Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En in vitro 3D-modell och Computational pipeline för att kvantifiera den Vasculogenic potentialen hos iPSC-härledda endoteliala progenitorer

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

Endotelstamceller från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC-EPs) har potential att revolutionera hjärt-kärlsjukdom behandlingar och för att möjliggöra skapandet av mer trogna hjärt-kärlsjukdomar modeller. Häri, inkapsling av iPSC-EPs i tredimensionell (3D) kollagen mikromiljöer och en kvantitativ analys av dessa celler ' vasculogenic potential beskrivs.

Abstract

Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är en patient-specifik, proliferativ cell källa som kan differentiera till någon somatisk celltyp. Bipotenta endotelceller progenitorer (EPS), som kan differentiera till de celltyper som behövs för att montera mogen, funktionell kärl, har härletts från både embryonala och inducerade pluripotenta stamceller. Emellertid, dessa celler har inte rigoröst utvärderats i tredimensionella miljöer, och ett kvantitativt mått av deras vasculogenic potential förblir svårfångade. Här, generering och isolering av iPSC-EPs via fluorescerande-aktiverad cell sortering först beskrivs, följt av en beskrivning av inkapsling och kultur iPSC-EPs i kollagen hydrogels. Denna extracellulära matrix (ECM)-imitera mikromiljön uppmuntrar en robust vasculogenic svar; vaskulära nätverk bildas efter en veckas kultur. Skapandet av en datoriserad pipeline som använder öppen källkod för att kvantifiera detta vasculogenic svar är avgränsad. Denna pipeline är speciellt utformad för att bevara 3D-arkitekturen i kapillär plexus att robust identifiera antalet grenar, förgreningar punkter, och den totala nätverks längd med minimal indata från användaren.

Introduction

Mänskliga navel ven endotelceller (huvecs) och andra primära endotelceller celltyper har utnyttjats i två decennier för att modellera blodkärl gro och utveckling in vitro-1. Sådana vaskulära plattformar lovar att belysa molekylär och vävnad-nivå mekanismer för hjärt-kärlsjukdom och kan presentera fysiologiska insikt i utvecklingen av primitiva vaskulära nätverk2,3. Även om området vaskulär modellering har bevittnat betydande framsteg, en "Gold Standard"-analys som kvantitativt kan modellera och bedöma fysiologiska vaskulär utveckling förblir svårfångade. De flesta publicerade protokoll inte tillräckligt rekapitulera den vaskulära nisch för att uppmuntra bildandet av mogna, funktionella blodkärl eller inte har en metod för att kvantitativt jämföra vasculogenic potentialen hos de bedömda celltyper i tre dimensioner ( 3D).

Många nuvarande vaskulära modeller är begränsade i sin förmåga att efterlikna den fysiologiska vaskulära nisch. En av de vanligaste används in vitro-plattformar är gelatinös proteinblandning-baserade rör formation assay. Kortfattat, huvecs är seedade som enstaka celler på ett tunt lager av gel som består av proteiner skördas från murina sarkom extracellulära matrix (ECM); inom en till två dagar, HUVECs själv montera i primitiva rör4. Emellertid, denna process sker i två dimensioner (2D) och endotelceller (ECs) utnyttjas i denna analys inte bildar slutna, ihåliga lumen, vilket begränsar den fysiologiska betydelsen av dessa studier. Mer nyligen, ECs och stödjande celler (t. ex., mesenkymala stamceller (MSCS) och pericyter) har samodlas i 3D-mikromiljöer som simulerar den fibrösa arkitekturen hos den infödda ECM, såsom kollagen eller fibrin hydrogeler5. För att modellera vaskulär utveckling i denna mikromiljö, polymera pärlor belagda med ECs vanligtvis används6. Tillsats av exogena tillväxtfaktorer och/eller tillväxtfaktorer som utsöndras av andra celler som är inbäddade i Hydrogelen kan inducera ECs, belägga polymerpärlor, spira och bilda enkellumen. antalet och diametern på groddar och kärl kan sedan beräknas. Emellertid, dessa groddar är singular och inte bildar en sluten, anslutna nätverk som ses i fysiologiska förhållanden och därmed är mer påminner om en tumör kärlsystemet modell. Microfluidic enheter har också utnyttjats för att efterlikna den vaskulära nisch och att främja bildandet av kärl i EG-lastad hydrogeler7,8. Typiskt, en angiogen tillväxtfaktor-gradient appliceras på cirkulerande cellodlingsmedium för att inducera EG migration och Sprouting. ECs som utgör lumen av utvecklade fartyg är känsliga för skjuvning stress induceras av tillämpningen av vätskeflödet genom mikroflödessystem enheten; dessa mikrofluidiska enheter fångar därför viktiga fysiologiska parametrar som inte är tillgängliga i de statiska modellerna. Dessa enheter kräver dock kostsamma mikrofabrikationsförmågor.

Viktigast av allt, alla tre vaskulära modeller (2D, 3D, microfluidic) överväldigande utnyttja primära ECs samt primära stödjande celltyper. Primära celler kan inte utvecklas till en effektiv kardiovaskulär terapi eftersom cellerna skulle kunna skapa ett immunsvar vid implantation; Dessutom, HUVECs och liknande primära celltyper är inte patientspecifika och inte fånga vaskulära avvikelser som förekommer hos patienter med en genetisk disposition eller redan existerande hälsotillstånd, t. ex., diabetes mellitus. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har vuxit fram under det senaste decenniet som en patient-specifik, proliferativ cell källa som kan differentieras till alla somatiska celler i människokroppen9. I synnerhet har protokoll publicerats som beskriver generering och isolering av IPSC-härledda endotelceller progenitorer (IPSC-EPS)10,11; iPSC-EPs är bipotenta och kan därför ytterligare differentieras till endotelceller och glatta muskelceller/pericyter, byggstenarna i mogna, funktionell vasculature. Endast en studie har övertygande detaljerade utvecklingen av en primär kapillär plexus från iPSC-EPs i en 3D-mikromiljö12; även om denna studie är kritisk till en förståelse av iPSC-EP församling och differentiering i naturliga och syntetiska hydrogels, det inte kvantitativt jämföra nätverkstopologier av den resulterande vasculature. En annan nyligen studie har använt polymera pärla modell för att jämföra groning av huvecs och IPSC-härledda ECs5. Därför finns det ett tydligt behov av att ytterligare belysa de fysiska och kemiska signalmekanismerna som reglerar iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljöer och för att avgöra om dessa celler är lämpliga för ischemisk terapi och kardiovaskulär sjukdom Modellering.

Under det senaste decenniet har olika öppen källkod Computational pipelines och skeletonization algoritmer utvecklats för att kvantifiera och jämföra vaskulär nätverks längd och anslutning. Till exempel, charwat et al. utvecklat en Photoshop-baserad pipeline för att extrahera en filtrerad, binarized bild av vaskulära nätverk som härrör från en co-kultur av adipose-härledda stamceller och utväxt ECs i en fibrin matris13,14. Kanske den mest använda topologin jämförelseverktyg är AngioTool, ett program som publicerats på nätet av National Cancer Institute15; Trots programmets utbredda antagande och väldokumenterade Fidelity, är programmet begränsat till att analysera fartyg-liknande strukturer i två dimensioner och andra program, inklusive AngioSys och Wimasis, dela samma dimensionalitet begränsning16. Kraftfulla mjukvarupaket som Imaris, Lucis och METAMORPH har utvecklats för att analysera nätverkets topologi av konstruerad mikrovaskulatur; Dessa sviter är dock kostnads oöverkomliga för de flesta akademiska labb och begränsar åtkomsten till källkoden, vilket kan hindra slutanvändaren från att anpassa algoritmen till deras specifika program. 3D slicer, en öppen källkod magnetisk resonanstomografi/datortomografi paket, innehåller en vaskulär modellering Toolkit som effektivt kan analysera topologin av 3D vaskulära nätverk17; analysen är dock beroende av användaren manuellt placera slutpunkter i nätverket, vilket kan bli tråkigt när du analyserar en stor datauppsättning och kan påverkas av användarens undermedvetna fördomar. I detta manuskript beskrivs i detalj en beräkningspipeline som kan kvantifiera 3D-vaskulära nätverk. För att övervinna de ovan beskrivna begränsningarna, denna öppen källkod Computational pipeline använder ImageJ till pre-process förvärvade konfokala bilder för att ladda 3D-volym till en skelett analysator. Skeleton Analyzer använder en parallell medial axel gallring algoritm, och utvecklades ursprungligen av Kerschnitzki et al. att analysera längd och konnektivitet av osteocyte nätverk18; denna algoritm kan tillämpas effektivt för att karakterisera längd och konnektivitet av konstruerad mikrovaskulatur.

Sammantaget beskriver detta protokoll skapandet av mikrovaskulära nätverk i 3D-mikromiljöer och ger en öppen källkod och User-bias gratis Computational pipeline för att lätt jämföra vasculogenic potential iPSC-EPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. förberedelse av odlingsmedier och beläggningslösningar

  1. För att förbereda aktie beläggning lösning, späd aktie 1:100 i Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning (dpbs).
    FÖRSIKTIGHET: när utspädd, det rekommenderas inte att förvara denna lösning för framtida användning.
  2. Vid mottagande fenol rödfri, tillväxtfaktor reducerad gelatinös proteinblandning (se tabell över material) från tillverkaren, Tina på is vid 4 ° c tills blandningen är transparent och vätska. Håll blandningen på is i ett laminärt flöde huva, Pipettera 75 μL av blandningen i en 1,8 mL microcentrifug röret och frysa vid-20 ° c omedelbart. Dessa alikvoter kan lagras i upp till ett år.
    Varning: denna gelatinös proteinblandning blir mycket trögflytande när den hålls i rumstemperatur och kommer att stelna vid högre temperaturer. Håll denna lösning iskall.
  3. För att förbereda denna blandning för beläggning, Tina en 75 μL alikvot på is och späd med 6 mL iskall Dulbecco ' s modifierade Eagle medium: näringsämne blandning F-12 (DMEM/F12). Denna förberedd volym räcker för att belägga en 12 brunn pläterar.
  4. Förbered en 100 mg/ml stamlösning av askorbinsyra magnesium-2-fosfat (ett vitt frystorkat pulver) i ultrarent vatten genom att tillsätta 500 mg pulver till 5 ml vatten i en 10 ml glas scintillation injektionsflaska. Agitera med en röra bar tills lösningen är helt transparent (detta kan ta upp till en timme). Denna lösning kan förvaras vid-20 ° c i upp till ett år.
  5. Skapa en 10 mM lager av CHIR99021 (CHIR) genom att lösa 10 mg frystorkat pulver i 1,9928 mL dimetylsulfoxid (DMSO) i en 15 mL konisk centrifug röret och värma i en 37 ° c pärla (eller vatten) bad tills lösningen är transparent. Alikvot i 1,8 mL mikrocentrifugrör och förvaras vid-20 ° c i upp till ett år.
  6. Skapa en 10 mM lager av Y-27632, en sten hämmare (ROCKi), genom att lösa 10 mg frystorkat pulver i 3,1225 mL dimetylsulfoxid (DMSO) i en 15 mL koniskt centrifug röret och värma i en 37 ° c pärla (eller vatten) bad tills lösningen är transparent. Alikvot i 1,8 mL mikrocentrifugrör och förvaras vid-20 ° c i upp till ett år.
  7. För att förbereda Essential 8 (E8) medium, Tina frysta kosttillskott, tillsätt till 500 mL flaska basala mediet, och filter sterilisera. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c i upp till två veckor.
    FÖRSIKTIGHET: det är mycket viktigt att inte värma detta medium vid 37 ° c, eftersom proteinerna i medium formuleringen kan brytas ned med långvarig användning. I stället, hålla detta medium i rumstemperatur för 15 till 30 min före användning.
  8. För att bereda sorterings buffert, tillsätt 1,33 mL 7,5% bovint serum albumin (BSA) i DPBS och 200 μL av 0,5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till 48,5 mL DPBS för att skapa en slutlig lösning av 0,5% BSA och 2 mM EDTA.
  9. För att förbereda LaSR basal, tillsätt 300 μL av 100 mg/mL askorbinsyra magnesium-2-fosfat och 5 mL GlutaMAX till 500 mL avancerad DMEM/F12. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c i upp till en månad.
  10. För att förbereda endotelceller tillväxtmedium-2 (EGM-2), Tina kosttillskott och tillsätt till 500 mL flaska basala mediet. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° c i upp till en månad.
  11. För att förbereda blockeringsbuffert, tillsätt 500 mg frystorkat bovint serum albumin (BSA) och 50 μL av ett emulgerande reagens (se tabell över material) till 48 ml dpbs. Inkubera vid 37 ° c i minst 15 minuter för att säkerställa att BSA inte klumpar och därefter separerar från lösningen.

2. upptinning, underhåll och passaging av iPSCs

  1. Före upptinning av en kryopreserverad IPSC injektionsflaska, Täck en enda brunn på en 6-brunn tallrik med 1 ml aktie lösning (beredd enligt beskrivningen i steg 1,1). Inkubera i en h vid rumstemperatur. Låt inte denna beläggning lufttorka innan du lägger till E8 medium på plattan.
  2. För att Tina iPSCs, hämta en kryopreserverad injektionsflaska med iPSCs från lagringsbehållaren för flytande kväve och Tina vid 37 ° c tills en liten kristall av is återstår. Överför försiktigt (dropwise) innehållet i den tinade injektionsflaskan till ett 15 mL koniskt centrifugeringsrör som innehåller 8 mL iskall DMEM/F12. Tvätta den tinade injektionsflaskan med en tillsats av 1 mL iskall DMEM/F12 för att minimera cell förlusten. Centrifugera i 5 min vid 300 x g.
  3. I väntan på centrifugen, aspirera på aktie-lösningen och tillsätt 1 ml E8-medium (berett enligt beskrivningen i steg 1,6) till brunnen. Ta sedan bort den DMEM/F12 supernatanten från den centrifugerade koniska röret och åter avbryta pelleten i 1 mL av E8 medium. Överför cellerna till den nyligen belagda plattan, att vara säker på att agitera suspensionen för att förhindra att kolonierna från klumpar på sådd.
  4. Det finns vanligt verklig celldöd efter upptinning. Nästa morgon, ta bort mediet och Ersätt med färskt E8 medium.
    Obs: även under optimala förhållanden, iPSCs tenderar att återhämta sig dåligt från cryopreservation. Det rekommenderas att kryopreserve en nära-confluent 6-brunn för framtida sådd till en enda 6-brunn. Förekomst av cellfragment är normalt under de första 2-3 dagarna under cell återställningen.
  5. Byt ut E8 medium dagligen tills cellerna är klara för passaging (70% – 80% confluency).
  6. Till passage, Förbered först vitronectin-belagda brunnar (som beskrivs i steg 2,1).
    1. När vitronectin-belagda brunnar är klara (ca 1 h), aspirera E8 medium från brunn för att vara blint och tvätta två gånger med 1 ml dpbs. Inkubera med 1 mL 0,5 mM EDTA i 5 – 7 minuter vid 37 ° c. Medan inkuberingen, ta bort aktie-lösningen från den nyligen belagda brunnen och Ersätt med 1 – 2 ml E8-medium.
    2. Ta bort EDTA-lösningen från de brunnar som ska passas och lossa kolonierna genom att försiktigt tvätta en eller två gånger med 1 mL E8. Överför 75-200 μL cellsuspension till de nyligen belagda E8-innehållande brunnarna, agitera plattan för att säkerställa jämn täckning och placera i inkubatorn omedelbart.
      FÖRSIKTIGHET: inkubationstiden för iPSC avlossning är cell-line beroende; Det rekommenderas att användaren av detta protokoll testar en rad gånger vid tillräckligt expanderande en mottagna/genererade iPSC linje. 75 μL cellsuspension resulterar vanligen i 4 dagar mellan passager; 150 μL eller mer leder till 2 – 3 dagar mellan passager.

3. generering av iPSC-härledda endotelprogenitorer (figur 1).

  1. Vid underhåll av iPSCs, se till att kolonierna är väl packad och att det finns ett lågt antal differentierade celler i kulturen. Om kolonierna börjar komma i kontakt med varandra, är cellerna troligen för konfluenta och måste omedelbart passas.
  2. När iPSCs är 70%-80% confluent, Coat en 24-brunn tallrik med gelatinös protein blandningen (beredd enligt beskrivningen i 1.2/1.3). Pipettera 250 μL av denna blandning i varje brunn och förvara i 1 h vid rumstemperatur.
  3. Under ovanstående 1-h inkubering, ta bort E8 mediet och Y-27632 från kyl och frys, respektive. När E8 medium och Y-27632 uppnår rumstemperatur, Förbered E8 + ROCKi genom att tillsätta 13 μL 10 μM Y-27632 till 13 mL E8 i ett 15 mL koniskt centrifugerör.
  4. Avlägsna E8-mediet från iPSC-brunnarna, tvätta två gånger med 1 mL DPBS och inkubera sedan med 0,5 mM EDTA för 5-7 min vid 37 ° c. Efter inkubationstiden, ta bort EDTA och snabbt skjuvning cellerna i en encellig suspension med en P1000 pipett spets med 1 mL av E8 + ROCKi medium.
  5. Räkna cellerna med en hemocytometer. För en suspension som kan innehålla miljontals iPSCs, tillsätt 20 μL cellsuspension till 180 μL trypan Blue. Bestäm antalet totala celler i encellig suspension.
  6. Överför 0,432 x 106 till 1,296 x 106 celler (104 till 3 x 104 celler/cm2) till återstående E8 + Rocki-medium. Ta bort gelatinösa blandningen beläggning från den nyligen belagda 12-brunn plattan och tillsätt 500 μL cellsuspension till varje brunn, se till att cellerna är väl fördelade och inte bildar små klumpar.
    Anmärkning: detta intervall av tätheter är optimalt för differentiering av CD34 positiva celler; dessa sådd tätheter är dock cell linje beroende och kan behöva optimeras av användaren av detta protokoll.
  7. Efter 24 h av kultur, ersätta medium med 500 μL färskt E8 medium. Inkubera i ytterligare 24 timmar under samma betingelser.
  8. Ta bort E8-mediet och Ersätt med LaSR basal kompletterat med 6-12 μM CHIR99021. Denna tidspunkt definieras som D0 av differentiering. Efter 24 h kultur, Ersätt med samma cell odlingssubstrat.
    Obs: som tidigare beskrivits, mängden CHIR99021 läggs till detta medium kommer att bero på iPSC linjen utnyttjas. Testa en rad CHIR99021 koncentrationer för att säkerställa optimala resultat.
  9. Efter 48 h av inkubering med CHIR99021, Ersätt med 1 mL LaSR basal.
  10. Byt ut mediet dagligen med 2 mL LaSR basal för 2-3 ytterligare dagar. Vid denna tidpunkt (D5 differentiering), en betydande del av dessa celler kommer att uttrycka CD34 och kan karakteriseras som endoteliala stamceller. En schematisk del av detta protokoll beskrivs med representativa resultat i figur 1 och beskrivs i sin helhet av de utredare som först publicerade denna metod 11,19.
    Anmärkning: dessa endoteliala stamceller kan differentieras ytterligare längs en endotelial härstamning (35% – 99%) eller en smidig muskel härstamning (1% – 65%). Differentierings effektiviteten varierar beroende på vilken typ av ECM-beläggning och cell odlingsmediet som används vid differentiering 20.

4. FACS av endotelceller progenitorer

  1. Innan du separerar D5/D6 differentierade celler, Förbered sorteringsbuffert enligt beskrivningen i steg 1,8 och håll på isen.
  2. Inkubera de differentierade cellerna med 250 μL cell avskiljande lösning per brunn (se tabell över material) i 10 min vid 37 ° c.
  3. Separera cellerna med en P1000 pipett spetsen till en enda cellsuspension i cell avlossning lösning. Konsolidera cell-cell avlossning lösning blandningen i en 15 ml koniskt centrifug röret och Centrifugera i 5 min vid 300 x g.
  4. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera i 200 μL iskall sorterings buffert (beredd enligt beskrivningen i steg 1,7. Tillsätt 5 μL av den koncentrerade CD34-PE-antikroppen till avstängningen av cell sorterings bufferten och inkubera i 10 minuter vid 4 ° c.
  5. Återsuspendera i 5 mL iskall sorterings buffert. Filtrera denna suspension genom en cellsil med en 40 μm lock innan du placerar på Sorteraren.
  6. På lämplig fluorescerande kanal, sortera 10 000 celler som inte har märkts med en fluorescerande antikropp. Grind en region med hög fluorescerande intensitet som inte innehåller någon av dessa 10 000 celler (figur 1d). Detta kommer att fungera som en negativ kontroll.
  7. Körprovet som innehåller iPSC-EPs märkta med en fluorescerande lösning och börja sortera. CD34 uttrycks mycket i dessa endoteliala stamceller och är lätt skiljas från huvud populationen. Efter sortering ska lösningen överföras till ett 15 mL koniskt centrifugrör och Centrifugera i 5 min vid 300 x g. Ta bort supernatanten.
    Anmärkning: om lösningen är i ett rör som är större än ett mikrocentrifugrör (t. ex. en 5 mL polystyren tub som vanligen används i många FACs-protokoll), Återsuspendera den sorterade cellpelleten i 1 mL sorteringsbuffert och överför denna lösning till ett microcentrifugrör. Centrifugera vid 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
    1. Valfritt: om ytterligare iPSC-EP-karakterisering önskas, Lägg till andra primära antikroppar (t. ex. CD31-APC) samtidigt med CD34-PE. Se till att överhörning mellan olika Lysrörs kanaler minimeras.

5. inkapsling och långsiktig kultur av IPSC-EP-lastad kollagen hydrogeler

  1. Förbered sådd medium genom att tillsätta 40 μl av 10X medium 199 till 400 μl endotelial tillväxtmedium (EGM-2) kompletterat med 10 μm Y-27632 i en 1,8 ml microcentrifug och placera röret på isen.
    Obs: medan användningen av antibiotika avskräcks för stamcells odling och upprätthållande av differentierade celler, rekommenderas dosering med penna/STREP efter sortering eftersom det är svårt att garantera sterilitet i sorterings miljön (detta är mer Sorteraren delas mellan många laboratorier).
  2. Ta bort alla supernatanten från cellsuspensionen och tillsätt 200 μL av EGM-2 kompletterat med 10 μM Y-27632. Överför cellsuspensionen till sådd medium och blanda kraftigt.
  3. Tillsätt 350 μL kollagen till den lösning som bereds i steg 5,2 och blanda väl. Lösningen blir ljusgul.
    Obs: den slutliga koncentrationen av kollagen kan ha en betydande inverkan på bildandet av kapillär plexus. Detta protokoll förutsätter att kollagenet har levererats till 10 mg/mL och att hydrogeler har en slutlig koncentration på 3,5 mg/mL. Justera dessa volymer för att uppnå deras slutliga kollagen koncentration; Det rekommenderas att begränsa den slutliga kollagen koncentrationen från 2 mg/mL till 4 mg/mL.
  4. Tillsätt 5 μL 1M NaOH till den lösning som utarbetats i 5,3 och blanda väl, undvika införandet av luftbubblor. Lösningen blir ljust rosa.
  5. Pipettera över 56 μL neutraliserad kollagen cells lösning som bereds i 5,4 till enskilda brunnar i en 96-och ultra-låg fastsättning U-bottom cellkultur plattan. Inkubera vid 37 ° c i 30 min. Innan du lägger till media, kontrollera att cellerna har varit jämnt fördelade genom att undersöka proverna med ett brightfield Mikroskop.
  6. Bered 1 mL odlingssubstrat bestående av EGM-2 kompletterat med 10 μM Y-27632 och 50 ng/mL vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) genom att tillsätta 1 μL av varje stamlösning till ett microcentrifugerör. Efter blandning väl, Pipettera 100 μL av detta cell odlingssubstrat på de cell-lastade hydrogels. Överför plattan till 37 ° c för långsiktig kultur.
  7. Byt ut odlingsmediet dagligen, och Lägg till ytterligare angiogena tillväxtfaktorer eller småmolekylära hämmare som styrs av syftet med studien. För att optimalt ta bort media, luta plattan och använda en P100 tips för att försiktigt aspirera medium utan att störa hydrogel.

6. fixering, immunofärgning och visualisering av EP-baserade vaskulära nätverk

  1. Efter en veckas kultur, tillsätt 250 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) lösning till en 48-brunn tallrik. Fyll så många brunnar som det finns hydrogels. Ta bort mediet från hydrogeler (PFA) och Använd fintippade pincetter för att överföra hydrogeler till PFA som innehåller brunnar. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur och ta bort PFA genom att tvätta snabbt med PBS.
  2. Permeabilize genom att tillsätta 250 μL av 0,5% av ett nonioniskt ytaktivt ämne (se tabell över material) i 5 min vid rumstemperatur. Tvätta två gånger med 250 μL PBS kompletterad med 300 mM glycin. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter för varje tvättsteg för att säkerställa avlägsnande av överflödigt rengöringsmedel. Block genom att doppa hydrogeler i 250 μl blockerande buffert i 30 min.
  3. Inkubera med önskade primära antikroppar utspädda i blockerande buffert över natten vid 4 ° c. Till exempel, om immun färgning med phalloidin och VE-cadherin, späd 1:40 och 1:200, respektive, i blockerande buffert.
  4. Nästa dag, ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta två gånger med 0,5% emulgering reagens i DPBS. Täck med aluminiumfolie och inkubera med en artspecifik sekundär antikropp (t. ex. 1:200 Alexa fluor 488 i PBS) för 2 h vid rumstemperatur.
  5. Ta bort den sekundära antikroppslösningen och tvätta två gånger med 0,5% emulgering reagens i DPBS. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter för varje tvättsteg för att säkerställa avlägsnande av fria fluoroforer.
  6. För att visualisera cellkärnor, späd 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:10000 i PBS och tillsätt till provet (s).
    1. Inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur och tvätta två gånger med PBS. Inkubera i rumstemperatur i 5 minuter för varje tvättsteg för att säkerställa avlägsnande av fria fluoroforer.
  7. Överför proverna till en angiogenes μ-Slide eller en glasbottnig petriskål med fin tippad pincett. Se till att inga luftbubblor fastnar under Hydrogelen.
  8. Bild på ett konfokalmikroskop genom att förvärva z-stackar som sträcker sig från botten till toppen av provet. Se till att detektorn inte är mättad och att den lägsta förstoringen är i bruk (ett stort synfält är önskvärt).
    Observera: för framtida bearbetning, se till att z-stackarna sparas med minimal komprimering (t. ex.. CZI).

7. använda beräkningspipeline för att analysera och jämföra vaskulära nätverkstopologier

  1. Inspektera varje z-stack för att se till att sektorerna bara innehåller fartyg. Öppna z-stacken i ImageJ och förbättra kontrasten genom att klicka på bild > Justera ≫ ljusstyrka/kontrast. Fartygs gränserna är nu tydligt avgränsade och bakgrundsnivån är minimerad. Z-dimensionerna matchar ofta inte x/y-dimensionerna. För att rätta till detta, klicka på bild > Justera > storlek och ändra antalet z-skivor så att avståndet mellan varje segment motsvarar en pixel i x/y. imagej interpolerar automatiskt. Om det här steget inte utförs korrekt visas de slutgiltiga 3D-volymerna komprimerade.
    FÖRSIKTIGHET: ECs kommer att migrera mot kanterna av gelen och kommer att bilda små kuller Stens kolonier. Även om dessa är användbara för att uppskatta gränserna för hydrogel, kommer de att störa den slutliga bildanalys och bör raderas.
    Obs: ImageJ är en Java-baserad öppen källkod bildanalysprogram vara som utvecklats i samförstånd av National Institutes of Health och laboratoriet för optisk och Computational Instrumentation. Det rekommenderas att ladda ner Fiji, som helt enkelt ImageJ levereras med användbara plugins (https://fiji.sc/).
  2. I ImageJ, oskärpa bilden i 3-dimensioner Klicka på Process > filter ≫ Gaussian Blur 3D och sedan ställa in Sigma värden i alla 3 dimensioner till 2,0 (detta värde kan behöva justeras av slutanvändaren).
  3. I ImageJ, klicka på Process > binära > gör binär och välj sedan en lämplig tröskel-algoritm. Den Cross-Entropy tröskelvärde algoritm som utvecklats av Li et al. är effektiv i att separera fartyg från bakgrunden21. Beräkna tröskeln för varje bild och Ställ in bakgrunden på "default".
  4. I ImageJ, ta bort falska brus och fyll i "hål" i lumen genom att klicka på Process > brus > ta bort extremvärden.
    Obs: ta bort "Bright" extremvärden kommer att fylla i små hål i anslutna fartyg; ta bort "mörka" extremvärden kommer att avlägsna döda celler. Storleken på borttagningsradien varierar beroende på fartygens förstoring och storlek. För bilder som har förvärvats med ett brett fält mål som är 512 x 512 pixlar, kommer radier vanligtvis att variera från 4-6 pixlar.
  5. Bearbeta alla RAW (t. ex., CZI förlängning) filer och konvertera till. TIF-filer innan du fortsätter till steg 7,6. Till stöd i denna bearbetning, en ImageJ script, "Binarize och filter. IJM" har bifogats till detta manuskript.
  6. Spara de bearbetade. tif-filerna i samma mapp som filen "BatchProcessSkeleton. m", som kan hämtas i manuskriptet. Detta skript, som utvecklats av författarna, kallar de funktioner som publicerats av Phillip Kollmannsberger22 och bedriver ytterligare fil manipulation.
  7. Ladda ner och packa upp alla filer som är associerade med de två huvudfunktionerna "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) och "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Spara alla funktioner i samma mapp som den öppnade bearbetade z-stacken.
  8. Öppna en numerisk datormiljö med flera paradigm (se tabell över material) och navigera till mappen där alla filer som beskrivs ovan har sparats.
  9. Kör "BatchProcessSkeleton. m" antingen genom att skriva batchprocessskeleton i kommandofönstret eller genom att öppna skriptet och trycka på Run-knappen (högervänd grön pil) i redigeraren.
    Om du vill analysera en stor datamängd med ett enda kommando ska du kontrollera att strängen i dir -funktionen på rad 6 innehåller en asterisk (t. ex. *. tif). Ersätt i annat fall asterisken med filnamnet om analysen av en enskild fil önskas.
  10. Hur lång tid det här skriptet tar att köra kommer att variera avsevärt baserat på den tillgängliga datorkraften. Det rekommenderas att utföra denna analys på en dator med minst 8 GB RAM-minne så att användaren kan komma åt andra program medan skriptet körs.
    Försiktighet: även om det inte är absolut nödvändigt, grafräknare den ursprungliga konfokalmikroskopi förvärvet (i grått) och överliggande med denna bild matris med skelettet matris (i rött) kan hjälpa till att utvärdera prestandan hos skeletonization algoritm. Dessutom kan läsaren skapa en nodal graf, som genomförs av Kollmannsberger et al., för att utvärdera riktigheten av nätverksanalys. Skapa båda diagrammen, medan användbara, kommer att dramatiskt öka körningen av skriptet och kräver ytterligare minne; Om användaren helt enkelt kräver en slutlig topologi analys och inte vill visualisera datauppsättningen, helt enkelt kommentera ut rader 44 till 61 (Skeleton Graph) och linjer 104 till 143 (topologi Graph).
  11. Efter slutförandet, data Matrix, synlig i arbetsytan, innehåller nu bearbetade data. Dubbelklicka på data och öppna den här cellen i variabel redigeraren.
    1. Observera att denna matris kommer att innehålla, från vänster till höger: 1) filnamnet, 2) antalet noder (gren Poäng + slutpunkter), 3) filial poäng, 4) länkar (dvs fartyg), 5) nätverks längd (inklusive isolera fartyg), och 6) antalet skivor som finns i z-stacken. Spara dessa data som en CSV-fil och exportera för vidare analys till valfri programvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter differentiering (figur 1), FACS och inkapsling av IPSC-EPS i kollagen hydrogels, cellerna kommer vanligtvis att förbli rundade för 24 h innan du börjar att migrera och bilda initiala lumen. Efter ca 6 dagar av kultur, en primitiv kapillär plexus kommer att vara synlig i hydrogel när de ses med brightfield mikroskopi (figur 2). Efter avbildning den fasta, färgade cell-lastat hydrogeler på ett konfokala Mikroskop (film 1, kompletterande film 1), de förbehandlade bilderna omvandlas till ett skelett som möjliggör en analys av den totala längden och anslutningen av nätet. Dessa kvantitativa åtgärder kan sedan användas för att fastställa vilka villkor som är optimala för att producera robusta vaskulära nätverk.

Detta protokoll möjliggör utveckling av en robust, tredimensionell kapillär plexus som är lyhörd för lokala fysiska och kemiska signaler. I tidigare arbete har detta nätverk bildats visat sig vara känsligt för Matrix densitet, mat ris stelhet, Matrix metalloproteas hämning, och typ och koncentration av olika angiogena mitogener20,23.

Figure 1
Figur 1: generering av iPSC-EPS från pluripotenta stamceller. (A) wicell 19-9-11 iPSCs, som färgade positivt för Oct4, odlades i E8 medium kompletterat med 10 μm Y-27632 rock inhibitor för 48 h.B) iPSCs inducerades sedan med 6 ΜM CHIR99021 i LASR-basmedium för 48 h, varvid cellerna var positiva för Brachyury, en mesoderm markör. Ccellerna odlades ytterligare i LASR basal Media tills de uttryckte CD34, en markör för endotelceller progenitorer. Dungefär 15% – 25% av de differentierade CELLERNA uttryckt CD34. Alla skalstreck representerar längder på 200 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: generering och analys av iPSC-EP vaskulära nätverk i kollagen hydrogels. (A) ett tvärsnitt av 3D-mikromiljön som används i denna analys för att främja vaskulär nätverk bildas från IPSC-EPS. En flytande kollagen hydrogel är seedad med iPSC-EPs och utsätts för EGM-2 kompletteras med 50 ng/mL VEGF och en temporal dos av Y-27632. (B) den resulterande kapillärplexus är mycket förgrenade och sammankopplade, som visualiseras via färgning med F-Actin (cyan). Den binarized bilden, som visas till vänster, genereras av förbehandling med ImageJ. Denna z-stack analyseras sedan via en tidigare utvecklad algoritm, som skeletonizes nätverket (visas i en samling av tunna röda linjer) och sedan analyserar nätverkets topologi förgrenar (gul), ändpunkter (blå), isolerade fartyg (svart), och ansluten fartyg (röda). Skalstapeln representerar en längd på 100 m. (C) morfologiska förändringar av IPSC-EPS-lastad kollagen hydrogels: 24 h efter sådd förblir IPSC-EPS sfäriska och inom 96 h gradvis ta på en mer långsträckt fenotyp. Ytterligare kultur resulterar i montering av lumen-innehållande VE-cadherin nätverk, som visas i infällt vid 144-h tid punkt. Skalstaplarna representerar längder på 400 μm. grön = VE-cadherin, röd = F-Actin, och blå = DAPI. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Movie 1
Film 1: Z-stack av VASCULATURE genereras från iPSC-EPS. Vaskulära nätverk fastställdes, färgas med F-Actin, och visualiseras genom att förvärva z-stackar på ett konfokala Mikroskop. Skivor förvärvades med 17 μm mellanrum. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Kompletterande film 1:3D-rendering av fartyg. Vaskulära nätverk fastställdes, färgas med F-Actin (röd) och VE-cadherin (grön), och visualiseras genom att förvärva z-stackar på ett konfokala Mikroskop. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll innebär en långsiktig kultur av celler i tre typer av cell odlingsmedier: E8, LaSR basal och EGM-2. Därför bör stor försiktighet iakttas för att på lämpligt sätt sterilisera alla material. Dessutom bör labb rockar och etanol-rengjorda handskar alltid bäras när du arbetar i laboratoriets laminärt flöde huva. Det rekommenderas att ofta testa för Mycoplasma kontamination; om en stor mängd skräp observeras under iPSC kultur eller en plötslig minskning av differentiering effektivitet noteras, Mycoplasma kontaminering är en sannolik orsak. iPSC-EPs genereras med detta protokoll tenderar att deponera en betydande mängd ECM, som förlänger dissociation tid och orsakar den enda cellsuspensionen att separera i små klumpar. Använd inte trypsin-EDTA (0,25%), eftersom lösningen kan störa CD34 epitoper på IPSC-EPS. Emellertid, behandling med kollagenase/dispase lösning kan ta bort deponerade ECM och underlätta dissociation med en standard cell avlossning lösning. Efter omfattande dissociation, några små klumpar av celler och ECM kan förbli; ta bort dessa klumpar med en P100 pipett spets, eftersom de är benägna att täppa till cellen silar eller störa FACS.

Pluripotenta stamceller är känsliga för dissociation och kommer att genomgå apoptos i en encellig suspension såvida inte en berg hämmare (vanligen Y-27632) tillsätts till mediet24. iPSC-EPs är också känsliga för dissociation; inklusive Y-27632 på 10 μM för de första 24 h kultur är absolut nödvändigt att öka cellöverlevnad och proliferation. Därför är det viktigt att en berg hämmare ingår i både hydrogel och omgivande medium omedelbart efter FACS. Sådd tätheten av iPSC-EPs påverkar också avsevärt fartygs utvecklingen och den totala nätverks storleken. I allmänhet är en koncentration av 500 000 celler/mL till 3 000 000 celler/mL ett lämpligt intervall av sådd tätheter. En ytterligare ökning i sådd densitet leder ofta till hydrogel kompakthet och celldöd.

Densiteten av ECM strukturella proteiner har visat sig ha en betydande inverkan på utvecklingen av konstruerade mikrovaskulaturen25,26. Generellt ökar tätheten av en ECM-baserad hydrogel (ofta kollagen eller fibrin) begränsar vaskulär nätverkets längd och anslutning. Därför är det viktigt att noggrann uppmärksamhet ägnas åt kollagen matrisens densitet; koncentrationer under 2 mg/mL främjar den för tidiga proteolytiska nedbrytningen av kollagenhydrogels, vilket resulterar i en irreparabel förlust av hydrogels strukturella integritet. Däremot, koncentrationer över 4 mg/mL inducera bildandet av korta, breda lumen som uppvisar dålig konnektivitet; hydrogel deformability och en förändring i porstorlek är i första hand ansvarig för denna upphävande20.

Acellulära och cell-lastad kollagen hydrogeler binder inte till Ultra-låga fästplattor; hydrogeler tenderar att förbli suspenderade i media och kommer ibland flyta till toppen av brunnen. Om vävnadsodling-behandlade plattor används i detta protokoll, kommer de inbäddade progenitorerna migrera till botten av brunnen och kommer att bilda en nära konfluenta enskiktslager på botten av plattan. Den resulterande minskningen i cell sådd densitet hämmar monteringen av dessa progenitorer i 3D-nätverk. Dessutom, om hydrogeler kastas i brunnarna av en vävnadskultur behandlade plattan, de kommer svagt binda den inre ytan av brunnen; Denna bindning applicerar stam till Hydrogelen. Eftersom denna plattform utvecklades för att isolera vikten av fysiska och kemiska signaler, är det viktigt att inga främmande krafter förmedlas till cellerna27. De flytande hydrogeler kan vara svåra att mata eftersom de flesta av cellkulturen Media ligger under hydrogel; för att övervinna detta, luta plattan och använda en P100 pipett för att ta bort media från sidan av väggen.

Vid avbildning av vaskulära nätverk på ett konfokala Mikroskop, är det viktigt att följa alla tvättsteg för att säkerställa att överflödig fluorophore inte resulterar i en låg signal-brus-förhållande. Överskott fluorescens kan förvirra standard tröskelvärde algoritmer och göra z-stacken svårt att binarisera. För att övervinna denna fråga, använda phalloidin, ett svamptoxin som selektivt etiketter F-Actin och visar begränsad off-målbindning. Använd i allmänhet primära antikroppar som har förkonjugerat till en sekundär antikropp för att begränsa koncentrationen av fri fluorofore som sprider sig genom gelen. Vid generering av z-stackar ett segment djup på 10-20 mikrometer rekommenderas för att balansera den tid som behövs för att förvärva en z-stack mot behovet av en högupplöst bild.

Här beskrivs en kvantitativ analys för att bedöma den vasculogenic potentialen hos iPSC-EPs i 3D-mikromiljöer. Denna analys använder programvara med öppen källkod och påverkas inte av användarens fördomar. Fortfarande, det representerar en förenklad modell av fysiologiska vaskulära nisch. Medan iPSC-EPs kan differentiera i de celler som behövs för mogna, funktionell kärl, denna analys försummar bidragen från andra celltyper (t. ex. fibroblaster och makrofager) som deltar i vasculogenic processer. Dessutom är detta system statiskt och utsätter inte utvecklings fartygen för att flöda. Slutligen, medan kollagen jag är en av de dominerande proteiner i ECM28 och upprätthåller sin fibrillar arkitektur in vitro, det är mycket beroende och är begränsad till svaga fysiska tvärbindning när neutraliseras vid höga temperaturer. Trots dessa begränsningar, denna analys utgör ett betydande steg framåt i strävan att ingenjör funktionell kärl för hjärt-kärlsjukdom terapi och modellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av American Heart Association (Grant nummer 15SDG25740035, tilldelas J.Z.), det nationella institutet för biomedicinsk avbildning och bioteknik (NIBIB) av National Institutes of Health (Grant nummer EB007507, tilldelas CC), och Alliansen för regenerativ rehabilitering forskning & utbildning (AR3T, Grant nummer 1 P2C HD086843-01, tilldelas J.Z.). Vi vill tacka prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas i Austin) för hennes tekniska råd om konfokalmikroskopi. Vi är också tacksamma för diskussioner med Samuel Mihelic (University of Texas i Austin), Dr. Alicia Allen (University of Texas i Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), och Dr Leon Bellan (Vanderbilt University) för sin insikt om beräknings analys av 3D-nätverk. Slutligen tackar vi Dr Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) för hans råd om att differentiera iPSCs till iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , In press (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , In press (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 147 stamceller endotelial progenitor vasculogenes extracellulär matris kollagen beräknings analys fartygs nätverk
En in vitro 3D-modell och Computational pipeline för att kvantifiera den Vasculogenic potentialen hos iPSC-härledda endoteliala progenitorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In… More

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter