Summary
Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.
Abstract
Onderzoek van intercellulaire interacties vereist vaak discrete labeling van specifieke celpopulaties en precieze eiwit lokalisatie. Het embryo van de zebravis is een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van dergelijke interacties met een in vivo model. Whole-Mount immunohistochemische en immunofluorescentie testen worden vaak toegepast in zebravis embryo's om de eiwit expressie te beoordelen. Het kan echter moeilijk zijn om nauwkeurige mapping van co-gelokaliseerde eiwitten in driedimensionale ruimte te bereiken. Daarnaast kunnen sommige studies het gebruik van twee antilichamen vereisen die niet compatibel zijn met dezelfde techniek (bijv. antilichaam 1 is alleen geschikt voor immunohistochemie en antilichaam 2 is alleen geschikt voor immunofluorescentie). Het doel van de hierin beschreven methode is het uitvoeren van sequentiële immunofluorescentie en/of immunohistochemie op individuele cryosecties afgeleid van vroege stadia van zebravis embryo's. Hier beschrijven we het gebruik van opeenvolgende rondes van immunofluorescentie, beeldvorming, immunohistochemie, beeldvorming voor een enkele cryosectie om een precieze identificatie van de eiwit expressie op het eencellige niveau te bereiken. Deze methodologie is geschikt voor elke studie in vroege stadia van zebravis embryo's die nauwkeurige identificatie van meerdere eiwit doelen in individuele cellen vereist.
Introduction
De zebravis is een extreem robuust modelorganisme dat momenteel wordt gebruikt in een breed scala aan disciplines in biomedisch onderzoek. Met name de snelle externe ontwikkeling en de translucentie van zebravis-embryo's vormen een uitstekend hulpmiddel voor in vivo-studies. Hierin beschrijven we een methode voor sequentiële immunofluorescentie (IF)-en immunohistochemische (IHC)-analyses van cryogesectioneerde zebravis-embryo's. Deze nieuwe procedure maakt gebruik van sequentiële toepassing van twee antilichamen op een enkele dia, waardoor nauwkeurige identificatie van cogelokaliseerde eiwitten op cellulair niveau, terwijl het behoud van weefsel secties. Dit protocol is met name nuttig voor studies met het zebravis-model, aangezien een relatief klein aantal antilichamen is gevalideerd voor gebruik in IF-en/of IHC-toepassingen in zebravis in vergelijking met Muismodellen.
De observatie van intercellulaire interacties is een essentieel element in veel studies, en kan belangrijke inzichten geven in moleculaire mechanismen die functioneren op cellulair niveau dat fenotypes op het organismale niveau onderdoet. Bovendien kan eiwit expressie informatie geven over cellulaire functie, vooral bij het onderzoeken van de expressie van meerdere eiwitten tegelijk binnen de cel (co-lokalisatie). Hoewel hele IHC en als veelgebruikte technieken voor het analyseren van eiwit expressie in zebravis embryo's1,2,3,4,5, kunnen hele Mount procedures worden problematisch voor het bereiken van precieze colokalisatie gegevens. In onze ervaring, het kan moeilijk zijn om onderscheid te maken tussen lagen van weefsel en visualiseren van eiwit expressie op het niveau van de eencellige in hele-Mount specimens. Beeldvormings software Programma's kunnen doorgaans geen onderscheid maken tussen oppervlakte kleuring versus diepere vlekken. Niet-oppervlakte niveau eiwit expressies kunnen worden verduisterd door meer helder uitgedrukt oppervlakte niveau expressie, wat leidt tot onnauwkeurigheden in kwantificering. Bovendien zijn de meeste traditionele zebravis clearing methoden vrij giftig6 en dus minder wenselijk voor gebruik.
Op antilichamen gebaseerde technieken, zoals IF en IHC, worden vaak gebruikt om eiwit expressie te detecteren in materiaal dat is verdeeld, waardoor de identificatie van discrete celpopulaties die een bepaald eiwit in complexe weefsels uitdrukken, wordt vereenvoudigd. IHC wordt vaak gebruikt voor colokalisatie, het vaakst door het gebruik van twee verschillende antilichamen geconjugeerd in verschillende gastheer soorten en gevisualiseerd met verschillende gekleurde chromogenen4,7,8,9 , 10. het gebruik van meerdere chromogenen kan echter leiden tot niet-specifieke achtergrondkleuring of onverenigbaarheid van kleuren11,12.
We ontwikkelden een nieuw protocol voor de detectie van meervoudige eiwitten door sequentiële IF en IHC op cryosectioneerde, in het beginstadium zebravis-embryo's. Cryosnijden is bijzonder geschikt voor delicate weefsels zoals zebravis embryo's, en cryosecties zijn superieur aan paraffine-ingesloten secties voor fluorescentie-gebaseerde assays13,14. We kozen ervoor om gecombineerde IF en IHC te optimaliseren in plaats van Dual-Color als of IHC, om het probleem van antilichamen onverenigbaarheid voor een enkel assay type te omzeilen. Deze problemen zijn met name relevant voor onderzoek waarbij zebravis wordt gebruikt vanwege het beperkte aantal in de handel verkrijgbare antilichamen die worden gevalideerd voor gebruik in zebravis. In feite toonde een studie van vier grote bedrijven aan dat in de handel verkrijgbare antilichamen voor gebruik in de muis ongeveer 112.000 versus ongeveer 5.300 voor gebruik in zebravis15waren. Ten slotte hebben we ervoor gekozen om een protocol te ontwikkelen dat kan worden uitgevoerd op één cryosectie, wat essentieel is bij het werken met kleine of beperkte weefselmonsters zoals verkregen uit zebravis embryo's.
Dit protocol is ontworpen om het proliferatieve gedrag van donor cellen te beoordelen in 48 h post-fertilisatie chimerische zebravis-embryo's die werden gegenereerd door blastula-to-blastula-transplantatie zoals beschreven door Carmany-Rampey en Moens16. Donor embryo's werden geïnjecteerd in de eencelfase met een fluorescentend gelabeld dextran-conjugaat voorafgaand aan transplantatie van donor cellen in ontvangende embryo's. We gebruikten immunofluorescentie voor ser 10 gefosforyleerd histone H3 (pH3) voor het opsporen van prolifererende cellen gevolgd door immunohistochemie voor het gelabelde dextran om donor cellen in chimerische zebravis-embryo's te detecteren. Sequentiële detectie van pH3 en het gelabelde dextran binnen een enkele cryosectie konden ons identificeren en kwantificeren van individuele cellen die beide markers uitgedrukt.
Dit sequentiële IF/IHC-protocol voor gecryoeerde zebravis zal een nuttig hulpmiddel zijn voor zebravis-onderzoekers die een colokalisatie protocol voor eiwit expressie wensen. De problemen waarmee dit protocol is bedoeld, zoals kleine weefsel specimens en beperkte beschikbaarheid van antilichamen, zijn niet uniek voor het zebravis-model. Deze methode kan daarom van toepassing zijn op elke onderzoeker die wil sequentieel uitvoeren als/IHC.
ETHISCHE VERKLARING:
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, VS.
Protocol
1. embryo voorbereiding
- Fix 48 h post-fertilisatie (HPF) chimerische zebravis embryo's gegenereerd door blastula-to-blastula transplantatie tussen AB wild-type zebravis embryo's in 4% Paraformaldehyde (PFA) 's nachts met schommelen bij 4 °C. Voer twee 5 min wassingen uit met schommelen bij kamertemperatuur met 500 μL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% van een niet-ionische oppervlakteactieve stof (1x PBSt; Zie de tabel met materialen)
Opmerking: Paraformaldehyde is giftig en kankerverwekkend en moet per institutionele regeling naar behoren worden afgevoerd. Werken met Paraformaldehyde dient te worden uitgevoerd in een chemische afzuigkap, en er moeten altijd passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, Labcoat en veiligheidsbril) worden gebruikt. - Dehydraat embryo's door opeenvolgend te wassen met 500 μL van 30%, 50% en 70% methanol (MeOH), verdund met 1x PBSt gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met schommeling. Incuberen embryo's in 500 μL 100% MeOH bij-20 °C gedurende ten minste 14 uur.
Opmerking: Methanol is giftig en moet naar behoren worden afgevoerd volgens de institutionele voorschriften. Werken met methanol moet worden uitgevoerd in een chemische afzuigkap en er moeten altijd geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, Labcoat en veiligheidsbrillen) worden gebruikt. - Rehydraat embryo's door opeenvolgend te wassen met 500 μL 70%, 50% en 30% MeOH verdund met 1x PBSt gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met schommeling. Voer twee 5 min wast met 500 μL 1x PBSt bij kamertemperatuur met schommelen.
- Verwijder de 1x PBSt en inincuberen in 500 μL van 30% sucrose verdund met gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur met schommelen tot de embryo's naar de bodem van de buis zinken (ongeveer 1 uur). Vervang sucrose met 500 μL van 15% visgelatine/25% sucrose (15/25; Zie de tafel van de materialen) en inbroed bij kamertemperatuur met schommelen 's nachts.
- Vervang ongeveer de helft van het volume van 15/25 met optimale snijtemperatuur medium (OCT-medium) en incuberen bij kamertemperatuur met schommelen tot de embryo's naar de bodem van de buis zinken (ongeveer 1 uur).
- Vervang ongeveer de helft van het volume met OCT medium en incuberen bij kamertemperatuur met schommelen gedurende 1 uur. Herhaal deze stap één keer.
- Tijdens incubatie stappen met 15/25 en OCT medium, Inverteer of veeg de buis naar behoefte om deze reagentia te combineren.
2. insluiten van embryo's en bereiding van cryosecties
- Breng embryo's over naar een plastic mal (Zie de tabel met de materialen) met een tang en Minimaliseer de overdracht van het mengsel van 15/25-Oct. Vul de mal ongeveer half vol met OCT medium en meng de embryo's voorzichtig in het medium OCT.
- Bereid gelabelde kunststof mallen en overdracht van de gewenste embryo's (meestal 1 \ u20123 embryo's) in de lege, gelabelde kunststof mallen, minimaliseren Carry-over van de LGO medium. Zodra de gewenste embryo's zich in de plastic mal bevinden, vult u zachtjes met een OCT-medium naar de bovenkant van de mal.
- Gebruik een tang of 25 G naalden om embryo's naar de gewenste oriëntatie te rangschikken, met behulp van een licht stereomicroscoop voor visualisatie (Figuur 1a, B).
- Vries de bereide mallen op droogijs in een geïsoleerde container met een metalen platform. Plaats een ijsemmer of schuim koeler zachtjes over het metalen platform om een koude kamer te creëren (figuur 1c, D)
-
Bereid 10 \ u201212 μm dikke cryosecties met een cryostaat set bij-20 °C.
- Stel één blok tegelijk in en gebruik het OCT-medium om het blok op de schijf/klauwplaat te bevriezen met de onderkant van het blok naar het blad gericht (Figuur 2a). Zorg ervoor dat het blok volledig is bevroren op de schijf (het LGO-medium wordt wit) voordat u begint met snijden (Figuur 2b).
- Plaats cryosecties op opgeladen glazen glijbanen (figuur 2c, D) en lucht drogen de dia's 's nachts op kamertemperatuur.
3. immunofluorescentie voor pH3
- Voer drie 5 min wassen van de dia's in 1x PBS in een geschikte container, zoals een Coplin jar. Als de weefsels niet goed aan de glijbaan worden gehecht, voert u waswater uit door dia's op een plat oppervlak te leggen en voorzichtig 500 μL 1x PBS op het oppervlak te pipetteren. Giet 1x PBS tussen de wassingen door zachtjes de glijbanen te kantelen.
- Schets de secties met een Barrier pen of een wax potlood om de vloeistof op de glaasjes te houden (Figuur 3).
- Leg de dia's op een vlakke ondergrond in een vochtige kamer en Pipetteer 200 μL van de blok buffer per sectie op de dia's. Inincuberen in blok buffer voor 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Bereid de primaire antilichaam verdunning (konijn anti-pH3 antilichaam, 1:200; Zie tabel met materialen) in blok buffer en meng goed door pipetteren. Tip de glaasjes voorzichtig aan om de blok buffer af te tappen, keer terug naar de vochtige kamer en Pipetteer 200 μL primaire antilichaam oplossing per sectie op de dia's. Pipetteer 200 μL blok buffer op de juiste gedeelten voor het besturingselement voor de secundaire besturing.
- Inincuberen de glaasjes bij 4 °C 's nachts in een vochtige kamer gevuld met gedeïoniseerd water. Sluit de randen van de vochtige kamer af om vocht vast te houden.
- Voer drie 5 min wassen van de dia's in 1x PBS in een geschikte container, zoals een Coplin jar. Bereid tijdens de wasstappen de secundaire antilichaam verdunning (anti-konijn-fluorescerende secundaire antilichaam conjugaat, 1:2000; Zie tabel met materialen) in blok buffer en meng goed door pipetteren.
- Leg de dia's op een vlakke ondergrond in een vochtige kamer en Pipetteer 200 μL secundaire antilichaam oplossing per sectie op de dia's. Incuberen de glaasjes in secundaire antilichaam oplossing (en) bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht, gedurende 30 minuten.
- Voer drie 5 min wassen van de dia's in 1x PBS in een geschikte container, zoals een Coplin jar, afgeschermd van licht. Maak tijdens de wasstappen een nucleaire kleurings oplossing (Zie de tabel met materialen).
- Plaats de dia's op een plat oppervlak en Pipetteer 200 \ u2012500 μL (afhankelijk van de grootte van het monster) van de nucleaire kleurings oplossing op elke sectie. Incuberen de glaasjes in de nucleaire kleurings oplossing gedurende 10 minuten, afgeschermd van licht.
- Giet de nucleaire kleurings oplossing af en monteer de dia's met niet-verhardende fluorescerende bevestigings media en een glazen afdekplaat. Houd de glaasjes in het donker bij 4 °C totdat er beeldvorming wordt uitgevoerd.
Opmerking: De beste resultaten worden verkregen wanneer de dia's op dezelfde dag of de volgende dag worden afgebeeld. - Volgende IF, visualiseer en beeld de dia's met een confocale fluorescentiemicroscoop en digitale camera met behulp van 555 nm (rood) en 645 nm (far-Red) emissie filters met een vergroting van 100x (10x oculaire vergroting en 10x objectieve vergroting). Houd de laser stroom consistent tijdens beeldvorming.
- Plaats na de beeldvorming de dia's in afzonderlijke containers van 1x PBS en sla deze gedurende de nacht op bij 4 °C om de afdekplaten voor te bereiden. Bij het plaatsen van de dia's in 1x PBS, zachtjes schudden de dia's om te helpen bij het verwijderen van de dekslip.
Opmerking: Druk niet op de dekslip of probeer de dekslip handmatig te verwijderen, omdat dit de kwaliteit van de secties in gevaar kan brengen. De afdek stroken moeten horizontaal worden verwijderd met minimale geforceerde beweging.
4. immunohistochemie voor gelabeld dextran
- Nadat de dekstroken zijn verwijderd, breng je de dia's voorzichtig over in een nieuwe 1x PBS in een geschikte container, zoals een Coplin jar. Verwijder de 1x PBS en voer drie 5 minuten incubaties van de glaasjes uit in 1x tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% van een niet-ionische oppervlakteactieve stof (1x TBSt) bij kamertemperatuur.
- Bereid 250 mL van 3% waterstofperoxide (H2O2) verdund in gedeïoniseerd water in een container met voldoende grootte. Incuberen de glaasjes in 3% H2O2 oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 min.
Opmerking: Waterstofperoxide is corrosief en moet naar behoren worden afgevoerd volgens de institutionele voorschriften. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, Labcoat en veiligheidsbril) moeten altijd worden gebruikt. - Spoel de dia's snel af met gedeïoniseerd water. Voer drie 5 min wassingen van de glijbanen uit in 1x TBSt. droog het gebied rond de weefsel secties voorzichtig en plaats de platen plat in een vochtige kamer. Schets de weefsel secties met een Barrier pen of een wax potlood om vloeistof op de secties te houden indien nodig.
- Breng een kant-en-klare 2,5% serum blokkerende oplossing aan die wordt geleverd met een secundair antilichaam labelset (Zie de tabel met materialen) druppelsgewijs naar elke sectie. Incuberen de glaasjes in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Bereid het primaire antilichaam verdund in antilichaam verdunningsmiddel (konijn anti-gelabeld dextran, 1:7500; Zie de tabel met materialen) en meng door voorzichtig pipetteren. Tip de glaasjes voorzichtig aan om de blok buffer af te voeren, droog het gebied rond de secties en plaats de dia's plat in een vochtige kamer.
- Niet wassen voordat u de primaire antilichaam oplossing toepast. Pipetteer 200 μL primaire antilichaam oplossing per sectie op de glaasjes en incuberen in een vochtige kamer bij 4 °C 's nachts. Pipetteer voor de secundaire besturing 200 μL antistof verdunningsmiddel op de desbetreffende secties.
- Tip de dia's voorzichtig aan om de primaire antilichaam oplossing af te tappen en plaats in 1x TBSt in een geschikte container, zoals een Coplin jar. Voer twee 5 min wast van de glijbanen in 1x TBSt. droog het gebied rond de secties en plaats plat in een vochtige kamer.
- Pas een kant-en-klare achtergrond-reducerende Blokkeer reagens toe (Zie de tabel met materialen) druppelsgewijs naar elke sectie. Incuberen de glaasjes in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Tip de glaasjes voorzichtig aan om de blok buffer uit te voeren, droog het gebied rond de secties voorzichtig af en plaats de dia's plat in een vochtige kamer. Niet wassen voordat u de secundaire antilichaam oplossing aanbrengt.
- Breng een kant-en-klare oplossing voor secundair antilichaam aan (anti-konijn-mierikswortelperoxidase (HRP) polymeer secundair antilichaam; Zie de tabel met materialen) naar elke sectie druppelsgewijs en inincuberen in een vochtige kamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Tip de dia's voorzichtig aan om de secundaire antilichaam oplossing af te tappen en plaats in 1x TBSt in een geschikte container, zoals een Coplin jar. Voer twee 5 min wast van de glijbanen in 1x TBSt.
- Bereid het HRP chromogene substraat onmiddellijk voor gebruik volgens het Protocol van de fabrikant (Zie de tabel met materialen).
- Droog het gebied rond de secties, plaats de dia's op een plat oppervlak en breng 200 μL van het HRP chromogene substraat aan op elke sectie. Inbroed gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, waarbij een timer wordt gestart wanneer de ondergrond op de eerste dia is aangebracht (Figuur 4).
- Aftappen van de substraat oplossing en spoel de dia's kort in een Coplin jar met 1x PBS. Plaats de dia's in gedeïoniseerd water in een geschikte container, zoals een Coplin jar, en voer twee 5 min wasmiddelen in gedeïoniseerd water met zachte opwinding.
- De dia's tegengaan door ze in hematoxyline-kleurings oplossing te plaatsen voor maximaal 30 s.
Opmerking: Hematoxylin is giftig en moet worden weggegooid volgens de institutionele voorschriften. Geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, Labcoat en veiligheidsbril) moeten altijd worden gebruikt. - Plaats de glaasjes in gedeïoniseerd water in een geschikte recipiënt, zoals een Coplin jar, en voer drie 5 min wasmiddelen uit in gedeïoniseerd water. Breng de dia's over naar een container met het kraanwater van Scott (Zie de tabel met materialen) en incuberen gedurende 1 minuut.
- Plaats de glaasjes in gedeïoniseerd water in een geschikte recipiënt, zoals een Coplin jar, en voer drie 5 min wasmiddelen uit in gedeïoniseerd water.
- Dehydraat de glaasjes door een reeks van ethanol (EtOH) soorten (verdund in gedeïoniseerd water) en xyleen in een chemische afzuigkap. Voer een incubatie van 2 minuten uit in 70% EtOH, twee incubaties van 1 minuut in 95% EtOH, twee incubaties van 1 minuut in 100% EtOH en drie incubaties van 1 minuut in xyleen. Verwijder de glaasjes van xyleen en plaats een dekslip terwijl het nat is met een op tolueen gebaseerd bevestigings medium in een chemische kap.
Opmerking: Xyleen en tolueen zijn giftig en ontvlambaar en moeten volgens de institutionele voorschriften naar behoren worden afgevoerd. Werken met xyleen en tolueen dient te worden uitgevoerd in een chemische afzuigkap en er moet altijd gebruik worden gemaakt van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, Labcoat en veiligheidsbril). - Volg IHC, visualiseer en beeld de dia's met een samengestelde lichtmicroscoop en digitale camera met een vergroting van 100x (10x oculaire vergroting en 10x objectieve vergroting). (Figuur 5).
Representative Results
We ontwikkelden dit protocol om de eiwit expressie te identificeren en te analyseren in individuele donor cellen in 48 h post-fertilisatie chimeer zebravis-embryo's die werden gegenereerd door blastula-to-blastula transplantatie tussen AB wild-type zebravis embryo's. Een succesvolle analyse van de eiwit expressie op het eencellige niveau vereist de bereiding van cryosecties met naar behoren georiënteerde embryo's (Figuur 1 en Figuur 2) en zorgvuldige, sequentiële toepassing van if-en IHC-technieken op deze cryosecties (Figuur 3 en Figuur 4). Het gebruik van specifieke antilichamen voor het gelijktijdig opsporen van prolifererende cellen (anti-pH3, Figure 5a, B) en donor cellen (anti-gelabeld dextran, figuur 5d) kan worden gebruikt om donor cellen die actief prolifererend zijn te identificeren en te kwantificeren ( Figuur 5e). Het is essentieel om afbeeldingen van hoge kwaliteit te genereren na zowel IF (Fig. 2a, B) als IHC (figuur 2D) om individuele cellen nauwkeurig te kunnen identificeren. Een analyseprogramma voor afbeeldingen moet worden gebruikt om beeld-overlay uit te voeren (figuur 5e). Afhankelijk van het beeldanalyse programma dat wordt gebruikt, kan het mogelijk zijn om geautomatiseerde tellingen van gelabelde cellen uit te voeren als kwantificering gewenst is.
Figuur 1: Voorbereiding van bevroren LGO-blokken. A) 50x microscopisch overzicht van de EMBRYO'S in LGO in een cryogene mal die voor bevriezing is bereid. Rode pijl geeft hoofd van zebravis embryo positie tegen het onderste oppervlak van de mal; zwarte pijl geeft de staart aan die naar de gebruiker wijst. B) kunststof mallen met EMBRYO'S en LGO geplaatst op een gekoeld metalen platform. C) schuim ijsemmer geplaatst over kunststof mallen om vrieskamer te creëren. (D) Oct wordt wit van transparant zodra het blok volledig is bevroren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Cryosectioning van bevroren Oct-blokken. A), toepassing van verse LGO op cryostatica en plaatsing van bevroren blok op Oct, gedraaid 180 ° van de Vries stand van het blok. B) zijaanzicht van blok bevroren aan snij schijf. C) aanzicht van het snij blok met rolplaat in positie. D) het ophalen van secties met een opgeladen glijbaan van het metalen platform van de cryostat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Weergave van voorbereide secties na plaatsing op een dia. Pijl geeft hydrofobe barrière aan en de stippellijn bepaalt de zone met secties binnen de barrière omtrek. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: voorbereiding voor chromogene substraat toepassing tijdens IHC. De glijbaan wordt geplaatst op een vlakke ondergrond bedekt met plastic folie om een uniforme toepassing van het chromogene substraat mogelijk te maken, terwijl het morsen van gevaarlijk materiaal bevat. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatief als en IHC-etikettering van cryogeen 48 HPF chimerische zebravis-embryo's opgewekt door blastula-to-blastula-transplantatie tussen AB-zebravis-embryo's. A) bij detectie van ser 10 fosforylated histone H3 (anti-pH3, 1:200) expressie in 48 HPF chimeer zebravis embryo. Rood = pH3-positieve cellen; blauw = kernen. Gele pijlen geven voorbeelden van positieve cellen aan. (B) het aftrekken van de blauwe kern vlek in het digitale beeld (imagej-software) verbetert de visualisatie van pH3-positieve cellen voor kwantificering en beeld bedekking. C) negatieve controle (alleen secundair antilichaam) voor if-assay in cryogene 48 HPF chimeer zebravis embryo. Schaalbalk vertegenwoordigt 50 μm (toepasbaar op alle panelen). D) IHC voor het opsporen van gelabelde dextran (anti-gelabelde dextran, 1:7500) in chimeer 48 HPF zebravis embryo gegenereerd door blastula-to-blastula transplantatie tussen AB wild-type zebravis embryo's. Donor embryo's werden geïnjecteerd met een fluorescentend gelabeld dextran conjugaat in de ééncelfase voorafgaand aan gebruik voor blastula-to-blastula transplantatie. Rood geeft cellen aan die gelabeld zijn met een dextran-conjugaat; blauw geeft nuclei aan. Gele pijlen geven voorbeelden van positieve cellen aan. (E) overlay van panel B (if for pH3) en panel C (IHC voor gelabelde dextran) met Colokalisatie van pH3 expressie en dextran-labeling in afzonderlijke cellen. Gele pijlen geven voorbeelden van dubbele positieve cellen aan. F) negatieve controle (alleen secundair antilichaam) voor IHC-test in cryogene 48 HPF chimeer zebravis embryo. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
We hebben een nieuwe methode voor gecombineerde immunofluorescentie en immunohistochemie gepresenteerd die een belangrijke stap voorwaarts is in het uitvoeren van colokalisatie-experimenten op cryogesectioneerde zebravis-embryo's. Er is een kritisch gebrek aan bestaande colokalisatie protocollen die zijn geoptimaliseerd voor gebruik met kleine embryo's en cryosectionmateriaal17,18, die beide anders vaak worden gebruikt in moleculaire studies14. Bestaande colokalisatie protocollen richten zich voornamelijk op gelijktijdige visualisatie van twee fluoroforen17,18. Hoewel deze protocollen goed kunnen werken, wordt hun bruikbaarheid beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen die (i) in zebravis kunnen worden gebruikt en (II) compatibel zijn met IF.
Wij zijn van mening dat het gebruik van cryosnijden voor zebravis embryo's een significant voordeel biedt op het gebied van bewaarde weefsel morfologie. Aangezien IHC vaker wordt uitgevoerd op paraffine secties dan cryosecties7,8, is verdere verkenning van op cryosection gebaseerde IHC-methoden voor de detectie van eiwit expressie gerechtvaardigd. Het gebruik van de hele steun is een veelgebruikte methode voor het visualiseren van uitdrukkings niveaus in zebravis embryo's, en wordt vaker beschreven in de literatuur dan bij gebruik van cryosecties1,2,3,4, 19. Echter, hele Mount protocollen hebben beperkingen, met inbegrip van het gebrek aan nauwkeurige lokalisatie van eiwitten uitgedrukt in diepe weefsels en het potentieel voor oppervlakte niveau expressie tot obscure eiwit expressie in diepere weefsels. We hebben consequent uitstekend onderhoud van cellulaire morfologie waargenomen na cryopreservation, snijden, en sequentiële IF en IHC. Voor toepassingen waarvoor een precieze lokalisatie van de eiwit expressie op het niveau van één cel vereist is, is er een significant voordeel voor op sectie gebaseerde procedures zoals we in dit protocol hebben beschreven. Hars insluiten biedt een alternatieve optie voor het uitvoeren van IF-of IHC-assays op secties van in het beginstadium zebravis-embryo's20. Hars secties bieden superieure behoud van weefsel morfologie in vergelijking met cryosecties, en relatief dunnere weefsel secties kunnen worden voorbereid. Fabrikanten raden echter meestal het gebruik van hars secties voor immuno gebaseerde assays niet aan, omdat sommige componenten van de harsen niet uit de secties kunnen worden verwijderd en antilichaam binding sites kunnen maskeren21.
Hoewel het hele Protocol essentieel is voor een accurate en geslaagde analyse van expressie patronen, zijn enkele specifieke stappen van cruciaal belang voor experimenteel succes. De eerste cruciale stap is de behandeling van embryo's tijdens het insluiten in oktober13,14. Het kan een uitdaging zijn om elk embryo in hetzelfde dwarsvlak te oriënteren, zodat secties van ongeveer hetzelfde gebied voor alle embryo's worden afgesneden. We hebben geconstateerd dat het gebruik van kleine ijknaalden om kleine, opzettelijke bewegingen uit te voeren via het viskeuze LGO-medium voor de embryonale oriëntatie superieur is aan het gebruik van de Tang, die te groot is en te veel OCT-medium verdringen. Een tweede kritieke stap vindt plaats tijdens het snijden van bevroren blokken, omdat het moeilijk kan zijn om secties van hoge kwaliteit te verkrijgen die het gewenste weefsel (en) bevatten zonder significante training en ervaring. We raden daarom aan om testsamples te gebruiken totdat de techniek wordt beheerst. Een derde kritieke stap is het verwijderen van de dekslip, die het potentieel heeft om weefselmonsters te storen of af te strippen. We hebben geconstateerd dat een combinatie van zachte opwinding om de dekslip los te maken en het langzaam verwijderen van de glijbaan uit de PBS-container de meest effectieve manier is om dekstroken te verwijderen. Een zachte en stabiele hand is het beste; onderzoekers kunnen vinden dat sommige trial and error is noodzakelijk om te leren hoe te verwijderen dekbonnen effectief.
Extra belangrijke stappen in het protocol zijn antilichaam optimalisatie (primaire en secundaire antilichamen voor zowel IF-Als IHC-assays) en blootstelling van dia's aan het chromogene substraat en contra vlek. Grondig onderzoek naar de specificiteit van primaire antilichamen en de doelconcentratie is essentieel; over het algemeen is het het beste om voldoende niet-kostbare monsters te verzamelen voor ten minste twee afzonderlijke experimenten voor IF en IHC die zullen worden uitgevoerd om de primaire antilichaamconcentraties te optimaliseren voordat de IF/IHC-combinatie begint. Met inbegrip van een bekende positieve en negatieve controle voor elk primair antilichaam is essentieel in elk experiment om ervoor te zorgen dat zowel als en IHC assays op de juiste wijze presteren. Aanpassingen van de secundaire antilichaam concentratie kunnen ook noodzakelijk zijn. Optimalisatie van de blootstelling van weefsel secties aan het chromogene substraat en contra vlek voor de IHC-test is vereist, aangezien de richtlijnen van de fabrikant vaak een breed scala aan mogelijke blootstellings tijden beschrijven. Niet alle chromen genen kunnen verenigbaar zijn met tegen vlekken en endogene weefsel pigmentatie, waarbij zorgvuldige planning vereist is met betrekking tot de selectie van chromogeen.
Er zijn tal van mogelijke wijzigingen die kunnen worden toegepast op het beschreven protocol, en we hebben dit protocol met succes uitgevoerd met andere combinaties van antilichamen die niet beide kunnen worden gebruikt voor als. Zoals hierboven vermeld, hebben chromogene stoffen een duidelijke compatibiliteit met specifieke tegen vlekken. We hebben geconstateerd dat deze componenten gemakkelijk te modificeerbaar zijn in het protocol. Bovendien zijn de parameters voor de incubatie van antilichamen vrij flexibel en kunnen ze worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de gewenste kleurings intensiteit. Het insluitings proces kan ook worden gewijzigd. Hoewel we ons hebben geconcentreerd op dwarsdoorsneden, kunnen embryo's gemakkelijk worden georiënteerd in elke richting om bepaalde weefsels van belang aan te pakken. Ten slotte zijn er meerdere mogelijke pauze punten in dit protocol. Gedehydrateerde embryo's kunnen gedurende enkele maanden worden opgeslagen in 100% MeOH bij-20 °C; Bevroren blokken kunnen maximaal drie maanden bij-80 °C worden bewaard; en bereide glijbanen kunnen tot negen maanden bij-80 °C bewaard worden in een Slide box.
Vanwege de relatieve complexiteit van dit gecombineerde IF/IHC-protocol zijn er meerdere mogelijke bronnen van variatie of fout die problemen kunnen vereisen, variërend van weefsel kwaliteit tot onderzoeker ervaring om de behandeling te voorkomen. De meeste van de hierboven beschreven kritieke stappen worden beschouwd als kritiek omdat ze vereisen optimalisatie op het niveau van de individuele gebruiker of ze vereisen specifieke Behendigheid, vaardigheid en ervaring. We hebben echter geconstateerd dat niet-specifieke achtergrondkleuring en lage signaalintensiteit de belangrijkste problemen zijn die optimalisatie vereisen. Net als bij elk IF-of IHC-protocol kan het aanpakken van deze problemen tijdrovend en arbeidsintensief zijn, en kan het worden verergerd door deze methode, omdat de twee technieken worden gecombineerd. Om deze reden raden we ten zeerste aan om te optimaliseren als en IHC afzonderlijk voordat u doorgaat met het gecombineerde protocol.
Hoewel we voorspellen dat deze methode nuttig zal zijn voor een breed scala aan experimenten, zijn er mogelijke beperkingen. Succesvolle uitvoering van deze procedure is afhankelijk van het handhaven van intact weefselmonsters door middel van twee sequentiële experimenten met een groot aantal wasstappen. Om deze reden, eventuele problemen die zich voordoen tijdens het snijden of weefselbehandeling, met inbegrip van het gebruik van oudere dia's die kunnen zijn aangetast in kwaliteit, zal het vermogen van onderzoekers om dit protocol succesvol uit te voeren aanzienlijk beperken. Hoewel dia's mogelijk maximaal negen maanden bij-80 °C kunnen worden bewaard, daalt de hechting van weefsels aan dia's na verloop van tijd en hadden we het beste succes met dia's die worden gebruikt binnen een maand van voorbereiding of idealiter, de volgende dag. Een tweede beperking is de kleine footprint van zebravis embryo's. Hoewel we hebben geconstateerd dat dit experiment nuttig is bij het visualiseren van eiwitten die relatief overvloedig zijn uitgedrukt in vroege stadia van embryo's, kunnen eiwitten die inconsistent of op laag niveau worden uitgedrukt, zeer moeilijk te vatten zijn in een sectie. Tot slot, aangezien het protocol 10 \ u201212 μm cryosecties gebruikt, is het het meest geschikt voor de evaluatie van eiwit expressie in grotere structuren, zoals kernen, in plaats van kleinere sub-cellulaire componenten.
Samenvattend, ons gecombineerde IF/IHC-protocol zal voordelig zijn voor een breed scala aan studies in vroege stadia van zebravis embryo's, en vormt een belangrijke innovatie in precieze eiwit expressie analyse in dergelijke specimens. Onze methode, die met succes wordt getoond in Figuur 5, stelt onderzoekers in staat om de delicate morfologie van in het beginstadium gezebravis embryo's in cryosecties te behouden tijdens het werken met het enigszins beperkte bereik van momenteel beschikbare primaire antilichamen die gevalideerd voor gebruik in IF of IHC bij deze soort. Dit protocol zal waarschijnlijk nuttig zijn voor studies in andere vissoorten en amfian soorten (bijv. Medaka en Xenopus spp.), die worden gehinderd door soortgelijke beperkingen van de beschikbaarheid van antilichamen, en kunnen van toepassing zijn op traditionele zoogdier modellen zoals Goed.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NIH Grant 5K01OD021419-02 en NC State University College voor diergeneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. Modern mosaic analysis in the zebrafish. Methods. 39, 228-238 (2006).
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
