Summary
このプロトコルは、初期のゼブラフィッシュ胚からの凍結切片に対する順次免疫蛍光および免疫組織化学を示し、特定の細胞集団における正確なコローカリゼーション分析を可能にする。
Abstract
細胞間相互作用の調査は、多くの場合、特定の細胞集団の離散標識と正確なタンパク質局在化を必要とする。ゼブラフィッシュ胚は、インビボモデルとの相互作用を調べる優れたツールです。全身型免疫組織化学および免疫蛍光アッセイは、タンパク質発現を評価するためにゼブラフィッシュ胚に頻繁に適用されます。しかし、3次元空間における共局所タンパク質の正確なマッピングを達成することは困難な場合があります。加えて、一部の研究は、同じ技術と互換性のない2つの抗体の使用を必要としてもよい(例えば、抗体1は免疫組織化学にのみ適しており、抗体2は免疫蛍光にのみ適している)。ここに記載される方法の目的は、初期のゼブラフィッシュ胚に由来する個々の凍結切除に対して順次免疫蛍光および/または免疫組織化学を行うことである。ここでは、単一細胞レベルでタンパク質発現の正確な同定を達成するために、単一凍結切除のための免疫蛍光、イメージング、免疫組織化学、画像化の順次ラウンドの使用について説明する。この方法論は、個々の細胞内の複数のタンパク質標的の正確な同定を必要とする初期のゼブラフィッシュ胚の任意の研究に適しています。
Introduction
ゼブラフィッシュは、現在生物医学研究の分野で幅広い分野で使用されている非常に堅牢なモデル生物です。特に、ゼブラフィッシュ胚の急速な外部発達および半透明性は、生体内研究のための優れたツールを提供する。ここで、凍結切除ゼブラフィッシュ胚の逐次免疫蛍光(IF)および免疫組織化学(IHC)分析の方法について説明する。この新しい手順は、単一のスライド上の2つの抗体の順次適用を使用し、組織切片を保存しながら、細胞レベルでのコローカライズされたタンパク質の正確な同定を可能にします。このプロトコルは、マウスモデルと比較してゼブラフィッシュのIFおよび/またはIHCアプリケーションでの使用のために比較的少数の抗体が検証されているので、ゼブラフィッシュモデルを用いて研究に特に有用である。
細胞間相互作用の観察は、多くの研究で不可欠な要素であり、組織レベルでの発現型の根元にある細胞レベルで機能する分子機構に関する重要な洞察を提供する可能性があります。さらに、タンパク質発現は、特に細胞内で複数のタンパク質の発現を同時に調べる場合に、細胞機能に関する情報を提供することができます(共局在化)。全マウントIHCおよびIFはゼブラフィッシュ胚1、2、3、4、5におけるタンパク質発現を分析するために一般的に使用される技術であるが、全体のマウント手順は、正確なコローカライズデータを達成するために問題があります。私たちの経験では、組織の層を区別し、全マウント標本の単一細胞レベルでタンパク質発現を視覚化することは困難な場合があります。イメージングソフトウェアプログラムは、一般に表面染色と深い染色を区別することができない場合があります。非表面レベルのタンパク質発現は、より明るく発現された表面レベル発現によって隠され、定量化の不正確さにつながる。さらに、ほとんどの伝統的なゼブラフィッシュのクリアリング方法は非常に有毒であり、したがって、使用のためにあまり望ましくありません。
IFやIHCなどの抗体ベースの技術は、断面材料中のタンパク質発現を検出するためにしばしば使用され、複雑な組織内で特定のタンパク質を発現する離散細胞集団の同定を簡素化します。IHCは、一般的に、異なる宿主種で結合し、異なる色の染色体4、7、8、9で可視化された2つの異なる抗体を使用することによって、コローカリゼーションのために一般的に使用されます。,10. しかし、複数の染色体を使用すると、色11、12の非特異的背景染色または非適合性につながる可能性があります。
我々は、凍結切除初期ゼブラフィッシュ胚に対するシーケンシャルIFおよびIHCによる複数のタンパク質の検出のための新しいプロトコルを開発した。凍結切除は、ゼブラフィッシュ胚などの繊細な組織に特に適しており、凍結切片は、蛍光ベースのアッセイ13、14のパラフィン埋め込みセクションよりも優れています。我々は、単一のアッセイタイプに対する抗体の非適合性の問題を回避するために、デュアルカラーIFまたはIHCではなく、組み合わせたIFとIHCを最適化することを選択しました。これらの問題は、ゼブラフィッシュでの使用が検証される市販の抗体の数が限られているため、ゼブラフィッシュに関する研究に特に関連しています。実際、4つの大企業の研究では、マウスで使用するための市販の抗体は、ゼブラフィッシュ15で使用するために約5,300対約112,000であったことが示されました。最後に、ゼブラフィッシュ胚から得られるような小さなまたは限られた組織サンプルを扱う際に不可欠な単一の凍結切除に対して実行できるプロトコルを開発することにしました。
このプロトコルは、Carmany-RampeyおよびMoens16によって説明されているように、ブラスチュラからブラストラ移植によって生成された48時間後受精キメラゼブラフィッシュ胚におけるドナー細胞の増殖挙動を評価するように設計された。ドナー胚をレシピエント胚に移植する前に蛍光標識デキストランコンジュゲートを用いた1細胞段階でドナー胚を注入した。Ser 10リン酸化ヒストンH3(pH3)に免疫蛍光を用いて増殖細胞を検出し、続いて標識デキストランの免疫組織化学を用いてキメラゼブラフィッシュ胚のドナー細胞を検出した。pH3と標識されたデキストランを単一の凍結切除内で順次検出することで、両方のマーカーを発現した個々の細胞を同定し、定量化することが可能になりました。
凍結切除ゼブラフィッシュのためのこのシーケンシャルIF/IHCプロトコルは、タンパク質発現のためのコローカリゼーションプロトコルを望むゼブラフィッシュ研究者のための有用なツールを提供します。このプロトコルが対処するように設計された問題は、小さな組織標本や限られた抗体の入手可能性など、ゼブラフィッシュモデルに特有のものではありません。したがって、この方法は、シーケンシャルIF/IHCを実行することを望む研究者にとって役に立つ可能性があります。
倫理声明:
すべての動物研究は、ノースカロライナ州立大学、ローリー、ノースカロライナ州、米国の機関動物ケアと使用委員会によって承認されました。
Protocol
1. 胚の調製
- 48h後受精(hpf)キメラゼブラフィッシュ胚を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で一晩4%パラホルムアルデヒド(PFA)でブラスチュラからブラストラ移植によって生成されたキメラゼブラフィッシュ胚を4°Cで揺れ動かします。非イオン界面活性剤の0.1%を含む1xリン酸緩衝生理食べ物の500 μLを使用して室温で揺れ動いた2つの5分の洗い流しを行う(1x PBSt;材料の表を参照)
注:パラホルムアルデヒドは有毒であり発癌物質であり、制度上の規制に従って適切に処分されなければならない。パラホルムアルデヒドの作業は、化学フードで行う必要があり、適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネ)は常に使用する必要があります。 - 500 μLを30%、50%、70%のメタノール(MeOH)で順次洗浄して胚を脱水し、1x PBStで10分間希釈し、それぞれ揺れ動かして室温で洗浄する。少なくとも14時間-20°Cで100%MeOHの500 μLで胚をインキュベートする。
注:メタノールは有毒であり、機関の規制に従って適切に処分する必要があります。メタノールの作業は化学フードで行い、適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネ)は常に使用する必要があります。 - 70%、50%、30%MeOHで順次洗浄して胚を水分補給し、1x PBStで1x PBStで希釈し、それぞれ10分間、揺れ動かします。揺れのある室温で500 μLの1x PBStの2つの5分の洗い流しを行う。
- 1x PBStを取り出し、胚がチューブの底(約1時間)に沈むまで、室温で脱イオン水で希釈した30%ショ糖の500 μLでインキュベートします。スクロースを15%の魚ゼラチン/25%のスクロース(15/25;材料の表を参照)の500 μLに置き換え、室温で一晩揺さぶります。
- 15/25の体積の約半分を最適な切断温度媒体(OCT培地)に置き換え、胚がチューブの底部(約1時間)に沈むまで、室温でインキュベートします。
- 体積の約半分をOCT培地に置き換え、室温で1時間揺れでインキュベートします。
- 15/25およびOCT媒体とのインキュベーションステップの間に、これらの試薬を結合するために必要に応じて管を反転またはフリックする。
2. 胚の埋め込みと凍結切除の準備
- 胚を鉗子でプラスチック型(材料の表を参照)に移し、15/25-OCT混合物の移動を最小限に抑えます。OCT培地で約半分の金型を充填し、OCT培地で胚を穏やかに混合します。
- ラベル付きプラスチック金型を調製し、所望の胚(通常は1\u20123胚)を空のラベル付きプラスチック型に移し、OCT培地の持ち越しを最小限に抑えます。所望の胚がプラスチック型に入ったら、OCT培地を金型の上部に穏やかに充填します。
- 鉗子または25Gの針を使用して、視覚化のための光立体顕微鏡を使用して、所望の向きに胚を配置する(図1A、B)。
- 準備された金型を、金属製のプラットフォームで絶縁容器に入れ、ドライアイスで凍結します。冷たい部屋を作成するために金属のプラットホームの上に氷のバケツまたは泡のクーラーを置く (図 1C,D)
-
-20 °Cに設定されたクライオスタットを使用して、10\u201212 μm厚い凍結切片を準備します。
- 一度に 1 つのブロックを設定し、OCT メディアを使用して、ブロックの下部をブレードに向けたディスク/チャックに固定します(図 2A)。断面を開始する前に、ブロックがディスクに完全に固定されていることを確認します (OCT メディアは白色に変わります)。
- 充電されたガラススライド(図2C、D)に凍結切り切りを置き、室温で一晩スライドを空気乾燥させます。
3. pH3の免疫蛍光
- コプリン瓶などの適切な容器で、1x PBSでスライドの3つの5分の洗い流しを実行します。組織がスライドに十分に付着していない場合は、平らな表面にスライドを敷設し、表面に1x PBSの500 μLを穏やかにピペッティングして洗い流します。スライドをそっとひっくり返して、洗い流しの間に1x PBSを注ぎます。
- スライド上の液体を保つためにバリアペンまたはワックス鉛筆でセクションの輪郭を描きます(図3)。
- 湿気の多い部屋の平らな表面にスライドを置き、スライドにセクションごとのブロックバッファーのピペット200 μLを置きます。室温で2時間、または4°Cで一晩ブロックバッファーにインキュベートします。
- 一次抗体希釈(ウサギ抗pH3抗体、1:200;材料の表を参照)をブロックバッファーに調製し、ピペッティングによってよく混合する。スライドをそっと先端にしてブロックバッファーを排出し、湿気の多いチャンバに戻り、セクションごとの一次抗体溶液のピペット200 μLをスライド上に置きます。二次的なみの制御のために、適切なセクションにブロックバッファーのピペット200 μL。
- 脱イオン水で満たされた湿気の多い部屋で一晩4 °Cでスライドをインキュベートします。湿気を保つために湿気の多い部屋の端をシールします。
- コプリン瓶などの適切な容器で、1x PBSでスライドの3つの5分の洗い流しを実行します。洗浄工程中に、二次抗体希釈(抗ウサギ蛍光二次抗体コンジュゲート、1:2,000;材料の表を参照)をブロックバッファーに調製し、ピペッティングによってよく混合する。
- 湿気の多いチャンバーの平らな表面にスライドを置き、セクションごとの二次抗体溶液のピペット200 μLをスライド上に置きます。光から遮蔽された二次抗体溶液中のスライドを30分間インキュベートする。
- 光から遮蔽されたコプリン瓶などの適切な容器に1x PBSでスライドの3つの5分の洗い流しを行います。洗浄工程中に核染色液を調記します(材料の表を参照)。
- 平らな表面にスライドを置き、核染色溶液のピペット200\u2012500 μL(サンプルのサイズに応じて)を各セクションに置きます。核染色溶液中のスライドを10分間インキュベートし、光から遮蔽します。
- 核染色液を排出し、非硬化蛍光マウントメディアとガラスカバースリップでスライドを取り付けます。イメージングが実行されるまで、暗闇の中でスライドを4°Cに維持します。
注:最良の結果は、スライドが同じ日または翌日にイメージされたときに得られます。 - IFに続いて、100倍の倍率(10倍の眼倍率と10倍の客観的な倍率)で555nm(赤)と645nm(遠赤)発光フィルタを使用して、共焦点蛍光顕微鏡とデジタルカメラでスライドを視覚化し、画像化します。イメージング全体を通じてレーザーパワーを一貫した状態に保ちます。
- イメージング後、スライドを1x PBSの個々の容器に入れ、カバースリップ除去の準備をするために一晩4°Cで平らに保管します。スライドを 1x PBS に配置する場合は、スライドを静かに攪拌して、カバースリップの除去に役立てます。
注:カバースリップを押し下げたり、セクションの品質が損なわれる可能性があるため、カバースリップを手動で取り外したりしないでください。カバースリップは、最小限の強制動きで水平方向に取り外す必要があります。
4. 標識デキストランの免疫組織化学
- カバースリップを取り外した後、コプリン瓶などの適切な容器にスライドを新しい1x PBSにそっと移します。1x PBSを取り外し、室温で非イオン界面活性剤(1x TBSt)の0.1%で1xトリス緩衝生理生理でスライドの3つの5分のインキュベーションを実行します。
- 3%過酸化水素(H2O2)の250mLを適当な大きさの容器に脱イオン水中で希釈して調記する。3%H2 O2溶液でスライドを室温で15分間インキュベートします。
注:過酸化水素は腐食性であり、機関の規制に従って適切に処分する必要があります。適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネ)は常に使用してください。 - スライドを脱イオン水で素早くすすいでください。1x TBStでスライドの3つの5分の洗いを行う慎重に組織セクションの周りの領域を乾燥させ、湿気の多い部屋に平らにスライドを置きます。必要に応じて、バリアペンまたはワックス鉛筆で組織セクションの輪郭を描き、液体をセクションに保持します。
- 二次抗体標識キット(材料の表を参照)を備えたすぐに使用可能な2.5%血清遮断液を各セクションに滴下して適用します。室温で湿気のある部屋でスライドを20分間インキュベートします。
- 抗体希釈剤で希釈した一次抗体(ウサギの抗標識デキストラン、1:7,500;材料の表を参照)を調製し、穏やかなピペッティングにより混合する。スライドをそっと先端にしてブロックバッファを排水し、セクションの周りの領域を乾燥させ、湿気の多い部屋にスライドを平らに置きます。
- 一次抗体溶液を塗布する前に洗浄しないでください。一次抗体溶液のピペット200 μLをスライド上にスライド上に置き、湿度の高いチャンバーで一晩4°Cでインキュベートする。二次的なみ対照のために、抗体のピペット200 μLを適切なセクション上に希釈する。
- スライドをそっと先端にして一次抗体溶液を排出し、コプリン瓶などの適切な容器に1x TBStに入れます。1x TBStでスライドの2つの5分の洗いを行うセクションの周りの領域を乾燥させ、湿気の多い部屋に平らに置きます。
- すぐに使用可能なバックグラウンドリダクションブロッキング試薬(材料の表を参照)を各セクションにドロップワイズで適用します。室温で湿気のある部屋でスライドを20分間インキュベートします。
- ゆっくりとスライドを先端にしてブロックバッファを排出し、セクションの周りの領域を慎重に乾燥させ、湿気の多い部屋にスライドを平らに置きます。二次抗体溶液を塗布する前に洗浄しないでください。
- すぐに使用可能な二次抗体溶液(抗ウサギワサビペルオキシダーゼ(HRP)ポリマー二次抗体を各セクションに滴下し、室温で湿気のある部屋で30分間インキュベートします。
- スライドをそっと先端にして二次抗体溶液を排出し、コプリン瓶などの適切な容器に1x TBStに入れます。1x TBStでスライドの2つの5分の洗いを行います。
- 製造元のプロトコルに従って、使用直前に HRP 発色基板を準備してください (材料の表を参照)。
- セクションの周りの領域を乾燥させ、平らな面にスライドを配置し、各セクションにHRP発色基板の200 μLを適用します。室温で3分間インキュベートし、基板が最初のスライドに印加されたときにタイマーを開始する(図4)。
- 基板溶液を排出し、1x PBSを含むコプリン瓶でスライドを短時間すすいで下します。スライドをコプリン瓶などの適切な容器に入れ、穏やかな攪拌で脱イオン水中で5分の洗い流しを2回行います。
- 最大30sのヘマトキシリン染色溶液に入れてスライドをカウンターステインします。
注:ヘマトキシリンは有毒であり、機関の規制に従って処分する必要があります。.適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネ)は常に使用してください。 - スライドをコプリン瓶などの適切な容器に入れ、脱イオン水で5分の洗い流しを3回行います。スライドをスコットの水道水を含む容器に移し(材料の表を参照)、1分間インキュベートします。
- スライドをコプリン瓶などの適切な容器に入れ、脱イオン水で5分の洗い流しを3回行います。
- 一連のエタノール(EtOH)グレード(脱イオン水中で希釈)とキシレンを化学フードで脱水します。70%EtOHで1つの2分インキュベーション、95%EtOHで2つの1分インキュベーション、100%EtOHで2つの1分インキュベーション、およびキシレンで3つの1分インキュベーションを行います。キシレンからスライドを取り外し、化学フードにトルエンベースの取り付け媒体を濡らしながらカバースリップを配置します。
注:キシレンおよびトルエンは有毒で可燃性であり、機関の規制に従って適切に処分されなければならない。キシレンとトルエンの作業は、化学フードで行う必要があり、適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネ)は常に使用する必要があります。 - IHCに続いて、複合光顕微鏡とデジタルカメラでスライドを100倍の倍率(10倍の眼倍率と10倍の客観的倍率)で視覚化し、画像化します。(図5)。
Representative Results
このプロトコルは、AB野生型ゼブラフィッシュ胚間のブラスチュラ移植によって生成された48時間後受精後キメラゼブラフィッシュ胚における個々のドナー細胞におけるタンパク質発現を同定し、分析するために開発された。1細胞レベルでのタンパク質発現の成功は、適切に配向された胚を用いて凍結切除を調製する必要があり(図1および図2)、およびこれらに対するIFおよびIHC技術の慎重かつ順次適用が必要である。凍結セクション(図3および図4)。増殖細胞(抗pH3、図5A、B)およびドナー細胞(抗標識デキストラン、図5D)を同時に検出する特定抗体を使用して、積極的に増殖しているドナー細胞を同定し、定量することができます(図5E)。個々の細胞を正確に識別するためには、IF(図2A、B)とIHC(図2D)の両方の後に高品質の画像を生成することが不可欠です。イメージ分析プログラムを使用してイメージ オーバーレイを実行する必要があります (図 5E)。使用する画像解析プログラムによっては、定量が望ましい場合に標識細胞の自動カウントを行うことができる場合がある。
図 1:凍結OCTブロックの準備。(A)凍結用に調製された低温型のOCTにおける胚の50倍の顕微鏡図。赤い矢印は、カビの底面に対するゼブラフィッシュ胚の位置の頭部を示します。黒い矢印は、ユーザーに向かって上向きの尾を示します。(B) チルドメタルプラットフォーム上に胚とOCTを含むプラスチック型。(C) プラスチック型の上に置かれた泡アイスバケツは、凍結室を作成します。(D) ブロックが完全に凍結されると、OCTは透明から白に変わります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:凍結OCTブロックの凍結切除。(A)クライオスタットディスク上の新鮮なOCTの適用およびOCT上の凍結ブロックの配置は、ブロックの凍結方向から180°回転した。(B) ブロックの側面図がセクションディスクに凍結された。(C) ロールプレートを配置した断面ブロックの表示。(D) クライオスタットの金属プラットフォームから充電されたスライドを使用してセクションをピックアップ。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3:スライド上に配置した後に準備されたセクションを表示します。矢印は疎水性バリアを示し、点線はバリア境界内のセクションを含むゾーンを示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:IHC中の発色基板塗布の準備スライドは、有害物質のこぼれを含みながら発色基板の均一な適用を可能にするために、ラップで覆われた平らな表面に配置されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5:AB野生型ゼブラフィッシュ胚間のブラスチュラ移植によって生成された48馬フキメラゼブラフィッシュ胚の代表的なIFおよびIHC標識。(A) IFは、48馬力のキメラゼブラフィッシュ胚におけるSer10リン酸化ヒストンH3(抗pH3、1:200)発現を検出する。赤 = pH3陽性細胞;青 = 核。黄色の矢印は、陽性細胞の例を示す。(B) デジタル画像における青色核染色の減算(ImageJソフトウェア)は、pH3陽性細胞の可視化を強化し、定量化および画像オーバーレイを実現する。(C)凍結切除48馬力キメラゼブラフィッシュ胚におけるIFアッセイに対する陰性対照(二次抗体のみ)。スケールバーは50 μmを表します(すべてのパネルに適用可能)。(D) IHCは、AB野生型ゼブラフィッシュ胚間のブラスチュラ移植によって発生したキメラ48hpfゼブラフィッシュ胚中の標識デキストラン(抗標識デキストラン、1:7,500)を検出する。ドナー胚は、ブラスブラからブラストラ移植に使用する前の1細胞段階で蛍光標識デキストランコンジュゲートを注射した。赤は、デキストランコンジュゲートで標識された細胞を示します。青は核を示す。黄色の矢印は、陽性細胞の例を示す。(E)パネルBのオーバーレイ(pH3用IF)及びパネルC(標識デキストラン用IHC)は、個々の細胞におけるpH3発現およびデキストラン標識のコローカライズを示す。黄色の矢印は、二重陽性細胞の例を示す。(F)凍結切除48馬力キメラゼブラフィッシュ胚におけるIHCアッセイに対する陰性対照(二次抗体のみ)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
凍結切除ゼブラフィッシュ胚に対するコローカリゼーション実験を行う上で重要な一歩を踏み出す免疫蛍光と免疫組織化学を組み合わせた新しい方法を提示した。小さな胚および凍結切除材料17、18との使用のために最適化された既存のコローカリゼーションプロトコルの重大な欠如があり、どちらも分子研究14で一般的に使用されている。既存のコローカリゼーションプロトコルは、主に2つの蛍煙素17、18の同時可視化に焦点を当てています。これらのプロトコルはうまく機能しますが、その有用性は、(i)ゼブラフィッシュで使用することができ、(ii)IFと互換性のある抗体の利用可能性によって制限されます。
ゼブラフィッシュ胚の凍結切除の使用は、保存された組織形態の面で重要な利点を提供すると感じています。IHCは、クライオセクション7、8よりもパラフィンセクションでより一般的に行われるので、タンパク質発現の検出のための凍結切除ベースのIHC法のさらなる探索が保証される。全身マウントIFの使用は、ゼブラフィッシュ胚における発現レベルを可視化するための一般的な方法であり、クライオセクション1、2、3、4を用いてIFよりも文献でより一般的に説明されている。 19.しかし、マウントプロトコル全体には、深部組織で発現されるタンパク質の正確な局在化の欠如や、より深い組織におけるタンパク質発現を不明瞭にする表面レベル発現の可能性など、限界があります。我々は一貫して凍結保存、断面、およびシーケンシャルIFおよびIHCに続く細胞形態の優れた維持を観察してきた。単一細胞レベルでタンパク質発現の正確な局在化を必要とするアプリケーションでは、このプロトコルで説明したように、セクションベースの手順に大きな利点があります。樹脂埋め込みは、初期のゼブラフィッシュ胚20からのセクションに関するIFまたはIHCアッセイを行うための代替オプションを提供する。樹脂切片は、凍結切除と比較して組織形態の優れた保存を提供し、比較的薄い組織切片を調製することができます。しかしながら、製造業者は一般に、樹脂の一部の成分をセクションから除去することができず、抗体結合部位21をマスクし得るため、免疫系アッセイに対する樹脂切片の使用を推奨しない。
プロトコル全体は、式パターンの正確かつ成功した分析に不可欠ですが、実験的な成功のためには、いくつかの具体的な手順が重要です。最初の重要なステップは、OCT13、14に埋め込み中の胚の取り扱いです。すべての胚に対してほぼ同じ領域から切り離しられるように、各胚を同じ横面に向けるのが難しい場合があります。我々は、小さなゲージ針を使用して、胚の向きのための粘性OCT媒体を通して小さく、意図的な動きを行うことが、大きすぎて、あまりにも多くのOCT媒体を置き換える鉗子を使用するよりも優れていることを発見した。2番目の重要なステップは、重要なトレーニングと経験なしに所望の組織を含む高品質のセクションを得ることが困難な場合があるため、凍結ブロックの断面中に発生します。したがって、技術が習得されるまでテスト サンプルを使用することをお勧めします。第3の重要なステップは、組織サンプルを妨害または剥離する可能性があるカバースリップ除去です。カバースリップを緩め、PBS容器からスライドをゆっくりと取り外す穏やかな撹拌の組み合わせが、カバースリップを除去するための最も効果的なアプローチであることがわかった。穏やかで安定した手が一番です。研究者は、カバースリップを効果的に削除する方法を学ぶためにいくつかの試行錯誤が必要であることがわかります。
プロトコルの他の重要なステップには、抗体最適化(IFおよびIHCアッセイの両方に対する一次抗体および二次抗体)と、発色基板およびカウンターステインへのスライドの暴露が含まれる。一次抗体特異性と標的濃度に関する徹底的な研究が不可欠です。一般的に、IF/IHCの組み合わせを開始する前に一次抗体濃度を最適化するために行われるIFとIHCの少なくとも2つの別々の実験に対して十分な非貴重なサンプルを収集することをお勧めします。各一次抗体に対して既知の陽性および陰性制御を含めると、IFアッセイとIHCアッセイの両方が適切に実行されることを確実にするために、各実験において不可欠です。二次抗体濃度の調整も必要な場合があります。IHCアッセイの発色基板およびカウンターステインへの組織切片の曝露の最適化は、多くの場合、可能な暴露時間の広い範囲を記述するので、IHCアッセイのためのカウンターステインが必要とされる。すべての染色体がカウンターステインおよび内因性組織色素沈着と互換性があるとは言えないが、染色体の選択に関して慎重な計画が必要である。
記載されたプロトコルに適用できる多くの潜在的な変更があり、我々は両方がIFに使用できなかった抗体の他の組み合わせでこのプロトコルを正常に実行しました。上記のように、発色性物質は、特定のカウンターステインと明確な互換性を有する。これらのコンポーネントは、プロトコルで簡単に変更できることがわかっています。さらに、抗体インキュベーションのパラメータは非常に柔軟であり、所望の染色強度に応じて増加または減少させることができる。埋め込みプロセスも変更できます。我々は横断セクションに焦点を当ててきたが、胚は関心のある特定の組織に対処するためにあらゆる方向に容易に向けることができる。最後に、このプロトコルには複数の可能な一時停止ポイントがあります。脱水胚は、数ヶ月間-20 °Cで100%MeOHに保存することができます。冷凍ブロックは-80 °Cで最大3ヶ月間保存できます。準備されたスライドはスライド箱で9ヶ月まで-80 °Cで貯えることができる。
この組み合わせIF/IHCプロトコルの相対的な複雑さのために、組織の品質から研究者の経験、サンプル処理に至るまで、トラブルシューティングを必要とする可能性のある複数の変動またはエラーの原因があります。上記の重要な手順のほとんどは、個々のユーザー レベルでの最適化が必要な場合、または特定の器用さ、スキル、および経験を必要とするため、重要と見なされます。しかし、非特異的な背景染色と低信号強度が最適化を必要とする最も重要な問題であることがわかった。他の IF プロトコルや IHC プロトコルと同様に、これらの問題に対処するには時間がかかり、労力を必要とし、2 つの手法が組み合わされるので、この方法を組み合わせることができます。このため、組み合わされたプロトコルを進める前に、IF と IHC を個別に最適化することを強くお勧めします。
この方法は幅広い実験に役立つと予測していますが、潜在的な制限があります。この手順の成功した性能は多数の洗浄ステップを含む2つの順次実験を通して無傷のティッシュサンプルを維持することに依存する。このため、品質が低下する可能性のある古いスライドの使用など、切り分けや組織の取り扱い中に発生する問題は、研究者がこのプロトコルを正常に実行する能力を著しく制限します。スライドは最大9ヶ月間-80°Cで保存できる可能性がありますが、スライドへの組織の付着は時間の経過とともに低下し、準備の1ヶ月以内または理想的には翌日に使用されるスライドで最高の成功を収めました。第2の制限は、ゼブラフィッシュ胚の小さな足跡である。この実験は、初期胚で比較的豊富に発現するタンパク質を可視化するのに有用であることが分かっていますが、一貫性のないタンパク質または低レベルで発現するタンパク質は、セクションで捕捉することは非常に困難である可能性があります。最後に、プロトコルは10\u201212 μmの凍結切片を使用するため、小さなサブ細胞成分ではなく、核などのより大きな構造におけるタンパク質発現の評価に最適です。
要約すると、我々の組み合わせIF/IHCプロトコルは、初期のゼブラフィッシュ胚における多種多様な研究に有利であり、そのような標本における正確なタンパク質発現分析における重要な革新を表す。図5に正常に示された我々の方法は、研究者が凍結切片の初期のゼブラフィッシュ胚の繊細な形態を維持しつつ、現在利用可能な一次抗体の幾分限られた範囲で作業することを可能にする。この種のIFまたはIHCでの使用のために検証されます。このプロトコルは、抗体の利用可能性に対する同様の制限によって妨げられている他の魚類および両生類種(例えば、メダカおよびキセノプスspp.)の研究に有用であり、従来の哺乳類モデルに適用される可能性が高い。まぁ。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、NIH助成金5K01OD021419-02とNC州立大学獣医学部によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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