking digest. (A) excitatie met UV-transilluminator. (B) excitatie met blauw-licht transilluminator. (C) excitatie met blauw-licht zaklamp (het uiteinde van die is licht zichtbaar, onscherp, in beeld onderaan). Lane 1:2-log ladder, 1 μg van totale DNA (grote bands van 3.0 kb, 1.0 kb, en 0.5 kb worden aangeduid). Lane 2: 0,5 μg pEF-GFP plasmide DNA (5.1 kb) verteerd met HindIII (verwacht grootte 5.1 kb). Lane 3: 0,5 μg pEF-GFP verteerd met HindIII en EcoRI (verwacht maten: 3.7 kb, 1.3 kb). Gel is uitgevoerd met 1.3 μg/mL thiazole oranje in de gel. Alle beelden genomen met behulp van standaard emissie filter (590/110 nm), belichting geoptimaliseerd voor intense bands. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ethidiumbromide is al lang een standaardhulpmiddel in de moleculaire biologie lab, ondanks bekende toxiciteit. Het lijdt ook waarbij UV-licht, die het DNA schade zoals het wordt ontdekt. Thiazole oranje biedt een goedkoop alternatief voor ethidiumbromide, evenals nuttig, maar dure commerciële kleurstoffen.
De voordelen van thiazole oranje zijn dus tweeledig. Eerst, thiazole oranje kan gewoon worden gebruikt als vervanging aan ethidiumbromide. Gels kunnen identiek aan EtBr, met aan vervangen als de vlek (stap 1.2) worden voorbereid. Detectiegrenzen zijn vergelijkbaar (~ 1-2 ng/lane)1. Geen extra apparatuur moet overschakelen van kleurstoffen omdat thiazole oranje kan worden opgespoord met UV-licht (stap 3) net als EtBr. Blootstelling aan UV-licht snel schade van DNA, echter, en kan leiden tot falen van downstream experimenten zoals afbinding en transformatie1. UV-licht is ook schadelijk voor huid en ogen, vereisen zorgvuldige veiligheidsmaatregelen.
Het tweede voordeel van aan is dat het biedt de mogelijkheid van verschuift van UV excitatie. Detectie met blauw licht (vervangen door stap 3 stap 4) elimineert schade aan DNA en beperkt risico naar de wetenschapper. Blauw-licht excitatie en opsporing van aan kunnen worden bereikt met een blauw-licht-transilluminator, en ook met een goedkope blauwe LED-zaklamp (beide ~ 470 nm maximale emissie golflengte, beide vereisen een amber emissie-filter). Adequate toepassing van excitatie golflengten (stap 4.1) en emissie filters (stap 4.2) is essentieel voor het succes van het experiment (Zie ook stap 5.1). Lichtbronnen en emissie filters zijn dadelijk beschikbaar, echter, en met een minimale investering, labs kunnen profiteren van de voordelen van blauw-licht excitatie en UV-licht schade voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door opstarten middelen aan TDG van Christopher Newport University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. Molecular Probes, Inc. , USA. WO/2005/0333342 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
