Summary
誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。
Abstract
誘導多能性幹細胞(iPSC)は、任意の体細胞型に分化することができる患者特異的、増殖性細胞源である。二能性内皮前駆体(EP)は、成熟した機能的血管系を組み立てるのに必要な細胞タイプに分化することができ、胚性および誘導多能性幹細胞の両方から得られている。しかし、これらの細胞は3次元環境では厳密に評価されておらず、血管球電位の定量的尺度は依然として解明されていない。ここでは、蛍光活性化細胞選別によるiPSC-EPの生成と単離について最初に概説し、続いてコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化および培養の説明を行う。この細胞外マトリックス(ECM)模倣微小環境は、堅牢な血管学的応答を奨励する。血管ネットワークは、培養の1週間後に形成されます。オープンソースソフトウェアを利用してこの血管学的応答を定量化する計算パイプラインの作成を示す。このパイプラインは、キャピラリープレクサスの 3D アーキテクチャを維持し、ブランチの数、分岐ポイント、およびユーザー入力を最小限に抑えてネットワークの総長を堅牢に識別するように特別に設計されています。
Introduction
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)および他の一次内皮細胞型は、インビトロ1における血管の発芽および発達をモデル化するために20年間利用されてきた。このような血管プラットフォームは、心血管疾患の分子および組織レベルのメカニズムを照らすことを約束し、原始的な血管ネットワーク2,3の発達に生理学的洞察を提示しうる。血管モデリングの分野は大きな進歩を遂げましたが、生理学的血管の発達を定量的にモデル化し評価できる「ゴールドスタンダード」アッセイは依然として解明されていません。ほとんどの公表されたプロトコルは、成熟した機能的な血管の形成を奨励するために血管ニッチを十分に要約しないか、評価された細胞型の血管球電位を3次元で定量的に比較する方法を持っていない(3D)。
多くの現在の血管モデルは、生理血管ニッチを模倣する能力に制限されています。インビトロプラットフォームで最も一般的に採用されているのは、ゼラチン性タンパク質混合物系チューブ形成アッセイです。簡単に言えば、HUVECは、マウス肉腫細胞外マトリックス(ECM)から採取されたタンパク質からなるゲルの薄い層上の単一細胞として播種される。1〜2日以内に、HUVECは原始的な管4に自己集合する。しかしながら、このプロセスは、このアッセイで利用される2次元(2D)および内皮細胞(IC)が密閉された中空の内包を形成せず、それによってこれらの研究の生理的意義を制限する。さらに最近では、ICおよび支持細胞(例えば、間葉系幹細胞(MSC)およびペリサイト)は、コラーゲンまたはフィブリンヒドロゲル5などの天然ECMの繊維構造をシミュレートする3D微小環境で共培養されている。この微小環境における血管発達をモデル化するために、ICでコーティングされたポリマービーズは、典型的には6を採用している。ヒドロゲルに間に埋め込まれた他の細胞によって分泌される外因性成長因子および/または成長因子の添加は、ICを誘導し、ポリマービーズをコーティングし、単一の内気を発芽させ、形成することができる。その後、芽や血管の数と直径を計算することができます。しかし、これらの芽は特異であり、生理学的条件で見られるように密閉された接続されたネットワークを形成しないため、腫瘍血管系モデルを連想させる。マイクロ流体デバイスはまた、血管ニッチを模倣し、ECを含むヒドロゲル7、8における血管系の形成を促進するために利用されている。典型的には、血管新生成長因子勾配は、EC移行および発芽を誘導するために循環細胞培養培地に適用される。発達した血管の内気を構成するICは、マイクロ流体装置を通る流体の流れの適用によって引き起こされるせん断応力に敏感である。したがって、これらのマイクロ流体デバイスは、静的モデルではアクセスできない主要な生理学的パラメータを捕捉します。しかし、これらのデバイスには高価な微細加工能力が必要です。
最も重要なことは、3つの血管モデル(2D、3D、マイクロ流体)すべてが、一次ICと一次支持細胞タイプを圧倒的に利用していることです。一次細胞は、移植時に免疫応答を生じるので、効果的な心血管療法に開発することはできません。さらに、HUVECおよび同様の一次細胞型は患者特異的ではなく、遺伝的性質または既存の健康状態(例えば糖尿病)を有する患者に生じる血管異常を捕捉しない。誘導多能性幹細胞(iPSC)は、患者特異的で増殖性の細胞源として過去10年間に出現しており、人体内のすべての体細胞に分化することができる9。特に、iPSC由来の内皮前駆子(iPSC-EPs)10,11の生成と単離を概説するプロトコルが公開されている。iPSC-EPは二重能であり、したがって、成熟した機能的血管系のビルディングブロックである内皮細胞および平滑筋細胞/ペリサイトにさらに分化することができる。3D微小環境12におけるiPSC-EPからの一次毛細叢の開発を説得力のある詳細に述べた研究は1つだけだ。本研究は、iPSC-EPアセンブリの理解と天然および合成ヒドロゲルの分化にとって重要であるが、得られた血管系のネットワークトポロジを定量的に比較しなかった。別の最近の研究では、ポリマービーズモデルを使用して、HUVECとiPSC由来のIC5の発芽を比較しました。したがって、3D微小環境におけるiPSC-EP血管形成を調節する物理的および化学的シグナル伝達機構をさらに解明し、これらの細胞が虚血療法および心血管疾患に適しているかどうかを判断する必要があることは明らかである。モデリング。
過去10年間で、血管ネットワークの長さと接続性を定量化し、比較するために、さまざまなオープンソースの計算パイプラインとスケルトン化アルゴリズムが開発されました。例えば、Charwatらは、フィブリンマトリックス13,14における脂肪由来幹細胞と成長するICの共培養に由来する血管ネットワークの濾過されたバイナリ化画像を抽出するPhotoshopベースのパイプラインを開発した。おそらく、最も広く使用されているトポロジ比較ツールは、AngioTool、国立がん研究所15によってオンラインで公開されたプログラムです。プログラムの広範な採用と十分に文書化された忠実さにもかかわらず、プログラムは2次元で血管のような構造を分析し、AngioSysとWimasisを含む他のプログラムは、同じ次元制限16を共有しています。イマリス、ルシス、メタモルフなどの強力なソフトウェアスイートは、設計された微小血管のネットワークトポロジを分析するために開発されました。ただし、これらのスイートは、ほとんどのアカデミック ラボにとってコストがかかり、ソース コードへのアクセスを制限する必要があるため、エンド ユーザーが特定のアプリケーションに合わせてアルゴリズムをカスタマイズする機能を妨げる可能性があります。オープンソースの磁気共鳴イメージング/コンピュータ断層撮影パッケージである3Dスライサーには、3D血管ネットワークのトポロジを効果的に分析できる血管モデリングツールキットが含まれています17;ただし、分析はユーザーがネットワークのエンドポイントを手動で配置することに依存します。この原稿では、3D血管ネットワークを定量することができる計算パイプラインについて詳しく説明する。上記の制限を克服するために、このオープンソースの計算パイプラインは、ImageJを使用して取得した共焦点イメージを事前に処理し、3D ボリュームをスケルトンアナライザにロードします。スケルトンアナライザは、並列中間軸間引きアルゴリズムを使用し、もともとKerschnitzkiらによって開発され、骨細胞ネットワーク18の長さと接続性を分析しました。このアルゴリズムは、設計された微小血管の長さと接続性を特徴付けるために効果的に適用することができる。
全体として、このプロトコルは、3Dマイクロ環境における微小血管ネットワークの作成の概要を説明し、オープンソースとユーザバイアスの自由な計算パイプラインを提供し、iPSC-EPの血管学的可能性を容易に比較します。
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Protocol
1. 培養培養剤・コーティングソリューションの調製
- ビトロネクチンコーティング溶液を調製するために、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食べ物(DPBS)でビトロネクチン1:100を希釈する。
注意: 一度希釈すると、将来の使用のためにこのソリューションを保存することはお勧めしません。 - フェノールレッドフリー、成長因子還元ゼラチン状タンパク質混合物(材料の表を参照)をメーカーから受け取ると、混合物が透明かつ流体になるまで氷上で4°Cで融解する。層流フードで氷上に混合物を保持し、1.8 mLマイクロ遠心管に混合物のピペット75 μLを、すぐに-20 °Cで凍結します。これらのアリコートは、最大1年間保存することができます。
注意:このゼラチン状タンパク質混合物は、室温で保つと非常に粘性になり、より高い温度で固化します。このソリューションは氷冷に保ちます。 - コーティングのためにこの混合物を調製するには、氷上の75 μLアリコートを解凍し、6 mLの氷冷ダルベッコの改変イーグル媒体:栄養混合物F-12(DMEM/F12)で希釈します。この調製された容積は12ウェルプレートをコーティングするのに十分である。
- 10mLガラスシンチレーションバイアルに500mgの粉末を5mLの水に加えて、超純水中のアスコルビン酸マグネシウム-2-リン酸(白色凍結乾燥粉末)の100mg/mLストック溶液を調製する。溶液が完全に透明になるまで攪拌バーで攪拌します(これは1時間かかることがあります)。この溶液は-20°Cで最大1年間保存できます。
- 15 mLの円錐遠心管で1.9928 mLの凍結乾燥粉末(DMSO)を溶解し、溶液が透明になるまで37°Cビーズ(または水)浴で温めます。アリコットを1.8mLマイクロ遠心管に入れ、-20°Cで最大1年間保存します。
- ROCK阻害剤であるY-27632(ROCKi)の10mMストックを作成し、15mLのコンフィカル遠心管で3.1225mLの凍結乾燥粉末(DMSO)を溶解し、溶液が透明になるまで37°Cビーズ(または水)浴で温めます。アリコットを1.8mLマイクロ遠心管に入れ、-20°Cで最大1年間保存します。
- エッセンシャル8(E8)培地を調用し、冷凍サプリメントを解凍し、基底培地の500mLボトルに加え、殺菌を濾過する。この溶液は、最大2週間4°Cで保存することができます。
注意:培地製剤中のタンパク質が長時間の使用で劣化する可能性があるため、この培地を37°Cで温めないことは非常に重要です。代わりに、この媒体を室温で15~30分間使用してください。 - ソートバッファーを調剤するには、DPBSに7.5%のウシ血清アルブミン(BSA)の1.33mL、0.5mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)の200 μLをDPBSの48.5mLに加え、0.5%BSAおよび2mMMEDTAの最終溶液を作成します。
- LaSR基底を調製するには、100mg/mLのアスコルビン酸マグネシウム-2リン酸と5mLのグルタマックスを500mLのアドバンストDMEM/F12に加えます。この溶液は、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。
- 内皮細胞増殖培地-2(EGM-2)を調製し、サプリメントを解凍し、基底培地の500mLボトルに添加する。この溶液は、最大1ヶ月間4°Cで保存することができます。
- ブロッキングバッファーを調剤するには、凍結乾燥牛血清アルブミン(BSA)500mg、乳化試薬の50μLをDPBSの48mLに加えます。 BSAが凝固し、その後溶液から分離しないことを確認するために、少なくとも15分間37°Cでインキュベートします。
2. iPSCの解凍、メンテナンス、継ぎ取り
- 凍結保存されたiPSCバイアルを解凍する前に、1mLのビトロネクチン溶液で6ウェルプレートの単一のウェルを塗ります(ステップ1.1に記載されているように調製)。室温で1時間インキュベートする。プレートにE8培地を加える前に、このコーティング空気を乾燥させないようにしてください。
- iPSCを解凍するには、液体窒素貯蔵容器からiPSCの凍結保存バイアルを取り出し、氷の小さな結晶が残るまで37°Cで解凍します。解凍したバイアルの含有量を、8 mLの氷冷DMEM/F12を含む15 mLの円錐遠心管に慎重に(滴下)移します。解凍したバイアルを氷冷DMEM/F12の1mLで洗浄し、細胞の損失を最小限に抑えてください。遠心分離機 300 x gで 5 分.
- 遠心分離機を待っている間、ビトロネクチン溶液を吸引し、ウェルにE8培地(ステップ1.6で説明するように調製)の1 mLを加える。次いで、遠心円錐管からDMEM/F12上清を取り出し、E8培地の1mLでペレットを再度サスペンドする。細胞を新しくコーティングしたプレートに移し、凝固が播種時に凝固するのを防ぐために懸濁液を攪拌することを確認する。
- 通常、解凍後に実質的な細胞死がある。翌朝、培地を取り外し、新鮮なE8培地に置き換えます。
注:最適な条件下でも、iPSCは凍結保存から回復が不十分である傾向があります。単一の6ウェルに将来の種子のために近いコンフルエント6ウェルを凍結保存することをお勧めします。細胞破片の存在は、細胞回収中の最初の2〜3日間正常である。 - 細胞が通過する準備ができるまで、E8培地を毎日交換します(70%~80%の合流性)。
- 通路を通すために、まずビトロネクチンコーティングウェルを調製する(ステップ2.1に記載されているように)。
- ビトロネクチンコーティングされたウェルが準備ができたら(約1時間)、E8培地をよく通行し、DPBSの1 mLで2回洗浄する。0.5 mM EDTAの1 mLで37°Cで5〜7分間インキュベートします。インキュベートしながら、新たにコーティングしたビトロネクチン溶液をよく取り出し、E8培地の1-2 mLに置き換えます。
- 通行するウェルからEDTA溶液を取り出し、E8の1mLで1回または2回静かに洗浄してコロニーを取り外します。75-200 μLの細胞懸濁液を新たにコーティングされたE8含有ウェルに移し、プレートを攪拌して均一なカバレッジを確保し、インキュベーターに直ちに入れます。
注意: iPSC 剥離のインキュベーション時間は細胞線に依存します。このプロトコルのユーザーは、受信/生成された iPSC 回線を十分に拡張したときに、さまざまな回数をテストすることをお勧めします。75 μLの細胞懸濁液は、一般に、通過間4日間で生じます。150 μL 以上は、通路間の 2 ~ 3 日につながります。
3. iPSC由来の内皮前駆器の生成(図1)。
- iPSCを維持する場合は、コロニーが十分に圧縮され、培養中の分化細胞の数が少ないことを確認してください。コロニーが互いに接触し始める場合、細胞はあまりにもコンフルエントである可能性が高く、直ちに通過する必要があります。
- iPSCが70%~80%のコンフルエントである場合は、ゼラチン状タンパク質混合物で24ウェルプレートを塗ります(1.2/1.3に記載されているように調製)。この混合物のピペット250 μLを各井戸に入れ、室温で1時間保持します。
- 上記の1-hインキュベーションの間に、それぞれ冷蔵庫と冷凍庫からE8培地とY-27632を取り出します。E8培地とY-27632が室温に達したら、15 mLの円錐遠心管にE8の13 μLを10 μM Y-27632~13 mLを加えてE8+ROCKiを調製します。
- iPSCウェルからE8培地を取り出し、1mLのDPBSで2回洗浄し、0.5mM EDTAで37°Cで5~7分間インキュベートします。インキュベーション期間の後、EDTAを取り出し、E8+ROCKi培地の1 mLを持つP1000ピペット先端を用いて細胞を単細胞懸濁液に急速にせん断する。
- 血球計で細胞を数えます。何百万ものiPSCを含む懸濁液の場合は、20 μLのセル懸濁液を180 μLのトリパンブルーに加えます。単一セル懸濁液内のセルの総数を決定します。
- 0.432 x 106から 1.296 x 106セル (104 ~ 3 x 104セル/cm2)を残りの E8 + ROCKi 培地に転送します。新たにコーティングされた12ウェルプレートからゼラチン状の混合物コーティングを取り除き、各ウェルに500μLの細胞懸濁液を加え、細胞が十分に分布し、小さな塊を形成しないことを保証します。
注:この密度の範囲は、CD34陽性細胞の分化に最適です。ただし、これらのシード密度はセルラインに依存するため、このプロトコルのユーザが最適化する必要がある場合があります。 - 培養の24時間後、新鮮なE8培地の500 μLで培地を交換してください。同じ条件下でさらに24時間インキュベートします。
- E8培地を取り外し、CHIR99021の6-12 μMを補充したLaSR基底に置き換えます。このタイムポイントは、差別化の D0 として定義されます。24時間培養後、同じ細胞培養培地に置き換える。
注: 前述のように、この媒体に追加される CHIR99021 の量は、使用される iPSC 回線によって異なります。最適な結果を確認するために、CHIR99021濃度の範囲をテストしてください。 - CHIR99021で48時間のインキュベーションを行った後、LaSR基底の1mLで交換してください。
- 2-3追加の日のためのLaSR Basalの2 mLで毎日媒体を交換します。この時点で(分化のD5)、これらの細胞のかなりの割合はCD34を発現し、内皮前駆体として特徴付けることができる。このプロトコルの概略図は図1の代表的な結果と概説され、この方法11,19を最初に公開した研究者によって完全に説明される。
注:これらの内皮前駆子は、内皮系統に沿ってさらに分化することができる(35%-99%)または平滑筋系統(1%-65%)。分化効率は、分化20の間に使用されるECMコーティングおよび細胞培養培地の種類によって異なる。
4. 内皮前駆器のFACS
- D5/D6分化細胞を解離する前に、ステップ1.8で説明したソートバッファを準備し、氷の上に保管してください。
- 分化した細胞をウェル当たり250μLの細胞剥離液でインキュベート(材料の表を参照)を37°Cで10分間インキュベートします。
- P1000ピペット先端で細胞を細胞剥離液中の単一細胞懸濁液に解離する。15 mLの円錐遠心管と遠心分離機でセル細胞剥離溶液混合物を300 x gで5分間統合します。
- 上清を取り外し、200 μLの氷冷選別バッファーで再中断します(ステップ1.7で説明したように調製)。濃縮CD34-PE抗体の5μLを細胞選別バッファー懸濁液に加え、4°Cで10分間インキュベートする。
- 氷冷ソーティングバッファの5 mLで再中断します。ソーターに置く前に、40 μmキャップを持つセルストレーナーを通してこの懸濁液をフィルタリングします。
- 適切な蛍光チャネル上で、蛍光抗体で標識されていない10,000細胞をソートする。これらの10,000細胞のいずれも含まない高い蛍光強度で領域をゲートする(図1D)。これは負のコントロールとして機能します。
- 蛍光溶液で標識されたiPSC-EPを含むサンプルを実行し、ソートを開始します。CD34は、これらの内皮前駆体において高度に発現され、主要集団から容易に分離される。ソート後、溶液を15mLの円錐遠心管と遠心分離機に300 x gで5分間移します。上清を取り除く。
注:溶液がマイクロ遠心管よりも大きいチューブ(例えば、多くのFACプロトコルで一般的に使用される5 mLポリスチレンチューブ)にある場合は、ソートバッファーの1 mLでソートされたセルペレットを再中断し、この溶液をマイクロ遠心管に移します。300 x gで5分間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。- オプション:さらなるiPSC-EP特性化が望ましい場合は、CD34-PEと同時に他の一次抗体(例えば、CD31-APC)を添加する。異なる蛍光チャネル間のクロストークが最小限に抑えられるようにします。
5. iPSC-EPを含むコラーゲンヒドロゲルの封入と長期培養
- 10x培地199~400μLの内皮増殖培地(EGM-2)の40μLを1.8mLマイクロセントリフュージに添加し、チューブを氷上に置いて種分培地を調製する。
注:幹細胞培養や分化細胞の維持には抗生物質の使用はお勧めしませんが、選別環境での無菌性を保証することは困難であるため、選別後にPen/Strepを投与することをお勧めします(これはより多くのです。ソーターが多くのラボ間で共有されている場合は必須です)。 - 細胞懸濁液からすべての上清を取り除き、10 μM Y-27632を補充したEGM-2の200 μLを追加します。細胞懸濁液を播種培地に移し、激しく混ぜる。
- ステップ5.2で調製した溶液に350μLのコラーゲンを加え、よく混ぜます。溶液は淡い黄色になります。
注:コラーゲンの最終的な濃度は、毛細血管叢の形成に大きな影響を与えることができます。このプロトコルは、コラーゲンが10mg/mLで供給され、ヒドロゲルの最終濃度が3.5mg/mLであることを前提としています。最終的なコラーゲン濃度を達成するために、これらのボリュームを調整します。最終的なコラーゲン濃度を 2 mg/mL から 4 mg/mL に制限することをお勧めします。 - 5.3で調製した溶液に1M NaOHの5 μLを加え、気泡の導入を避け、よく混ぜます。解決策は明るいピンクになります。
- 96ウェル超低アタッチメントU-ボトム細胞培養プレートの個々のウェルに5.4で調製した中和コラーゲン細胞溶液のピペット56μL。37 °Cで30分間インキュベートします。培地を追加する前に、明視野顕微鏡でサンプルを調べることで、細胞が均等に分布していることを確認してください。
- マイクロ遠心管に各ストック溶液の1μLを添加することにより、10 μM Y-27632および50 ng/mL血管内皮成長因子(VEGF)を添加したEGM-2からなる培養培地の1mLを調製する。よく混合した後、この細胞培養培地のピペット100μLを細胞積み重ねヒドロゲル上に置く。長期間培養するためにプレートを37°Cに移します。
- 培養培地を毎日置き換え、研究の目的に従って血管新生成長因子または低分子阻害剤を追加する。メディアを最適に取り外すには、プレートを傾け、P100チップを使用して、ヒドロゲルを邪魔することなく、穏やかに媒体を吸引します。
6. EPベースの血管ネットワークの固定、免疫染色、可視化
- 1週間培養後、4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液の250 μLを48ウェルプレートに加えます。ヒドロゲルがあるのと同じくらい多くの井戸を埋めます。ヒドロゲル(PFA)から培地を取り出し、細かいピンセットを使用して、ウェルを含むPFAにヒドロゲルを移します。室温で10分間インキュベートし、PBSで速く洗浄してPFAを除去します。
- 室温で5分間、ニオニオニック界面活性剤(材料の表を参照)の0.5%の250 μLを加えて透過化する。300 mMグリシンを補充したPBSの250 μLで2回洗浄します。余分な洗剤の除去を確実にするために、各洗浄工程のために室温で5分間インキュベートします。ヒドロゲルを250μLのブロッキングバッファーに30分間浸漬してブロックする。
- 所望の一次抗体を4°Cで一晩ブロッキングバッファーで希釈してインキュベートする。例えば、ファロイジンおよびVE-カドヘリンによる免疫染色の場合、それぞれ1:40および1:200を希釈するバッファー内で。
- 翌日、一次抗体溶液を取り出し、DPBSで0.5%乳化試薬で2回洗浄する。アルミホイルで覆い、種特異的二次抗体(例えば、PBSで1:200 Alexa Fluor 488)で2時間室温でインキュベートします。
- 二次抗体溶液を取り出し、DPBSで0.5%乳化試薬で2回洗浄します。各洗浄工程で室温で5分間インキュベートし、フリー蛍煙の除去を確保します。
- 細胞核を可視化するには、4'、6-ジアミド-フェニリンドール(DAPI)1:10000をPBSで希釈し、試料に添加する。
- 室温で2分間インキュベートし、PBSで2回洗浄します。各洗浄工程で室温で5分間インキュベートし、フリー蛍煙の除去を確保します。
- 微細なピンセットを使用して、血管新生μ-Slideまたはガラス底ペトリ皿にサンプルを転送します。ヒドロゲルの下に気泡が閉じ込められていないことを確認します。
- サンプルの下部から上部に伸びるZスタックを取得することにより、共焦点顕微鏡上の画像。検出器が飽和状態で、使用可能な最小倍率が使用されていることを確認します(大きな視野が望ましい場合)。
注: 将来の処理では、Z スタックが最小限の圧縮 (.czi など) で保存されていることを確認してください。
7. 計算パイプラインを使用して血管ネットワークトポロジを分析および比較する
- 各 Z スタックを検査して、スライスに容器のみが含まれていることを確認します。ImageJ で Z スタックを開き、[イメージ>調整>明るさ/コントラスト]をクリックしてコントラストを高めます。船舶の境界線が明確に区切られ、背景レベルが最小化されました。多くの場合、Z ディメンションは x/y ディメンションと一致しません。これを修正するには、[イメージ>サイズを調整し、Z スライスの数を変更して、各スライス間の距離が x/y. ImageJ の 1 ピクセルに相当するように変更します。 この手順が正しく実行されない場合、最後の 3D ボリュームは圧縮されたように表示されます。
注意:ICはゲルの端に向かって移動し、小さな石畳のコロニーを形成します。これらはヒドロゲルの境界を推定するのに有用であるが、それらは最終的な画像分析を妨げ、削除されるべきである。
注:ImageJは、国立衛生研究所と光学・計算計測研究所が共同で開発したJavaベースのオープンソース画像解析ソフトウェアです。単に便利なプラグイン(https://fiji.sc/)にバンドルされたImageJであるフィジーをダウンロードすることをお勧めします。 - ImageJ では、3 次元クリックで画像をぼかし、[プロセス>ガウス ブラー 3D]をクリックし、3 次元すべてでシグマ値を 2.0 に設定します (この値はエンド ユーザーが調整する必要がある場合があります)。
- ImageJ で、[プロセス>バイナリ>バイナリを作成]をクリックし、適切なしきい値アルゴリズムを選択します。Liらによって開発されたクロスエントロピー閾値アルゴリズムは、バックグラウンド21から血管を分離するのに有効である。各画像のしきい値を計算し、背景を「デフォルト」に設定します。
- ImageJ では、[プロセス>ノイズ>外れ値の削除] をクリックして、スプリアスノイズを削除し、ルーメンの「穴」を埋めます。
注:「明るい」外れ値を削除すると、接続された容器の小さな穴が埋まる。「暗い」外れ値を削除すると、死んだ細胞が削除されます。除去半径のサイズは、容器の拡大とサイズに応じります。512 x 512 ピクセルの広視野目標で取得された画像の場合、半径は通常 4 ~ 6 ピクセルの範囲になります。 - ステップ 7.6 に進む前に、すべての生のファイル (czi 拡張子など) を処理し、.tif ファイルに変換します。この処理を支援するために、ImageJ スクリプト "Binarize and Filter.ijm" がこの原稿に添付されています。
- 処理された .tif ファイルを、原稿でダウンロードできるファイル "BatchProcessSkeleton.m" と同じフォルダーに保存します。著者によって開発されたこのスクリプトは、フィリップ・コルマンスバーガー22によって公開された関数を呼び出し、いくつかの追加のファイル操作を行います。
- 2つの主要な機能「Skel2Graph3D」(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d)と「スケルトン3D」(https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d)に関連するすべてのファイルをダウンロードして解凍します。開いた処理済み z スタックと同じフォルダーにすべての関数を保存します。
- マルチパラダイム数値計算環境(「材料の表」を参照)を開き、上記のすべてのファイルが保存されているフォルダに移動します。
- コマンド ウィンドウでBatchProcessSkeletonを入力するか、スクリプトを開き、エディタで実行ボタン (右向きの緑色の矢印) を押して "BatchProcessSkeleton.m" を実行します。
注: 単一のコマンドで大きなデータセットを分析するには、6 行線のdir関数内の文字列にアスタリスク ('*.tif' など) が含まれていることを確認します。それ以外の場合は、単一のファイルの分析が必要な場合は、アスタリスクをファイル名に置き換えます。 - このスクリプトの実行にかかる時間は、使用可能なコンピューティング能力によって大きく異なります。スクリプトの実行中にユーザーが他のプログラムにアクセスできるように、少なくとも 8 GB の RAM を搭載したコンピュータでこの分析を実行することをお勧めします。
注意: 厳密には必要ではありませんが、元の共焦点集録 (灰色) をグラフ化し、このイメージ マトリックスをスケルトン マトリックス (赤色) でオーバーレイすると、スケルトン化アルゴリズムのパフォーマンスを評価するのに役立ちます。さらに、読者は、Kollmannsbergerらによって実装された節点グラフを作成して、ネットワーク解析の精度を評価することができる。両方のグラフを作成すると便利ですが、スクリプトの実行時間が大幅に増加し、追加のメモリが必要になります。ユーザーが単に最終的なトポロジ分析を必要とし、データ セットを視覚化したくない場合は、単に行 44 から 61 (スケルトン グラフ) と行 104 から 143 (トポロジ グラフ) をコメントアウトします。 - 完了すると、ワークスペースに表示されるデータマトリックスに処理されたデータが含まれるようになりました。[データ]をダブルクリックし、変数エディタでこのセルを開きます。
- このマトリックスには、左から右へ:1)ファイル名、2)ノード数(分岐点+終点)、3)ブランチポイント、4)リンク(船舶)、5)ネットワーク長(隔離容器を含む)、および6)Zスタックに含まれるスライスの数が含まれます。このデータを .csv ファイルとして保存し、任意のソフトウェアにさらに分析をエクスポートします。
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Representative Results
分化(図1)、FACSおよびコラーゲンヒドロゲル中のiPSC-EPのカプセル化後、細胞は通常、移行し、初期ルーメンを形成し始める前に24時間丸みを帯びたままになります。約6日間の培養後、ブライトフィールド顕微鏡で見ると、原始毛細叢がヒドロゲルに見える(図2)。共焦点顕微鏡(ムービー1、補足ムービー1)で固定された染色された細胞を含むヒドロゲルをイメージングした後、前処理された画像は、ネットワークの全体的な長さと接続性の分析を可能にする骨格に変換されます。これらの定量的測定を使用して、堅牢な血管ネットワークを生成するために最適な条件セットを決定できます。
このプロトコルは、局所的な物理的および化学的手がかりに応答する堅牢な3次元毛細叢の開発を可能にする。前の研究では、このネットワーク形成は、マトリックス密度、マトリックス剛性、マトリックスメタロプロプロシティ阻害、および種々の血管新生性マイトゲン20、23のタイプおよび濃度に敏感であることが示されている。
図1:多能性幹細胞からのiPSC-EPの生成(A) 10月4日に陽性に染色したWiCell 19-9-11 iPSCをE8培地で培養し、10 μM Y-27632 ROCK阻害剤を48h(B)用に10μM Y-27632 ROCK阻害剤で培養し、次いで、LaSR Basal培地で6μMのCHIR99021を用いて誘導した。中皮マーカーであるブラチュリーに陽性であった。(C) 細胞は、内皮前駆体のマーカーであるCD34を発現するまでLaSR基底培地でさらに培養した。(D)分化細胞の約15%~25%がCD34を発現した。すべてのスケールバーは200 μmの長さを表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:コラーゲンヒドロゲルにおけるiPSC-EP血管ネットワークの生成と解析(A) iPSC-EPからの血管ネットワーク形成を促進するためにこのアッセイで用いられる3D微小環境の断面。浮遊コラーゲンヒドロゲルはiPSC-EPsで播種され、50 ng/mL VEGFおよびY-27632の一時的な用量を補充したEGM-2に曝露される。(B)得られた毛細管叢は、F-アクチン(シアン)による染色を介して可視化されるように、高度に分岐し、相互接続される。左側に示すバイナライズされたイメージは、ImageJ を使用した前処理によって生成されます。このZスタックは、以前に開発されたアルゴリズムを介して分析され、ネットワークをスケルトン化し(細い赤い線のコレクションに示す)、ブランチ(黄色)、終点(青)、孤立した容器(黒)、接続されたネットワークトポロジを分析します。容器(赤)。スケールバーは、100m. (C)iPSC-EPsを含むコラーゲンヒドロゲルの形態変化を表す:播種後24時間、iPSC-EPは球状のままであり、96時間以内に徐々により細長い表現型を取る。さらなる培養は、144時間の時点でのインセットに示すように、内膜含有VE-カドヘリンネットワークの組み立てをもたらす。スケールバーは400 μmの長さを表します。緑 = VE-カドヘリン、赤 = F アクチン、青 = DAPI。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ムービー1:VASCULATURE生成フロムiPSC-EPのZスタック。血管ネットワークを固定し、Fアクチンで染色し、共焦点顕微鏡上でZスタックを取得して可視化した。スライスは17μm間隔で取得した。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
補足ムービー1:容器の3Dレンダリング。血管ネットワークを固定し、Fアクチン(赤)とVEカドヘリン(緑)で染色し、共焦点顕微鏡上でZスタックを取得して可視化した。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、E8、LaSR基底、およびEGM-2の3種類の細胞培養培地における細胞の長期培養を含む。したがって、すべての材料を適切に殺菌するために細分注意する必要があります。さらに、ラボコートとエタノール洗浄手袋は、実験室の層流フードで作業する場合は常に着用する必要があります。マイコプラズマ汚染を頻繁にテストすることをお勧めします。iPSC培養中に大量の破片が観測されたり、分化効率が急激に低下したりすると、マイコプラズマ汚染が原因と考えられます。このプロトコルで生成されたiPSC-EPは、解離時間を長くし、単一細胞懸濁液を小さな塊に分離させるECMのかなりの量を堆積する傾向があります。溶液がiPSC-EP上のCD34エピトープを破壊する可能性があるため、トリプシン-EDTA(0.25%)を使用しないでください。しかし、コラゲナーゼ/ディスパーゼ溶液による治療は、沈着したECMを除去し、標準的な細胞剥離溶液で解離を容易にする。広範な解離後、細胞およびECMのいくつかの小さな塊が残る。彼らは細胞ストレーナーを詰まらせるか、FACSを妨害する可能性が高いので、P100ピペット先端でこれらの塊を削除します。
多能性幹細胞は解離に敏感であり、ROCK阻害剤(一般Y-27632)を培地24に添加しない限り、単細胞懸濁液中でアポトーシスを受ける。iPSC-EP も解離に敏感です。培養の最初の24時間に10μMでY-27632を含む細胞の生存および増殖を増加させるために不可欠である。したがって、ROCK阻害剤は、FACS直後のヒドロゲルおよび周囲媒体の両方に含まれることが重要である。iPSC-Pのシード密度は、船舶の開発とネットワーク全体のサイズにも大きな影響を与えます。一般に、500,000細胞/mLから300万細胞/mLの濃度は、播種密度の適切な範囲である。播種密度のさらなる増加は、多くの場合、ヒドロゲル圧縮および細胞死につながる。
ECM構造タンパク質の密度は、工学的微小血管系25,26の開発に大きな影響を及ぼすことが見出されている。一般に、ECMベースのヒドロゲル(多くの場合、コラーゲンまたはフィブリン)の密度を高めることは、血管ネットワークの長さと接続性を制限します。したがって、コラーゲンマトリックス密度に細心の注意を払う必要があります。2mg/mL未満の濃度は、コラーゲンヒドロゲルの早期タンパク化分解を促進し、ヒドロゲルの構造的完全性の回復不能な損失をもたらす。対照的に、4 mg/mLを超える濃度は、接続性が悪い短い広いルーメンの形成を誘発する。ヒドロゲルの変形性と細孔サイズの変化は、主にこの破壊20を担当しています。
細胞および細胞を含むコラーゲンヒドロゲルは、超低アタッチメントプレートに結合しません。ヒドロゲルは、メディアに懸濁されたままになる傾向があり、時折井戸の上部に浮かびます。組織培養処理プレートがこのプロトコルで使用されている場合、埋め込まれた前駆体は井戸の底部に移行し、プレートの底部に近いコンフルエント単層を形成します。その結果、細胞播種密度の低下は、これらの前駆者の3Dネットワークへの集合を阻害する。さらに、ヒドロゲルが組織培養処理プレートの井戸に鋳造された場合、それらは弱くウェルの内面を結合します。この結合は、ヒドロゲルに歪みを適用する。このプラットフォームは、物理的および化学的手がかりの重要性を分離するために開発されたので、細胞27に余分な力が与えなくてはならないことが重要である。浮遊ヒドロゲルは、細胞培養培養培養媒体のほとんどがヒドロゲルの下にあるため、供給が困難な場合があります。これを克服するには、プレートを傾け、P100ピペットを使用して壁の側面からメディアを取り外します。
共焦点顕微鏡で血管ネットワークをイメージングする場合、過剰な蛍煙球が低い信号対雑音比にならないように、すべての洗浄手順に従うことが重要です。過剰な蛍光は、デフォルトの閾値アルゴリズムを混乱させ、Zスタックをバイナライズするのを困難にする可能性があります。この問題を克服するために、F-アクチンを選択的に標識し、限られたオフターゲット結合を表示する真菌毒素であるファロイジンを使用してください。一般に、二次抗体に事前に結合された一次抗体を使用して、ゲルを通して拡散するフリーフルオロフォの濃度を制限する。Z スタックを生成する場合は、Z スタックの取得に必要な時間と高解像度のイメージの必要性とのバランスを取るために、10~ 20 ミクロンのスライス深度を使用することをお勧めします。
ここでは、3Dマイクロ環境におけるiPSC-EPの血管学的電位を評価する定量的アッセイについて説明する。このアッセイはオープンソースソフトウェアを利用しており、ユーザーのバイアスの影響を受けません。それでも、生理学的血管ニッチの過度に単純化されたモデルを表す。iPSC-EPは成熟した機能的血管系に必要な細胞に分化することができますが、このアッセイは血管球骨プロセスに関与する他の細胞タイプ(例えば、線維芽細胞およびマクロファージ)の寄与を無視する。さらに、このシステムは静的であり、流れに現像容器を露出しない。最後に、コラーゲンIはECM28の主要タンパク質の一つであり、インビトロでその線維構造を維持する一方で、それは多依存性であり、高温で中和された場合に弱い物理的架橋に限定される。これらの限界にもかかわらず、このアッセイは、心血管疾患治療およびモデリングのための機能的血管系を設計するための探求において重要な前進を表す。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、米国心臓協会(助成番号15SDG25740035、J.Z.に授与)、国立衛生研究所の生物医学イメージングとバイオエンジニアリング研究所(NIBIB)(助成番号EB007507、C.C.に授与)によって支援されました。再生リハビリテーション研究・訓練同盟(AR3T、助成番号1 P2C HD086843-01、J.Z.に授与)私たちは、ジャンヌ・スタッコワック教授(テキサス大学オースティン校)が共焦点顕微鏡に関する技術的助言を受け入れたいと思います。また、サミュエル・ミヘリック(テキサス大学オースティン校)、アリシア・アレン博士(オースティンのテキサス大学)、ジュリー・リトルフスキ博士(アダプティブ・バイオテクノロジー)、レオン・ベラン博士(ヴァンダービルト大学)とのディスカッションにも感謝しています。3Dネットワークの計算分析。最後に、iPSCをiPSC-EPに分化するためのアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のXiaoping Bao博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
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