Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Модель In Vitro 3D и вычислительный трубопровод для количественной оценки васкулогенного потенциала iPSC-производных эндотелиальных прародителей

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59342
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

Эндотелиальные прародители, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC-EPs), обладают потенциалом для революционизации лечения сердечно-сосудистых заболеваний и создания более верных моделей сердечно-сосудистых заболеваний. Здесь описана инкапсуляция iPSC-EPs в трехмерных (3D) коллагеновых микросредах и количественный анализ васкулогенного потенциала этих клеток.

Abstract

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) являются специфическим для пациента, пролиферативным источником клеток, который может дифференцироваться в любой тип соматических клеток. Бипотентэндилиальных прародителей (EPs), которые могут дифференцировать в типы клеток, необходимых для сборки зрелых, функциональных сосуд, были получены из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Однако эти клетки не были тщательно оценены в трехмерных средах, и количественное измерение их васкулогенного потенциала остается неуловимым. Здесь сначала очерчиваются генерация и изоляция iPSC-EPs с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток, за которым ипотретешься инкапсуляция и культура iPSC-EPs в коллагеновых гидрогелях. Эта внеклеточная матрица (ECM)-мимикрирующая микроокружение поощряет надежную васкулогенную реакцию; сосудистые сети образуются после недели культуры. Очертивалось создание вычислительного конвейера, используюго программное обеспечение с открытым исходным кодом для количественной оценки этого васкулогенного ответа. Этот конвейер специально разработан для сохранения 3D-архитектуры капиллярного сплетения для надежного определения количества ветвей, точек ветвления и общей длины сети с минимальным пользовательским входом.

Introduction

Человеческие пупочные вены эндотелиальных клеток (HUVECs) и других основных типов эндотелиальных клеток были использованы в течение двух десятилетий для моделирования прорастания кровеносных сосудов и развития в пробирке1. Такие сосудистые платформы обещают осветить молекулярные и тканевые механизмы сердечно-сосудистых заболеваний и могут представить физиологическое понимание развития примитивных сосудистых сетей2,3. Хотя область сосудистого моделирования стала свидетелем значительных достижений, "золотой стандарт" анализ, который может количественно моделировать и оценивать физиологическое развитие сосудов остается неуловимым. Большинство опубликованных протоколов не адекватно резюмировать сосудистую нишу для поощрения формирования зрелых, функциональных кровеносных сосудов или не имеют метода количественного сравнения васкулогенного потенциала оцениваемых типов клеток в трех измерениях ( 3D).

Многие современные сосудистые модели ограничены в своей способности имитировать физиологическую сосудистую нишу. Один из наиболее часто используемых в пробирке платформ является желатиновый белок смеси основе трубки анализа. Кратко, HUVECs семя как одиночные клетки на тонком слое геля который consist of протеины собранные от внеклеточной матрицы саркомы murine (ECM); в течение одного-двух дней, HUVECs самостоятельно собирать сяпок в примитивные трубы4. Тем не менее, этот процесс происходит в двух измерениях (2D) и эндотелиальных клеток (ECs), используемых в этом исследовании не образуют закрытые, полые люмены, тем самым ограничивая физиологическое значение этих исследований. В последнее время, ECs и поддерживающие клетки (например, мезенхимальные стволовые клетки (MSC) и перициты) были совместно культивированы в 3D микросредах, которые имитируют волокнистую архитектуру родного ECM, такие как коллаген или фибринин гидрогели5. Для моделирования развития сосудов в этой микросреде, полимерные бусы, покрытые eCs, как правило, используются6. Добавление экзогенных факторов роста и/или факторов роста, выделяемых другими клетками, интерстилиально встроенными в гидрогель, может побудить ОР, покрывающие полимерные бусы, прорастать и сформировать один просвет; количество и диаметр ростков и сосудов могут быть вычислены. Тем не менее, эти ростки являются единственными и не образуют замкнутую, связанную сеть, как это видно в физиологических условиях и, таким образом, больше напоминает модель сосуды опухоли. Микрофлюидические устройства также были использованы для имитации сосудистой ниши и содействия образованию сосудов в EC-Ладена гидрогелей7,8. Как правило, ангиогенный фактор роста градиент применяется к циркулирующей среде культуры клеток, чтобы вызвать миграцию ИК и прорастание. ЭК, составляющие просвет развитых сосудов, чувствительны к стрессу сдвига, вызванному применением потока жидкости через микрофлюидное устройство; таким образом, эти микрофлюидные устройства фиксируют ключевые физиологические параметры, которые не доступны в статических моделях. Однако эти устройства требуют дорогостоящих микрофабрикационных способностей.

Самое главное, все три сосудистые модели (2D, 3D, микрофлюидные) в подавляющем большинстве используют первичные ОР, а также первичные поддерживающие типы клеток. Первичные клетки не могут быть разработаны в эффективную сердечно-сосудистую терапию, потому что клетки породят иммунный ответ при имплантации; кроме того, HUVECs и аналогичные типы первичных клеток не являются конкретными для пациентов и не фиксируют сосудистые аномалии, которые возникают у пациентов с генетической предрасположенностью или уже существующими заболеваниями, например, сахарным диабетом. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) появились в последнее десятилетие в качестве пациента конкретных, пролиферативных клеток источника, которые могут быть дифференцированы во все соматические клетки в организме человека9. В частности, были опубликованы протоколы, в которых излагаются генерации и изоляции iPSC полученных эндотелиальных прародителей (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs являются бипотентными и поэтому могут быть дополнительно дифференцированы в эндотелиальные клетки и гладкие мышечные клетки/перициты, строительные блоки зрелой, функциональной сосуды. Только одно исследование убедительно подробно развитие первичного капиллярного сплетения от iPSC-EPs в 3D микросреде12; хотя это исследование имеет решающее значение для понимания сборки iPSC-EP и дифференциации естественных и синтетических гидрогелей, оно не количественно сравнило сетевые топологии результирующей сосуды. Другое недавнее исследование использовало полимерную модель бисера для сравнения прорастания HUVECs и iPSC-производных ECs5. Таким образом, существует явная необходимость дальнейшего выяснения физических и химических сигнальных механизмов, которые регулируют iPSC-EP васкулогенез в 3D микросреде и определить, если эти клетки подходят для ишемической терапии и сердечно-сосудистых заболеваний Моделирования.

В последнее десятилетие были разработаны различные вычислительные трубопроводы с открытым исходным кодом и алгоритмы скелетизации для количественной оценки и сравнения длины и подключения сосудистой сети. Например, Charwat et al. разработали конвейер на основе Photoshop для извлечения фильтрованного, бинарного изображения сосудистых сетей, полученных из совместной культуры стволовых клеток, полученных из жировых стволовых клеток и экаторов в фибринной матрице13,14. Возможно, наиболее широко используемым инструментом сравнения топологии является AngioTool, программа, опубликованная в Интернете Национальным институтом рака15; несмотря на широкое распространение программы и хорошо документированную верность, программа ограничивается анализом судовых структур в двух измерениях и других программ, включая AngioSys и Wimasis, имеют одно и то же ограничение размерности16. Для анализа сетевой топологии микроваскулярии были разработаны мощные пакеты программного обеспечения, такие как Imaris, Lucis и Metamorph; однако эти пакеты являются непомерно затратными для большинства академических лабораторий и ограничивают доступ к исходному коду, что может помешать конечному пользователю настроить алгоритм под их конкретное приложение. 3D Slicer, с открытым исходным кодом магнитно-резонансной томографии / компьютерной томографии пакет, содержит сосудистого моделирования Toolkit, которые могут эффективно анализировать топологию 3D сосудистых сетей17; однако, анализ зависит от пользователя, вручную размещающего конечные точки сети, которые могут стать утомительными при анализе большого набора данных и могут зависеть от подсознательных предубеждений пользователя. В этой рукописи подробно описан вычислительный конвейер, который может количественно очислить 3D сосудистые сети. Чтобы преодолеть вышеизложенные ограничения, этот вычислительный конвейер с открытым исходным кодом использует ImageJ для предварительного обработки приобретенных конфокальных изображений для загрузки 3D-объема в анализатор скелета. Анализатор скелета использует параллельный медиальная оси истончение алгоритма, и первоначально был разработан Kerschnitzki et al. для анализа длины и подключения остеоцитных сетей18; этот алгоритм может быть эффективно применен для характеристики длины и подключения инженерных микроваскулярности.

В целом, этот протокол описывает создание микрососудистых сетей в 3D микросреде и обеспечивает открытый исходный код и пользовательские предубеждения свободного вычислительного трубопровода, чтобы легко сравнить васкулогенный потенциал iPSC-EPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка культурных носителей и покрытий

  1. Для приготовления раствора покрытия витромонектина разбавляют витромонектин 1:100 в фосфатно-буферном сольниковом растворе Dulbecco (DPBS).
    ВНИМАНИЕ: После разбавления не рекомендуется хранить это решение для использования в будущем.
  2. После получения фенола без красного, фактор роста снижение желатиновой белковой смеси (см. Таблица материалов) от производителя, оттаивать на льду при 4 градусов по Цельсию, пока смесь не станет прозрачной и жидкости. Сохраняя смесь на льду в ламинарном капоте потока, пипетка 75 л. смеси в микроцентрифуге мощностью 1,8 мл и немедленно замерзает при -20 градусов по Цельсию. Эти aliquots могут храниться до одного года.
    ВНИМАНИЕ: Эта желатиновая белковая смесь становится очень вязкой при комнатной температуре и затвердевает при более высоких температурах. Держите этот раствор ледяным.
  3. Чтобы подготовить эту смесь для покрытия, разморозить 75 л аликот на льду и разбавить 6 мл ледяной Dulbecco в модифицированных Eagle Medium: Питательная смесь F-12 (DMEM/F12). Этого подготовленного объема достаточно, чтобы покрыть 12 хорошо пластины.
  4. Приготовьте 100 мг/мл бульонного раствора аскорбиновой кислоты магния-2-фосфата (белый лиофилизированный порошок) в ультрачистой воде, добавив 500 мг порошка до 5 мл воды в 10 мл стеклянного сцинтилляционного флакона. Агитировать с перемешивания бар, пока решение полностью прозрачным (это может занять до часа). Это решение может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение одного года.
  5. Создайте запас 10 мМ CHIR99021 (CHIR), растворив 10 мг лиофилизированного порошка в 1,9928 мл диметилсульфида (DMSO) в конической центрифуге 15 мл и прогрейтесь в 37-й ванне (или воде) до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Aliquot в 1,8 мл микроцентрифуговых труб и хранить при -20 градусов по Цельсию в течение одного года.
  6. Создайте запас 10 мМ Y-27632, ингибитор ROCK (ROCKi), растворив 10 мг лиофилизированного порошка в 3,1225 мл диметилсульфида (DMSO) в 15 мл конической центрифуги трубки и теплой в 37 градусов по Цельсию (или воды) ванне до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Aliquot в 1,8 мл микроцентрифуговых труб и хранить при -20 градусов по Цельсию в течение одного года.
  7. Для приготовления основных 8 (E8) средних, оттепель замороженные добавки, добавить в 500 мл бутылку базальной среды, и фильтр стерилизовать. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение двух недель.
    ВНИМАНИЕ: Очень важно не нагревать эту среду при 37 градусах Цельсия, так как белки в средней формуле могут деградировать при длительном применении. Вместо этого, держать эту среду при комнатной температуре в течение 15 до 30 минут перед использованием.
  8. Для подготовки сортировки буфера, добавить 1,33 мл 7,5% бычьего сыворотки альбумина (BSA) в DPBS и 200 л 0,5 мм этиленденедиаминететраатическая кислота (ЭДТА) до 48,5 мл DPBS для создания окончательного решения 0,5% BSA и 2 мМ EDTA.
  9. Для приготовления LaSR Basal добавьте 300 л из 100 мг/мл аскорбиновой кислоты магния-2-фосфата и 5 мл GlutaMAX до 500 мл Advanced DMEM/F12. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одного месяца.
  10. Для приготовления эндотелиальной клеточной среды роста Medium-2 (EGM-2), оттепели добавки и добавить к 500 мл бутылку базальной среды. Это решение может храниться при 4 градусах Цельсия в течение одного месяца.
  11. Для приготовления блокирующего буфера добавьте 500 мг лиофильного сывороточки (BSA) и 50 л эмульгирующего реагента (см. Таблица материалов) до 48 мл DPBS. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение по крайней мере 15 минут, чтобы убедиться, что BSA не слипаются и впоследствии отделяются от раствора.

2. Оттачивание, техническое обслуживание и пропуск iPSCs

  1. Перед оттаиванием криоконсервированного флакона iPSC покрасьте одну скважину из 6-колодца с 1 мл раствора витромонектина (подготовленного как описано в шаге 1.1). Инкубировать в течение одного ч при комнатной температуре. Не дайте этому покрытию воздуха высохнуть перед добавлением E8 среды на пластину.
  2. Для размораживания iPSCs, получить криоконсервированный флакон iPSCs из его контейнера для хранения жидкого азота и оттепели при 37 градусов по Цельсию, пока небольшой кристалл льда остается. Тщательно (капля) перенесите содержимое оттаятого флакона в коническую центрифугу 15 мл, содержащую 8 мл ледяного DMEM/F12. Вымойте талой флакон с добавлением 1 мл ледяной DMEM/F12, чтобы свести к минимуму потерю клеток. Центрифуга в течение 5 мин при 300 х г.
  3. В ожидании центрифуги, аспирировать раствор витронектина и добавить 1 мл среды E8 (подготовлены, как описано в шаге 1.6) к колодцу. Затем снимите супернатант DMEM/F12 с центрифуговой конической трубки и повторно подтяните гранулы в 1 мл среды E8. Перенесите клетки на недавно покрытую пластину, будучи уверенным, чтобы агитировать подвески, чтобы предотвратить колонии от слипания при посевной.
  4. Существует, как правило, существенная гибель клеток после оттаивания. На следующее утро, удалить среду и заменить на свежий E8 среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Даже при оптимальных условиях, iPSCs, как правило, плохо оправиться от криоконсервации. Рекомендуется криоконсервировать почти конфлюент 6-ну для будущего посева в один 6-колодец. Наличие клеточного мусора является нормальным в течение первых 2-3 дней во время восстановления клеток.
  5. Заменяйте среду E8 ежедневно, пока клетки не будут готовы к прохождению (70%-80% конфлюкс).
  6. Для прохождения сначала подготовьте витрунектин-покрытые скважины (как описано в шаге 2.1).
    1. После того, как витрунектин покрытием скважины готовы (около 1 ч), аспир E8 среды из скважины, чтобы пройти и мыть дважды с 1 мл DPBS. Инкубировать с 1 мл 0,5 мм EDTA для 5-7 мин при 37 градусов по Цельсию. Во время инкубации удалите раствор витронектина с недавно покрытого колодца и замените 1-2 мл среды E8.
    2. Удалите раствор EDTA из скважин, чтобы пройти и отсоединить колонии, осторожно мыть один или два раза с 1 мл E8. Перенесите 75-200 л клеточной подвески в свежепокрытые E8-содержащие скважины, агитируют пластину, чтобы обеспечить равномерное покрытие, и поместите в инкубатор немедленно.
      ВНИМАНИЕ: Время инкубации для отслоения iPSC зависит от клеточной линии; рекомендуется, чтобы пользователь этого протокола тестировал ряд раз при достаточном расширении полученной/генерируемой линии iPSC. 75 ЗЛ клеточной суспензии обычно приводит к 4 дням между проходами; 150 кЛ или более приводит к 2-3 дней между проходами.

3. Поколение эндотелиальных прародителей iPSC (рисунок1).

  1. При поддержании iPSCs, убедитесь, что колонии хорошо уплотняются и что Есть небольшое количество дифференцированных клеток в культуре. Если колонии начинают контактировать друг с другом, клетки, скорее всего, слишком сливочные и должны быть немедленно проходят.
  2. Когда iPSCs 70%-80% слив, пальто 24-хорошо пластины с желатиновой белковой смеси (подготовлены, как описано в 1.2/1.3). Пипетка 250 л этой смеси в каждую скважину и держать в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Во время вышеуказанной инкубации 1-h, извлеките средство E8 и Y-27632 от холодильника и морозильника, соответственно. Как только E8 средний и Y-27632 достигнет комнатной температуры, подготовьте E8 и ROCKi, добавив 13 qL из 10 МКм Y-27632 до 13 мл E8 в 15 мл конической центрифуги трубки.
  4. Удалите среду E8 из скважин iPSC, дважды промойте 1 мл DPBS, а затем инкубировать 0,5 мМ EDTA в течение 5-7 мин при 37 градусах Цельсия. После инкубационного периода, удалить ЭДТА и быстро стрижки клеток в одноклеточной подвески с P1000 пипетка отзыв с 1 мл E8 и ROCKi среды.
  5. Подсчитайте клетки гемоситометром. Для подвески, которая может содержать миллионы iPSCs, добавьте 20 зл клеточной подвески до 180 злице трипан синего цвета. Определите количество клеток в одноклеточной подвеске.
  6. Перенесите 0,432 x 106 на 1,296 x 106 ячеек (104 х 3 х 104 ячейки/см2)на оставшийся e8 и ROCKi medium. Удалите желатиновую смесь покрытия с недавно покрытием 12-наилучшим пластины и добавить 500 злицы клеточной подвески для каждой скважины, гарантируя, что клетки хорошо распределены и не образуют небольшие комки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот диапазон плотности является оптимальным для дифференциации положительных клеток CD34; однако, эти плотности посева зависят от линии клеток и, возможно, должны быть оптимизированы пользователем этого протокола.
  7. После 24 ч культуры замените среду 500 л свежей среды E8. Инкубировать еще 24 ч при тех же условиях.
  8. Удалите среду E8 и замените LaSR Basal, дополненный 6-12 мкм CHIR99021. Эта точка времени определяется как D0 дифференциации. После 24 ч культуры, заменить с той же среде культуры клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано ранее, количество CHIR99021, добавленного к этой среде, будет зависеть от использованной линии iPSC. Пожалуйста, проверьте диапазон концентраций CHIR99021, чтобы обеспечить оптимальные результаты.
  9. После 48 ч инкубации с CHIR99021, заменить 1 мл Базала ЛаСР.
  10. Замените среду ежедневно 2 мл Базала ЛаСР на 2-3 дополнительных дня. В этот момент времени (D5 дифференциации), значительная часть этих клеток будет выражать CD34 и может быть охарактеризована как эндотелиальных прародителей. Схема этого протокола изложена с репрезентативными результатами на рисунке 1 и описана в полном объеме следователями, которые впервые опубликовали этот метод 11,19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти эндотелиальные прародители могут быть дополнительно дифференцированы вдоль эндотелиальной линии (35%-99%) или гладкая мышечная линия (1%-65%). Эффективность дифференциации варьируется в зависимости от типа покрытия ECM и среды клеточной культуры, используемой во время дифференциации 20.

4. FACS эндотелиальных прародителей

  1. Перед тем, как разъединять дифференцированные ячейки D5/D6, подготовьте сортированный буфер, описанный в шаге 1.8, и держитесь на льду.
  2. Инкубировать дифференцированные клетки с 250 qL раствора отслоения клетки в наилучшим образом (см. Таблицаматериалов) для 10 min на 37 C.
  3. Разъедините клетки с наконечником пипетки P1000 в одноклеточной подвеске в растворе отслоения клеток. Консолидируйте смесь раствора отслоения клеток в конической центричной трубе 15 мл и центрифуге в течение 5 мин при 300 х г.
  4. Удалите супернатант и приостановите в 200 году l ледяного сортировки буфера (подготовлено, как описано в шаге 1.7. Добавьте 5 qL концентрированного антитела CD34-PE к сортирующей буферной подвеске клетки и инкубируйте в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
  5. Повторно приостановить в 5 мл ледяной сортировки буфера. Фильтр эту подвеску через ячейку ситечко с крышкой 40 мкм перед размещением на сортировщике.
  6. На соответствующем флуоресцентном канале сортируйте 10 000 клеток, которые не были помечены флуоресцентным антителом. Ворота области с высокой интенсивностью флуоресцентных, который не содержит ни одного из этих 10000 клеток(Рисунок 1D). Это будет служить негативным контролем.
  7. Выполнить образец, содержащий iPSC-EPs помечены флуоресцентным раствором и начать сортировку. CD34 высоко выражен в этих эндотелиальных прародителях и легко отделяется от основной популяции. После сортировки перенесите раствор на коническую центрифугу мощностью 15 мл и центрифугу на 5 мин при 300 х г. Удалите супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если раствор находится в трубке больше, чем микроцентрифуговая трубка (например, проницаленная трубка 5 мл полистирола, обычно используемая во многих протоколах FACs), повторно приостанавливаетсить отсортированные клеточные гранулы в 1 мл сортировки буфера и перенесите это решение в микроцентрифуговую трубку. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
    1. Необязательно: если необходима дальнейшая характеристика iPSC-EP, добавьте другие первичные антитела (например, CD31-APC) одновременно с CD34-PE. Убедитесь, что перекрестный разговор между различными флуоресцентными каналами сведен к минимуму.

5. Инкапсуляция и долгосрочная культура гидрогелей коллагена iPSC-EP

  1. Подготовка среды посева, добавив 40 л 10x среднего 199 до 400 л эндотелиальной среды роста (EGM-2) дополнены 10 МКм Y-27632 в 1,8 мл микроцентрифуга и место трубки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как использование антибиотиков не рекомендуется для культуры стволовых клеток и поддержания дифференцированных клеток, дозировка с пером / Strep рекомендуется после сортировки, потому что трудно гарантировать бесплодие в среде сортировки (это больше императив, если сортатор распределяется между многими лабораториями).
  2. Удалите все супернатанты из клеточной подвески и добавьте 200 зл EGM-2, дополненных 10 МКМ Y-27632. Перенесите суспензию клетки на среду посева и энергично перемешайте.
  3. Добавьте 350 л коллагена в раствор, подготовленный в шаге 5.2 и хорошо перемешайте. Раствор станет бледно-желтым.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация коллагена может оказать значительное влияние на образование капиллярного сплетения. Этот протокол предполагает, что коллаген был поставлен на 10 мг/мл и что гидрогели имеют окончательную концентрацию 3,5 мг/мл. Отрегулируйте эти объемы для достижения их конечной концентрации коллагена; рекомендуется ограничить конечную концентрацию коллагена с 2 мг/мл до 4 мг/мл.
  4. Добавьте 5 кл.л. 1М НаОХ к раствору, приготовленному в 5,3, и хорошо перемешайте, избегая введения пузырьков воздуха. Решение станет ярко-розовым.
  5. Пипетка 56 л нейтрализованного коллагеново-клеточного раствора, приготовленного в 5,4 в отдельные скважины 96-хорошо ультра-низкой пластины культуры вложений U-bottom. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Перед добавлением носителей, убедитесь, что клетки были равномерно распределены путем изучения образцов с ярко-поля микроскоп.
  6. Подготовьте 1 мл культурной среды, состоящей из EGM-2, дополненной 10 МКм Y-27632 и 50 нг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), добавив 1 л каждого запасного раствора в микроцентрифуговый фактор роста. После смешивания хорошо, пипетка 100 зл этой среде клеточной культуры на клетки груженых гидрогелей. Перенесите пластину на 37 градусов по Цельсию для долгосрочной культуры.
  7. Заменить культуру среды ежедневно, добавив дополнительные ангиогенные факторы роста или малых ингибиторы молекулы, как продиктовано целью исследования. Для оптимального удаления носителей, наклоните пластину и используйте наконечник P100, чтобы мягко аспирировать среду, не нарушая гидрогеля.

6. Фиксация, иммуностоирование и визуализация сосудистых сетей на основе EP

  1. После одной недели культуры добавьте 250 qL 4% параформальдегида (PFA) раствор азатем в 48-хорошую пластину. Заполните столько скважин, сколько гидрогелей. Удалить средство из гидрогелей (PFA) и использовать тонко йош тетизны для передачи гидрогелей ПФА, содержащих скважины. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре и удалить PFA путем быстрой промывания с PBS.
  2. Permeabilize путем добавления 250 зЛ 0,5% от неионического сурфактанта (см. Таблица материалов) в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте дважды с 250 Л Л PBS дополнены 300 мм глицин. Инкубировать при комнатной температуре по 5 мин для каждого шага стирки, чтобы обеспечить удаление избыточного моющего средства. Блок, погружая гидрогели в 250 л блокирующего буфера в течение 30 минут.
  3. Инкубировать с желаемыми первичными антителами, разбавленными в блокирующем буфере на ночь при 4 градусах Цельсия. Например, если иммуностоина с фаллоидина и VE-кадерин, разбавить 1:40 и 1:200, соответственно, в блокирующем буфере.
  4. На следующий день, удалить основной раствор антитела и мыть дважды с 0,5% эмульгирующий реагент в DPBS. Накройте алюминиевой фольгой и инкубируйте с видовыми вторичными антителами (например, 1:200 Alexa Fluor 488 в PBS) на 2 ч при комнатной температуре.
  5. Удалить вторичный раствор антитела и мыть дважды с 0,5% эмульгирующий реагент в DPBS. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для каждого шага стирки, чтобы обеспечить удаление свободных фторофоров.
  6. Чтобы визуализировать ядра клеток, разбавить 4', 6-диамидино-2-фенилиноле (DAPI) 1:10000 в PBS и добавить в образец (ы).
    1. Инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре и дважды мыть PBS. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут для каждого шага стирки, чтобы обеспечить удаление свободных фторофоров.
  7. Перенесите образцы на ангиогенез -Слайд или стеклянное нижнее блюдо Петри с помощью тонкого наконечником пинцета. Убедитесь, что никакие пузырьки воздуха не оказались в ловушке под гидрогелем.
  8. Изображение на конфокальном микроскопе, приобретая z-стеки, которые простираются от нижней до верхней части образца. Убедитесь, что детектор не насыщен и что используется самое низкое увеличение (желательно большое поле зрения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для будущей обработки убедитесь, что z-стеки сохраняются с минимальным сжатием (например, .czi).

7. Использование вычислительного конвейера для анализа и сравнения топологий сосудистой сети

  1. Осмотрите каждый z-стек, чтобы убедиться, что ломтики содержат только сосуды. Откройте z-стек в ImageJ и повысить контраст, нажав на изображение Границы судна теперь четко разграничены, а фоновый уровень сведен к минимуму. Часто z-размеры не соответствуют размерам x/y. Чтобы исправить это, нажмите Изображение , нажмите изображение , отрегулируйте и измените количество z-срезов так, чтобы расстояние между каждым ломтиком эквивалентно одному пикселю в x/y. ImageJ будет интерполировать автоматически. Если этот шаг не выполняется должным образом, окончательные 3D тома будут отображаться сжатыми.
    ВНИМАНИЕ: ECs будет мигрировать к краям геля и будет образовывать небольшие колонии булыжника. Хотя они полезны для оценки границ гидрогеля, они будут мешать окончательному анализу изображений и должны быть удалены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ — это программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом, разработанное совместно Национальными институтами здравоохранения и Лабораторией оптических и вычислительных приборов. Рекомендуется скачать Фиджи, который просто ImageJ в комплекте с полезными плагинами (https://fiji.sc/).
  2. В ImageJ, размытие изображения в 3-измерения, нажав процесс ,gt; Фильтры , гауссианский Blur 3D, а затем установка значения сигмы во всех 3 измерениях до 2,0 (это значение, возможно, должны быть скорректированы конечным пользователем).
  3. В ImageJ, нажмите Процесс (gt; Binary) и сделайте двоичный, а затем выберите подходящий алгоритм порога. Алгоритм порогового перекрестного энтропии, разработанный Li et al., эффективен в отделении судов от фона21. Рассчитайте порог для каждого изображения и установите фон на "По умолчанию".
  4. В ImageJ, удалить ложный шум и заполнить "дыры" в люменах, нажав процесс
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление "ярких" выбросов заполнит небольшие отверстия в соединенных сосудах; удаление "темных" выбросов позволит удалить мертвые клетки. Размер радиуса удаления будет варьироваться в зависимости от увеличения и размера судов. Для изображений, полученных с широкоугольной целью 512 x 512 пикселей, радиусы, как правило, варьируются от 4-6 пикселей.
  5. Обработка всех необработанных (например, расширение czi) файлов и конвертировать в .tif файлы, прежде чем приступить к шагу 7.6. Для этой обработки к этой рукописи был прикреплен скрипт ImageJ "Binarize and Filter.ijm".
  6. Сохраните обработанные файлы .tif в той же папке, что и файл "BatchProcessSkeleton.m", доступный для скачивания в рукописи. Этот сценарий, разработанный авторами, называет функции, опубликованные Филиппом Kollmannsberger22 и проводит некоторые дополнительные манипуляции файл.
  7. Скачать и распаковать все файлы, связанные с двумя основными функциями "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) и "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Сохраните все функции в той же папке, что и открытый обработанный z-стек.
  8. Откройте мультипарадигмическую численную вычислительную среду (см. таблицуматериалов) и перейдите к папке, где сохранены все файлы, описанные выше.
  9. Выполнить "BatchProcessSkeleton.m" либо путем ввода BatchProcessSkeleton в окне команды или, открыв сценарий и нажав кнопку Run (правая зеленая стрелка) в редакторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проанализировать большой набор данных с помощью одной команды, убедитесь, что строка внутри функции dir в строке 6 содержит звездочку (например, ''.tif'). В противном случае замените звездочку на имя файла, если пожелает проделать анализ одного файла.
  10. Продолжительность времени, которое потребуется для выполнения этого скрипта, будет существенно отличаться в зависимости от имеющейся вычислительной мощности. Рекомендуется проводить этот анализ на компьютере с не менее 8 ГБ оперативной памяти, чтобы пользователь мог получить доступ к другим программам во время выполнения сценария.
    ВНИМАНИЕ: Хотя это и не является строго необходимым, график оригинального конфокального приобретения (в сером) и наложение с этой матрицы изображения с матрицей скелета (красным цветом) может помочь в оценке производительности алгоритма скелетизации. Кроме того, читатель может создать узловой график, реализованный Kollmannsberger et al., для оценки точности сетевого анализа. Создание обоих графиков, хотя и полезно, значительно увеличит время выполнения скрипта и потребует дополнительной памяти; если пользователь просто требует окончательного анализа топологии и не хочет визуализировать набор данных, просто прокомментировать строки 44 к 61 (скелетный график) и строки от 104 до 143 (топология график).
  11. После завершения работы матрица данных, видимая в рабочем пространстве, теперь содержит обработанные данные. Дважды щелкните данные и откройте эту ячейку в редакторе Переменной.
    1. Обратите внимание, что эта матрица будет содержать, слева направо: 1) имя файла, 2) количество узлов (точки ветки и конечные точки), 3) точки ветви, 4) ссылки (т.е. сосуды), 5) длина сети (включая изолятные сосуды) и 6) количество ломтиков, содержащихся в z-стеке. Сохранить эти данные в виде файла .csv и экспортировать для дальнейшего анализа на любое программное обеспечение по своему выбору.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После дифференциации(Рисунок 1), FACS и инкапсуляции iPSC-EPs в коллагеновых гидрогелях, клетки, как правило, остаются округлыми в течение 24 ч, прежде чем начать мигрировать и образуют начальные люмены. Примерно через 6 дней культуры, примитивное капиллярное сплетение будет видно в гидрогеле при просмотре с яркой микроскопией поля(рисунок 2). После визуализации фиксированных, окрашенных гидрогелей нагруженных клетками на конфокальном микроскопе (Фильм1,Дополнительный фильм 1), предварительно обработанные изображения преобразуются в скелет, который позволяет анализировать общую длину и подключение сети. Эти количественные показатели могут затем использоваться для определения того, какой набор условий является оптимальным для создания надежных сосудистых сетей.

Этот протокол позволяет разработать надежное трехмерное капиллярное сплетение, реагируя на местные физические и химические сигналы. В предыдущей работе было показано, что это образование сети чувствительно к плотности матрицы, матричной жесткости, ингибированию матричного металлопротоза, а также типу и концентрации различных ангиогенных митогенов20,23.

Figure 1
Рисунок 1: Поколение iPSC-EPs из плюрипотентных стволовых клеток. (A) WiCell 19-9-11 iPSCs, который окрашенных положительных для Oct4, были культивированы в E8 среде дополнены 10 мкм Y-27632 ROCK ингибитор для 48 ч. (B) IPSCs затем были индуцированы с 6 КМ CHIR99021 в LaSR Basal среде для 48 ч, в какой точке клетки были положительными для Brachyury, мезодерм маркер. (C) Клетки были дополнительно культивируется в LaSR базальных средств массовой информации, пока они не выразили CD34, маркер для эндотелиальных прародителей. (D) Примерно 15%-25% дифференцированных клеток, выраженных CD34. Все бары масштаба представляют длину 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Генерация и анализ сосудистых сетей iPSC-EP в коллагеновых гидрогелях. (A) Поперечное сечение 3D микросреды, используемой в этом анализе для содействия образованию сосудистой сети из iPSC-EPs. Плавучий коллагенный гидрогель посеян с iPSC-EPs и подвергается воздействию EGM-2, дополненного 50 нг/мл VEGF и временной дозой Y-27632. (B) В результате капиллярного сплетения высоко разветвленной и взаимосвязаны, как визуализированы через окрашивание с F-актина (циан). Бинаризированное изображение, показанное слева, генерируется путем предварительной обработки с ImageJ. Этот z-стек затем анализируется с помощью ранее разработанного алгоритма, который скелетизирует сеть (показано в коллекции тонких красных линий), а затем анализирует топологию сети для ветвей (желтый), конечных точек (синий), изолированных сосудов (черный), и подключенных судов (красный). Шкала бар представляет длину 100 м. (C) Морфологические изменения iPSC-EPs-Ладена коллагена гидрогелей: 24 ч после посева, iPSC-EPs остаются сферическими и в течение 96 ч постепенно взять на себя более удлиненный фенотип. Дальнейшая культура приводит к сборке сети VE-Cadherin, содержащей просвет, как показано в врезке на 144-h-часовой момент времени. Шкала баров представляют длину 400 мкм; зеленый цвет , VE-Cadherin, красный и F-актин, и синий dAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Movie 1
Фильм 1: З-стек ВАСКУЛАТУРЕ СГЕНЕРированный FRom iPSC-EPs. Сосудистые сети были зафиксированы, окрашены F-актином, и визуализированы путем приобретения z-стеков на конфокальном микроскопе. Фрагменты были приобретены с интервалом 17 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правый клик для загрузки.)

Дополнительный фильм 1: 3D рендеринг сосудов. Сосудистые сети были зафиксированы, окрашены F-актина (красный) и VE-кадхерин (зеленый), и визуализированы путем приобретения z-стеки на конфокальный микроскоп. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол включает в себя долгосрочную культуру клеток в трех типах носителей клеточной культуры: E8, LaSR Basal и EGM-2. Поэтому следует провести большую осторожность, чтобы надлежащим образом стерилизовать все материалы. Кроме того, лабораторные пальто и этинол-очищенные перчатки всегда следует носить при работе в ламинарном капоте. Рекомендуется часто тестировать на микоплазму загрязнения; если большое количество мусора наблюдается во время культуры iPSC или внезапное падение эффективности дифференциации отмечается, загрязнение микоплазмы является вероятной причиной. iPSC-EPs, генерируемые с помощью этого протокола, как правило, откладываются значительное количество ECM, что удлиняет время диссоциации и приводит к тому, что одноклеточная подвеска разделяется на небольшие комки. Не используйте Трипсин-EDTA (0,25%), так как решение может нарушить эпитопы CD34 на iPSC-EPs. Тем не менее, лечение раствором коллагеназы/диспазы может удалить отложенный ECM и облегчить диссоциацию со стандартным решением отслоения клеток. После обширной диссоциации могут остаться небольшие скопления клеток и ECM; удалить эти сгустки с P100 пипетка отзыв, так как они могут засорить ячейки ситечко или вмешиваться в FACS.

Плюрипотентные стволовые клетки чувствительны к диссоциации и будут проходить апоптоз в одноклеточной подвеске, если ингибитор ROCK (обычно Y-27632) не добавляется к среде24. iPSC-EPs также чувствительны к диссоциации; в том числе Y-27632 на 10 мкм для первых 24 ч культуры необходимо увеличить выживаемость клеток и распространение. Поэтому очень важно, чтобы ингибитор ROCK был включен как в гидрогель, так и в окружающую среду сразу же после FACS. Плотность посева iPSC-EPs также существенно влияет на развитие судов и общий размер сети. Как правило, концентрация от 500 000 клеток/мл до 3 миллионов клеток/мл является подходящим диапазоном плотности посева. Дальнейшее увеличение плотности посева часто приводит к уплотнению гидрогеля и гибели клеток.

Плотность структурных белков ECM оказалась значительной отдачей на развитие проектируемой микроваскулярной25,26. Как правило, увеличение плотности гидрогеля на основе ECM (часто коллагена или фибрина) ограничивает длину сосудистой сети и связь. Поэтому крайне важно, чтобы пристальное внимание уделялось плотности коллагеновой матрицы; концентрации ниже 2 мг/мл способствует преждевременной протеолитической деградации коллагеновых гидрогелей, что приводит к непоправимой потере структурной целостности гидрогеля. В отличие от этого, концентрации выше 4 мг/мл вызывают образование короткого, широкого проема, которые демонстрируют плохую связь; гидрогель деформации и изменения в размерах пор в первую очередь ответственны за это отмена20.

Коллагенные и клеточные коллагенные гидрогели не связываются с ультра-низкими пластинами крепления; гидрогели, как правило, остаются приостановленными в средствах массовой информации и иногда плавают в верхней части скважины. Если в этом протоколе используются пластины, обработанные культурой тканей, встроенные прародители мигрируют на дно колодца и образуют почти соплокивый монослой в нижней части пластины. В результате снижение плотности клеточного посева тормозит сборку этих прародителей в 3D-сети. Кроме того, если гидрогели брошены в колодцы обработанной пластины культуры тканей, они слабо свяжут внутреннюю поверхность колодца; эта связка применяет сятков к гидрогелю. Так как эта платформа была разработана, чтобы изолировать важность физических и химических сигналов, очень важно, чтобы никакие посторонние силы не были переданы клеткам27. Плавающие гидрогели могут быть трудно кормить, потому что большинство средств массовой информации клеточной культуры находится ниже гидрогеля; чтобы преодолеть это, наклонить пластину и использовать пипетку P100, чтобы удалить носители со стороны стены.

При визуализации сосудистых сетей на конфокальный микроскоп, очень важно следовать всем шагам стирки, чтобы обеспечить, чтобы избыток фторофора не приводит к низкому соотношению сигнала к шуму. Избыточная флуоресценция может запутать алгоритмы пороговых значений по умолчанию и затруднить бинаринизацию z-стека. Чтобы преодолеть эту проблему, используйте фаллоидин, грибковый токсин, который выборочно маркирует F-актин и отображает ограниченную нецелевую привязку. В целом, используйте первичные антитела, которые были предварительно спряжены к вторичному антителу, чтобы ограничить концентрацию свободного фторофора, который рассеивается через гель. При генерации z-стеков рекомендуется сбалансировать время, необходимое для приобретения z-стек, с необходимостью изображения с высоким разрешением.

Здесь описан количественный анализ для оценки васкулогенного потенциала iPSC-EPs в 3D микросредах. Этот ассс использует программное обеспечение с открытым исходным кодом и не зависит от пользовательских предубеждений. Тем не менее, он представляет собой упрощенную модель физиологической сосудистой ниши. В то время как iPSC-EPs могут дифференцироваться в клетки, необходимые для зрелых, функциональных сосуд, этот анализ пренебрегает вкладом других типов клеток (например, фибробластов и макрофагов), которые участвуют в васкулогенных процессах. Кроме того, эта система является статичной и не подвергает развивающимся сосудам течь. Наконец, в то время как коллаген i является одним из доминирующих белков в ECM28 и сохраняет свою фибриллярную архитектуру in vitro, он сильно зависит от и ограничивается слабыми физическими перекрестным иссоединением при нейтрализованности при высоких температурах. Несмотря на эти ограничения, этот план представляет собой значительный шаг вперед в стремлении инженер функциональной сосуды для сердечно-сосудистых заболеваний терапии и моделирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Американской ассоциацией сердца (грант номер 15SDG25740035, присуждается J.З.), Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии (NIBIB) Национальных институтов здравоохранения (грант номер EB007507, присуждается C.C.), и Альянс по исследованиям в области регенеративной реабилитации и обучения (AR3T, грант No 1 P2C HD086843-01, присуждаемый Дж.З.). Мы хотели бы отметить профессора Джин Стаховяк (Техасский университет в Остине) за ее технические рекомендации по конфокальной микроскопии. Мы также признательны за беседы с Сэмюэлем Михеличом (Техасский университет в Остине), д-ром Алисией Аллен (Техасский университет в Остине), д-ром Джули Рытлевски (Адаптивный биотех) и доктором Леоном Белланом (Университет Вандербильта) за их понимание вычислительный анализ 3D сетей. Наконец, мы благодарим д-ра Сяопин Бао (Калифорнийский университет, Беркли) за его советы по дифференциациации iPSCs в iPSC-EPs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
µ-Slide Angiogenesis Ibidi N/A A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging
96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile Corning 7007 Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS
Advanced DMEM/F12 Thermo Scientific 12634010 The base media for iPSC-EP differentiation. 
Barnstead GenPure xCAD Plus  Thermo Fisher Scientific 50136165 Water purification system; others can be readily substituted
Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture Fisher Scientific A8412 To preserve cell viability when FACs sorting
CD34-PE, human (clone: AC136) Miltenyi Biotec 130-098-140 Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs
CHIR99021 LC Laboratories C-6556 Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells
Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg VWR 354249 Main component of the 3D microenvironment
Conical centrifuge tubes (15/50 mL) Fisher Scientific 14-959-49D/A Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306 To counterstain and visualize cell nuclei
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320-082 For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) ThermoFisher 14190-250 To wash monolayer cultures
EDTA Sigma-Aldrich E8008 For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting
Endothelial Cell Growth Medium 2 PromoCell C-22011 Promotes endothelial cell viability and proliferation
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001   For maintenance of pluripotent stem cells
Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) Sigma-Aldrich 50046 Neutralizes remaining detergent
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% Sigma-Aldrich A8960 Component of iPSC-EP differentiation medium
MATLAB MathWorks 1.8.0_152 Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) Fisher Scientific 356231 Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation
Medium-199 10X Thermo Fisher Scientific 1825015 Used to balance final hydrogel osmolarity and pH
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) VWR 87003-294 Stores small volumes of reagents
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 The main ingredient of the immunostaining solutions
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122 Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument
Recombinant Human VEGF 165 Protein R&D Systems 293-VE Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis
Rhodamine phalloidin Themo Fisher Scientific R415 To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks
Triton X-100 (nonionic surfactant) Sigma-Aldrich X-100 Detergent used to gently permeabilize cells
Tween-20 (emulsifying reagent) Fisher Scientific BP337 Increases the binding specificity of the added antibodies
VE-Cadherin (F-8) Santa Cruz Biotechnology sc-9989  To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels
Vitronectin ThermoFisher A14700 For maintenance of pluripotent stem cells
Y-27632 Selleck Chemicals S1049 Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
  2. Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues. Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).
  3. Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. Design principles for therapeutic angiogenic materials. Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).
  4. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  5. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  6. Nakatsu, M. N., et al. VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model. Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).
  7. Shamloo, A., Heilshorn, S. C. Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients. Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).
  8. Jeon, J. S., et al. Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems. Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).
  9. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  10. Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).
  11. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  12. Kusuma, S., Shen, Y. -I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).
  13. Charwat, V., et al. Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures. Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).
  14. Holnthoner, W., et al. Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).
  15. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).
  16. Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).
  17. Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).
  18. Kerschnitzki, M., et al. Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality. Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).
  19. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions. Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).
  20. Crosby, C. O., et al. Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels. Tissue Engineering Part A. , In press (2019).
  21. Li, C. H., Tam, P. K. S. An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding. Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).
  22. Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone. New Journal of Physics. 19 (7), (2017).
  23. Crosby, C. O., Zoldan, J. Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials. Regenerative Biomaterials. , In press (2019).
  24. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  25. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).
  26. Ghajar, C. M., et al. The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis. Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).
  27. Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction. Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).
  28. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).

Tags

Биология развития выпуск 147 стволовая клетка эндотелиальный прародитель васкулогенез внеклеточная матрица коллаген вычислительный анализ сосудные сети
Модель In Vitro 3D и вычислительный трубопровод для количественной оценки васкулогенного потенциала iPSC-производных эндотелиальных прародителей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In… More

Crosby, C. O., Zoldan, J. An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors. J. Vis. Exp. (147), e59342, doi:10.3791/59342 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter