Summary
Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.
Abstract
A investigação das interações intercelulares exige frequentemente a rotulagem discreta de populações específicas da pilha e a localização precisa da proteína. O embrião zebrafish é uma excelente ferramenta para examinar essas interações com um modelo in vivo. Ensaios imunoistoquímicos e imunofluorescência de montagem total são freqüentemente aplicados em embriões de zebrafish para avaliar a expressão protéica. Entretanto, pode ser difícil conseguir o traço exato de proteínas colocalizadas no espaço tridimensional. Além disso, alguns estudos podem requerer a utilização de dois anticorpos que não são compatíveis com a mesma técnica (por exemplo, o anticorpo 1 só é adequado para imunohistoquímica e o anticorpo 2 só é adequado para a imunofluorescência). A finalidade do método descrito nisto é executar a imunofluorescência seqüencial e/ou immunohistochemistry em Cryosections individuais derivados dos embriões do zebrafish do cedo-estágio. Aqui nós descrevemos o uso de círculos seqüenciais da imunofluorescência, imagem latente, Immunohistochemistry, imagem latente para um único criossecção a fim conseguir a identificação precisa da expressão da proteína a nível da único-pilha. Esta metodologia é adequada para qualquer estudo em embriões de zebrafish de fase precoce que requeira identificação precisa de múltiplos alvos proteicos em células individuais.
Introduction
O zebrafish é um organismo modelo extremamente robusto que é usado atualmente através de uma grande variedade de disciplinas na pesquisa biomédica. Em particular, o rápido desenvolvimento externo e a translucidez dos embriões de zebrafish proporcionam uma excelente ferramenta para estudos in vivo. Nisto, nós descrevemos um método para a imunofluorescência seqüencial (se) e as análises immunohistochemical (IHC) de embriões cryosectioned do zebrafish. Este procedimento novo usa a aplicação seqüencial de dois anticorpos em uma única corrediça, permitindo a identificação exata de proteínas colocalizadas a nível celular ao conservar seções do tecido. Este protocolo é particularmente útil para estudos com o modelo zebrafish, uma vez que um número relativamente pequeno de anticorpos foram validados para uso em aplicações de IF e/ou IHC em zebrafish em comparação com modelos de mouse.
A observação de interações intercelulares é um elemento essencial em muitos estudos, e pode fornecer insights-chave em mecanismos moleculares que funcionam a nível celular que sustentam os fenótipos no nível organizmal. Adicionalmente, a expressão da proteína pode fornecer a informação sobre a função celular, especial ao examinar a expressão de proteínas múltiplas simultaneamente dentro da pilha (colocalização). Embora o IHC de montagem total e se sejam técnicas comumente usadas para analisar a expressão protéica em embriões de zebrafish1,2,3,4,5, os procedimentos de montagem inteira podem ser problemático para alcançar dados de colocalização precisos. Em nossa experiência, pode ser difícil diferenciar entre camadas de tecido e visualizar a expressão da proteína no nível da único-pilha em espécimes da inteiro-montagem. Os programas de software da imagem latente podem geralmente ser incapazes de distinguir entre a mancha de superfície contra a mancha mais profunda. Expressões de proteínas de nível não superficial podem ser obscurecidas por expressão de nível de superfície mais brilhantemente expressa, levando a imprecisões na quantificação. Adicionalmente, a maioria de métodos tradicionais do clearing do zebrafish são completamente tóxicos6 e assim menos desejável para o uso.
Técnicas baseadas em anticorpos, como IF e IHC, são freqüentemente usadas para detectar a expressão protéica em material seccionado, simplificando a identificação de populações de células discretas que expressam uma determinada proteína dentro de tecidos complexos. O IHC é comumente usado para colocalização, mais freqüentemente usando dois anticorpos diferentes conjugados em diferentes espécies hospedeiras e visualizados com diferentes cromogénios coloridos4,7, 8,9 , 10. no entanto, o uso de múltiplos cromogénios pode levar a coloração de fundo não específica ou incompatibilidade de cores11,12.
Nós desenvolvemos um protocolo novo para a deteção de proteínas múltiplas pelo IF seqüencial e pelo IHC em embriões cryosectioned do zebrafish da fase inicial. O criseccionamento é particularmente adequado para tecidos delicados, como embriões de zebrafish, e crisecções são superiores às secções encaixadas em parafina para ensaios à base de fluorescência13,14. Optou-se por otimizar o IF e o IHC combinados em vez de Dual-Color IF ou IHC, para contornar o problema da incompatibilidade de anticorpos para um único tipo de ensaio. Estes problemas são particularmente relevantes para a investigação envolvendo o zebrafish devido ao número limitado de anticorpos comercialmente disponíveis que são validados para uso em zebrafish. De facto, um estudo de quatro grandes companhias mostrou que os anticorpos comercialmente disponíveis para o uso no rato eram aproximadamente 112.000 contra aproximadamente 5.300 para o uso no zebrafish15. Por fim, optou-se por desenvolver um protocolo que pudesse ser realizado em uma única crissecção, que é essencial quando se trabalha com amostras de tecido pequenas ou limitadas, como são obtidas a partir de embriões de zebrafish.
Este protocolo foi projetado para avaliar o comportamento proliferativo de células doadoras em embriões de zebrafish quimérico de 48 h pós-fertilização que foram gerados por transplante de blastula-a-blastula como descrito por Carmany-Rampey e moens16. Os embriões doadores foram injetados no estágio da um-pilha com um conjugado cDNAs etiquetado do dextrano antes do transplante de pilhas fornecedoras em embriões do receptor. Nós usamos a imunofluorescência para ser 10 fosforilated histone H3 (PH3) para detectar as pilhas proliferating seguidas por immunohistochemistry para o dextrano etiquetado para detectar pilhas fornecedoras em embriões quimérico do zebrafish. A deteção seqüencial de PH3 e o dextrano etiquetado dentro de um único criossecção permitiram-nos de identificar e quantificar as pilhas individuais que expressaram ambos os marcadores.
Este protocolo seqüencial de IF/IHC para o zebrafish cryosectioned fornecerá uma ferramenta útil para os investigadores do zebrafish que desejam um protocolo da colocalização para a expressão da proteína. Os problemas que este protocolo foi projetado endereçar, tais como espécimes pequenos do tecido e a disponibilidade limitada do anticorpo, não são originais ao modelo do zebrafish. Este método pode, portanto, ser de uso para qualquer pesquisador desejando executar seqüencial IF/IHC.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA:
Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Estadual da Carolina do Norte, Raleigh, Carolina do Norte, EUA.
Protocol
1. preparação do embrião
- Fixar 48 h pós-fertilização (HPF) embriões de zebrafish quimérico gerados por transplante de blastula-a-blastula entre embriões de Zebrafish do tipo AB selvagem em 4% de paraformaldeído (PFA) durante a noite com balanço a 4 ° c. Realize duas lavas de 5 min com balanço à temperatura ambiente usando 500 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato 1x contendo 0,1% de um surfactante não iônico (1x PBSt; ver a tabela de materiais)
Nota: Paraformaldeído é tóxico e um carcinógeno e deve ser devidamente eliminado por regulamentos institucionais. O trabalho com paraformaldeído deve ser realizado em uma capa química, e o equipamento de proteção individual apropriado (luvas, jaleco e óculos de segurança) deve sempre ser usado. - Deshidratar os embriões por lavagem sequencialmente com 500 μL de 30%, 50% e 70% metanol (MeOH) diluído com 1x PBSt por 10 min cada em temperatura ambiente com balanço. Incubar embriões em 500 μL de 100% MeOH a-20 ° c durante pelo menos 14 h.
Nota: O metanol é tóxico e deve ser devidamente eliminado por regulamentação institucional. O trabalho com metanol deve ser realizado em uma capa química, e o equipamento de proteção individual apropriado (luvas, jaleco e óculos de segurança) deve sempre ser usado. - Rehidratar os embriões por lavagem sequencialmente com 500 μL de 70%, 50% e 30% MeOH diluído com 1x PBSt por 10 min cada em temperatura ambiente com balanço. Realize duas lavas de 5 min com 500 μL de 1x PBSt à temperatura ambiente com balanço.
- Retire o 1x PBSt e incubar em 500 μL de sacarose a 30% diluída com água desionizada à temperatura ambiente com balanço até que os embriões se afundem até ao fundo do tubo (aproximadamente 1 h). Substitua a sacarose por 500 μL de 15% de gelatina de peixe/25% de sacarose (15/25; ver a tabela de materiais) e incubar à temperatura ambiente com balanço durante a noite.
- Substitua cerca de metade do volume de 15/25 com o meio de temperatura de corte ideal (meio OCT) e incubar à temperatura ambiente com balanço até que os embriões afundam na parte inferior do tubo (aproximadamente 1 h).
- Substitua cerca de metade do volume por meio de OCT e incubar à temperatura ambiente com balanço por 1 h. Repita este passo uma vez.
- Durante as etapas de incubação com 15/25 e meio OCT, inverta ou movimente o tubo conforme necessário para combinar estes reagentes.
2. incorporação de embriões e preparação de Crisecções
- Transfira embriões para um molde plástico (veja a tabela de materiais) com fórceps, minimizando qualquer transferência da mistura 15/25-Oct. Encha o molde aproximadamente metade cheio com meio de OCT e misture delicadamente os embriões no meio de OCT.
- Prepare os moldes plásticos etiquetados e transfira embriões desejados (geralmente 1 \ u20123 embriões) no vazio, rotulado moldes plásticos, minimizando o carry-over do meio de OCT. Uma vez que os embriões desejados estão no molde plástico, encha delicadamente com o meio de OCT à parte superior do molde.
- Use fórceps ou agulhas de 25 G para organizar os embriões para a orientação desejada, usando um estereomicroscópio leve para visualização (Figura 1a, B).
- Congele os moldes preparados no gelo seco em um recipiente isolado com uma plataforma do metal. Coloc uma cubeta de gelo ou um refrigerador da espuma delicadamente sobre a plataforma do metal para criar uma câmara fria (Figura 1C, D)
-
Prepare 10 \ u201212 μm de criosecções grossas usando um criostat ajustado em-20 ° c.
- Configure um bloco de cada vez e use o meio OCT para congelar o bloco no disco/mandril com a parte inferior do bloco voltado para a lâmina (Figura 2a). Assegure-se de que o bloco esteja completamente congelado ao disco (o meio OCT ficará branco) antes de iniciar o corte (Figura 2b).
- Coloc Cryosections em corrediças de vidro carregadas (Figura 2C, D) e ar-seque as corrediças durante a noite na temperatura ambiente.
3. imunofluorescência para pH3
- Realize três lavas de 5 min das lâminas em 1X PBS em um recipiente apropriado, tal como um frasco de Coplin. Se os tecidos não forem bem aderidos à lâmina, realize lavas colocando lâminas sobre uma superfície plana e introduzindo suavemente 500 μL de 1X PBS na superfície. Despeje 1X PBS entre as lavas gentilmente derrubando as lâminas.
- Delinear as secções com uma caneta de barreira ou lápis de cera para manter o líquido nas lâminas (Figura 3).
- Coloque as lâminas em uma superfície plana em uma câmara úmida e pipetar 200 μL de tampão de bloco por seção para os slides. Incubar no tampão do bloco por 2 h na temperatura ambiente ou durante a noite em 4 ° c.
- Prepare a diluição preliminar do anticorpo (anticorpo pH3 do coelho, 1:200; Veja a tabela dos materiais) no amortecedor do bloco e misture bem introduzindo com pipting. Gentilmente derrube as lâminas para drenar o tampão do bloco, retorne à câmara úmida, e pipeta 200 μL da solução preliminar do anticorpo por a seção nas corrediças. Para o controle somente secundário, pipetar 200 μL de buffer de bloco para as seções apropriadas.
- Incubar as lâminas a 4 ° c durante a noite numa câmara húmida preenchida com água desionizada. Sele as bordas da câmara úmida para ajudar a reter a umidade.
- Realize três lavas de 5 min das lâminas em 1X PBS em um recipiente apropriado, tal como um frasco de Coplin. Durante as etapas da lavagem, prepare a diluição secundária do anticorpo (conjugado secundário fluorescente do anticorpo do anti-coelho, 1:2000; Veja a tabela dos materiais) no amortecedor do bloco e misture bem introduzindo com pipting.
- Coloque as lâminas em uma superfície plana em uma câmara úmida e pipetar 200 μL de solução de anticorpos secundários por seção para as lâminas. Incubar as lâminas em solução (s) de anticorpo secundário à temperatura ambiente, protegida da luz, durante 30 min.
- Realize três lavas de 5 min das lâminas em 1X PBS em um recipiente apropriado, tal como um frasco de Coplin, protegido da luz. Durante as etapas de lavagem, prepare uma solução de coloração nuclear (veja a tabela de materiais).
- Coloque os slides em uma superfície plana e pipetar 200 \ u2012500 μL (dependendo do tamanho da amostra) da solução de coloração nuclear para cada seção. Incubar as lâminas na solução de coloração nuclear por 10 min, protegida da luz.
- Escorra a solução de coloração nuclear e monte as lâminas com suportes de montagem fluorescentes não endurecendo e uma lamínula de vidro. Mantenha os slides no escuro a 4 ° c até que a imagem seja realizada.
Nota: Os melhores resultados são obtidos quando as lâminas são fotografadas no mesmo dia ou no dia seguinte. - Seguindo se, visualize e imagem os slides com um microscópio de fluorescência confocal e câmera digital usando 555 nm (vermelho) e 645 nm (far-Red) filtros de emissão em 100x ampliação (10x ampliação ocular e 10x ampliação objetiva). Mantenha a potência do laser consistente ao longo da imagem.
- Após a imagem, coloc as corrediças em uns recipientes individuais de 1X PBS e armazene horizontalmente em 4 ° c durante a noite para preparar-se para a remoção do lamela. Ao colocar os slides em 1X PBS, agitar suavemente as lâminas para ajudar na remoção da lamínula.
Nota: Não pressione para baixo na lamínula ou tente remover a lamínula manualmente, pois isso pode comprometer a qualidade das seções. Os COVERSLIP devem ser removidos horizontalmente com movimento forçado mínimo.
4. immunohistochemistry para Dextran etiquetado
- Depois que os COVERSLIP foram removidos, transfira delicadamente os slides em 1x novo PBS em um recipiente apropriado, tal como um frasco de Coplin. Retire o 1X PBS e realize três incubações de 5 min das lâminas em soro fisiológico com tampão Tris 1x com 0,1% de um surfactante não iônico (1x TBSt) à temperatura ambiente.
- Prepare 250 mL de peróxido de hidrogênio a 3% (H2O2) diluído em água deionizada em um recipiente de tamanho adequado. Incubar as lâminas em solução de 3% H2o2 à temperatura ambiente durante 15 min.
Nota: O peróxido de hidrogênio é corrosivo e deve ser devidamente descartado por regulamentações institucionais. Deve sempre ser utilizado um equipamento de protecção pessoal adequado (luvas, jaleco e óculos de segurança). - Enxague rapidamente as lâminas com água desionizada. Realize três lavas de 5 min dos slides em 1x TBSt. seque cuidadosamente a área ao redor das seções de tecido e coloque as lâminas planas em uma câmara úmida. Delinear as secções de tecido com uma caneta de barreira ou lápis de cera para manter o líquido nas secções, se necessário.
- Aplique uma solução de bloqueio de soro 2,5% pronta para uso, fornecida com um kit de rotulagem de anticorpos secundários (consulte a tabela de materiais) gota gota para cada seção. Incubar as lâminas numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 20 min.
- Prepare o anticorpo primário diluído em diluente de anticorpos (coelho anti-rotulado Dextran, 1:7500; ver a tabela de materiais) e misture por pipetagem suave. Delicadamente derrube as corrediças para drenar fora do amortecedor do bloco, seque a área em torno das seções, e coloc as corrediças lisas em uma câmara úmida.
- Não lave antes de aplicar a solução de anticorpos primários. Pipete 200 μL de solução de anticorpos primários por secção para as lâminas e incubar numa câmara húmida a 4 ° c durante a noite. Para o controlo secundário, pipetar 200 μL de diluente de anticorpos para as secções apropriadas.
- Gentilmente derrube as lâminas para drenar a solução de anticorpos primários e coloque em 1x TBSt em um recipiente apropriado, como um frasco de Coplin. Realize duas lavas de 5 min dos slides em 1x TBSt. seque a área em torno das seções e coloc horizontalmente em uma câmara húmida.
- Aplique um reagente de bloqueio de redução de fundo pronto para uso (consulte a tabela de materiais) gota gota para cada seção. Incubar as lâminas numa câmara húmida à temperatura ambiente durante 20 min.
- Delicadamente derrube as corrediças para drenar fora do amortecedor do bloco, seque com cuidado a área em torno das seções, e coloc as corrediças lisas em uma câmara úmida. Não lave antes de aplicar a solução de anticorpos secundários.
- Aplique uma solução de anticorpo secundário pronta para uso (anticorpo secundário de polímero de rábano de rábano (HRP), consulte a tabela de materiais) para cada seção gota gota e incubar em uma câmara úmida à temperatura ambiente por 30 min.
- Gentilmente derrube as lâminas para drenar a solução de anticorpos secundários e coloque em 1x TBSt em um recipiente apropriado, como um frasco de Coplin. Realize duas lavas de 5 min dos slides em 1x TBSt.
- Prepare o substrato cromogênico HRP imediatamente antes da utilização de acordo com o protocolo do fabricante (consulte a tabela de materiais).
- Seque a área ao redor das seções, coloque as lâminas em uma superfície plana e aplique 200 μL do substrato cromogênico HRP em cada seção. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min, iniciando um temporizador quando o substrato tiver sido aplicado ao primeiro slide (Figura 4).
- Escorra a solução de substrato e enxague brevemente as lâminas em um frasco de Coplin contendo 1X PBS. Coloc as corrediças na água deionizada em um recipiente apropriado, tal como um frasco de Coplin, e realize duas lavas de 5 minutos na água deionizada com agitação delicada.
- Contratura as lâminas colocando-as em solução de coloração de hematoxilina por até 30 s.
Nota: A hematoxilina é tóxica e deve ser descartada por regulamentações institucionais. Deve sempre ser utilizado um equipamento de protecção pessoal adequado (luvas, jaleco e óculos de segurança). - Coloque os slides em água desionizada em um recipiente apropriado, como um frasco de Coplin, e realize três lavas de 5 min em água desionizada. Transfira os slides para um recipiente contendo a água da torneira de Scott (veja a tabela de materiais) e incubar por 1 min.
- Coloque os slides em água desionizada em um recipiente apropriado, como um frasco de Coplin, e realize três lavas de 5 min em água desionizada.
- Desidratar as lâminas através de uma série de etanol (EtOH) graus (diluído em água deionizada) e xileno em um capuz químico. Realize uma incubação de 2 min em 70% de EtOH, duas incubações de 1 min em 95% de EtOH, duas incubações de 1 min em 100% de EtOH e três incubações de 1 min em xileno. Retire as lâminas do xileno e coloque um lamínula enquanto molhado com um meio de montagem à base de tolueno em uma capa química.
Nota: Xileno e tolueno são tóxicos e inflamáveis e devem ser devidamente eliminados por regulamentos institucionais. O trabalho com xileno e tolueno deve ser realizado em uma capa química, e o equipamento de proteção individual apropriado (luvas, jaleco e óculos de segurança) deve sempre ser usado. - Após IHC, visualize e imagem as corrediças com um microscópio claro composto e uma câmara digital na ampliação 100x (ampliação da ocular 10x e ampliação objetiva 10x). (Figura 5).
Representative Results
Nós desenvolvemos este protocolo a fim identificar e analisar a expressão da proteína em pilhas individuais do doador em 48 h embriões quimérico do zebrafish da borne-fertilização que foram gerados pelo transplante do blastula-à-blastula entre embriões do selvagem-tipo Zebrafish do AB. A análise bem-sucedida da expressão protéica no nível de uma célula exigiu a preparação de criosecções com embriões adequadamente orientados (Figura 1 e Figura 2) e a aplicação cuidadosa e sequencial das técnicas de If e IHC a estes crisecções (Figura 3 e Figura 4). O uso de anticorpos específicos para detectar simultaneamente células proliferantes (pH3, Figura 5a, B) e células doadoras (Dextran Antirotulado, Figura 5D) pode ser usado para identificar e quantificar células fornecedoras que estão proliferando ativamente ( Figura 5E). É essencial gerar imagens de alta qualidade após ambas as IF (Figura 2a, B) e IHC (Figura 2D), a fim de identificar com precisão as células individuais. Um programa de análise de imagem deve ser usado para executar a sobreposição de imagem (Figura 5E). Dependendo do programa de análise de imagem usado, pode ser possível realizar contagens automatizadas de células rotuladas deve ser desejada quantificação.
Figura 1: Preparação de blocos de OCT congelados. (A) 50x Visão microscópica de embriões em Oct em um molde criogênico preparado para congelamento. A seta vermelha indica a cabeça da posição do embrião do zebrafish de encontro à superfície inferior do molde; seta preta indica cauda apontando para o usuário. (B) moldes plásticos com embriões e Oct colocados em plataforma metálica refrigerada. (C) balde de gelo da espuma coloc sobre moldes plásticos para criar a câmara de congelação. (D) Oct fica branco de transparente uma vez que o bloco está totalmente congelado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Criseccionamento de blocos de OCT congelados. (A), aplicação de OCT fresca no disco do criostato e colocação do bloco congelado em Oct, girado 180 ° da orientação de congelação do bloco. (B) vista lateral do bloco congelado para o disco de corte. (C) vista do bloco de corte com placa de rolo em posição. (D) pick-up de seções usando um slide carregado da plataforma metálica do criostat. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Vista de seções preparadas após a colocação em um slide. Seta indica barreira hidrofóbica, e linha pontilhada delineia a zona contendo seções dentro do perímetro da barreira. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: preparação para aplicação de substrato cromogênico durante a IHC. A corrediça é coloc em uma superfície lisa coberta com o envoltório plástico para permitir a aplicação uniforme do substrato cromogênico ao conter todo o derramamento do material perigoso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Rotulagem If e IHC representativa de embriões de zebrafish quimérico crioseccionados 48 HPF gerados por transplante de blastula-a-blastula entre embriões de zebrafish de tipo selvagem AB. (A) se detectar ser 10 fosforilados histona H3 (pH3, 1:200) expressão em 48 HPF embrião zebrafish quimérico. Vermelho = células pH3-positivas; azul = núcleos. As setas amarelas indicam exemplos de células positivas. (B) a subtração da mancha nuclear azul na imagem digital (software de ImageJ) realça a visualização de pilhas PH3-positive para a quantificação e a sobreposição da imagem. (C) controle negativo (somente anticorpo secundário) para o ensaio If no embrião de zebrafish quimérico 48 HPF criseccionado. A barra de escala representa 50 μm (aplicável a todos os painéis). (D) IHC para detectar o dextrano etiquetado (dextrano anti-etiquetado, 1:7500) no embrião quimérico do zebrafish de 48 HPF gerado pelo transplante do blastula-à-blastula entre embriões do selvagem-tipo ZEBRAFISH do AB. Os embriões doadores foram injetados com um conjugado dextrano fluorescentamente etiquetado no estágio da um-pilha antes do uso para a transplantação do blastula-à-blastula. Vermelho indica células rotuladas com um conjugado dextrano; azul indica núcleos. As setas amarelas indicam exemplos de células positivas. (E) sobreposição do painel B (if para PH3) e do painel C (IHC para dextrano rotulado) mostrando colocalização de expressão PH3 e dextrano rotulagem em células individuais. As setas amarelas indicam exemplos de células de duplo positivo. (F) controle negativo (somente anticorpo secundário) para o ensaio de IHC no embrião de zebrafish quimérico 48 HPF crioseccionado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Nós apresentamos um método novo para a imunofluorescência combinada e immunohistochemistry que representa uma etapa importante para a frente em executar experiências da colocalização em embriões cryosectioned do zebrafish. Há uma falta crítica de protocolos existentes da colocalização que são otimizados para o uso com embriões pequenos e o material cryosectioned17,18, ambo são usados de outra maneira geralmente em estudos moleculars14. Os protocolos de colocalização existentes concentram-se principalmente na visualização simultânea de dois fluoróforos17,18. Embora esses protocolos possam funcionar bem, sua utilidade é limitada pela disponibilidade de anticorpos que (i) podem ser usados em zebrafish e (II) são compatíveis com o IF.
Nós sentimos que o uso do criossecção para embriões do zebrafish fornece uma vantagem significativa nos termos da morfologia preservada do tecido. Porque o IHC é executado mais geralmente em seções da parafina do que Cryosections7,8, uma exploração mais adicional de métodos cryosection-baseados de IHC para a deteção da expressão da proteína é justificada. O uso de toda a montagem se é um método comum para visualizar os níveis de expressão em embriões de zebrafish, e é mais comumente descrito na literatura do que se usando Cryosections1,2,3,4, a 19. Entretanto, os protocolos inteiros da montagem têm limitações, incluindo a falta da localização exata das proteínas expressadas em tecidos profundos e o potencial para a expressão nivelada de superfície para obscurecer a expressão da proteína em uns tecidos mais profundos. Nós observamos consistentemente a manutenção excelente da morfologia celular depois da criopreservação, do seccionamento, e do IF e do IHC sequenciais. Para aplicativos que exigem localização precisa de expressão protéica no nível de célula única, há uma vantagem significativa para procedimentos baseados em seção como descrevemos neste protocolo. A incorporação da resina fornece uma opção alternativa para executar ensaios de IF ou de IHC em seções dos embriões do zebrafish do cedo-estágio20. As seções da resina fornecem a preservação superior da morfologia do tecido comparada aos Cryosections, e as seções relativamente mais finas do tecido podem ser preparadas. No entanto, os fabricantes geralmente não recomendam o uso de seções de resina para ensaios imuno-baseados, como alguns componentes das resinas não podem ser removidos das seções e podem mascarar sites de ligação de anticorpos21.
Embora todo o protocolo seja essencial para uma análise precisa e bem-sucedida dos padrões de expressão, algumas etapas específicas são críticas para o sucesso experimental. O primeiro passo crítico é o manejo de embriões durante a incorporação em13de outubro de14. Pode ser desafiador orientar cada embrião no mesmo plano transversal para que as seções sejam cortadas de aproximadamente a mesma área para todos os embriões. Descobrimos que o uso de pequenas agulhas de bitola para realizar pequenos movimentos deliberados através do meio de OCT viscoso para orientação embrionária é superior ao uso de fórceps, que são muito grandes e deslocar muito médio de OCT. Uma segunda etapa crítica ocorre durante o corte de blocos congelados, pois pode ser difícil obter seções de alta qualidade que contenham o (s) tecido (es) desejado sem treinamento e experiência significativos. Assim, recomendamos o uso de amostras de teste até que a técnica seja dominada. Um terceiro passo crítico é a remoção de lamínula, que tem o potencial de perturbar ou descascar amostras de tecido. Nós descobrimos que uma combinação de agitação suave para afrouxar a lamínula e a remoção lenta da corrediça do recipiente de PBS é a aproximação a mais eficaz para remover os lamela. Uma mão delicada e firme é A melhor; pesquisadores podem achar que algum julgamento e erro é necessário para aprender a remover os COVERSLIP efetivamente.
As etapas importantes adicionais no protocolo incluem a optimização do anticorpo (anticorpos preliminares e secundários para ambos os ensaios de If e de IHC) e a exposição das corrediças ao substrato e à contratura cromogênico. Uma pesquisa aprofundada sobre a especificidade do anticorpo primário e a concentração alvo é essencial; Geralmente, é melhor coletar amostras não-preciosas suficientes para pelo menos dois experimentos separados para IF e IHC que serão realizados para otimizar as concentrações primárias de anticorpos antes de iniciar a combinação IF/IHC. Incluir um controle positivo e negativo conhecido para cada anticorpo preliminar é essencial em cada experimento para assegurar-se de que ambos os ensaios de IF e de IHC estejam realizando apropriadamente. Os ajustes à concentração secundária do anticorpo podem igualmente ser necessários. A otimização da exposição de secções teciduais ao substrato cromogênico e à contratura para o ensaio IHC é necessária, uma vez que as diretrizes do fabricante frequentemente descrevem uma ampla gama de possíveis tempos de exposição. Nem todos os cromogénios podem ser compatíveis com as contrações e a pigmentação endógena do tecido, exigindo o planeamento cuidadoso no que diz respeito à seleção do cromogénio.
Há umas modificações potenciais numerosas que podem ser aplicadas ao protocolo descrito, e nós executamos com sucesso este protocolo com outras combinações de anticorpos que não poderiam ambos ser usados para o se. Como aludido acima, as substâncias cromogênico têm a compatibilidade distinta com as contrações específicas. Descobrimos que esses componentes são facilmente modificáveis no protocolo. Adicionalmente, os parâmetros para a incubação do anticorpo são completamente flexíveis, e podem ser aumentados ou diminuído dependendo da intensidade de coloração desejada. O processo de incorporação também pode ser modificado. Quando nós focarmos em seções transversais, os embriões podem facilmente ser orientados em todo o sentido endereçar os tecidos particulares do interesse. Finalmente, existem vários pontos de pausa possíveis neste protocolo. Os embriões desidratados podem ser armazenados em 100% MeOH em-20 ° c por alguns meses; os blocos congelados podem ser armazenados em-80 ° c por até três meses; e as corrediças preparadas podem ser armazenadas em-80 ° c por até nove meses em uma caixa de corrediça.
Devido à complexidade relativa deste protocolo combinado de IF/IHC, há umas fontes possíveis múltiplas da variação ou do erro que podem exigir a solução de problemas, variando da qualidade do tecido à experiência do investigador à manipulação da amostra. A maioria das etapas críticas descritas acima são consideradas críticas porque exigem otimização no nível de usuário individual ou exigem destreza, habilidade e experiência específicas. No entanto, descobrimos que a coloração de fundo não específica e a baixa intensidade do sinal são as questões mais importantes que exigem otimização. Tal como com qualquer protocolo IF ou IHC, abordar estas questões pode ser demorado e trabalhoso, e pode ser agravado com este método, uma vez que as duas técnicas são combinadas. Por esse motivo, é altamente recomendável otimizar o IF e o IHC separadamente antes de prosseguir com o protocolo combinado.
Enquanto nós prevemos que este método será útil para uma ampla gama de experimentos, existem potenciais limitações. O desempenho bem sucedido deste procedimento é dependente de manter amostras intactas do tecido através de dois experimentos seqüenciais que incluem etapas numerosas da lavagem. Por esta razão, quaisquer problemas que surgem durante o corte ou manuseio de tecidos, incluindo o uso de slides mais antigos que podem ter degradado na qualidade, irá limitar significativamente a capacidade dos pesquisadores para executar este protocolo com sucesso. Embora os slides possam ser potencialmente armazenados em-80 ° c por até nove meses, a aderência dos tecidos às lâminas diminui ao longo do tempo e tivemos o melhor sucesso com slides que são usados dentro de um mês de preparação ou idealmente, no dia seguinte. Uma segunda limitação é a pegada pequena de embriões do zebrafish. Embora tenhamos encontrado este experimento para ser útil na visualização de proteínas que são relativamente abundantemente expressas em embriões de estágio inicial, as proteínas que são expressas de forma inconsistente ou em níveis baixos podem ser muito difíceis de capturar em uma seção. Finalmente, uma vez que o protocolo utiliza crisecções 10 \ u201212 μm, é mais adequado para a avaliação da expressão protéica em estruturas maiores, tais como núcleos, ao invés de menores componentes sub-celulares.
Em resumo, nosso protocolo IF/IHC combinado será vantajoso para uma grande variedade de estudos em embriões de zebrafish de estágio inicial, e representa uma importante inovação na análise de expressão protéica precisa em tais espécimes. Nosso método, mostrado com sucesso na Figura 5, permitirá que os pesquisadores preservem a delicada morfologia dos embriões de zebrafish em estágio inicial em critisecções, enquanto trabalham com o intervalo um pouco limitado de anticorpos primários atualmente disponíveis que são validado para uso em IF ou IHC nesta espécie. Este protocolo será provavelmente útil para estudos em outros peixes e espécies de anfíbios (por exemplo, Medaka e Xenopus spp.), que são dificultados por limitações semelhantes à disponibilidade de anticorpos, podendo ser aplicáveis a modelos tradicionais de mamíferos como Bem.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por NIH Grant 5K01OD021419-02 e NC Universidade Estadual da faculdade de medicina veterinária.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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