Summary
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC-EPs) से व्युत्पन्न Endothelial संतान हृदय रोग उपचार में क्रांति लाने के लिए और अधिक वफादार हृदय रोग मॉडल के निर्माण को सक्षम करने की क्षमता है. इसमें, तीन आयामी (3 डी) कोलेजन microenvironments में iPSC-EPs के encapsulation और इन कोशिकाओं के vasculogenic क्षमता का एक मात्रात्मक विश्लेषण वर्णित हैं.
Abstract
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) एक रोगी विशेष, proliferative सेल स्रोत है कि किसी भी दैहिक सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं. द्विशक्तिशाली endothelial संतति (ईपीएस), जो सेल प्रकार परिपक्व इकट्ठा करने के लिए आवश्यक में अंतर कर सकते हैं, कार्यात्मक vascualture, दोनों भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त किया गया है. हालांकि, इन कोशिकाओं को कड़ाई से तीन आयामी वातावरण में मूल्यांकन नहीं किया गया है, और उनके vasculogenic क्षमता का एक मात्रात्मक उपाय मायावी बनी हुई है. यहाँ, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के माध्यम से iPSC-EPs की पीढ़ी और अलगाव पहले रेखांकित कर रहे हैं, कोलेजन hydrogels में iPSC-EPs के encapsulation और संस्कृति का वर्णन द्वारा पीछा किया. यह extracellular मैट्रिक्स (ECM)-mimicking microenvironment एक मजबूत vasculogenic प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करती है; संवहनी नेटवर्क संस्कृति के एक सप्ताह के बाद फार्म. इस vasculogenic प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करता है कि एक कम्प्यूटेशनल पाइप लाइन का निर्माण रेखांकित किया है. इस पाइप लाइन को विशेष रूप से केशिका जाल के 3 डी वास्तुकला को मजबूत शाखाओं की संख्या, शाखाओं अंक, और न्यूनतम उपयोगकर्ता इनपुट के साथ कुल नेटवर्क लंबाई की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
Introduction
मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) और अन्य प्राथमिक endothelial सेल प्रकार के लिए दो दशकों के लिए उपयोग किया गया है रक्त वाहिका अंकुरित और इन विट्रो1में विकास मॉडल . इस तरह के संवहनी प्लेटफार्मों हृदय रोग के आणविक और ऊतक स्तर के तंत्र रोशन करने के लिए वादा करता हूँ और आदिम संवहनी नेटवर्क2,3 के विकास में शारीरिक अंतर्दृष्टि पेश कर सकतेहैं. हालांकि संवहनी मॉडलिंग के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति देखी गई है, एक "सोने के मानक" परख कि मात्रात्मक मॉडल और शारीरिक संवहनी विकास का आकलन कर सकते हैं मायावी बनी हुई है. सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल पर्याप्त रूप से संवहनी आला rerecapulate परिपक्व के गठन को प्रोत्साहित नहीं करते, कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं या मात्र तीन आयामों में मूल्यांकन सेल प्रकार के vasculogenic क्षमता की तुलना करने के लिए एक विधि नहीं है ( 3 डी)।
कई वर्तमान संवहनी मॉडल शारीरिक संवहनी आला नकल करने की क्षमता में सीमित हैं. इनविट्रो प्लेटफार्मों में सबसे अधिक कार्यरत में से एक जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण आधारित ट्यूब गठन परख है। संक्षेप में, HUVECs जेल की एक पतली परत पर एकल कोशिकाओं के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कि murine सार्कोमा extracellular मैट्रिक्स (ECM) से काटा प्रोटीन के होते हैं; एक से दो दिनों के भीतर, HUVECs स्वयं आदिम ट्यूबों में इकट्ठा4. हालांकि, इस प्रक्रिया को दो-आयामों (2 डी) में होता है और इस परख में उपयोग किए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) संलग्न, खोखले लुमेन नहीं बनाते हैं, जिससे इन अध्ययनों के शारीरिक महत्व को सीमित किया जा सकता है। हाल ही में, ईसी और सहायक कोशिकाओं (जैसे, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) और pericytes) सह 3 डी microenvironments कि देशी ECM के रेशेदार वास्तुकला अनुकरण में संस्कृति है, ऐसे कोलेजन या फाइब्रिन hydrogels के रूप में5. इस सूक्ष्म पर्यावरण में संवहनी विकास को मॉडल करने के लिए, ईसी के साथ लेपित बहुलक मोती आमतौर पर6कार्यरत हैं। exogenous विकास कारकों और / या वृद्धि कारकों के अलावा अन्य कोशिकाओं interstitially hydrogel में एम्बेडेड द्वारा स्रावित ECs प्रेरित कर सकते हैं, बहुलक मोती कोटिंग, अंकुरित और एकल लुमेन फार्म; अंकुरित और जहाजों की संख्या और व्यास तो गणना की जा सकती है. हालांकि, इन अंकुरित विलक्षण हैं और एक संलग्न, जुड़े नेटवर्क के रूप में शारीरिक स्थितियों में देखा जाता है और इस तरह एक ट्यूमर vasculature मॉडल की अधिक याद ताजा करती है फार्म नहीं है. माइक्रोफ्लूइडी उपकरणों का उपयोग संवहनी आला की नकल करने और ईसी-ललित हाइड्रोजेल्स7,8 में वास्कुलचर के गठन को बढ़ावा देने के लिए भी किया गयाहै। आमतौर पर, ईसी प्रवास और अंकुरित करने के लिए घूम सेल संस्कृति माध्यम पर एक एंजियोजेनिक विकास कारक-ग्रेडिएंट लागू किया जाता है। विकसित जहाजों के लुमेन का गठन करने वाले ईसी माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के माध्यम से तरल प्रवाह के आवेदन से प्रेरित कतरनी तनाव के प्रति संवेदनशील होते हैं; इस प्रकार, इन microfluidic उपकरणों महत्वपूर्ण शारीरिक पैरामीटर है कि स्थिर मॉडल में सुलभ नहीं हैं पर कब्जा. हालांकि, इन उपकरणों महंगा microfabrication क्षमताओं की आवश्यकता होती है.
सबसे महत्वपूर्ण बात, सभी तीन संवहनी मॉडल (2 डी, 3 डी, microfluidic) भारी प्राथमिक ईसी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक समर्थन सेल प्रकार का उपयोग. प्राथमिक कोशिकाओं को एक प्रभावी हृदय चिकित्सा में विकसित नहीं किया जा सकता है क्योंकि कोशिकाओं प्रत्यारोपण पर एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा होता है; इसके अलावा, HUVECs और इसी तरह के प्राथमिक सेल प्रकार रोगी-विशिष्ट नहीं हैं और संवहनी असामान्यताओं है कि एक आनुवंशिक स्वभाव या पूर्व मौजूदा स्वास्थ्य स्थितियों के साथ रोगियों में पाए जाते हैं पर कब्जा नहीं है, उदा. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) एक रोगी विशेष, proliferative सेल स्रोत है कि मानव शरीर9में सभी दैहिक कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है के रूप में पिछले एक दशक में उभरा है. विशेष रूप से, प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं जो iPSC व्युत्पन्न एंडोथेलियल संतति (iPSC-EPs)10,11के उत्पादन और अलगाव की रूपरेखा प्रस्तुत करते हैं; iPSC-EPs द्वि-शक्तिमान हैं और इसलिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में और अधिक विभेदित किया जा सकता है/ केवल एक अध्ययन में 3 डी माइक्रोएमेंट 12 में आईपीएससी-ईपीएससे प्राथमिक केशिका जाल के विकास का विस्तृत विवरण दिया गया है; हालांकि यह अध्ययन iPSC-ईपी विधानसभा और प्राकृतिक और सिंथेटिक hydrogels में भेदभाव की समझ के लिए महत्वपूर्ण है, यह मात्रात्मक परिणामी vasculature के नेटवर्क topologies की तुलना नहीं किया. एक और हाल ही में एक अध्ययन polymeric मनका मॉडल का इस्तेमाल किया गया है HUVECs और iPSC व्युत्पन्न ईसी5के अंकुरित तुलना . इसलिए, भौतिक और रासायनिक संकेतन तंत्र को और अधिक स्पष्ट करने की आवश्यकता है जो 3 डी माइक्रोन्यूमेंशन में आईपीएससी-ईपी वास्कुलोजेनेसिस को विनियमित करता है और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये कोशिकाएं इस्कीमिक थेरेपी और हृदय रोग के लिए उपयुक्त हैं या नहीं। मॉडलिंग.
पिछले दशक में, विभिन्न खुला स्रोत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों और कंकाल एल्गोरिदम मात्रा और संवहनी नेटवर्क लंबाई और कनेक्टिविटी की तुलना करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, Charwat एट अल एक फ़ोटोशॉप आधारित पाइप लाइन विकसित करने के लिए एक फ़िल्टर्ड, संवहनी नेटवर्क के binarized छवि वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं और एक फाइब्रिन मैट्रिक्स13,14में वृद्धि ECs के सह संस्कृति से व्युत्पन्न निकालने के लिए . शायद सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया टोपोलॉजी तुलना उपकरण AngioTool, एक राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा ऑनलाइन प्रकाशित कार्यक्रम15है; कार्यक्रम के व्यापक गोद लेने और अच्छी तरह से प्रलेखित निष्ठा के बावजूद, कार्यक्रम दो आयामों और AngioSys और Wimasis सहित अन्य कार्यक्रमों में पोत की तरह संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए सीमित है, एक ही आयामीता सीमा16का हिस्सा है. ऐसे Imaris, Lucis, और Metamorph के रूप में शक्तिशाली सॉफ्टवेयर सुइट्स इंजीनियर microvasculature के नेटवर्क टोपोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है; हालांकि, इन सुइट्स सबसे शैक्षिक प्रयोगशालाओं के लिए लागत-प्रतिषेधात्मक हैं और स्रोत कोड तक पहुंच को सीमित करते हैं, जो अंत-उपयोगकर्ता की क्षमता को अपने विशिष्ट आवेदन के लिए एल्गोरिथ्म को अनुकूलित करने में बाधा डाल सकते हैं। 3 डी स्लाइसर, एक खुला स्रोत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग / computed टोमोग्राफी पैकेज, एक संवहनी मॉडलिंग टूलकिट है कि प्रभावी ढंग से 3 डी संवहनी नेटवर्क17के टोपोलॉजी का विश्लेषण कर सकते हैं शामिल हैं; हालांकि, विश्लेषण उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से नेटवर्क के अंत अंक रखने पर निर्भर है, जो थकाऊ हो सकता है जब एक बड़े डेटासेट का विश्लेषण और उपयोगकर्ता के अवचेतन पूर्वाग्रहों से प्रभावित किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में, एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन है कि 3 डी संवहनी नेटवर्क मात्रा कर सकते हैं विस्तार से वर्णित है. ऊपर से बाहर की सीमाओं को दूर करने के लिए, इस खुला स्रोत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन एक कंकाल विश्लेषक में 3 डी मात्रा लोड करने के लिए confocal छवियों का अधिग्रहण पूर्व प्रक्रिया के लिए ImageJ का इस्तेमाल करता है. कंकाल विश्लेषक एक समानांतर मध्यस्थ अक्ष thinning एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है, और मूल रूप से Kerschnitzki एट अल द्वारा विकसित किया गया था. की लंबाई और ऑस्टियोसाइट नेटवर्क की कनेक्टिविटी का विश्लेषण करने के लिए18; इस एल्गोरिथ्म को प्रभावी ढंग से इंजीनियर microvasculature की लंबाई और कनेक्टिविटी की विशेषता के लिए लागू किया जा सकता है.
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल 3 डी microenvironments में microvascular नेटवर्क के निर्माण की रूपरेखा और एक खुला स्रोत और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह मुक्त कम्प्यूटेशनल पाइप लाइन प्रदान करता है आसानी से iPSC-EPs के vasculogenic क्षमता की तुलना.
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Protocol
1. संस्कृति मीडिया और कोटिंग समाधान की तैयारी
- विट्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान तैयार करने के लिए, दुलबिकको के फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (डीपीबीएस) में विट्रोनेक्टिन 1:100 को पतला करें।
चेतावनी: एक बार पतला, यह भविष्य में उपयोग के लिए इस समाधान को स्टोर करने के लिए अनुशंसित नहीं है। - फीनॉल लाल-मुक्त प्राप्त करने पर, विकास कारक कम जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण (सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता से, मिश्रण पारदर्शी और तरल पदार्थ है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर thaw. एक स्तरीय प्रवाह हुड में बर्फ पर मिश्रण रखते हुए, एक 1.8 एमएल microcentrifuge ट्यूब में मिश्रण के पिपेट 75 डिग्री सेल्सियस और तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज। इन एलिकोट्स को एक वर्ष तक के लिए भंडारित किया जा सकता है।
चेतावनी: यह जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण बहुत चिपचिपा हो जाता है जब कमरे के तापमान पर रखा और उच्च तापमान पर जम जाएगा. इस घोल को बर्फ से ठंडा रखें। - कोटिंग के लिए इस मिश्रण को तैयार करने के लिए, बर्फ पर एक 75 डिग्री सेल्सियस aliquot thaw और बर्फ ठंडा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम के 6 एमएल के साथ पतला: पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (DMEM/ यह तैयार मात्रा एक 12 अच्छी तरह से थाली कोट करने के लिए पर्याप्त है.
- एस्कॉर्बिक एसिड मैग्नीशियम-2-फॉस्फेट (एक सफेद lyophilized पाउडर) के एक 100 मिलीग्राम/ समाधान पूरी तरह से पारदर्शी है जब तक एक हलचल पट्टी के साथ आंदोलन (यह एक घंटे तक लग सकते हैं). इस समाधान को एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- एक 15 एमएल शंकु सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डाइमेथिल सल्फोक्सेक (DMSO) के 1.9928 एमएल में lyophilized पाउडर के 10 मिलीग्राम भंग करके CHIR99021 (CHIR) के एक 10 एम एम स्टॉक बनाएँ और समाधान पारदर्शी है जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस मनका (या पानी) स्नान में गर्म। अलीकोट 1.8 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में और एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है।
- Y-27632 के एक 10 एम एम स्टॉक बनाएँ, एक रॉक अवरोध करनेवाला (ROCKi), एक 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में dimethyl sulfoxide (DMSO) के 3.1225 एमएल में lyophilized पाउडर के 10 मिलीग्राम भंग करके और एक 37 डिग्री सेल्सियस मनका (या पानी) स्नान में गर्म जब तक समाधान पारदर्शी है. अलीकोट 1.8 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में और एक वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करता है।
- आवश्यक 8 (E8) मध्यम तैयार करने के लिए, thaw जमे हुए की खुराक, बेसल मध्यम की 500 एमएल बोतल में जोड़ें, और बाँझ फिल्टर. इस समाधान को दो सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
चेतावनी: इस माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म नहीं करना बहुत महत्वपूर्ण है, क्योंकि माध्यम निर्माण में प्रोटीन लंबे समय तक उपयोग के साथ नीचा हो सकता है। इसके बजाय, उपयोग करने से पहले 15 से 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इस माध्यम रखें। - सॉर्टिंग बफर तैयार करने के लिए, DPBS में 7.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 1.33 एमएल और 0.5 एमएम एथिलीनडिऐलोminetetraacetic एसिड (EDTA) के 200 $L को डीपीबीएस के 48.5 एमएल में जोड़ें ताकि 0.5% बीएसए और 2 एम एम टी ए का अंतिम समाधान बनाया जा सके।
- LaSR Basal तैयार करने के लिए, 100 मिलीग्राम/एमएल एस्कॉर्बिक एसिड मैग्नीशियम-2-फॉस्फेट और 5 एमएल ग्लूटामैक्स को 500 एमएल उन्नत DMEM/F12 में जोड़ें। इस समाधान को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम-2 (ईजीएम-2) तैयार करने के लिए, थॉ सप्लीमेंट्स और बेसल मीडियम की 500 एमएल बोतल में जोड़ें। इस समाधान को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- अवरुद्ध बफर तैयार करने के लिए, 500 मिलीग्राम lyophilized गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) और एक पायसीकारी अभिकर्मक के 50 डिग्री एल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) DPBS के 48 एमएल करने के लिए। कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट यह सुनिश्चित करने के लिए कि बीएसए झुरमुट नहीं करता है और बाद में समाधान से अलग होता है।
2. थाविंग, रखरखाव, और iPSCs के पासिंग
- एक cryopreserved iPSC शीशी thwing से पहले, vitronectin समाधान के 1 एमएल के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक भी अच्छी तरह से कोट (चरण 1.1 में वर्णित के रूप में तैयार). कमरे के तापमान पर एक एच के लिए इनक्यूबेट। थाली में E8 मध्यम जोड़ने से पहले इस कोटिंग हवा सूखी मत करो.
- iPSCs को थपथपाने के लिए, अपने तरल नाइट्रोजन भंडारण कंटेनर से आई पी एस सी की एक क्रायोपआरक्षित शीशी को पुनः प्राप्त करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर था जब तक कि बर्फ का एक छोटा सा क्रिस्टल नहीं रहता। सावधानी से (ड्रॉपवार) एक 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब बर्फ ठंडा DMEM/F12 के 8 एमएल युक्त करने के लिए thawed शीशी की सामग्री हस्तांतरण। सेल हानि को कम करने के लिए एक अतिरिक्त 1 एमएल बर्फ-ठंडा DMEM/F12 के साथ thawed शीशी धो लें। 300 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
- जबकि अपकेंद्रित्र के लिए प्रतीक्षा कर रहा है, vitronectin समाधान aspirate और 1 एमएल E8 मध्यम जोड़ें (चरण 1.6 में वर्णित के रूप में तैयार) अच्छी तरह से. फिर, DMEM/F12 supernatant centrifuged शंकु ट्यूब से निकालें और E8 माध्यम के 1 एमएल में गोली फिर से निलंबित. नए लेपित प्लेट में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें, निलंबन को उत्तेजित करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है ताकि कालोनियों को सीडिंग पर clumping से रोका जा सके।
- वहाँ आम तौर पर पर्याप्त सेल मौत thawing के बाद है. अगली सुबह, माध्यम को हटा दें और ताजा E8 माध्यम के साथ बदलें.
नोट: यहां तक कि इष्टतम परिस्थितियों के तहत, iPSCs cryopservation से खराब ठीक हो जाते हैं. यह एक भी 6 अच्छी तरह से भविष्य में बोने के लिए एक के पास-confluent 6-well cryopreserve करने के लिए सिफारिश की है। सेल वसूली के दौरान पहले 2-3 दिनों के लिए सेल मलबे की उपस्थिति सामान्य है। - E8 मध्यम दैनिक बदलें जब तक कोशिकाओं passaging के लिए तैयार हैं (70%-80% संगम).
- पारित करने के लिए, पहले vitronectin लेपित कुओं तैयार (के रूप में चरण 2.1 में वर्णित).
- एक बार vitronectin लेपित कुओं के लिए तैयार कर रहे हैं (के बारे में 1 ज), aspirate E8 मध्यम अच्छी तरह से पारित किया जा करने के लिए और DPBS के 1 एमएल के साथ दो बार धो लो. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए 0.5 एमएल EDTA के 1 एमएल के साथ इनक्यूबेट। इनक्यूबेटिंग करते समय, नए लेपित अच्छी तरह से vitronectin समाधान निकालें और E8 माध्यम के 1-2 एमएल के साथ बदलें।
- कुओं से EDTA समाधान निकालें पारित किया जा करने के लिए और धीरे E8 के 1 एमएल के साथ एक या दो बार धोने से कालोनियों को अलग. ताजा लेपित E8 युक्त कुओं के लिए सेल निलंबन के 75-200 $L स्थानांतरण, यहां तक कि कवरेज सुनिश्चित करने के लिए थाली आंदोलन, और तुरंत इनक्यूबेटर में जगह।
चेतावनी: iPSC टुकड़ी के लिए ऊष्मायन समय सेल लाइन निर्भर है; यह अनुशंसा की जाती है कि इस प्रोटोकॉल का प्रयोक्ता प्राप्त/जनरेट किया गया iPSC लाइन का पर्याप्त रूप से विस्तार करने पर कई बार परीक्षण करता है। सेल निलंबन के 75 डिग्री एल आम तौर पर मार्ग के बीच 4 दिनों में परिणाम; 150 $L या उससे अधिक मार्ग के बीच 2-3 दिनों की ओर जाता है।
3. iPSC व्युत्पन्न endothelial संतति का उत्पादन (चित्र 1) .
- आई पी एस सी को बनाए रखते समय, सुनिश्चित करें कि कालोनियों को अच्छी तरह से संकुचित किया जाता है और संस्कृति में विभेदित कोशिकाओं की कम संख्या है। यदि कालोनियों में एक दूसरे से संपर्क करना शुरू हो जाता है, तो कोशिकाओं में बहुत अधिक संभावना होती है और उन्हें तुरंत पारित किए जाने की आवश्यकता होती है।
- जब iPSCs 70%-80% confluent हैं, कोट एक 24 अच्छी तरह से प्लेट जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण के साथ (के रूप में 1.2/1.3 में वर्णित के रूप में तैयार). इस मिश्रण का पिपेट 250 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक कुएं में डालकर कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए रखें।
- उपरोक्त 1-h ऊष्मायन के दौरान, क्रमशः रेफ्रिजरेटर और फ्रीजर से E8 मध्यम और Y-27632 को निकालें। एक बार जब E8 मध्यम और Y-27632 पहुँच कमरे के तापमान तक पहुँचने, एक 15 एमएल शंकु अपकेंद्रण ट्यूब में 10 डिग्री सेल्सियस Y-27632 के 13 $L को जोड़कर E8 शंकु अपकेंद्रण ट्यूब में 13 डिग्री सेल्सियस जोड़कर तैयार करें।
- IPSC कुओं से E8 माध्यम निकालें, DPBS के 1 एमएल के साथ दो बार धोने, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 मिनट के लिए 0.5 एम एम EDTA के साथ इनक्यूबेट। ऊष्मायन अवधि के बाद, EDTA को हटा दें और तेजी से एक एकल सेल निलंबन में कोशिकाओं को एक P1000 पिपेट टिप के साथ 1 एमएल के साथ ई 8 + ROCKi माध्यम के साथ कतरनी।
- एक हीमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना. एक निलंबन है कि iPSCs के लाखों हो सकते हैं के लिए, सेल निलंबन के 20 $L trypan नीले रंग के 180 डिग्री एल करने के लिए जोड़ें. एकल-कक्ष निलंबन में कुल कक्षों की संख्या निर्धारित करें.
- स्थानांतरण 0.432 x 106 से 1.296 x 106 कोशिकाओं (104 से 3 x 104 कोशिकाओं/ नए लेपित 12-वेल प्लेट से जिलेटिन मिश्रण कोटिंग निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 500 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, यह सुनिश्चित करना कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से वितरित किया जाता है और छोटे clumps फार्म नहीं करते हैं।
नोट: घनत्व की यह श्रेणी CD34 सकारात्मक कोशिकाओं के भेदभाव के लिए इष्टतम है; हालांकि, इन seeding घनत्व सेल लाइन पर निर्भर हैं और इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है. - संस्कृति के 24 ज के बाद, ताजा E8 मध्यम के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ माध्यम की जगह. एक ही शर्तों के तहत एक अतिरिक्त 24 एच के लिए इनक्यूबेट।
- E8 माध्यम निकालें और LASR बासल के साथ बदलें CHIR99021 के 6-12 डिग्री के साथ पूरक. इस समय बिंदु भेदभाव के D0 के रूप में परिभाषित किया गया है। संस्कृति के 24 एच के बाद, एक ही सेल संस्कृति माध्यम के साथ बदलें.
नोट: जैसा कि पहले बताया गया है, इस माध्यम में जोड़ी गई CHIR99021 की मात्रा उपयोग की गई iPSC लाइन पर निर्भर करेगी। इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए CHIR99021 सांद्रता की एक श्रृंखला का परीक्षण करें। - CHIR99021 के साथ ऊष्मायन के 48 एच के बाद, LaSR बासल के 1 एमएल के साथ बदलें।
- 2-3 अतिरिक्त दिनों के लिए LaSR बासल के 2 एमएल के साथ मध्यम दैनिक बदलें. इस समय बिंदु पर (भेदभाव के D5), इन कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण अनुपात CD34 व्यक्त करेंगे और endothelial संतति के रूप में विशेषता जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में प्रतिनिधि परिणामों के साथ रेखांकित किया गया है और जांचकर्ताओं ने इस विधि 11,19को प्रकाशित किया था .
नोट: इन endothelial जनक आगे एक endothelial वंश के साथ विभेदित किया जा सकता है (35%-99%) या एक चिकनी मांसपेशी वंश (1%-65%). विभेदन क्षमता ईसीएम कोटिंग के प्रकार और विभेद 20 के दौरान प्रयुक्त कोशिका संस्कृति माध्यम के आधार पर भिन्न होती है ।
4. एंडोथेलियल संतति के FACS
- D5/D6 विभेदित कोशिकाओं को अलग करने से पहले, चरण 1.8 में वर्णित के रूप में छँटाई बफ़र तैयार है और बर्फ पर रहते हैं।
- प्रति अच्छी तरह से सेल टुकड़ी समाधान के 250 डिग्री सेल्सियस के साथ विभेदित कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिकादेखें ) 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए।
- सेल टुकड़ी समाधान में एक एकल सेल निलंबन में एक P1000 पिपेट टिप के साथ कोशिकाओं को अलग करें। सेल-सेल टुकड़ी के विलयन के मिश्रण को 15 एमएल शंकु अपकेंद्रित्र ट्यूब में समेकित करें तथा 300 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रण करें।
- supernatant निकालें और बर्फ ठंडा छँटाई बफर के 200 डिग्री एल में resuspend (चरण 1.7 में वर्णित के रूप में तैयार. सेल-सॉर्टिंग बफर सस्पेंशन में केंद्रित CD34-पीई एंटीबॉडी का 5 डिग्री एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- बर्फ ठंडा छँटाई बफर के 5 एमएल में फिर से निलंबित. सॉर्टर पर रखने से पहले एक 40 डिग्री सेल्सियस टोपी के साथ एक सेल छलनी के माध्यम से इस निलंबन फ़िल्टर.
- उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनल पर, 10,000 कोशिकाओं है कि एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ लेबल नहीं किया गया है सॉर्ट करें. उच्च फ्लोरोसेंट तीव्रता पर एक क्षेत्र को गेट करें जिसमें इन 10,000 कोशिकाओं में से कोई भी शामिल नहीं है (चित्र 1D) । यह एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेगा.
- एक फ्लोरोसेंट समाधान के साथ लेबल iPSC-EPs युक्त नमूना चलाने के लिए और तरह शुरू करते हैं। CD34 अत्यधिक इन endothelial संतति में व्यक्त की है और आसानी से मुख्य आबादी से अलग है. छँटाई के बाद, विलयन को 15 एमएल शंकु सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और अपकेंद्रित्र को 300 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए स्थानांतरित करें। सुपरनेंट निकालें.
नोट: यदि समाधान एक microcentrifuge ट्यूब से बड़ा एक ट्यूब में है (जैसे, एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब आमतौर पर कई FACs प्रोटोकॉल में कार्यरत), फिर से क्रमबद्ध सेल गोली छँटाई बफर के 1 एमएल में निलंबित और एक microcentrifuge ट्यूब के लिए इस समाधान हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें।- वैकल्पिक: यदि आगे iPSC-EP विशेषता वांछित है, अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, CD31-APC) एक साथ CD34-पीई के साथ जोड़ें. सुनिश्चित करें कि विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों के बीच crosstalk कम से कम है.
5. एनकैप्सुलेशन और आईपीएससी-ईपी से लदी कोलेजन हाइड्रोजेल्स की दीर्घकालिक संस्कृति
- 10x मध्यम 199 से 400 डिग्री सेल्सियस के 40 डिग्री सेल्सियस को जोड़कर बीज बोने का माध्यम तैयार करें, जो कि 1.8 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज और बर्फ पर जगह ट्यूब में 10 डिग्री सेल्सियस Y-27632 के साथ पूरक है।
नोट: जबकि एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग स्टेम सेल संस्कृति और विभेदित कोशिकाओं के रखरखाव के लिए हतोत्साहित किया जाता है, पेन / अनिवार्य अगर सॉर्टर कई प्रयोगशालाओं के बीच साझा किया जाता है). - सेल निलंबन से सभी supernatant निकालें और EGM-2 के 200 $L जोड़ने के साथ पूरक 10 $M Y-27632. सेल निलंबन को बोने के माध्यम से स्थानांतरित करें और तेजी से मिश्रण करें।
- चरण 5.2 में तैयार समाधान के लिए कोलेजन के 350 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण. समाधान पीला पीला हो जाएगा।
नोट: कोलेजन के अंतिम एकाग्रता केशिका जाल के गठन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में यह माना गया है कि कोलेजन की आपूर्ति 10 मिलीग्राम/एमएल पर की गई है और हाइड्रोजेल्स की अंतिम सांद्रता 3.5 मिलीग्राम/एमएल है। उनके अंतिम कोलेजन एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए इन संस्करणों को समायोजित करें; अंतिम कोलेजन सांद्रता को 2 मिलीग्राम/एमएल से 4 मिलीग्राम/एमएल तक प्रतिबंधित करने की सिफारिश की जाती है। - 5.3 में तैयार समाधान के लिए 1M NaOH के 5 $L जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण, हवा के बुलबुले की शुरूआत से बचने. समाधान उज्ज्वल गुलाबी हो जाएगा।
- एक 96-अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव यू-नीचे सेल संस्कृति प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में 5.4 में तैयार बेअसर कोलेजन-सेल समाधान के Pipette 56 डिग्री सेल्सियस। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। मीडिया जोड़ने से पहले, जाँच करें कि कोशिकाओं को समान रूप से एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ नमूनों की जांच करके वितरित किया गया है.
- संस्कृति माध्यम के 1 एमएल तैयार करें जिसमें 10 डिग्री एम वाई-27632 और 50 एनजी/एमएल संवहनी अंत:संवहनी वृद्धि कारक (वीईजीएफ) के साथ पूरक एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए प्रत्येक स्टॉक समाधान के 1 डिग्री सेल्सियस को जोड़कर तैयार करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के बाद, इस सेल संस्कृति माध्यम के पिपेट 100 डिग्री सेल्सियस सेल-लदी हाइड्रोजेल्स पर। लंबी अवधि की संस्कृति के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
- अध्ययन के उद्देश्य से निर्धारित के रूप में संस्कृति मध्यम दैनिक बदलें, अतिरिक्त angiogenic विकास कारकों या छोटे अणु inhibitors जोड़ने. बेहतर मीडिया को दूर करने के लिए, प्लेट झुकाव और hydrogel परेशान किए बिना धीरे aspirate माध्यम के लिए एक P100 टिप का उपयोग करें.
6. फिक्सिंग, इम्यूनोस्टेनिंग, और ईपी आधारित संवहनी नेटवर्क का दृश्य
- संस्कृति के एक सप्ताह के बाद, एक 48 अच्छी तरह से थाली के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान के 250 $L जोड़ें. के रूप में कई कुओं भरें के रूप में वहाँ hydrogels हैं. हाइड्रोजेल्स (पीएफए) से माध्यम निकालें और ठीक-टिप्ड चिमटी का उपयोग करने के लिए hydrogels को पीएफए जिसमें कुओं को स्थानांतरित. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट और पीबीएस के साथ तेजी से धोने से पीएफए को हटा दें।
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक nonionic सर्फैक्टेंट के 0.5% के 250 $L जोड़कर permeabilize ( सामग्री की तालिकादेखें)। 300 एमएम ग्लाइसिन के साथ पूरक पीबीएस के 250 डिग्री एल के साथ दो बार धो एंकिया। अतिरिक्त डिटर्जेंट को हटाने सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक धोने के कदम के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। 30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध के 250 डिग्री एल में hydrogels immersing द्वारा ब्लॉक.
- वांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इन्क्यूबेट, बफर को रात भर अवरुद्ध करने में पतला 4 डिग्री सेल्सियस पर। उदाहरण के लिए, यदि फल्लॉयडिन और VE-cadherin के साथ इम्यूनोस्टेनिंग, बफर को अवरुद्ध करने में क्रमशः 1:40 और 1:200 को पतला करें।
- अगले दिन, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और DPBS में 0.5% पायसीकारी अभिकर्मक के साथ दो बार धो लें। कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और एक प्रजाति-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, 1:200 एलेक्सा फ्लोर 488 PBS में) के साथ इनक्यूबेट के साथ कवर।
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और DPBS में 0.5% पायसीकारी अभिकर्मक के साथ दो बार धो लें। मुक्त फ्लोरोफोर्स को हटाने सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक धोने के कदम के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
- सेल न्यूक्लिय कल्पना करने के लिए, 4 ', 6-diamidino-2-फेनिलिनो (DAPI) 1:10000 PBS में पतला और नमूना करने के लिए जोड़ें (ओं).
- कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट और पीबीएस के साथ दो बार धो लें। मुक्त फ्लोरोफोर्स को हटाने सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक धोने के कदम के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
- नमूनों को एक एंजियोजेनेसिस जेड-स्लाइड या एक ग्लास बॉटम पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, जिससे ठीक-ठाक चिमटी का उपयोग किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले hydrogel के नीचे फंस रहे हैं.
- एक confocal माइक्रोस्कोप पर छवि z-स्टैक प्राप्त करके कि नमूने के ऊपर करने के लिए नीचे से विस्तार. सुनिश्चित करें कि डिटेक्टर संतृप्त नहीं है और यह कि सबसे कम आवर्धन उपलब्ध उपयोग में है (एक बड़े क्षेत्र के दृश्य वांछनीय है).
नोट: भविष्य के संसाधन के लिए, सुनिश्चित करें कि z-स्टैक न्यूनतम संपीड़न (उदाहरण के लिए, .czi) के साथ बच रहे हैं।
7. विश्लेषण और संवहनी नेटवर्क topologies की तुलना करने के लिए गणना पाइप लाइन का उपयोग करना
- प्रत्येक z-स्टैक का निरीक्षण करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि स्लाइस में केवल वाहिकाओं हैं। ImageJ में z-स्टैक खोलें और छवि पर क्लिक करके इसके विपरीत को एन्हांस करें , समायोजित करें ] और चमक / पोत सीमाओं अब स्पष्ट रूप से सीमांकन कर रहे हैं, और पृष्ठभूमि स्तर कम से कम है. अक्सर, z-आयाम x/y आयाम से मेल नहीं खाते. इसे सुधारने के लिए, छवि पर क्लिक करें और समायोजित करें और z-slices की संख्या बदलें ताकि प्रत्येक स्लाइस के बीच की दूरी x/y में एक पिक्सेल के बराबर हो, ImageJ स्वचालित रूप से अंतर्विष्ट हो जाएगा. यह चरण ठीक से नहीं किया जाता है, तो अंतिम 3D वॉल्यूम संपीड़ित दिखाई देगा।
चेतावनी: ईसी जेल के किनारों की ओर पलायन करेंगे और छोटे मोची पत्थर कालोनियों का निर्माण करेंगे। हालांकि इन hydrogel की सीमाओं का अनुमान करने के लिए उपयोगी होते हैं, वे अंतिम छवि विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करेंगे और नष्ट किया जाना चाहिए.
नोट: ImageJ एक जावा आधारित खुला स्रोत छवि विश्लेषण स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और ऑप्टिकल और अभिकलनीय इंस्ट्रूमेंटेशन के लिए प्रयोगशाला द्वारा संगीत कार्यक्रम में विकसित सॉफ्टवेयर है. यह फिजी, जो बस ImageJ उपयोगी plugins (https://fiji.sc/) के साथ बंडल है डाउनलोड करने के लिए सिफारिश की है. - ImageJ में, छवि को 3-आयामों में धुंधला करके प्रक्रिया पर क्लिक करें और फ़िल्टर करें और गाऊसी धुंधला 3D करें और फिर सभी 3 आयामों में सिग्मा मानों को 2.0 पर सेट करें (इस मान को अंतिम उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है).
- ImageJ में, क्लिक करें प्रक्रिया gt; बाइनरी और बाइनरी करें और फिर एक उपयुक्त थ्रेशोल्ड एल्गोरिथ्म का चयन करें। ली एट अल द्वारा विकसित क्रॉस-एन्ट्रॉपी दहलीज एल्गोरिथ्म 21पृष्ठभूमि से जहाजों को अलग करने में प्रभावी है। प्रत्येक छवि के लिए थ्रेशोल्ड की गणना और "डिफ़ॉल्ट" करने के लिए पृष्ठभूमि सेट।
- ImageJ में, नकली शोर को दूर करने और प्रक्रिया पर क्लिक करके lumens में "छिद्र" में भरने के लिए और शोर gt; बाहरी निकालें.
नोट: "चमकदार" outliers हटाने जुड़े जहाजों में छोटे छेद में भर जाएगा; "अंधेरे" outliers को हटाने मृत कोशिकाओं को हटा देंगे. हटाने के त्रिज्या का आकार आवर्धन और जहाजों के आकार के आधार पर अलग अलग होंगे. 512 x 512 पिक्सेल वाले विस्तृत फ़ील्ड उद्देश्य के साथ प्राप्त की गई छवियों के लिए, रेडी आमतौर पर 4-6 पिक्सेल से रेंज होगी. - चरण 7.6 पर आगे बढ़ने से पहले सभी कच्चे (उदा., czi एक्सटेंशन) फ़ाइलों को संसाधित करें और .tif फ़ाइलों में कनवर्ट करें. इस प्रसंस्करण में सहायता करने के लिए, एक ImageJ स्क्रिप्ट, "Binarize और Filter.izm" इस पांडुलिपि से जुड़ा हुआ है.
- संसाधित .tif फ़ाइलों को फ़ाइल "BatchProcessSkeleton.m", पांडुलिपि में डाउनलोड के लिए उपलब्ध के रूप में एक ही फ़ोल्डर में सहेजें। यह स्क्रिप्ट, लेखकों द्वारा विकसित, फिलिप Kollmannsberger22 द्वारा प्रकाशित कार्यों कहते हैं और कुछ अतिरिक्त फ़ाइल हेरफेर आयोजित करता है.
- डाउनलोड करें और दो मुख्य कार्यों के साथ जुड़े सभी फ़ाइलों को खोलना "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) और "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). सभी फ़ंक्शन को एक ही फ़ोल्डर में सहेजते हैं जैसे कि खोला गया संसाधित z-स्टैक.
- एक बहु-प्रतिमान संख्यात्मक कंप्यूटिंग वातावरण खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) और फ़ोल्डर में नेविगेट करें जहां ऊपर वर्णित सभी फ़ाइलें सहेजी गई हैं.
- "BatchProcessSkeleton.m" या तो आदेश विंडो में BatchProcessSkeleton लिखकर या स्क्रिप्ट खोलकर और संपादक में चलाएँ बटन (दाएँ-फ़ेसिंग हरे तीर) से टकराकर चलाएँ।
नोट: एक एकल आदेश के साथ एक बड़े डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए, सुनिश्चित करें कि पंक्ति 6 में dir फ़ंक्शन के अंदर स्ट्रिंग एक तारांकन (जैसे, '*.tif') है। अन्यथा, तारांकन किसी एकल फ़ाइल का विश्लेषण इच्छित है, तो फ़ाइल नाम से बदलें। - इस स्क्रिप्ट को निष्पादित करने में जो समय लगेगा, वह उपलब्ध कंप्यूटिंग शक्ति के आधार पर काफी भिन्न होगा. यह उपयोगकर्ता स्क्रिप्ट चलाता है, जबकि अन्य कार्यक्रमों का उपयोग कर सकते हैं ताकि कम से कम 8 GB RAM के साथ एक कंप्यूटर पर इस विश्लेषण का संचालन करने के लिए अनुशंसा की जाती है।
चेतावनी: जबकि सख्ती से आवश्यक नहीं, मूल confocal अधिग्रहण रेखांकन (ग्रे में) और कंकाल मैट्रिक्स के साथ इस छवि मैट्रिक्स के साथ overlaying (लाल रंग में) कंकाल ीकरण एल्गोरिथ्म के प्रदर्शन के मूल्यांकन में सहायता कर सकते हैं. इसके अलावा, पाठक एक नोडल ग्राफ बना सकते हैं, के रूप में Kollmannsberger एट अल द्वारा लागू, नेटवर्क विश्लेषण की सटीकता का मूल्यांकन करने के लिए. दोनों रेखांकन बनाना, जबकि उपयोगी, नाटकीय रूप से स्क्रिप्ट के रनटाइम में वृद्धि होगी और अतिरिक्त स्मृति की आवश्यकता होती है; उपयोगकर्ता बस एक अंतिम टोपोलॉजी विश्लेषण की आवश्यकता है और डेटा सेट कल्पना नहीं करना चाहता है, तो बस लाइनों 44 से 61 (स्केलेटन ग्राफ) और लाइनों 104 से 143 (टोपोलॉजी ग्राफ) के लिए बाहर टिप्पणी. - पूरा होने पर, डेटा मैट्रिक्स, कार्यस्थान में दिखाई, अब संसाधित डेटा शामिल हैं। डेटा डबल क्लिक करें और इस कक्ष को चर संपादक में खोलें.
- ध्यान दें कि इस मैट्रिक्स में बाएँ से दाएँ होंगे: 1) फ़ाइल का नाम, 2) नोड्स की संख्या (शाखा अंक + अंत अंक), 3) शाखा बिंदु, 4) लिंक (यानी, जहाजों), 5) नेटवर्क लंबाई (अलग जहाजों सहित), और 6) z-स्टैक में निहित स्लाइस की संख्या. इस डेटा को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें और पसंद के किसी भी सॉफ़्टवेयर में आगे विश्लेषण के लिए निर्यात करें.
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Representative Results
विभेद (चित्र1), FACS और कोलेजन hydrogels में iPSC-EPs के encapsulation के बाद, कोशिकाओं को आम तौर पर माइग्रेट करने के लिए शुरू करने और प्रारंभिक lumens फार्म से पहले 24 एच के लिए गोल रहेगा. संस्कृति के बारे में 6 दिनों के बाद, एक आदिम केशिका जाल hydrogel में दिखाई देगा जब उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ देखा (चित्र2). एक confocal माइक्रोस्कोप पर निश्चित, दाग सेल से लदी hydrogels इमेजिंग के बाद (मूवी 1, पूरक मूवी 1),पूर्व संसाधित छवियों एक कंकाल जो समग्र लंबाई और नेटवर्क की कनेक्टिविटी के एक विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है में परिवर्तित कर रहे हैं. इन मात्रात्मक उपायों तो निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो शर्तों के सेट मजबूत संवहनी नेटवर्क के उत्पादन के लिए इष्टतम हैं.
इस प्रोटोकॉल एक मजबूत, तीन आयामी केशिका जाल है कि स्थानीय शारीरिक और रासायनिक संकेतों के लिए उत्तरदायी है के विकास के लिए अनुमति देता है. पिछले काम में, इस नेटवर्क गठन मैट्रिक्स घनत्व, मैट्रिक्स कठोरता, मैट्रिक्स धातु प्रोटोटोटीज़ निषेध के प्रति संवेदनशील होना दिखाया गया है, और प्रकार और विभिन्न एंजियोजेनिक mitogens के एकाग्रता20,23.
चित्र 1: pluripotent स्टेम सेल से iPSC-EPs का उत्पादन. (ए) विसेल 19-9-11 आई पी एस सी, जो अक्टूबर 4 के लिए सकारात्मक दाग, E8 मध्यम में सुसंस्कृत थे 10 $M Y-27632 रॉक अवरोधक के साथ 48 ज . (बी) iPSCs तब 48 एच के लिए CHIR99021 के 6 $M के साथ प्रेरित किया गया था, जो कोशिकाओं बिंदु पर Brachyury, एक mesoderm मार्कर के लिए सकारात्मक थे. (ग) इन कोशिकाओं को लाएसआर बासल मीडिया में तब तक सुसंस्कृत किया गया जब तक कि उन्होंने एंडोथेलियल संतति के लिए एक मार्कर सीडी34 व्यक्त नहीं किया। (घ) विभेदित कोशिकाओं में से लगभग 15%-25% सीडी34 व्यक्त की गई है। सभी पैमाने सलाखों 200 डिग्री मीटर की लंबाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: कोलेजन hydrogels में iPSC-ईपी संवहनी नेटवर्क का उत्पादन और विश्लेषण. (क) iPSC-EPs से संवहनी नेटवर्क गठन को बढ़ावा देने के लिए इस परख में प्रयुक्त 3डी सूक्ष्म पर्यावरण का एक क्रॉस-सेक्शन। एक अस्थायी कोलेजन हाइड्रोजेल को आईपीएससी-ईपीएस के साथ वरीयता प्राप्त किया जाता है और ईजीएम-2 के संपर्क में 50 एनजी/एमएल वीजीएफ और वाई-27632 की एक अस्थायी खुराक के साथ पूरक किया जाता है। (बी) परिणामी केशिका जाल अत्यधिक शाखाबद्ध और परस्पर जुड़ा हुआ है, जैसा कि एफ-एक्टिन (सियान) के साथ धुंधला के माध्यम से कल्पना की गई है। binarized छवि, बाईं ओर दिखाया गया है, ImageJ के साथ पूर्व प्रसंस्करण द्वारा उत्पन्न होता है. इस z-स्टैक तो एक पहले से विकसित एल्गोरिथ्म है, जो नेटवर्क skeletonizes के माध्यम से विश्लेषण किया है (पतली लाल लाइनों का एक संग्रह में दिखाया गया है) और फिर शाखाओं के लिए नेटवर्क टोपोलॉजी का विश्लेषण (पीला), अंत अंक (नीले), अलग जहाजों (काला), और जुड़ा जहाजों (लाल). स्केल बार 100 मीटर की लंबाई का प्रतिनिधित्व करता है (ग) iPSC-EPs-ललित कोलेजन hydrogels के Morphological परिवर्तन: 24 घंटे बोने के बाद, iPSC-EPs गोलाकार रहते हैं और 96 एच के भीतर धीरे-धीरे एक अधिक लम्बी phenotype पर ले लो. इसके अलावा संस्कृति lumen युक्त VE-Cadherin नेटवर्क के विधानसभा में परिणाम, के रूप में 144-h समय बिंदु पर इनसेट में दिखाया गया है. पैमाने सलाखों 400 डिग्री मीटर की लंबाई का प्रतिनिधित्व करते हैं; हरे रंग की - VE-Cadherin, लाल ] एफ-actin, और नीले ] DAPI. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
मूवी 1: VASCULATURE GENERATED FROM iPSC-EPs की $-स्टैक. संवहनी नेटवर्क तय कर रहे थे, एफ-actin के साथ दाग, और एक confocal माइक्रोस्कोप पर z-स्टैक प्राप्त करके कल्पना की. स्लाइस 17 डिग्री मीटर के अंतराल पर प्राप्त किए गए थे। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
पूरक मूवी 1: जहाजों के 3 डी प्रतिपादन. संवहनी नेटवर्क तय कर रहे थे, एफ-actin (लाल) और VE-cadherin (हरा) के साथ दाग, और एक confocal माइक्रोस्कोप पर z-स्टैक प्राप्त करके कल्पना की. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल सेल संस्कृति मीडिया के तीन प्रकार में कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति शामिल है: E8, LaSR बासल, और EGM-2. इसलिए, सभी सामग्रियों को उचित रूप से निष्फल करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगशाला कोट और इथेनॉल साफ दस्ताने हमेशा पहना जाना चाहिए जब प्रयोगशाला के laminar प्रवाह हुड में काम कर रहे. माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए अक्सर परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है; यदि आईपीएससी संस्कृति के दौरान बड़ी मात्रा में मलबे को देखा जाता है या भेदभाव दक्षता में अचानक गिरावट देखी जाती है, तो माइकोप्लाज्मा संदूषण एक संभावित कारण है। इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न iPSC-EPs ECM की एक महत्वपूर्ण राशि जमा करते हैं, जो वियोजन समय को लंबा करता है और एकल सेल निलंबन को छोटे clumps में अलग करने का कारण बनता है। ट्रिप्सिन-EDTA (0.25%) का उपयोग न करें, क्योंकि समाधान iPSC-EPs पर CD34 एपिटोप को बाधित कर सकता है। हालांकि, कोलैजाइनेस/डिस्पेस समाधान के साथ उपचार जमा ईसीएम को हटा सकता है और एक मानक सेल टुकड़ी समाधान के साथ वियोजन को कम कर सकता है। व्यापक वियोजन के बाद, कोशिकाओं और ईसीएम के कुछ छोटे clumps रह सकते हैं; एक P100 पाइपेट टिप के साथ इन clumps निकालें, के रूप में वे सेल परवेन रोकना या FACS के साथ हस्तक्षेप की संभावना है.
Pluripotent स्टेम सेल वियोजन के प्रति संवेदनशील हैं और एक एकल सेल निलंबन में apoptosis से गुजरना होगा जब तक कि एक रॉक अवरोध करनेवाला (आम तौर पर Y-27632) मध्यम24में जोड़ा जाता है. iPSC-EPs भी वियोजन के प्रति संवेदनशील हैं; संस्कृति के पहले 24 एच के लिए 10 डिग्री मीटर पर Y-27632 सहित सेल अस्तित्व और प्रसार को बढ़ाने के लिए आवश्यक है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि एक रॉक अवरोध करनेवाला दोनों hydrogel और आसपास के माध्यम में तुरंत FACS के बाद शामिल है. आइपीएससी-ईपीएस का सीडिंग घनत्व भी पोत विकास और कुल नेटवर्क आकार को काफी प्रभावित करता है। आम तौर पर, 3 मिलियन कोशिकाओं/एमएल को 500,000 कोशिकाओं/एमएल की सांद्रता बीज घनत्व की एक उपयुक्त श्रेणी है। बीज घनत्व में एक और वृद्धि अक्सर hydrogel संहनन और सेल मौत की ओर जाता है.
ईसीएम संरचनात्मक प्रोटीनों का घनत्व इंजीनियर सूक्ष्मवास के विकास पर महत्वपूर्ण प्रभावपाया गया है. आम तौर पर, एक ECM आधारित hydrogel के घनत्व में वृद्धि (अक्सर कोलेजन या फाइब्रिन) संवहनी नेटवर्क लंबाई और कनेक्टिविटी को सीमित करता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि सावधान ध्यान कोलेजन मैट्रिक्स घनत्व के लिए भुगतान किया जाता है; 2 मिलीग्राम/एमएल से नीचे सांद्रता कोलेजन hydrogels के समय से पहले प्रोटीओलिटिक गिरावट को बढ़ावा देता है, जो hydrogel की संरचनात्मक अखंडता के एक अपूरणीय नुकसान में परिणाम. इसके विपरीत, 4 मिलीग्राम/एमएल से ऊपर सांद्रता कम, व्यापक लुमेन के गठन को प्रेरित करती है जो खराब कनेक्टिविटी को प्रदर्शित करती है; हाइड्रोजेल विकृति और छिद्र आकार में परिवर्तन मुख्य रूप से इस निराकरण20के लिए जिम्मेदार हैं .
अकोशिक और सेल से लदी कोलेजन हाइड्रोजेल्स अल्ट्रा-लो लगाव प्लेटों से बाध्य नहीं होते हैं; hydrogels के लिए मीडिया में निलंबित रहते हैं और कभी कभी अच्छी तरह से शीर्ष करने के लिए नाव जाएगा. यदि ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेटें इस प्रोटोकॉल में कार्यरत हैं, एम्बेडेड संतान अच्छी तरह से नीचे करने के लिए माइग्रेट करेंगे और थाली के तल पर एक निकट confluent मोनोलेयर के रूप में होगा. सेल सीडिंग घनत्व में जिसके परिणामस्वरूप कमी 3 डी नेटवर्क में इन संतानों की विधानसभा को रोकता है. इसके अतिरिक्त, यदि hydrogels एक ऊतक संस्कृति इलाज प्लेट के कुओं में डाल रहे हैं, वे कमजोर अच्छी तरह से आंतरिक सतह बाँध होगा; इस बंधन hydrogel के लिए तनाव लागू होता है. चूंकि यह मंच भौतिक और रासायनिक संकेतों के महत्व को अलग करने के लिएविकसित किया गया था, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को 27 कोशिकाओं को कोई बाहरी बल प्रदान न किया जाए। अस्थायी hydrogels फ़ीड करने के लिए मुश्किल हो सकता है क्योंकि सेल संस्कृति मीडिया के अधिकांश hydrogel नीचे निहित है; इस पर काबू पाने के लिए, प्लेट झुकाव और दीवार की ओर से मीडिया को दूर करने के लिए एक P100 pippette का उपयोग करें.
जब एक confocal माइक्रोस्कोप पर संवहनी नेटवर्क इमेजिंग, यह सुनिश्चित करें कि अतिरिक्त fluorophore शोर अनुपात के लिए एक कम संकेत में परिणाम नहीं है करने के लिए सभी धोने के चरणों का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है. अतिरिक्त फ्लोरोसेंट डिफ़ॉल्ट दहलीज एल्गोरिदम को भ्रमित कर सकते हैं और z-स्टैक binarize करने के लिए मुश्किल बना. इस समस्या को दूर करने के लिए, phaloidin, एक कवक विष है कि चुनिंदा F-actin लेबल का उपयोग करें और सीमित बंद लक्ष्य बाइंडिंग प्रदर्शित करता है. सामान्य में, प्राथमिक एंटीबॉडी है कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए पूर्व-संयुग्मी किया गया है का उपयोग करने के लिए मुक्त fluorophore कि जेल के माध्यम से फैलाना की एकाग्रता को सीमित. जब z-स्टैक उत्पन्न 10-20 microns का एक टुकड़ा गहराई एक उच्च संकल्प छवि के लिए आवश्यकता के खिलाफ एक z-स्टैक प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय संतुलन की सिफारिश की है.
यहाँ 3 डी microenvironments में iPSC-EPs के vasculogenic क्षमता का आकलन करने के लिए एक मात्रात्मक परख का वर्णन किया गया है. यह परख खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करता है और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रहों से अप्रभावित है. फिर भी, यह शारीरिक संवहनी आला के एक oversimplified मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. जबकि iPSC-EPs परिपक्व, कार्यात्मक vasculature के लिए आवश्यक कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, इस परख अन्य सेल प्रकार के योगदान की उपेक्षा (जैसे, फाइब्रोब्लास्ट और मैक्रोफेज) कि vasculogenic प्रक्रियाओं में भाग लेते हैं. इसके अलावा, इस प्रणाली स्थिर है और विकासशील जहाजों को प्रवाह का खुलासा नहीं करता है. अंत में, जबकि कोलेजन मैं ECM28 में प्रमुख प्रोटीन में से एक है और इन विट्रो में अपनी फाइब्रिलर वास्तुकला का कहना है, यह बहुत निर्भर है और कमजोर शारीरिक crosslinking जब उच्च तापमान पर बेअसर तक ही सीमित है. इन सीमाओं के बावजूद, इस परख हृदय रोग चिकित्सा और मॉडलिंग के लिए कार्यात्मक vascualture इंजीनियर करने के लिए खोज में एक महत्वपूर्ण कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान संख्या 15SDG25740035, जे.जेड.), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जैव चिकित्सा इमेजिंग और बायोइंजीनियरिंग संस्थान (NIBIB) के लिए सम्मानित किया (अनुदान संख्या EB007507, सी.सी.) को सम्मानित किया गया), और पुनर्योजी पुनर्वास अनुसंधान और प्रशिक्षण के लिए एलायंस (AR3T, अनुदान संख्या 1 P2C HD086843-01, जे जेड को सम्मानित किया). हम प्रो Jeanne Stachowiak स्वीकार करना चाहते हैं (Austin में टेक्सास विश्वविद्यालय) confocal माइक्रोस्कोपी पर उसकी तकनीकी सलाह के लिए. हम भी शमूएल Mihelic के साथ विचार विमर्श के लिए आभारी हैं (आस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय), डॉ एलिसिया एलन (आस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय), डॉ जूली Rytlewski (अनुकूल बायोटेक), और डॉ लियोन Bellan (Vanderbilt विश्वविद्यालय) पर उनकी अंतर्दृष्टि के लिए 3 डी नेटवर्क की गणना विश्लेषण. अंत में, हम iPSC-EPs में iPSCs अलग करने पर उनकी सलाह के लिए डॉ Xiaoping Bao (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, बर्कले) धन्यवाद.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
References
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