Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En in vitro 3D-model og beregnings ledning til kvantificering af det Vasculogeniske potentiale af iPSC-afledte Endotelafprogenitorer

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

Endotheliale progenitorer afledt af inducerede pluripotente stamceller (iPSC-EPs) har potentialet til at revolutionere kardiovaskulære sygdoms behandlinger og gøre det muligt at skabe mere trofaste kardiovaskulære sygdomsmodeller. Heri beskrives indkapsling af iPSC-EPs i tredimensionale (3D) kollagenmikromiljøer og en kvantitativ analyse af disse cellers vasculogeniske potentiale.

Abstract

Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentiere sig til enhver somatisk celletype. Bipotente endotheliale progenitorer (EPs), som kan differentiere sig i de celletyper, der er nødvendige for at samle moden, funktionel vaskulatur, er afledt af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller. Men, disse celler er ikke blevet nøje evalueret i tredimensionale miljøer, og en kvantitativ måling af deres vasculogenic potentiale forbliver undvigende. Her er generering og isolering af iPSC-EPs via fluorescerende aktiveret celle sortering først skitseret, efterfulgt af en beskrivelse af indkapsling og kultur af iPSC-EPs i kollagen hydrogels. Dette ekstracellulære matrix (ECM)-mimicking mikromiljø tilskynder en robust vasculogenic respons; vaskulære netværk danner efter en uges kultur. Oprettelsen af en beregningsmæssige pipeline, der udnytter open source-software til at kvantificere denne vasculogenic respons er afgrænset. Denne rørledning er specielt designet til at bevare den 3D-arkitektur af kapillar plexus til robust at identificere antallet af grene, forgrenings punkter, og den samlede netværks længde med minimal brugerinput.

Introduction

Humane navle formede vene endotelceller (HUVECs) og andre primære endotelcelle typer er blevet udnyttet i to årtier til model blodkar spiring og udvikling in vitro1. Sådanne vaskulære platforme lover at belyse molekylære og vævs-niveau mekanismer af hjerte-kar-sygdom og kan præsentere fysiologisk indsigt i udviklingen af primitive vaskulære netværk2,3. Selvom feltet af vaskulær modellering har været vidne til betydelige fremskridt, en "guld standard" assay, der kan kvantitativt model og vurdere fysiologiske vaskulære udvikling forbliver undvigende. De fleste offentliggjorte protokoller ikke i tilstrækkelig grad rekapitulere den vaskulære niche til at fremme dannelsen af modne, funktionelle blodkar eller ikke har en metode til kvantitativt at sammenligne vasculogenic potentiale af de vurderede celletyper i tre dimensioner ( 3D).

Mange nuværende vaskulære modeller er begrænset i deres evne til at efterligne den fysiologiske vaskulære niche. En af de mest almindeligt anvendte in vitro-platforme er den gelatinøse protein blandings baserede rørdannelses analyse. Kort, HUVECs er seedet som enkeltceller på et tyndt lag af gel, der består af proteiner høstet fra murine sarkom ekstracellulær matrix (ECM); inden for en til to dage, HUVECs selv samles i primitive rør4. Denne proces forekommer dog i to dimensioner (2D), og endotelcellerne (ECs), der anvendes i denne analyse, danner ikke indesluttet, hule lumen og begrænser derved den fysiologiske betydning af disse undersøgelser. For nylig er ECs og understøttende celler (f. eks. mesenchymal stamceller (MSCS) og pericytes) blevet Co-dyrket i 3D-mikromiljøer, der simulerer den lokale ECM-fiber arkitektur, såsom kollagen eller fibrin silicagelrogeler5. At modellere vaskulære udvikling i dette mikromiljø, polymere perler belagt med ECs er typisk ansat6. Tilføjelsen af eksogene vækstfaktorer og/eller vækstfaktorer udskillet af andre celler interstitielt indlejret i hydrogel kan inducere ECs, belægning af polymere perler, at spire og danne enkelt lumen; antallet og diameteren af spirer og fartøjer kan derefter beregnes. Men disse spirer er ental og ikke danner en lukket, forbundet netværk som ses i fysiologiske forhold og dermed er mere minder om en tumor Vaskulaturen model. Microfluidic enheder er også blevet udnyttet til at efterligne den vaskulære niche og til at fremme dannelsen af Vaskulaturen i EC-laden silicagelrogeler7,8. Typisk påføres en angiogen vækstfaktor-gradient på det cirkulerende cellekulturmedium for at inducere EF-migration og spiring. ECs, der udgør lumen af udviklede fartøjer er følsomme over for forskydnings stress induceret af anvendelsen af fluid flow gennem mikrofluidisk enhed; således, disse mikrofluidisk enheder fange vigtige fysiologiske parametre, der ikke er tilgængelige i de statiske modeller. Men, disse enheder kræver dyre mikrofabrikation evner.

Vigtigst af alt, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, microfluidic) overvældende udnytte primære ECs samt primære understøttende celletyper. Primære celler kan ikke udvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling, fordi cellerne vil skabe en immunrespons ved implantation; Desuden er Huvec'er og lignende primære celletyper ikke patientspecifikke og indfanger ikke vaskulære abnormaliteter, der forekommer hos patienter med genetisk disposition eller allerede eksisterende helbredstilstande, f. eks. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er dukket op i det seneste årti som en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentieres i alle somatiske celler i den menneskelige krop9. Navnlig er der offentliggjort protokoller, som skitserer dannelse og isolering af iPSC-afledte endotelorer (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være yderligere differentieret i endotelceller og glatte muskelceller/pericytes, byggestenene i moden, funktionel vaskulatur. Kun én undersøgelse har overbevisende beskrevet udviklingen af en primær kapillar plexus fra iPSC-EPs i et 3D-mikromiljø12; selv om denne undersøgelse er afgørende for en forståelse af iPSC-EP forsamling og differentiering i naturlige og syntetiske hydrogels, det ikke kvantitativt sammenligne nettopologier af den resulterende Vaskulaturen. En anden nylig undersøgelse har brugt den polymere perle model til at sammenligne spiring af HUVECs og iPSC-afledte ECs5. Derfor er der et klart behov for yderligere at belyse de fysiske og kemiske signalerings mekanismer, der regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljøer, og for at afgøre, om disse celler egner sig til iskæmisk behandling og Kardiovaskulær sygdom Modellering.

I det seneste årti, forskellige open-source beregningsmæssige pipelines og skeletonization algoritmer er blevet udviklet til at kvantificere og sammenligne vaskulære netværk længde og tilslutningsmuligheder. For eksempel, charwat et al. udviklet en Photoshop-baserede pipeline til at udtrække en filtreret, binarized billede af vaskulære netværk afledt af en co-kultur af Adipose-afledte stamceller og udvækst ECs i en fibrin matrix13,14. Måske den mest udbredte topologi sammenligning værktøj er AngioTool, et program offentliggjort online af National Cancer Institute15; på trods af programmets udbredte vedtagelse og veldokumenteret troskab, programmet er begrænset til at analysere fartøj-lignende strukturer i to dimensioner og andre programmer, herunder AngioSys og Wimasis, deler den samme dimensionalitet begrænsning16. Kraftfulde software suiter som Imaris, Lucis og Metamorph er blevet udviklet til at analysere netværkstopologien af manipuleret mikrovaskulatur; men disse suiter er cost-prohibitive for de fleste akademiske laboratorier og begrænse adgangen til kildekoden, som kan hæmme muligheden for slutbrugeren til at tilpasse algoritmen til deres specifikke anvendelse. 3D slicer, en open source magnetisk resonans imaging/computertomografi pakke, indeholder en vaskulær modellering Toolkit, der effektivt kan analysere topologi af 3D vaskulære netværk17; Men, analysen er afhængig af brugeren manuelt placere slutpunkter af netværket, som kan blive kedelig, når du analyserer et stort datasæt og kan påvirkes af brugerens underbevidste bias. I dette manuskript er en beregnings pipeline, der kan kvantificere 3D-vaskulære netværk, beskrevet i detaljer. For at overvinde de ovenfor skitserede begrænsninger, bruger denne open source Computational pipeline ImageJ til at forbehandle erhvervede confokale billeder for at indlæse 3D-volumen i en skelet analysator. Skelet analysatoren bruger en parallel mediale-akse udtynding algoritme, og blev oprindeligt udviklet af Kerschnitzki et al. at analysere længden og forbindelsen af osteocyte Networks18; denne algoritme kan effektivt anvendes til at karakterisere længden og konnektivitet af manipuleret microvasculature.

I alt, denne protokol skitserer oprettelsen af microvaskulære netværk i 3D mikromiljøer og giver en open-source og User-bias gratis Computational pipeline til let sammenligne vasculogenic potentiale af iPSC-EPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af kultur medier og belægnings opløsninger

  1. For at tilberede vitronectin-belægnings opløsningen fortyndes vitronectin 1:100 i Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (DPBS).
    Forsigtig: når det er fortyndet, anbefales det ikke at opbevare denne løsning til fremtidig brug.
  2. Ved modtagelse af phenolfri vækstfaktor-reduceret gelatinøs protein blanding (Se tabel over materialer) fra producenten, tø på is ved 4 °c, indtil blandingen er gennemsigtig og flydende. Hvis blandingen holdes på is i en laminar flow hætte, pipetteres 75 μL af blandingen i et 1,8 mL mikrocentrifuge glas, og der fryses straks ved-20 °C. Disse aliquoter kan lagres i op til et år.
    Forsigtig: denne gelatinøse protein blanding bliver meget viskøs, når den opbevares ved stuetemperatur og vil størkne ved højere temperaturer. Hold denne løsning iskold.
  3. For at tilberede denne blanding til belægning, tø en 75 μL alikvot på is og fortyndes med 6 mL iskold Dulbecco's modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F-12 (DMEM/F12). Denne forberedte volumen er nok til at belægge en 12 brønd plade.
  4. Forbered en 100 mg/ml stamopløsning af ascorbinsyre magnesium-2-phosphat (et hvidt frysetørret pulver) i ultrarent vand ved at tilsætte 500 mg pulver til 5 ml vand i et 10 ml glas scintillationshætte glas. Omrystning med en røre stang, indtil opløsningen er helt gennemsigtig (dette kan tage op til en time). Denne opløsning kan opbevares ved-20 °C i op til et år.
  5. Opret et 10 mM lager af CHIR99021 (CHIR) ved at opløse 10 mg frysetørret pulver i 1,9928 mL dimethylsulfoxid (DMSO) i et 15 mL konisk centrifugeglas og varm i et 37 °C perle (eller vand) bad, indtil opløsningen er gennemsigtig. Alikvot i 1,8 mL mikrocentrifuge glas og opbevares ved-20 °C i op til et år.
  6. Opret et 10 mM lager af Y-27632, en klippe hæmmer (ROCKi), ved at opløse 10 mg frysetørret pulver i 3,1225 mL dimethylsulfoxid (DMSO) i et 15 mL konisk centrifugeglas og varm i en 37 °C perle (eller vand) bad, indtil opløsningen er gennemsigtig. Alikvot i 1,8 mL mikrocentrifuge glas og opbevares ved-20 °C i op til et år.
  7. For at forberede essentielle 8 (E8) medium, Tø frosne kosttilskud, tilsættes til 500 mL flaske basal medium, og filter sterilisere. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til to uger.
    Forsigtig: det er meget vigtigt ikke at varme dette medium ved 37 °C, da proteinerne i medium formuleringen kan nedbrydes med langvarig brug. Opbevar i stedet dette medium ved stuetemperatur i 15 til 30 minutter før brug.
  8. For at forberede sorterings buffer tilsættes 1,33 mL 7,5% bovint serumalbumin (BSA) i DPBS og 200 μL af 0,5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) til 48,5 mL DPBS for at skabe en endelig opløsning af 0,5% BSA og 2 mM EDTA.
  9. For at tilberede LaSR basal tilsættes 300 μL af 100 mg/mL ascorbinsyre magnesium-2-phosphat og 5 mL GlutaMAX til 500 mL fremskreden DMEM/F12. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til en måned.
  10. For at forberede endotel cellevækst medium-2 (EGM-2), tø kosttilskud og tilsæt til 500 mL flaske basal medium. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C i op til en måned.
  11. For at forberede blokerende buffer tilsættes 500 mg lyofiliseret bovint serumalbumin (BSA) og 50 μL af et emulgerings reagens (Se tabel over materialer) til 48 ml dpbs. Der inkubates ved 37 °C i mindst 15 minutter for at sikre, at BSA ikke klumper sig og efterfølgende adskilles fra opløsningen.

2. optøning, vedligeholdelse og passaging af iPSCs

  1. Før optøning af et kryopræserverede IPSC hætteglas, frakke en enkelt brønd af en 6-brønd plade med 1 ml vitronectin opløsning (forberedt som beskrevet i trin 1,1). Inkuber i en h ved stuetemperatur. Lad ikke denne belægning lufttørre, før du tilføjer E8 medium til pladen.
  2. For at tø iPSCs skal du hente et kryopreserveret hætteglas med iPSCs fra dets flydende kvælstof opbevaringsbeholder og tø ved 37 °C, indtil der er en lille krystal af is tilbage. Forsigtigt (dropwise) overføre indholdet af det optøede hætteglas til et 15 mL konisk centrifugeglas indeholdende 8 mL iskold DMEM/F12. Skyl det optøede hætteglas med en tilsætning 1 mL iskold DMEM/F12 for at minimere celle tabet. Centrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
  3. Mens du venter på centrifugen, skal du aspirere vitronectin-opløsningen og tilføje 1 mL E8-medium (forberedt som beskrevet i trin 1,6) til brønden. Derefter skal du fjerne DMEM/F12-supernatanten fra det centrifugeret koniske rør og igen suspendere pellet i 1 mL E8 medium. Overfør cellerne til den nybelagte plade, og sørg for at agitere suspensionen for at forhindre kolonierne i at klumpe ved såning.
  4. Der er normalt en betydelig celledød efter optøning. Næste morgen, Fjern mediet og Udskift med frisk E8 medium.
    Bemærk: selv under optimale forhold har iPSCs en tendens til at komme sig dårligt fra cryopreservation. Det anbefales at embryonog en Near-confluent 6-godt for fremtidig såning i en enkelt 6-Well. Tilstedeværelsen af cellerester er normal i de første 2-3 dage under celle genvinding.
  5. Udskift E8 medium dagligt, indtil cellerne er klar til passaging (70%-80% konfluency).
  6. Til passage, skal du først tilberede vitronectin-coatede brønde (som beskrevet i trin 2,1).
    1. Når vitronectin-coatede brønde er klar (ca. 1 time), skal du aspirere E8 medium fra brønd til at blive urerne og vaske to gange med 1 ml dpbs. Inkuber med 1 mL 0,5 mM EDTA i 5 – 7 minutter ved 37 °C. Under inkubeering fjernes vitronectin-opløsningen fra det nybelagte brønd og udskiftes med 1 – 2 mL E8-medium.
    2. Fjern EDTA-opløsningen fra brøndene for at blive urerne, og Løsn kolonierne ved forsigtigt at vaske en eller to gange med 1 ml E8. Overfør 75-200 μL cellesuspension til de frisk belagte E8-holdige brønde, omryp pladen for at sikre en jævn dækning, og Placer den straks i inkubator.
      Forsigtig: inkubationstiden for iPSC-løsrivelse afhænger af celle linjen. Det anbefales, at brugeren af denne protokol tester en række gange, når en modtaget/genereret iPSC-linje er tilstrækkeligt udvidet. 75 μL cellesuspension resulterer generelt i 4 dage mellem passager; 150 μL eller mere fører til 2 – 3 dage mellem passager.

3. generation af iPSC-afledte endotheliale progenitorer (figur 1).

  1. Når du vedligeholder iPSCs, skal du sørge for, at kolonierne er godt komprimeret, og at der er et lavt antal differentierede celler i kulturen. Hvis kolonierne begynder at kontakte hinanden, er cellerne sandsynligvis for flydende og skal omgående være urerne.
  2. Når ipscs er 70%-80% konflydende, frakke en 24-brønd plade med gelatinøse protein blanding (udarbejdet som beskrevet i 1.2/1.3). Afpipetteres 250 μL af blandingen i hver brønd og opbevares i 1 time ved stuetemperatur.
  3. Under den ovennævnte 1-h inkubation fjernes E8-mediet og Y-27632 fra henholdsvis køleskab og fryser. Når E8 medium og Y-27632 opnår stuetemperatur, skal du tilberede E8 + ROCKi ved at tilføje 13 μL 10 μM Y-27632 til 13 mL E8 i et 15 mL konisk centrifugeglas.
  4. Fjern E8-mediet fra iPSC-brøndene, vask to gange med 1 mL DPBS, og Inkuber derefter med 0,5 mM EDTA i 5-7 min ved 37 °C. Efter inkubationstiden skal du fjerne EDTA og hurtigt forskyde cellerne i en enkelt cellesuspension med en P1000-pipettespids med 1 mL E8 + ROCKi-medium.
  5. Tæl cellerne med et hemocytometer. For en suspension, der kan indeholde millioner af iPSCs, tilsættes 20 μL cellesuspension til 180 μL trypan og et blå. Bestem antallet af samlede celler i enkelt cellesuspensionen.
  6. Overfør 0,432 x 106 til 1,296 x 106 celler (104 til 3 x 104 celler/cm2) til det resterende E8 + rocki medium. Fjern den gelatinøse blandings belægning fra den nybelagte 12-brønd plade, og tilsæt 500 μL cellesuspension til hver brønd, hvilket sikrer, at cellerne er velfordelte og ikke danner små klumper.
    Bemærk: denne vifte af tætheder er optimal til differentiering af CD34 positive celler; disse såning tætheder er dog cellelinje afhængige og skal muligvis optimeres af brugeren af denne protokol.
  7. Efter 24 timers kultur, Udskift medium med 500 μL frisk E8 medium. Inkuber i yderligere 24 timer under de samme betingelser.
  8. Fjern E8 mediet, og Udskift det med LaSR basal suppleret med 6-12 μM CHIR99021. Dette tidspunkt er defineret som d0 af differentiering. Efter 24 h af kultur, erstatte med den samme cellekulturmedium.
    Bemærk: som beskrevet tidligere vil mængden af CHIR99021, der er føjet til dette medium, afhænge af den anvendte iPSC-linje. Test en række CHIR99021 koncentrationer for at sikre optimale resultater.
  9. Efter 48 h inkubation med CHIR99021, Udskift med 1 mL LaSR basal.
  10. Udskift mediet dagligt med 2 mL LaSR basal i 2-3 ekstra dage. På dette tidspunkt (D5 af differentiering), en betydelig del af disse celler vil udtrykke CD34 og kan karakteriseres som endotheliale forfædre. En skematisk af denne protokol er skitseret med repræsentative resultater i figur 1 og beskrevet fuldt ud af de efterforskere, der først offentliggjort denne metode 11,19.
    Bemærk: disse endotelorer kan differentieres yderligere langs en endotel afstamning (35% – 99%) eller en glat muskulatur afstamning (1% – 65%). Differentierings effektiviteten varierer afhængigt af typen af ECM-belægning og det celle dyrkningsmedium, der anvendes under differentieringen 20.

4. FACER af endotheliale progenitorer

  1. Før du dissocierer de differentierede celler D5/D6, skal du forberede sorterings bufferen som beskrevet i trin 1,8 og holde på is.
  2. De differentierede celler inkuberes med 250 μL celle løsrivelse pr. brønd (Se tabel over materialer) i 10 min ved 37 °c.
  3. Dissociér cellerne med en P1000-pipettespids i en enkelt cellesuspension i celle løsrivelse. Saml cellen celle løsningens løsrivelse i et 15 mL konisk centrifugeglas og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g.
  4. Supernatanten fjernes og resuspenderes i 200 μL iskold sorterings buffer (fremstillet som beskrevet i trin 1,7. Tilsæt 5 μL af det koncentrerede CD34-PE-antistof til celle sorterings buffer suspensionen og Inkuber i 10 min ved 4 °C.
  5. Re-suspendere i 5 mL iskold sorterings buffer. Denne suspension filtreres gennem en celle-si med en 40 μm-hætte, før den placeres på sorteringsområdet.
  6. På den relevante fluorescerende kanal, sortere 10.000 celler, der ikke er blevet mærket med et fluorescerende antistof. Gate en region med en høj fluorescerende intensitet, der ikke indeholder nogen af disse 10.000 celler (figur 1d). Dette vil tjene som en negativ kontrol.
  7. Kør eksemplet med iPSC-EPs, der er mærket med en fluorescerende opløsning, og begynd sorteringen. CD34 udtrykkes stærkt i disse endotelorer og er let adskilt fra hoved populationen. Efter sortering skal opløsningen overføres til et 15 mL konisk centrifugeglas og centrifugeres i 5 minutter ved 300 x g. Fjern supernatanten.
    Bemærk: Hvis opløsningen er i et rør, der er større end et mikrocentrifuge glas (f. eks. et 5 mL polystyren tube, der almindeligvis anvendes i mange FACs-protokoller), skal den sorterede celle pellet igen suspenderes i 1 mL sorterings buffer og overføre denne opløsning til et mikrocentrifuge glas. Centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og supernatanten fjernes.
    1. Valgfrit: hvis yderligere iPSC-EP-karakterisering ønskes, tilsættes andre primære antistoffer (f. eks. CD31-APC) samtidig med CD34-PE. Sørg for, at kryds stalken mellem forskellige lysstofrør minimeres.

5. indkapsling og langsigtet kultur af IPSC-EP-laden kollagen silicagelrogeler

  1. Forbered sånings middel ved at tilsætte 40 μL 10x medium 199 til 400 μL endotel vækstmedium (EGM-2) suppleret med 10 μM Y-27632 i en 1,8 mL mikrocentrifuge og Placer røret på is.
    Bemærk: mens brugen af antibiotika frarådes for stamcelle kultur og vedligeholdelse af differentierede celler, anbefales dosering med pen/STREP efter sortering, fordi det er vanskeligt at garantere sterilitet i sorterings miljøet (dette er mere nødvendigt, hvis sorteringen deles af mange laboratorier).
  2. Fjern alle supernatanten fra cellesuspensionen og tilsæt 200 μL EGM-2 suppleret med 10 μM Y-27632. Overføre cellesuspensionen til såning medium og blandes kraftigt.
  3. Tilsæt 350 μL kollagen til opløsningen tilberedt i trin 5,2 og bland godt. Opløsningen bliver lysegul.
    Bemærk: den endelige koncentration af kollagen kan have en betydelig indvirkning på dannelsen af kapillar plexus. I denne protokol antages det, at Kollagenet er forsynet med 10 mg/mL, og at hydrogeler har en slutkoncentration på 3,5 mg/mL. Justere disse mængder for at opnå deres endelige kollagenkoncentration; Det anbefales at begrænse den endelige kollagenkoncentration fra 2 mg/mL til 4 mg/mL.
  4. Tilsæt 5 μL 1M NaOH til opløsningen tilberedt i 5,3 og bland godt, undgå indførelse af luftbobler. Opløsningen bliver lys lyserød.
  5. Pipette 56 μL neutraliseret kollagen-celle opløsning fremstillet i 5,4 til individuelle brønde af en 96-brønd ultra-lav fastgørelse U-bottom cellekultur plade. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter. Før du tilføjer medier, skal du kontrollere, at cellerne er jævnt fordelt ved at undersøge prøverne med et lysfelt-mikroskop.
  6. Der fremstilles 1 mL kulturmedium, der består af EGM-2 suppleret med 10 μM Y-27632 og 50 ng/mL vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) ved at tilsætte 1 μL af hver stamopløsning til et mikrocentrifuge glas. Efter at have blandet godt, pipetten 100 μL af dette celle dyrkningsmedium på de celle belastede hydrogels. Pladen overføres til 37 °C for langsigtet kultur.
  7. Udskift kulturmediet dagligt, tilføje yderligere angiogen vækstfaktorer eller små molekyle hæmmere som dikteret af formålet med undersøgelsen. For at fjerne mediet optimalt skal du vippe pladen og bruge et P100 tip til forsigtigt at aspirere mediet uden at forstyrre hydrogel.

6. fastgørelse, immun farvning og visualisering af EP-baserede vaskulære netværk

  1. Efter en uges kultur tilsættes 250 μL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning til en 48-brønd plade. Fyld så mange brønde, som der er hydrogels. Fjern mediet fra silicagelrogeler (PFA) og brug fine-tippet pincet til at overføre silicagelrogeler til PFA indeholdende brønde. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur og fjern PFA ved at vaske hurtigt med PBS.
  2. Permeabilize ved tilsætning af 250 μL 0,5% af et nonionisk overfladeaktivt stof (Se tabel over materialer) i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask to gange med 250 μL PBS suppleret med 300 mM glycin. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter for hvert vaske trin for at sikre, at overskydende rengøringsmiddel fjernes. Bloker ved at fordybe silicagelrogeler i 250 μl blokerende buffer i 30 min.
  3. Inkuber med de ønskede primære antistoffer fortyndet i blokerende buffer natten over ved 4 °C. For eksempel, hvis immun farvning med phalloidin og VE-cadherin, fortyndet henholdsvis 1:40 og 1:200 i blokerende buffer.
  4. Den næste dag, Fjern den primære antistof opløsning og vask to gange med 0,5% emulgerende reagens i DPBS. Dæk med aluminiumsfolie og Inkuber med et artsspecifikt sekundært antistof (f. eks. 1:200 Alexa fluor 488 i PBS) i 2 timer ved stuetemperatur.
  5. Fjern den sekundære antistof opløsning, og vask to gange med 0,5% emulgerende reagens i DPBS. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter for hvert vaske trin for at sikre fjernelse af frie fluorophorer.
  6. For at visualisere cellekerner fortyndes 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1:10000 i PBS og tilsættes til prøven (erne).
    1. Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur og vaskes to gange med PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter for hvert vaske trin for at sikre fjernelse af frie fluorophorer.
  7. Prøverne overføres til et angiogenese μ-slide eller en petriskål af glasbund ved hjælp af fintippet pincet. Sørg for, at der ikke er fanget luftbobler under hydrogel.
  8. Billede på et Konfokal mikroskop ved at erhverve z-stakke, der strækker sig fra bunden til toppen af prøven. Sørg for, at detektoren ikke er mættet, og at den lavest mulige forstørrelse er i brug (et stort synsfelt er ønskeligt).
    Bemærk: for fremtidig behandling, sikre, at z-stakke gemmes med minimal komprimering (f. eks.,. czi).

7. brug af Computational pipeline til at analysere og sammenligne vaskulære netværk topologier

  1. Undersøg hver z-stak for at sikre, at skiver kun indeholder beholdere. Åbn z-stakken i ImageJ, og Forøg kontrasten ved at klikke på billede > justere > lysstyrke/kontrast. Fartøjets grænser er nu tydeligt afgrænset, og baggrundsniveauet er minimeret. Z-dimensionerne svarer ofte ikke til x/y-dimensionerne. For at rette op på dette skal du klikke på billede > justere > størrelse og ændre antallet af z-udsnit, så afstanden mellem hvert udsnit svarer til en pixel i x/y. ImageJ vil interpolere automatisk. Hvis dette trin ikke udføres korrekt, vil de endelige 3D-diskenheder blive komprimeret.
    Forsigtig: ECs vil migrere mod kanterne af gelen og vil danne små brosten kolonier. Mens disse er nyttige til at estimere grænserne for hydrogel, vil de forstyrre den endelige billedanalyse og bør slettes.
    Bemærk: ImageJ er en Java-baseret open-source billedanalyse software udviklet i forening af National Institutes of Health og laboratoriet for optisk og beregningsmæssige instrumentering. Det anbefales at downloade Fiji, som er simpelthen ImageJ bundtet med nyttige plugins (https://fiji.sc/).
  2. I ImageJ, sløre billedet i 3-dimensioner klikke proces > filtre ≫ Gaussisk blur 3D og derefter indstille Sigma værdier i alle 3 dimensioner til 2,0 (denne værdi skal muligvis justeres af slutbrugeren).
  3. I ImageJ skal du klikke på Behandl > binære > foretage binære og derefter vælge en passende tærskel-algoritme. Den Cross-Entropy tærskel algoritme udviklet af Li et al. er effektiv i at adskille fartøjer fra baggrunden21. Beregn tærsklen for hvert billede og sæt baggrunden til "default".
  4. I ImageJ, Fjern falske støj og Udfyld "huller" i lumen ved at klikke på proces > støj > fjerne afvigende værdier.
    Bemærk: fjernelse af "lyse" Outliers vil udfylde små huller i tilsluttede fartøjer; fjernelse af "mørke" Outliers vil fjerne døde celler. Størrelsen af fjernelses radius vil variere baseret på forstørrelsen og størrelsen af skibene. For billeder, der er erhvervet med en bred felt målsætning, som er 512 x 512 pixels, vil radier typisk variere fra 4-6 pixels.
  5. Oparbejde al rå (e.g., czi forlængelse) filer og omforme i. tif filer i nærværelse af fortsætte hen til skridt 7,6. Til støtte i denne behandling, en ImageJ script, "Binarize og filter. IJM" er blevet knyttet til dette manuskript.
  6. Gem de behandlede. tif-filer i samme mappe som filen "BatchProcessSkeleton. m", som kan downloades i manuskriptet. Dette script, udviklet af forfatterne, kalder de funktioner, udgivet af Phillip Kollmannsberger22 og gennemfører nogle yderligere fil manipulation.
  7. Download og Pak alle filer, der er forbundet med de to hovedfunktioner "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) og "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Gem alle funktionerne i den samme mappe som den åbnede behandlede z-stak.
  8. Åbn et multi-paradigme numerisk computermiljø (Se tabel over materialer) og Naviger til den mappe, hvor alle de filer, der er beskrevet ovenfor, er blevet gemt.
  9. Kør "BatchProcessSkeleton. m" enten ved at skrive batchprocessskeleton i kommandovinduet eller ved at åbne scriptet og trykke på knappen Kør (højrevendt grøn pil) i editoren.
    Bemærk: Hvis du vil analysere et stort datasæt med en enkelt kommando, skal du sikre dig, at strengen inde i dir -funktionen i linje 6 indeholder en asterisk (f. eks. ' *. tif '). Ellers skal du udskifte stjernen med filnavnet, hvis analysen af en enkelt fil ønskes.
  10. Den tid, dette script vil tage for at udføre, vil variere betydeligt baseret på den tilgængelige computerkraft. Det anbefales at foretage denne analyse på en computer med mindst 8 GB RAM, så brugeren kan få adgang til andre programmer, mens scriptet kører.
    Forsigtig: selv om det ikke er strengt nødvendigt, graftegning den oprindelige confokal erhvervelse (i gråt) og over æglæggende med denne billed matrix med skelet matrix (i rødt) kan støtte i evalueringen af udførelsen af skeletonization algoritme. Desuden kan læseren oprette en knude graf, som implementeret af kollmannsberger et al., at evaluere nøjagtigheden af netværks analysen. Oprettelse af begge grafer, mens nyttige, vil dramatisk øge Runtime af scriptet og kræver ekstra hukommelse; Hvis brugeren blot kræver en endelig topologi analyse og ikke ønsker at visualisere datasættet, skal du blot kommentere linjerne 44 til 61 (skelet graf) og linjer 104 til 143 (topologi graf).
  11. Efter færdiggørelsen indeholder data matrixen, som er synlig i arbejdsområdet, nu de behandlede data. Dobbeltklik på data , og Åbn denne celle i variabel editoren.
    1. Bemærk, at denne matrix vil indeholde, fra venstre mod højre: 1) filnavnet, 2) antallet af noder (filial point + slutpunkter), 3) filial point, 4) links (dvs., fartøjer), 5) netværks længde (herunder isolere fartøjer), og 6) antallet af skiver, der er indeholdt i z-stakken. Gem disse data som en. csv-fil og Eksporter til yderligere analyse til enhver software efter eget valg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter differentiering (figur 1), facer og indkapsling af IPSC-EPS i kollagen hydrogels, cellerne vil typisk forblive afrundet til 24 h før du begynder at migrere og danne indledende lumen. Efter ca. 6 dages kultur vil en primitiv kapillær plexus være synlig i hydrogel, når den ses med lysfelt mikroskopi (figur 2). Efter at have afbildet de faste, farvede, celle belastede silicagelrogeler på et confokalt mikroskop (film 1, supplerende film 1), konverteres de forbehandlede billeder til et skelet, der muliggør en analyse af netværkets samlede længde og tilslutningsmuligheder. Disse kvantitative foranstaltninger kan derefter anvendes til at bestemme, hvilke sæt betingelser der er optimale til fremstilling af robuste vaskulære netværk.

Denne protokol giver mulighed for udvikling af en robust, tredimensionel kapillar plexus, der reagerer på lokale fysiske og kemiske signaler. I tidligere arbejde har dette netværk dannelse vist sig at være følsom over for matrix tæthed, matrix stivhed, matrix metalloprotease hæmning, og typen og koncentrationen af forskellige angiogene mitogener20,23.

Figure 1
Figur 1: generering af iPSC-EPS fra pluripotente stamceller. (A) wicell 19-9-11 ipscs, som farves positivt for Oct4, blev dyrket i E8 medium suppleret med 10 μM Y-27632 rock hæmmer for 48 h.B) ipsc'erne blev derefter INDUCERET med 6 ΜM CHIR99021 i lasr basal medium for 48 h, hvorefter cellerne var positive for Brachyury, en mesoderm markør. C) cellerne blev yderligere dyrket i Lasr basal Media, indtil de udtrykte CD34, en markør for endotelorer. D) ca. 15% – 25% af de differentierede celler udtrykt CD34. Alle skala stænger repræsenterer længder på 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: generering og analyse af iPSC-EP-vaskulære netværk i kollagen hydrogels. A) et tværsnit af 3D-mikromiljøet, der anvendes i denne analyse til at fremme dannelsen af vaskulære netværk fra IPSC-EPS. En flydende kollagen hydrogel er seedet med iPSC-EPs og eksponeret for EGM-2 suppleret med 50 ng/mL VEGF og en tidsmæssig dosis af Y-27632. B) den resulterende kapillar plexus er stærkt forgrenet og sammenkoblet, som visualiseret via farvning med F-actin (cyan). Det binariserede billede, der vises til venstre, genereres ved forbehandling med ImageJ. Denne z-stak er derefter analyseret via en tidligere udviklet algoritme, som skeletonizes netværket (vist i en samling af tynde røde linjer) og derefter analyserer netværkstopologien for grene (gul), slutpunkter (blå), isolerede fartøjer (sort), og forbundet fartøjer (rød). Skala bjælken repræsenterer en længde på 100 m.C) morfologiske ændringer af IPSC-EPS-laden kollagen hydrogels: 24 h efter såning forbliver IPSC-EPS kugleformet og inden for 96 h gradvist tage en mere aflang fænotype. Yderligere kultur resulterer i montering af lumen-holdige ve-cadherin netværk, som vist i justerings på 144-h tidspunkt. Skala bjælkerne repræsenterer længder på 400 μm; grøn = VE-Cadherin, rød = F-actin og blå = DAPI. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Film 1: Z-stak af VASCULATURE genereret fra iPSC-EPS. Vaskulære netværk blev fastsat, plettet med F-actin, og visualiseret ved at erhverve z-stakke på et Konfokal mikroskop. Skiver blev erhvervet med 17 μm intervaller. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Supplerende film 1:3D-gengivelse af fartøjer. Vaskulære netværk blev fastsat, plettet med F-actin (rød) og VE-cadherin (grøn), og visualiseret ved at erhverve z-stakke på et Konfokal mikroskop. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol omfatter den langsigtede kultur af celler i tre typer af cellekultur medier: E8, LaSR basal, og EGM-2. Derfor bør man være meget forsigtig med at sterilisere alle materialer korrekt. Derudover bør laboratorie frakker og ethanol-rengjorte handsker altid bæres, når de arbejder i laboratoriets laminar flow hætte. Det anbefales ofte at teste for Mycoplasma kontaminering; Hvis der observeres en stor mængde snavs under iPSC-kulturen eller et pludseligt fald i differentierings effektiviteten, er Mycoplasma-kontaminering en sandsynlig årsag. iPSC-EPs genereret med denne protokol tendens til at deponere en betydelig mængde ECM, som forlænger dissociations tiden og forårsager enkelt cellesuspension til at adskille i små klumper. Brug ikke trypsin-EDTA (0,25%), da opløsningen kan forstyrre CD34 epitoper på IPSC-EPS. Men, behandling med collagenase/dispase opløsning kan fjerne deponerede ECM og lette dissociation med en standard celle løsrivelse løsning. Efter omfattende dissociation kan nogle små klumper af celler og ECM forblive; Fjern disse klumper med en P100 pipettespids, da de sandsynligvis vil tilstoppe celle-strainerne eller forstyrre FACERNE.

Pluripotente stamceller er følsomme over for dissociation og vil gennemgå apoptose i en enkelt cellesuspension, medmindre en klippe hæmmer (almindeligvis Y-27632) tilsættes til mediet24. iPSC-EPs er også følsom over for dissociation; herunder Y-27632 ved 10 μM for de første 24 h af kulturen er bydende nødvendigt at øge cellens overlevelse og spredning. Derfor er det afgørende, at en klippe hæmmer er inkluderet i både hydrogel og omgivende medium umiddelbart efter FACS. Den såning tæthed af IPSC-EPS også betydeligt påvirker fartøjs udvikling og samlede netværks størrelse. Generelt er en koncentration på 500.000 celler/mL til 3.000.000 celler/mL en passende række af såning tætheder. En yderligere stigning i såning tæthed fører ofte til hydrogel komprimering og celledød.

Tætheden af ECM strukturelle proteiner har været konstateret at have en betydelig indvirkning på udviklingen af manipuleret mikrovaskulaturen25,26. Generelt, øge tætheden af en ECM-baseret hydrogel (ofte kollagen eller fibrin) grænser vaskulære netværk længde og tilslutningsmuligheder. Derfor er det afgørende, at der rettes omhyggelig opmærksomhed mod kollagen matrix tæthed; koncentrationer under 2 mg/mL fremmer den præmature proteolytiske nedbrydning af kollagen hydrogels, hvilket resulterer i et uopretteligt tab af hydrogelens strukturelle integritet. I modsætning hertil inducerer koncentrationer over 4 mg/mL dannelsen af korte, brede lumen, der udviser dårlig konnektivitet; hydrogel deformabilitet og en ændring i porestørrelse er primært ansvarlig for denne ophævelse20.

Acellulære og celle belastede kollagen silicagelrogeler binder ikke til de ultra-lave fastgørelses plader; silicagelrogeler tendens til at forblive suspenderet i medierne og vil lejlighedsvis flyde til toppen af brønden. Hvis vævskultur-behandlede plader er ansat i denne protokol, vil de indlejrede Stam forfædre migrere til bunden af brønden og vil danne en nær konfluent enkeltlags i bunden af pladen. Den resulterende fald i celle såning tæthed hæmmer samlingen af disse stamceller i 3D-netværk. Desuden, hvis silicagelrogeler er kastet ind i brøndene af en vævskultur behandlet plade, vil de svagt binde den indvendige overflade af brønden; denne binding gælder for belastningen af hydrogel. Da denne platform blev udviklet for at isolere betydningen af fysiske og kemiske signaler, er det afgørende, at ingen fremmede kræfter er fremlagt til cellerne27. De flydende silicagelrogeler kan være svært at fodre, fordi de fleste af cellekultur medierne ligger under hydrogel; for at overvinde dette, vippe pladen og bruge en P100 pipette til at fjerne medier fra siden af væggen.

Når du afbilder de vaskulære netværk på et konfokalt mikroskop, er det afgørende at følge alle vaske trin for at sikre, at overskydende fluoroforet ikke resulterer i et lavt signal/støjforhold. Overskydende fluorescens kan forvirre standard tærskel algoritmer og gøre z-stakken vanskeligt at binarize. For at løse dette problem skal du bruge phalloidin, et svampe-toksin, der selektivt mærker F-actin og viser begrænset off-Target binding. Brug generelt primære antistoffer, der er blevet præ-konjugeret til et sekundært antistof for at begrænse koncentrationen af fri fluoroforet, der spreder sig gennem gelen. Når du genererer z-stakke en skive dybde på 10-20 mikron anbefales at afbalancere den tid, der kræves for at erhverve en z-stack mod behovet for en høj opløsning billede.

Her beskrives en kvantitativ analyse til vurdering af det vasculogene potentiale af iPSC-EPs i 3D-mikromiljøer. Denne analyse anvender Open source software og er upåvirket af bruger bias. Stadig, det repræsenterer en oversimplificeret model af den fysiologiske vaskulære niche. Mens iPSC-EPs kan skelne i cellerne er nødvendige for moden, funktionel vasculature, denne analyse forsømmer bidragene fra andre celletyper (f. eks, fibroblaster og makrofager), der deltager i vasculogenic processer. Desuden er dette system statisk og udsætter ikke de udviklende fartøjer for at flyde. Endelig, mens kollagen jeg er en af de dominerende proteiner i ECM28 og fastholder sin fibrillar arkitektur in vitro, det er meget afhængig og er begrænset til svage fysiske binding når neutraliseret ved høje temperaturer. På trods af disse begrænsninger, denne analyse repræsenterer et betydeligt skridt fremad i jagten på at ingeniør funktionelle Vaskulaturen for hjerte-kar-sygdom terapi og modellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (tilskudsnummer 15SDG25740035, tildelt J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) af National Institutes of Health (tilskudsnummer EB007507, tildelt C.C.), og Alliancen for regenerativ rehabiliterings forskning & uddannelse (AR3T, Grant nummer 1 P2C HD086843-01, tildelt J.Z.). Vi vil gerne anerkende Prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas i Austin) for hendes tekniske rådgivning om confokal mikroskopi. Vi er også taknemmelige for diskussioner med Samuel Mihelic (University of Texas i Austin), Dr. Alicia Allen (University of Texas at Austin), Dr. Julie Rytlewski (adaptive Biotech), og Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) for deres indsigt i beregningsmæssige analyse af 3D-netværk. Endelig takker vi Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) for hans råd om differentiering iPSCs i iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , In press (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , In press (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Tags

Udviklingsmæssige biologi stamcelle endotel stamfader vasculogenesis ekstracellulær matrix kollagen beregningsmæssige analyse fartøjs netværk
En in vitro 3D-model og beregnings ledning til kvantificering af det Vasculogeniske potentiale af iPSC-afledte Endotelafprogenitorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In… More

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter