Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

Abstract

המושרה בתאי גזע פלוריטי (iPSCs) הם מקור ספציפי למטופל, תא שהתרבות שיכול להבדיל לכל סוג תא הסומטית. ביופוטנאל ושלתי (EPs), אשר יכול להבדיל בין סוגי התאים הדרושים כדי להרכיב בוגרת, פונקציונלית ולבלטורה, נגזר הן העובריים והמושרה תאים גזע pluripotent עם זאת, תאים אלה לא הוערכו בקפדנות בסביבות תלת ממדיות, ואת המדד הכמותי של הפוטנציאל הvas, שלהם נשאר חמקמק. כאן, הדור והבידוד של iPSC-EPs באמצעות מיון התא מופעל פלורסנט מתוארים תחילה, ואחריו תיאור של עטיפת ותרבות של iPSC-EPs ב קולגן הידרוג. מטריצה זו (ECM)-מחקה המיקרו-סביבה מעודדת תגובה חזקה ומרכזית; ליצור רשתות כלי דם לאחר שבוע של תרבות. יצירת צינור חישובית העושה שהוא משתמש בתוכנה מקור פתוח כדי לכמת את התגובה הזאת הוא התחום. צינור זה נועד במיוחד כדי לשמר את ארכיטקטורת 3d של מקלעת נימי כדי מכבש לזהות את מספר הענפים, נקודות הסתעפות, ואת אורך הרשת הכולל עם קלט משתמש מינימלי.

Introduction

וריד הטבור האנושי בתאי הטבורי (HUVECs) וסוגים אחרים של תאים אנדותל הראשי כבר מנוצל במשך שני עשורים לדגמן כלי דם לבלוב ופיתוח בתוך מבחנה1. פלטפורמות כלי דם כאלה להבטיח להאיר מולקולרית ברמת רקמות מנגנונים של מחלות לב וכלי דם והוא עשוי להציג תובנה פיזיולוגית לתוך פיתוח של רשתות כלי דם פרימיטיביים2,3. למרות שהשדה של מידול כלי הדם הגיע עד להתקדמות משמעותית, שיטת "תקן זהב" שיכולה לכמת את המודל ולהעריך את ההתפתחות הפיזיולוגית של כלי הדם, נותרה חמקנית. רוב הפרוטוקולים שפורסמו אינם מתפקדים כראוי את הנישה של כלי הדם כדי לעודד היווצרות של כלי דם בוגרים ופונקציונליים או שיטה להשוות את הפוטנציאל הגלום בסוגי התאים המוערך בשלושה מימדים ( 3D).

מודלים רבים של כלי הדם הנוכחיים מוגבלים ביכולתם לחקות את הנישה הפיזיולוגית של כלי הדם. אחד הנפוצים ביותר בפלטפורמות מבחנה הוא חלבון ז'לטין מבוססי תערובת היווצרות שפופרת. בקצרה, HUVECs הם הזרע כמו תאים בודדים על שכבה דקה של ג'ל המורכב של חלבונים שנקטפו מתוך מיטין סרקומה מורתתאי (ECM); בתוך אחד עד יומיים, HUVECs להרכיב את עצמו לתוך צינורות פרימיטיביים4. עם זאת, תהליך זה מתרחש בשני מימדים (2D) ובתאי האנדותל (ECs) הנמצאים בשימוש באותו שיטת הפעולה אינם יוצרים מוקפים, חלולים לומן, ובכך מגבילים את המשמעות הפיזיולוגית של מחקרים אלה. לאחרונה, ECs ותאים תומכים (g., תאי גזע mesenchymal (MSCs) ו קרום הלב) כבר שיתוף תרבותי במיקרו מיקרוסביבות 3D המדמים את הארכיטקטורה הסיבי של ECS יליד, כגון קולגן או פיברוב הידרוג'ל5. כדי לדגמן פיתוח כלי דם מיקרוסביבה זו, חרוזים פולימריים מצופה ECs מועסקים בדרך כלל6. התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני ו/או גורמי גדילה מופרש על ידי תאים אחרים interstitially מוטבע הידרוג'ל יכול לגרום ECs, ציפוי חרוזים פולימריים, כדי נבט וטופס לומן יחיד; המספר והקוטר של נבטים והכלים יכולים להיות מחושבים. עם זאת, נבטים אלה הם באופן ייחודי ולא יוצרים רשת סגורה, מחובר כפי שהוא נראה בתנאים פיסיולוגיים ולכן הוא מזכיר יותר מודל הגידול של המודל. התקנים מיקרופלואידים מנוצלים גם כדי לחקות את נישה כלי הדם ולקדם את היווצרות ואצלב ב-EC-לאדן הידרוג'ל7,8. בדרך כלל, גורם גידול אנגיוגנטי-מעבר הדרגתי מוחל על בינונית תרבות התא מחזורי כדי לגרום הגירה EC ולבלוב. ECs המהווים לומן של כלי מפותח רגישים למתח ההטיה הנגרמת על ידי יישום של זרימת הנוזלים דרך המכשיר microfluidic; לכן, מכשירים אלה microflu, התקנים מיקרופלואידים ללכוד פרמטרים פיזיולוגיים מפתח כי הם לא נגישים במודלים סטטיים. עם זאת, התקנים אלה דורשים יכולות מיקרו-ייצור יקרות.

והכי חשוב, כל שלושת מודלים כלי הדם (2D, 3D, microfluidic) להשתמש באופן גורף ECs הראשי, כמו גם הראשי התומך בסוגי תאים. לא ניתן לפתח תאים ראשוניים לטיפול קרדיווסקולרי אפקטיבי, כי התאים היו לעורר תגובה חיסונית על השרשה; יתר על כן, HUVECs וסוג התאים הראשוניים דומים אינם מסוימים המטופל ולא ללכוד חריגות כלי הדם המתרחשים בחולים עם מתכונת גנטית או מראש קיים תנאי הבריאות, למשל, סוכרת. המושרה בתאי גזע פלאוריטי (iPSCs) התפתחה בעשור האחרון כמו מקור מטופל ספציפי, המקור התא מתרבים כי ניתן לבדיל את כל התאים הסומטיים בגוף האדם9. בפרט, הפרוטוקולים פורסמו כי המתאר את הדור והבידוד של iPSC הנגזר ושלתי (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs הם בעלי עוצמה והוא יכול, ולכן, להיות מובחנת עוד לתוך תאים אנדותל ותאי שריר חלקה/קרום הלב, אבני הבניין של בוגרת, פונקציונלי תפקודית. רק מחקר אחד יש מפורט משכנעת את הפיתוח של מקלעת נימי העיקרי מ-iPSC-EPs ב מיקרוסביבה 3D12; למרות שמחקר זה הוא קריטי להבנת ההרכבה iPSC-EP ובידול טבעי וסינתטי הידרוג, זה לא להשוות את טופולוגיות הרשת של המערכת המתקבלת. עוד מחקר שנערך לאחרונה השתמש במודל חרוז פולימרי כדי להשוות את הנביטה של HUVECs ו-iPSC-נגזר ECs5. לכן, יש צורך ברור נוסף להבהיר את מנגנוני האיתות הפיזיים והכימיים לווסת iPSC-EP vasculogenesis בסביבות מיקרו 3D וכדי לקבוע אם תאים אלה מתאימים לטיפול איסכמי ומחלות לב וכלי דם דוגמנות.

בעשור האחרון, קווים שונים של מקור פתוח ואלגוריתמים השלד הינם מפותחים לכמת ולהשוות את אורך הרשת והקישוריות של כלי הדם. לדוגמה, charwat ואח ' פיתח צינור מבוסס פוטושופ כדי לחלץ תמונה מסוננת, בינארית של רשתות כלי דם נגזר תרבות שיתוף של תאי גזע נגזר של אדיפוז ו-ecs הצמיחה של מטריצה הפיטין13,14. אולי הכלי הנפוץ ביותר להשוואת הטופולוגיה הוא אנגיוtool, תוכנית שפורסמה באינטרנט על ידי המכון הלאומי לסרטן15; למרות אימוץ נרחב של התוכנית נאמנות מתועדת היטב, התוכנית מוגבלת לניתוח מבנים כמו כלי בשני ממדים ותוכניות אחרות, כולל AngioSys ו Wimasis, לשתף את אותה הגבלה מימדי16. חבילות תוכנה רבות עוצמה כגון Imaris אריס, לוסיא והתמרה פותחו כדי לנתח את טופולוגיית הרשת של מיקרובילטורה מהונדסים; עם זאת, סוויטות אלה הן מעלות עבור מעבדות אקדמיות ביותר ולהגביל את הגישה לקוד המקור, אשר עשוי לעכב את היכולת של משתמש הקצה להתאים את האלגוריתם ליישום הספציפי שלהם. 3D מבצעה, מקור פתוח דימות תהודה מגנטית/חבילת טומוגרפיה ממוחשבת, מכיל ערכת מידול כלי דם שיכול לנתח ביעילות את הטופולוגיה של רשתות 3D כלי דם17; עם זאת, הניתוח תלוי במשתמש מציב ידנית את נקודות הקצה של הרשת, דבר העלול להיות מייגע בעת ניתוח ערכת נתונים גדולה ויכול להיות מושפע מהטיות התת-מודע של המשתמש. בכתב יד זה, צינור חישובית שיכול לכמת רשתות כלי דם 3D מתואר בפרוטרוט. כדי להתגבר על מגבלות הנ ל, זה צינור בחישוב מקור פתוח מנצל ImageJ כדי לעבד מראש התמונות מיקוד רכשה לטעון את נפח 3D לתוך מנתח שלד. מנתח השלד משתמש באלגוריתם מקביל של ציר דליל, והוא פותח במקור על ידי קרשניצקי ואח '. כדי לנתח את האורך והקישוריות של רשתות אוסטאופציט18; אלגוריתם זה ניתן להחיל באופן יעיל כדי לאפיין את האורך ואת הקישוריות של מיקרוקולטורה הנדסה.

בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את היצירה של רשתות microvascular מיקרונימי בסביבות תלת-ממד, ומספק צינור חישוב מקור פתוח ומשתמש-הטיה בחינם כדי להשוות את הפוטנציאל vasculogenic של iPSC-EPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדיה תרבותית ופתרונות ציפויים

  1. כדי להכין הפתרון ציפוי vitronectin, לדלל vitronectin 1:100 ב מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS).
    התראה: לאחר דילול, לא מומלץ לאחסן פתרון זה לשימוש עתידי.
  2. עם קבלת פנול חינם אדום, גורם גדילה-מופחת תערובת חלבון ז'לטין (ראה שולחן חומרים) מהיצרן, להפשיר על קרח ב 4 ° צ' עד התערובת היא שקופה ונוזלית. שמירה על התערובת על קרח במכסה זרם למינארי, פיפטה 75 μL של התערובת לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ולהקפיא ב-20 ° c מיד. ניתן לאחסן את הבליטים האלה עד לשנה אחת.
    התראה: תערובת חלבון הלטין הופכת לצמיגה מאוד כאשר היא נשמרת בטמפרטורת החדר וממשיכה להיות מועלת בטמפרטורות גבוהות יותר. . שמור על הפתרון הזה קפוא
  3. כדי להכין את התערובת הזאת לציפוי, הפשרת 75 μl סדרת מחלקים על קרח ולדלל עם 6 מ ל של מדיום נשר שונה של הקרח קר מאוד בינונית: תערובת מזינים F-12 (dמאמ/F12). הכרך המוכן הזה מספיק. כדי לחלוק צלחת 12 היטב
  4. הכנת מלאי 100 mg/mL של חומצה אסקורבית מגנזיום-2-פוספט (אבקה לבנה הלבן) ב-אלקטרופורזה מים על ידי הוספת 500 mg של אבקה ל 5 מ ל של מים ב 10 ml זכוכית בקבוקון. מתפרעים עם בר מהומה עד הפתרון הוא שקוף לחלוטין (זה עשוי להימשך עד שעה). ניתן לאחסן פתרון זה ב-20 ° צ' עד לשנה אחת.
  5. צור 10 מ"מ מלאי של CHIR99021 (CHIR) על ידי המסת 10 מ"ג של אבקת ליאופהדיה ב 1.9928 mL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) בתוך 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה של 1 מ ל וחמים ב 37 מעלות צלזיוס (או מים) אמבט עד הפתרון הוא שקוף. מחלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ומאחסנים ב-20 ° צ' עד לשנה אחת.
  6. צור 10 מ"מ מלאי של Y-27632, מעכב סלע (ROCKi), על ידי המסת 10 מ ג אבקה של ליאופהדיה ב 3.1225 mL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה ו חם ב 37 מעלות צלזיוס (או מים) אמבטיה עד הפתרון הוא שקוף. מחלקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.8 mL ומאחסנים ב-20 ° צ' עד לשנה אחת.
  7. כדי להכין Essential 8 (E8) בינונית, להפשיר תוספי מקפיא, להוסיף את הבקבוק 500 mL של בינונית בסיס, מסנן לעקר. ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c עד שבועיים.
    התראה: חשוב מאוד לא לחמם את המדיום בשעה 37 ° c, כאשר החלבונים בניסוח הבינוני עלולים להיפגם עם שימוש ממושך. במקום זאת, שמור את המדיום בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות לפני השימוש.
  8. כדי להכין את מאגר מיון, להוסיף 1.33 mL של 7.5% בסרום שור חלבון אלבומין (BSA) ב DPBS ו 200 μL של 0.5 מ"מ חומצה ethylenediams (EDTA) כדי 48.5 mL של DPBS ליצור פתרון סופי של 0.5% BSA ו 2 מ"מ EDTA.
  9. כדי להכין LaSR בסיס, להוסיף 300 μL של 100 mg/מ"ל חומצה אסקורבית מגנזיום-2-פוספט ו 5 מ ל של גלוטמקס ל 500 מ ל מתקדם Dמאמ/F12. ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד חודש אחד.
  10. כדי להכין את הצמיחה של תאים אנדותל בינונית-2 (EGM-2), הפשרת תוספי תזונה והוסף לבקבוק 500 mL של המדיום הבזאלי. ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד חודש אחד.
  11. כדי להכין את מאגר חסימת, להוסיף 500 mg של סרום ליאופד בנסיוב הפרה (BSA) ו 50 μL של אמולסיה מגיב (ראה טבלת חומרים) ל 48 ML של dpbs. מודקון ב 37 ° c עבור לפחות 15 דקות כדי להבטיח כי BSA לא לקבץ ולאחר מכן נפרד מהפתרון.

2. הפשרה, אחזקה, והפסקתו של iPSCs

  1. לפני הקפאת הקריובית בקבוקון iPSC שמור, מעיל באר אחת של 6-היטב צלחת עם 1 מ ל של פתרון vitronectin (מוכן כמתואר בשלב 1.1). . מבית המלון בטמפרטורת החדר אל תתנו זה ציפוי אוויר יבש לפני הוספת E8 בינוני לצלחת.
  2. כדי להפשיר iPSCs, לשחזר בקבוקון cryopreserved של iPSCs מתוך המיכל הנוזלי שלה אחסון חנקן ולהפשיר ב 37 ° c עד גביש קטן של קרח נשאר. בזהירות (dropwise) להעביר את התוכן של הבקבוקון המוסדר עד 15 מ"ל צנטר חרוטי המכיל 8 מ ל של הקרח קר Dמאמ/F12. לשטוף את הבקבוקון המוסדר עם תוספת של 1 מ ל של הקרח קר DMEM F12 כדי למזער את אובדן התאים. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g.
  3. בזמן ההמתנה לצנטריפוגה, לאכול את הפתרון vitronectin ולהוסיף 1 mL של E8 בינונית (מוכן כמתואר בשלב 1.6) לבאר. לאחר מכן, להסיר את DMEM/F12 supernatant מצינור centrifuged חרוט ולהשעות מחדש את הגלולה ב 1 mL של E8 medium. להעביר את התאים לצלחת החדשה מצופה, להיות בטוח להתסיס את ההשעיה כדי למנוע את המושבות מתוך ההתפייעות על זריעה.
  4. בדרך כלל יש מוות משמעותי. בתאים לאחר הפשרה למחרת בבוקר, להסיר את המדיום ולהחליף עם E8 מדיום טרי.
    הערה: גם בתנאים אופטימליים, iPSCs נוטים להתאושש מהקריוגנית. מומלץ להפוך את הקפאת האזור לכמעט-שוטפת 6-ולכן לזריעה עתידית לתוך 6-היטב. נוכחות של פסולת תא נורמלי עבור 2-3 הימים הראשונים במהלך שחזור התא.
  5. החלף E8 בינונית מדי יום עד שהתאים מוכנים לקראת המשך (70% – 80% שליטה).
  6. למעבר, ראשית הכינו בארות מצופות ויטרופקטין (כמתואר בשלב 2.1).
    1. לאחר בארות vitronectin מצופה מוכנים (כ 1 h), מE8 בינוני מבאר להיות מעבר ולשטוף פעמיים עם 1 מ ל של DPBS. דגירה עם 1 מ ל של 0.5 mM EDTA עבור 5 – 7 דקות ב 37 ° c. בעוד הדגירה, להסיר את הפתרון vitronectin מן הבאר מצופה החדש ולהחליף עם 1 – 2 מ ל של E8 בינונית.
    2. הסר את פתרון EDTA מן הבארות להיות מעבר ולנתק את המושבות על ידי שטיפת בעדינות פעם או פעמיים עם 1 מ ל של E8. העבר 75-200 μL של השעיית התא אל הבארות הE8 מצופה טרי, מתפרעים את הצלחת להבטיח אפילו כיסוי, ומקום בחממה מיד.
      התראה: זמן הדגירה של הניתוק iPSC הוא תלוי קו התאים; מומלץ למשתמש בפרוטוקול זה בדיקות מגוון של פעמים על הרחבה מספקת של קו iPSC שהתקבל/נוצר. 75 μL של ההשעיה של התא בדרך כלל תוצאות 4 ימים בין מעברים; 150 μL או יותר מוביל ל-2 – 3 ימים בין מעברים.

3. יצירת הושלתי הנגזרת של iPSC (איור 1).

  1. בעת שמירה על iPSCs, לוודא המושבות הם דחוס היטב וכי יש מספר נמוך של תאים הבדיל בתרבות. אם המושבות מתחילות ליצור קשר אחד עם השני, סביר להניח שהתאים מאוד שוטפת וצריכים להיות מיושנים באופן מיידי.
  2. כאשר iPSCs הם 70%-80% שוטפת, מעיל צלחת 24-באר עם תערובת חלבון ז'לטין (מוכן כמתואר בשנת 1.2/1.3). פיפטה 250 μL של תערובת זו לתוך כל טוב ולשמור על 1 h בטמפרטורת החדר.
  3. במהלך הדגירה למעלה 1-h, להסיר את E8 בינונית ו-Y-27632 מהמקרר והמקפיא, בהתאמה. לאחר E8 בינונית ו-Y-27632 להגיע לטמפרטורת החדר, להכין E8 + ROCKi על ידי הוספת 13 μL של 10 μM Y-27632 כדי 13 מ ל של E8 ב 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה חרוט.
  4. הסר את המדיום E8 מן הבארות iPSC, לשטוף פעמיים עם 1 מ ל של DPBS, ולאחר מכן דגירה עם 0.5 mM EDTA עבור 5-7 דקות ב 37 ° c. לאחר תקופת הדגירה, להסיר את EDTA ולהטות במהירות את התאים לתוך השעיה תא יחיד עם טיפ P1000 מעלה עם תשר 1 מ ל של E8 + ROCKi מדיום.
  5. . תספור את התאים באמצעות הומוטומטר עבור השעיה שעשוי להכיל מיליוני iPSCs, להוסיף 20 μL של השעיית התא כדי 180 μL של טרי כחול. קבע את מספר התאים הכולל בהשעיה של תא יחיד.
  6. העברת 0.432 x 106 כדי 1.296 x 106 תאים (104 עד 3 x 104 תאים/cm2) אל E8 + rocki הנותרים. הסר את ציפוי בתערובת ז'לטין מן הלוח החדש מצופה 12-באר ולהוסיף 500 μL של השעיית התא לכל באר, להבטיח כי התאים הם מבוזרים היטב אינם יוצרים גושים קטנים.
    הערה: טווח זה של צפיפויות הוא אופטימלי לבידול CD34 תאים חיוביים; עם זאת, צפיפויות אלה הן תלויות-קו תאים וייתכן שיהיה צורך למטב על-ידי המשתמש בפרוטוקול זה.
  7. לאחר 24 h של תרבות, להחליף בינוני עם 500 μL של מדיום E8 טריים. מודטה עבור 24 שעות נוספות תחת אותם תנאים.
  8. הסר את המדיום E8 ולהחליף עם LaSR בסיס בתוספת עם 6-12 μM של CHIR99021. נקודת זמן זו מוגדרת כD0 של בידול. לאחר 24 שעות של תרבות, להחליף עם אותו מדיום תרבות התא.
    הערה: כפי שמתואר קודם לכן, כמות CHIR99021 שנוספה למדיום זה תהיה תלויה בקו iPSC שנוצל. נא בדוק מגוון של ריכוזי CHIR99021 כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
  9. לאחר 48 h של דגירה עם CHIR99021, להחליף עם 1 מ ל של LaSR בסיס.
  10. החלף את המדיום מדי יום עם 2 מ ל של LaSR בסיס עבור 2-3 ימים נוספים. בשלב זה (D5 of בידול), חלק משמעותי של תאים אלה יהיה לבטא CD34 והוא יכול להיות מאופיין כושלתי אנדותל. סכמטי של פרוטוקול זה מחולק לתוצאות מייצגות באיור 1 ומתואר במלואו על-ידי החוקרים שפרסמו לראשונה את השיטה הזאת 11,19.
    הערה: ניתן לבדיל בין ושלתי האנדותל לאורך שושלת האנדותל (35%-99%) או שושלת שריר חלקה (1% – 65%). יעילות הבידול משתנה בהתאם לסוג ציפוי ECM ולמדיום התרבותי התאי המשמש במהלך בידול 20.

4. FACS של אנדותל ושלתי

  1. לפני הנתק את D5/D6 תאים הבדיל, להכין מאגר מיון כמתואר בשלב 1.8 ולשמור על קרח.
  2. דגירה את התאים הבדיל עם 250 μL של פתרון התנתקות התא לכל טוב (ראה טבלת חומרים) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
  3. הנתק את התאים עם טיפ P1000 לתוך השעיה תא יחיד בפתרון ניתוק התא. לאחד את תערובת התא התא הפתרון ערבוב ב 15 מ"ל שפופרת הצנטריפוגה חרוטי ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g.
  4. הסר את הסופרנטאנט והשהה אותו מחדש ב-200 μL של מאגר מיון קר-קרח (מוכן כמתואר בשלב 1.7. הוסף 5 μL של הנוגדן CD34-PE מרוכז לתוך התא-מיון ההשעיה מאגר ו הדגירה של 10 דקות ב 4 ° c.
  5. השהה מחדש ב-5 מ ל של מאגר מיון קר-קרח. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא עם כובע 40 יקרומטר לפני הצבת על סדרן.
  6. בערוץ הפלורסנט המתאים, מיין 10,000 תאים שאינם מתויגים עם נוגדן פלורסנט. שער אזור בעוצמה פלורסנט גבוהה שאינה מכילה כל אלה 10,000 תאים (איור 1D). . זה ישמש כשליטה שלילית
  7. הפעל את הדוגמה המכילה את התווית iPSC-EPs עם פתרון פלורסנט והתחל במיון. CD34 מתבטאת במידה רבה בושלתי האנדותל, והיא מופרדת בקלות מהאוכלוסייה הראשית. לאחר מיון, להעביר את הפתרון ל 15 מ ל צנטריפוגה שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g. . הסר את הסופרנטאנט
    הערה: אם הפתרון הוא בצינור גדול יותר מאשר צינור מיקרוצנטריפוגה (למשל, 5 מ ל קלקר בדרך כלל מועסקים בפרוטוקולי FACs רבים), להשעות מחדש את הגלולה תא ממוין 1 מ ל של מיון מאגר ולהעביר את הפתרון לצינור מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant.
    1. אופציונלי: אם יש צורך באפיון iPSC-EP נוסף, הוסף נוגדנים ראשוניים אחרים (למשל, CD31-APC) בו עם CD34-PE. ודא שטבלת הצלבות בין ערוצי פלורסנט שונה ממוזערת.

5. כימוס ותרבות ארוכת טווח של הידרוג'לים קולגן של iPSC-EP

  1. להכין זריעה בינונית על ידי הוספת 40 μL של 10x בינוני 199 ל 400 μL של הצמיחה אנדותל בינונית (EGM-2) בתוספת עם 10 μM Y-27632 בתוך מיקרוצנטריפוגה ב1.8 mL ושפופרת המקום על הקרח.
    הערה: בעוד השימוש באנטיביוטיקה הוא מיואש לתרבות תא גזע ותחזוקה של תאים הבדיל, מינון עם עט/דלקת מומלץ לאחר מיון כי קשה להבטיח עקרות בסביבת מיון (זה יותר חיוני אם הסדרן משותף בין מעבדות רבות).
  2. הסר את כל supernatant מן ההשעיה התא ולהוסיף 200 μL של EGM-2 בתוספת עם 10 μM Y-27632. להעביר את ההשעיה התא לזריעה בינוני ולערבב במרץ.
  3. הוסף 350 μL של קולגן לפתרון שהוכן בשלב 5.2 ומערבבים היטב. הפתרון יהפוך לצהוב בהיר.
    הערה: הריכוז הסופי של קולגן יכול להיות השפעה משמעותית על היווצרות של מקלעת נימי. פרוטוקול זה מניח כי הקולגן סופק ב 10 מ"ג/mL וכי ההידרוג'לים יש ריכוז סופי של 3.5 mg/mL. כוונן אמצעי אחסון אלה כדי להשיג את ריכוז הקולגן הסופי שלהם; מומלץ להגביל את ריכוז הקולגן הסופי מ 2 מ"ג/mL ל 4 מ"ג/mL.
  4. להוסיף 5 μL של 1M NaOH לפתרון הכין ב 5.3 ומערבבים היטב, הימנעות המבוא של בועות אוויר. הפתרון יהיה ורוד בהיר.
  5. פיפטה 56 μL של הפתרון לנטרל תא קולגן הכין ב 5.4 לתוך בארות בודדות של 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף הלוח התחתון תרבות התאים. מודקון ב 37 ° c עבור 30 דקות. לפני הוספת מדיה, בדוק כי התאים הופצו באופן שווה על ידי בחינת הדגימות עם מיקרוסקופ ברייטפילד.
  6. הכינו 1 מ ל של תרבות בינונית מורכב EGM-2 בתוספת עם 10 μM Y-27632 ו 50 ng/mL כלי הדם מקדם הצמיחה (הוסיף) על ידי הוספת 1 μL של כל פתרון מניות לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר ערבוב היטב, פיפטה 100 μL של תרבות התא הזה בינונית על הידרו-לאדן התא. העבירו את הצלחת ל 37 ° c לתרבות ארוכת טווח.
  7. החלף את מדיום התרבות מדי יום, תוך הוספת גורמי צמיחה אנגיוגנטיים נוספים או מעכבי מולקולה קטנה כפי שוכתב על-ידי מטרת המחקר. כדי להסיר את המדיה בצורה אופטימלית, הטה את הצלחת והשתמש בעצת P100 כדי להכניס בעדינות את המדיום מבלי להפריע להידרוג'ל.

6. תיקון, חיסוני, והדמיה של רשתות כלי דם מבוססי EP

  1. לאחר שבוע של תרבות, להוסיף 250 μL של 4% פאראפורמלדהיד (בתחתית) פתרון צלחת 48-באר. ממלאים כמו בארות רבות כמו הידרוג ' לים. הסירו את המדיום מההידרוג (בלגון) והשתמשו בפינצטה משובחת כדי להעביר את ההידרוג לתוך הל, הכולל בארות. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהסיר את הה, על ידי שטיפת במהירות עם PBS.
  2. הפרראות על ידי הוספת 250 μL של 0.5% של החומר הגולש nonionic (ראה טבלת חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף פעמיים עם 250 μL של PBS שיושלם עם 300 mM גליצין. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות עבור כל צעד כביסה כדי להבטיח את ההסרה של ניקוי עודף. לחסום על ידי האישר את ההידרוג'לים ב-250 μL של חסימת מאגר עבור 30 דקות.
  3. מודלת עם הנוגדנים הראשוניים הרצוי מדולל במאגר חסימת לילה ב 4 ° c. לדוגמה, אם הגנה מפני הפאלואידיב ו-VE-קדהרין, דלל 1:40 ו-1:200, בהתאמה, במאגר חסימת.
  4. למחרת, להסיר את פתרון הנוגדן העיקרי ולשטוף פעמיים עם 0.5% אמולסיה מגיב ב-DPBS. מכסה עם רדיד אלומיניום ו דגירה עם נוגדן משני ספציפי (g., 1:200 אלקסה Fluor 488 ב PBS) עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  5. הסר את הפתרון נוגדן משני ולשטוף פעמיים עם 0.5% אמולסיה מגיב ב-DPBS. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות עבור כל צעד כביסה כדי להבטיח את הסרת fluorophores חינם.
  6. כדי להמחיש את גרעיני התאים, דלל 4, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI) 1:10000 ב PBS ולהוסיף למדגם (ים).
    1. דגירה 2 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף פעמיים עם PBS. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות עבור כל צעד כביסה כדי להבטיח את הסרת fluorophores חינם.
  7. העבירו את הדגימות לתוך שקופית אנגיוגנזה או צלחת פטרי בתחתית זכוכית בעזרת מלקחיים משובחים. ודא כי אין בועות אוויר לכודים מתחת הידרוג'ל.
  8. תמונה על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד על ידי רכישת z-ערימות הנמתחים מלמטה לחלק העליון של המדגם. ודא שהגלאי אינו רווי ושההגדלה הנמוכה ביותר הזמינה בשימוש (שדה גדול של תצוגה רצוי).
    הערה: לעיבוד עתידי, ודא שערימות ה-z נשמרות עם דחיסה מינימלית (לדוגמה,. czi).

7. שימוש בצינור החישוביות לניתוח והשוואת טופולוגיות רשת כלי דם

  1. בדוק כל אחת מערימות z כדי לוודא שפרוסות מכילות כלי קיבול בלבד. פתח את מחסנית z ב-ImageJ ושפר את הניגודיות על-ידי לחיצה על תמונה ≫ התאם ≫ בהירות /ניגודיות. הגבולות של כלי הקיבול נמצאים כעת בבירור, ורמת הרקע ממוזערת. לעתים קרובות, ממדי z אינם תואמים לממדי x/y. כדי לתקן זאת, לחץ על תמונה ≫ התאם > גודל ושנה את מספר הפרוסות של z כך שהמרחק בין כל פרוסה הוא שווה ערך לפיקסל אחד ב-x/y. imagej יבצע אינטרפולציה באופן אוטומטי. אם שלב זה לא יבוצע כראוי, אמצעי האחסון התלת-ממדיים האחרונים יופיעו דחוסים.
    התראה: ECs יועברו לעבר קצות הג והוא יצור מושבות אבנים קטנות. למרות שאלה שימושיים להערכת גבולות ההידרוג'ל, הם יפריעו לניתוח התמונה הסופי ויש למחוק אותם.
    הערה: ImageJ היא תוכנת ניתוח תמונה פתוחה המבוססת על Java שפותחה בקונצרט על ידי המכון הלאומי לבריאות והמעבדה למכשור אופטי וחישוביות. מומלץ להוריד את פיג'י, וזה פשוט ImageJ ארוזות עם תוספים שימושיים (https://fiji.sc/).
  2. ב-ImageJ, יש לטשטש את התמונה בתהליך לחיצה של 3 ממדים ≫ מסננים ≫ -גאוס טשטוש תלת-ממד ולאחר מכן הגדרת ערכי סיגמא ב-3 הממדים ל-2.0 (ייתכן שיהיה צורך לכוונן ערך זה על-ידי משתמש הקצה).
  3. ב-ImageJ, לחץ על עבד ≫ בינארי ≫ הפוך לבינארי ולאחר מכן בחר אלגוריתם סף מתאים. האלגוריתם סף הצלב האנטרופיה שפותחה על ידי Li et al. הוא יעיל בהפרדת כלי הקיבול מהרקע21. חשב את הסף עבור כל תמונה והגדר את הרקע "ברירת מחדל".
  4. ב ImageJ, להסיר רעש מזויף ולמלא "חורים" ב לומן על ידי לחיצה על תהליך > רעש > להסיר outliers.
    הערה: הסרת החוצה "מוארת" תמלא חורים קטנים באוניות מחוברות; הסרת החוצה "כהה" תסיר תאים מתים. גודל רדיוס ההסרה ישתנה בהתאם להגדלה ולגודל כלי הקיבול. עבור תמונות שנרכשו עם מטרה שדות רחב כי הם 512 x 512 פיקסלים, רדיוi בדרך כלל נע בין 4-6 פיקסלים.
  5. עבד את כל raw (למשל, הארכה czi) קבצים ולהמיר לתוך קבצי. tif לפני שתמשיך שלב 7.6. כדי לסייע בעיבוד זה, קובץ ImageJ, "Binarize ו-Filter. ijm" צורף לכתב היד הזה.
  6. שמור את הקבצים המעובדים. tif באותה תיקיה כמו הקובץ "Batchמעבד שלד. m", זמין להורדה בכתב היד. סקריפט זה, שפותח על ידי המחברים, קורא את הפונקציות שפורסמו על ידי פיליפ Kollmannsberger22 ומבצעת מניפולציה קבצים נוספים.
  7. להוריד ולפתוח את כל הקבצים המשויכים שתי הפונקציות העיקריות "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) ו "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). שמור את כל הפונקציות באותה תיקיה כמו מחסנית z מעובד שנפתחו.
  8. פתח סביבת מיחשוב נומרית מרובת פרדיגמה (ראה טבלת חומרים) ונווט אל התיקיה שבה נשמרו כל הקבצים המתוארים לעיל.
  9. הפעל את "השלד העצמי" או על- ידי הקלדת השלד בתוך חלון הפקודה או על-ידי פתיחת קובץ ה-script ופגיעה בלחצן הפעלה (חץ שפונה לימין) בעורך.
    הערה: כדי לנתח ערכת נתונים גדולה בעלת פקודה יחידה, ודא שהמחרוזת בתוך הפונקציה dir בשורה 6 מכילה כוכבית (לדוגמה, ' *. tif '). אחרת, החלף את הכוכבית בשם הקובץ אם הניתוח של קובץ יחיד רצוי.
  10. משך הזמן שקובץ script זה לביצוע ישתנה באופן משמעותי בהתאם לכוח המחשוב הזמין. מומלץ לבצע ניתוח זה במחשב עם לפחות 8 GB של זיכרון RAM כך שהמשתמש יוכל לגשת לתוכניות אחרות בזמן שקובץ ה-script יופעל.
    התראה: בעוד שאין צורך בהכרח, העתק את הרכישה המקורית (באפור) והנחת היתר עם מטריצת תמונה זו עם מטריצת השלד (באדום) יכולה לסייע בהערכת הביצועים של אלגוריתם הסקלטונזציה. בנוסף, הקורא יכול ליצור גרף קטרי, כפי שיושם על ידי Kollmannsberger et al., כדי להעריך את הדיוק של ניתוח הרשת. כדי ליצור את שני הגרפים, בעוד שימושיים, תגדיל באופן דרמטי את זמן הריצה של הסקריפט וידרוש זיכרון נוסף; אם המשתמש פשוט דורש ניתוח טופולוגיה סופי ואינו מעוניין להמחיש את ערכת הנתונים, פשוט הגיבו על קווים 44 עד 61 (גרף שלד) ושורות 104 ל-143 (בגרף הטופולוגיה).
  11. עם השלמתה, מטריצת הנתונים, המוצגת בסביבת העבודה, מכילה כעת את הנתונים המעובדים. לחץ פעמיים על נתונים ופתח תא זה בעורך המשתנים.
    1. שים לב כי מטריצה זו תכיל, משמאל לימין: 1) שם הקובץ, 2) מספר הצמתים (נקודות הסתעפות + נקודות קצה), 3) הסתעפות נקודות, 4) קישורים (כלומר, כלים), 5) אורך הרשת (כולל בידוד ספינות) ו-6) מספר הפרוסות הכלולות במחסנית z. שמור נתונים אלה כקובץ. csv וייצוא לצורך ניתוח נוסף לכל תוכנה שתבחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר בידול (איור 1), facs ו כימוס של ipsc-EPs ב קולגן הידרוג'לים, התאים יישארו בדרך כלל מעוגל עבור 24 שעות לפני תחילת להגר וטופס הראשונית לומן. לאחר כשישה ימי תרבות, מקלעת נימי-המים הפרימיטיבית תהיה גלויה בהידרוג'ל כאשר היא מוצגת במיקרוסקופ ברייטפילד (איור 2). לאחר הדמיה קבועה, מוכתם התא לאדן הידרוג'לים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (סרט 1, משלים סרט 1), התמונות מעיבוד מראש מומרים לשלד המאפשר ניתוח של האורך הכולל קישוריות של הרשת. מדדים כמותיים אלה יכולים לשמש לקביעת מערכת התנאים המיטבית להפקת רשתות כלי דם חזקות.

פרוטוקול זה מאפשר פיתוח של מקלעת נימי שלושה מימדים, הקשוב לרמזים הפיזיים והכימיים המקומיים. בעבודה קודמת, מערך רשת זה הוכח כרגיש לצפיפות מטריצה, קשיות מטריקס, עיכוב מטריצה מטפרוטאז, ואת סוג וריכוז של אנגיוגנטי שונים mitogens20,23.

Figure 1
איור 1: הדור של iPSC-EPs מתאי גזע פלאוריטי. (A) wicell 19-9-11 iPSCs, אשר מוכתם חיובי עבור Oct4, היו מתורבתים בינונית E8 בתוספת 10 Μm Y-27632 סלע מעכבי עבור 48 h. (ב) iPSCs המושרה אז עם 6 μm של CHIR99021 במדיום lasr בסיס עבור 48 h, בו בשלב התאים היו חיוביות. לברכיבורי, סמן מזועור (ג) התאים היו יותר מתורבתים במדיה הבזליים של lasr עד שהם הביעו CD34, סמן לושלתי אנדותל. (ד) בערך 15% – 25% מהתאים המובחנים הביעו CD34. כל פסי הסרגל מייצגים אורכים של 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדור והניתוח של רשתות של iPSC-EP וסקוללים קולגן הידרוג. (א) חתך רוחב של סביבת המיקרו-תלת-ממד המשמשת באותו מועד לקידום היווצרות רשת כלי דם מ-Ipsc-EPs. קולגן צף הידרוג'ל הוא הנזרע עם iPSC-EPs ונחשף EGM-2 בתוספת עם 50 ng/mL ומינון זמני של Y-27632. (ב) מקלעת הנימים המתקבלת מסועלת ביותר ומחוברים ביניהם, כפי שדמיינו באמצעות כתמים עם F-actin (ציאן). התמונה הקיימת, המוצגת משמאל, נוצרת על-ידי עיבוד מקדים עם ImageJ. מחסנית z זו מנותח באמצעות אלגוריתם שפותח בעבר, אשר שלד את הרשת (מוצג באוסף של קווים אדומים דקים) ולאחר מכן מנתח את טופולוגיית הרשת עבור סניפים (צהוב), נקודות קצה (כחול), ספינות מבודדים (שחור), ומחוברים ספינות (אדום). סרגל קנה המידה מייצג אורך של 100 m. (C) שינויים מורפולוגיים של ipsc-eps-לאדן קולגן הידרוג: 24 h לאחר זריעה, Ipsc-eps להישאר כדורית בתוך 96 h בהדרגה לקחת על פנוטיפ מוארך יותר. תוצאות התרבות הנוספות בהרכבת לומן-המכילות את רשת ה-VE-קדהרין, כפי שמוצג בכניסה בנקודת הזמן 144-h. פסי קנה המידה מייצגים אורכים של 400 μm; ירוק = VE-קדהרין, אדום = F-actin, וכחול = DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Movie 1
סרט 1: Z-מחסנית של ואצלב שנוצר מ-iPSC-EPs. רשתות כלי הדם היו קבועות, מוכתמות עם F-actin, ודמיינו על ידי רכישת z-ערימות על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. פרוסות הוכנסו במרווחי זמן של 17 יקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

משלים סרט 1: עיבוד תלת-ממד של כלי קיבול. רשתות כלי הדם היו קבועות, מוכתמות עם F-actin (אדום) ו-VE-קדהרין (ירוק), ודמיינו על ידי רכישת z-ערימות על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה כולל את התרבות הארוכת טווח של תאים בשלושה סוגים של מדיית תרבות התא: E8, LaSR בסיס ו-EGM-2. לכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי לעקר את כל החומרים. בנוסף, מעילי מעבדה וכפפות שעברו ניקוי אתנול צריכים תמיד להיות שחוקים כשעובדים במכסה הזרימה המבינארי של המעבדה. מומלץ לבדוק לעתים קרובות לזיהום mycoplasma; אם כמות גדולה של פסולת נצפתה במהלך תרבות iPSC או ירידה פתאומית ביעילות הבידול הוא ציין, זיהום mycoplasma הוא גורם סביר. iPSC-EPs שנוצר עם פרוטוקול זה נוטים להפקיד כמות משמעותית של ECM, אשר מתארך את זמן הדיסוציאציה וגורם השעיית התא היחיד להפריד לתוך גושים קטנים. אין להשתמש בטריפסין-אדטה (0.25%), מאחר והפתרון עלול לשבש את CD34 האפיליסקופים ב-iPSC-EPs. עם זאת, טיפול עם התמיסה הקולגן/הפתרון יכול להסיר ECM הופקד ולהקל על הדיסוציאציה עם פתרון התנתקות תא סטנדרטי. לאחר דיסוציאציה נרחבת, מספר גושים קטנים של תאים ו-ECM עשויים להישאר; להסיר את הגושים האלה עם טיפ P100, כפי שהם צפויים לסתום את מכשירי הטלפון או להפריע FACS.

התאים הגזע pluriפוטנטי רגישים הדיסוציאציה יעברו אפופטוזיס בהשעיה תא יחיד אלא אם מעכב סלע (בדרך כלל Y-27632) מתווסף למדיום24. iPSC-EPs הם גם רגישים לדיסוציאציה; כולל Y-27632 ב 10 μM עבור 24 h הראשון של התרבות הוא הכרחי כדי להגדיל את ההישרדות והתפשטות התא. לכן, יש לחשוב כי מעכב סלע נכלל הן ההידרוג'ל והן בינוני המקיף מיד לאחר FACS. צפיפות הזריעה של iPSC-EPs גם משפיעה באופן משמעותי על פיתוח הספינה ועל גודל הרשת הכולל. באופן כללי, ריכוז של 500,000 תאים/mL ל 3,000,000 תאים/mL הוא מגוון המתאים של הזריעה. גידול נוסף בצפיפות הזריעה מוביל לעתים קרובות לדחיסת הידרוג'ל ולמוות תאים.

הצפיפות של חלבונים מבניים ecm נמצא יש השפעה משמעותית על התפתחות של microvasculature לטורה25,26. בדרך כלל, הגדלת הצפיפות של הידרוג'ל מבוסס ECM (לעתים קרובות קולגן או פיברומין) מגביל את אורך הרשת של כלי הדם ואת הקישוריות. לכן, זה קריטי כי תשומת לב משולמת משולם צפיפות מטריקס קולגן; ריכוזים מתחת 2 מ"ג/mL מקדם את השפלה פרוטחרדה מוקדמת של הידרוג קולגן, אשר מביא לאובדן בלתי הפיך של השלמות המבנית של הידרוג'ל. לעומת זאת, ריכוזים מעל 4 מ"ג/mL לגרום היווצרות קצר, לומן רחב התערוכה קישוריות ירודה; הידרוג'ל דפורמביליות ושינוי בגודל הנקבוביות הם בעיקר אחראי על הדבר הזה20.

תאי הידרולים וקולגן לאדן התאים אינם לאגד את הלוחות האולטרה מצורף נמוך; ההידרוג נוטים להישאר מושעים בתקשורת ולעתים לצוף לראש הבאר. אם לוחיות הטיפול בתרבות הרקמה מועסקים בפרוטוקול זה, הושלתי המוטבעים יועברו לתחתית הבאר והוא יצור מונאולייר קרוב באופן שוטף בתחתית הצלחת. הירידה המתקבלת בצפיפות התא מעכבת את ההרכבה של ושלתי אלה לתוך רשתות תלת-ממד. בנוסף, אם הידרוג'ל מושלך לתוך הבארות של הצלחת תרבות הרקמה המטופלת, הם לאגד בחולשה את המשטח הפנימי של הבאר; מחייב זה מחיל את הלחץ על ההידרוג'ל. מאחר שפלטפורמה זו פותחה כדי לבודד את החשיבות של רמזים פיזיים וכימיים, זה קריטי כי אין כוחות זרים הנחיבות לתאים27. הידרו-ג'ל צף עלול להיות קשה להזנה משום שרוב מדיית התרבות התאית נמצאת מתחת להידרוג'ל; כדי להתגבר על זה, להטות את הצלחת ולהשתמש בפיפטה P100 כדי להסיר מדיה מצידו של הקיר.

בעת הדמיה של רשתות כלי הדם על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, זה קריטי לעקוב אחר כל הצעדים כביסה כדי להבטיח כי fluorophore עודף אינו גורם לאות נמוך יחס הרעש. זריחה עודפת עלולה לבלבל ברירת מחדל סף אלגוריתמים ולהפוך את מחסנית z קשה binarize. כדי להתגבר על בעיה זו, השתמש phalloidin, רעלן פטרייתי כי באופן סלקטיבי תוויות F-actin ומציג מוגבלת מחוץ ליעד הכריכה. באופן כללי, להשתמש בנוגדנים העיקרי שהיו מראש מעלה לנוגדן משני כדי להגביל את הריכוז של fluorophore חופשי כי מפזרת דרך ג'ל. כאשר מייצרים את ה-z-ערימות עומק פרוסה של 10-20 מיקרון מומלץ לאזן את הזמן הדרוש לרכישת z-מחסנית נגד הצורך בתמונה ברזולוציה גבוהה.

הנה מערכת כמותית כדי להעריך את הפוטנציאל הvas, של iPSC-EPs במיקרוסביבות תלת-ממד מתוארים. שיטת הפעולה הזאת משתמשת בתוכנת קוד פתוח ואינה מושפעת מחשבון המשתמש. ובכל זאת, הוא מייצג מודל יתר. של הנישה הפיזיולוגית של כלי הדם בעוד iPSC-EPs יכול להבדיל לתאים הדרושים עבור בוגרת, פונקציונלי תפקודית, שיטת זה מזניחה את התרומות של סוגי תאים אחרים (למשל, פיברוהגים ו מקרופאאגים) המשתתפים בתהליכים vasculature. יתרה מזאת, מערכת זו היא סטטית ואינה חושפת את כלי הפיתוח לזרום. בסופו של דבר, בעוד קולגן אני אחד החלבונים הדומיננטי ב ECM28 ושומר על הארכיטקטורה הfibrillar שלה בתוך מבחנה, זה תלוי הרבה והוא מוגבל ליצירת קשר פיזי חלש כאשר מנוטרל בטמפרטורות גבוהות. למרות מגבלות אלה, שיטת הפעולה הזו מייצגת צעד משמעותי קדימה בחיפוש אחר מהנדס וסקולרית פונקציונלי לטיפול במחלות לב וכלי דם ומידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (מענק מספר 15SDG25740035, הוענק J.Z.), המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי ו Bioהנדסאים (NIBIB) של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר EB007507, הוענק סיסי), ו הברית למחקר שיקום משובי & הדרכה (AR3T, גרנט מספר 1 P2C HD086843-01, הוענק J.Z.). ברצוני להכיר בפרופ ' ז'אן סטצ'ויאק (אוניברסיטת טקסס באוסטין) לעצתה הטכנית במיקרוסקופיה. אנחנו גם אסירי תודה על דיונים עם סמואל Mihelic (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר אלישיה אלן (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר ג ' ולי Rytlewski (ביוטכנולוגיה מסתגלת), וד ר ליאון Bellan (אוניברסיטת ואנדרבילט) על התובנה שלהם על אנליזה חישובית של רשתות תלת-מימד. לבסוף, אנו מודים לדר ' שיאופינג באו (אוניברסיטת קליפורניה בברקלי) על עצתו להבדיל iPSCs לתוך iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , In press (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , In press (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 147 תא גזע מחולל שורש אנדותל ואסיקולוגנזה מטריצה מינתאית קולגן אנליזה חישובית רשתות כלי שיט
מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In… More

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter