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Biology

क्रायोसेक्शन्ड ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Published: May 14, 2019 doi: 10.3791/59344
Automatic Translation
,
1Department of Population Health and Pathobiology, NC State University College of Veterinary Medicine

Summary

यह प्रोटोकॉल विशिष्ट कोशिका आबादी में सटीक सहस्थानीकरण विश्लेषण को सक्षम करने के प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से क्रायोसेक्शन पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को दर्शाता है।

Abstract

intercellular बातचीत की जांच अक्सर विशिष्ट सेल आबादी और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण के असतत लेबलिंग की आवश्यकता है. जेब्राफ़िश भ्रूण एक में विवो मॉडल के साथ इस तरह की बातचीत की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए पूरे-माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख अक्सर जेब्राफ़िश भ्रूण में लागू किए जाते हैं। हालांकि, तीन आयामी अंतरिक्ष में सह-स्थानीयकृत प्रोटीन की सटीक मानचित्रण प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों में दो एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है जो एक ही तकनीक के साथ संगत नहीं हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी 1 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ही उपयुक्त है और एंटीबॉडी 2 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए ही उपयुक्त है)। यहाँ वर्णित विधि का उद्देश्य प्रारंभिक चरण जेब्राफ़िश भ्रूण से व्युत्पन्न व्यक्तिगत क्रायोसेक्शन पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस और/या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करना है। यहाँ हम एक एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति की सटीक पहचान प्राप्त करने के क्रम में एक ही क्रायोसेक्शन के लिए इमेजिंग इम्यूनोफ्लोरेसी, इमेजिंग, इम्यूनोफ्लोरेसीकेमिया के अनुक्रमिक दौर के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस पद्धति के प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं में कई प्रोटीन लक्ष्यों की सही पहचान की आवश्यकता में किसी भी अध्ययन के लिए उपयुक्त है.

Introduction

जेब्राफ़िश एक अत्यंत मजबूत मॉडल जीव है कि वर्तमान में जैव चिकित्सा अनुसंधान में विषयों की एक विस्तृत विविधता भर में प्रयोग किया जाता है. विशेष रूप से, तेजी से बाहरी विकास और ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के translucency विवो अध्ययन में के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं. इसमें, हम अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, क्रायोसेक्शन्ड जेब्राफ़िश भ्रूणों का विश्लेषण करते हैं। इस उपन्यास प्रक्रिया एक ही स्लाइड पर दो एंटीबॉडी के अनुक्रमिक आवेदन का उपयोग करता है, सेलुलर स्तर पर colocalized प्रोटीन की सही पहचान को सक्षम करने, जबकि ऊतक वर्गों के संरक्षण. इस प्रोटोकॉल ज़ेबराफ़िश मॉडल के साथ अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, एंटीबॉडी की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के बाद से माउस मॉडल की तुलना में ज़ेब्राफ़िश में IF और /

intercellular बातचीत के अवलोकन के कई अध्ययनों में एक आवश्यक तत्व है, और आणविक तंत्र सेलुलर स्तर पर काम कर रहा है कि जीव स्तर पर underlie phenotypes में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति सेलुलर समारोह के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, खासकर जब सेल के भीतर एक साथ कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच (सह स्थानीयकरण). हालांकि पूरे-माउंट आईएचसी और आईएफ का उपयोग आमतौर पर जेब्राफ़िश भ्रूणों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है1,2,3,4,5, पूरे माउंट प्रक्रियाएं हो सकती हैं सटीक colocalization डेटा प्राप्त करने के लिए समस्याग्रस्त. हमारे अनुभव में, यह ऊतक की परतों के बीच अंतर और पूरे-माउंट नमूनों में एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम आम तौर पर सतह धुंधला बनाम गहरे धुंधला के बीच भेद करने में असमर्थ हो सकता है. गैर-सतहस्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति अधिक चमकदार व्यक्त सतह स्तर अभिव्यक्ति द्वारा अस्पष्ट किया जा सकता है, परिमाणीकरण में inaccuracies के लिए अग्रणी. इसके अतिरिक्त, सबसे पारंपरिक ज़ेब्राफ़िश समाशोधन विधियों काफी विषाक्त कर रहे हैं6 और इस तरह कम उपयोग के लिए वांछनीय.

IF और IHC जैसे एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों का उपयोग अक्सर अनुभागीय सामग्री में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है, जो जटिल ऊतकों के भीतर एक विशेष प्रोटीन व्यक्त करने वाली असतत कोशिका आबादी की पहचान को सरल बनाते हैं। IHC आमतौर पर colocalization के लिए प्रयोग किया जाता है, सबसे अधिक बार विभिन्न मेजबान प्रजातियों में संयुग्मी दो अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके और अलग अलग रंग क्रोमोजेन4,7,8,9के साथ कल्पना , 10. हालांकि, कई क्रोमोजेन का उपयोग करने से गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला या रंग11,12की असंगति हो सकती है।

हमने क्रायोसेक्शन्ड प्रारंभिक चरण जेब्राफ़िश भ्रूणों पर अनुक्रमिक आईएफ और आईएचसी द्वारा अनेक प्रोटीनों का पता लगाने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित किया है। क्रायोसेक्शनिंग विशेष रूप से जेब्राफ़िश भ्रूण जैसे नाजुक ऊतकों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और क्रायोसेक्शन फ्लोरोसेंट आधारित परख13,14के लिए पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों से बेहतर हैं। हम संयुक्त IF और IHC के बजाय दोहरे रंग IF या IHC का अनुकूलन करने के लिए चुना है, एक भी परख प्रकार के लिए एंटीबॉडी असंगति की समस्या को दरकिनार करने के लिए. इन समस्याओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी है कि ज़ेबराफ़िश में उपयोग के लिए मान्य कर रहे हैं की सीमित संख्या के कारण जेब्राफ़िश से जुड़े अनुसंधान के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. वास्तव में, चार बड़ी कंपनियों के एक अध्ययन से पता चला है कि माउस में उपयोग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के बारे में 112,000 बनाम के बारे में 5,300 ज़ेब्राफ़िश में उपयोग के लिए15था . अंत में, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक ही cryosection पर किया जा सकता है विकसित करने के लिए चुना है, जो आवश्यक है जब छोटे या सीमित ऊतक के नमूने के साथ काम कर के रूप में इस तरह के जेब्राफ़िश भ्रूण से प्राप्त कर रहे हैं.

इस प्रोटोकॉल को 48 एच के बाद निषेचन चिमेरिक जेब्राफ़िश भ्रूणों में दाता कोशिकाओं के प्रोजीवनात्मक व्यवहार का आकलन करने के लिए डिजाइन किया गया था जो ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न किए गए थे जैसा कि कार्मनी-रैमपे और मोन्स16द्वारा वर्णित किया गया था। दाता भ्रूण प्राप्तकर्ता भ्रूण में दाता कोशिकाओं के प्रत्यारोपण से पहले एक फ्लोरोसेंट लेबल डेक्सट्रान संयुग्मी के साथ एक सेल चरण में इंजेक्ट किया गया. हम सेर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसिस का इस्तेमाल किया 10 फॉस्फोरीलेटिड हिस्टोन एच 3 (पीएच 3) के लिए बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लेबल dextran के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पीछा करने के लिए चिमेरिक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में दाता कोशिकाओं का पता लगाने के लिए. pH3 का अनुक्रमिक पता लगाने और एक ही cryosection के भीतर लेबल डेक्सट्रान हमें पहचान करने के लिए सक्षम बनाने और व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि दोनों मार्करों व्यक्त की मात्रा.

cryosectioned ज़ेब्राफ़िश के लिए यह अनुक्रमिक IF/IHC प्रोटोकॉल जेब्राफ़िश शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करेगा जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल की इच्छा रखते हैं। समस्याओं है कि इस प्रोटोकॉल को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जैसे छोटे ऊतक नमूनों और सीमित एंटीबॉडी उपलब्धता, ज़ेब्राफ़िश मॉडल के लिए अद्वितीय नहीं हैं. अतः यह विधि अनुक्रमिक आईएफ/आईएचसी करने के इच्छुक किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयोगी हो सकती है।

एथेंिक्स स्टेटमेंट:

सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय, Raleigh, उत्तरी केरोलिना, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा अनुमोदित किया गया.

Protocol

1. भ्रूण की तैयारी

  1. फिक्स 48 एच पोस्ट-फर्टिलाइजेशन (hpf) झंकार ज़ेब्राफ़िश भ्रूण ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न एबी वाइल्ड-टाइप जेब्राफ़िश भ्रूण के बीच 4% पैरालेल्ड्रेडिहाइड (पीएफए) रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉकिंग के साथ। कमरे के तापमान पर रॉकिंग के साथ दो 5 मिनट washes प्रदर्शन 1x फॉस्फेट बफर नमकीन के 500 $L का उपयोग कर एक गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट के 0.1% युक्त (1x PBSt; सामग्री की तालिकादेखें )
    नोट: Paraformaldehyde विषाक्त और एक कार्सिनोजन है और ठीक से संस्थागत नियमों के प्रति निपटान किया जाना चाहिए. paraformaldehyde के साथ काम एक रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (ग्लव, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा) हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  2. 30%, 50%, और 70% मेथनॉल (MeOH) के साथ क्रमिक रूप से धोने से निर्जलीकरण भ्रूण 10 मिनट के लिए प्रत्येक कमरे के तापमान पर रॉकिंग के साथ 10 मिनट के लिए पतला। कम से कम 14 ज के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% MeOH के 500 $L में इनक्यूबेट भ्रूण।
    नोट: मेथेनोल विषाक्त है और संस्थागत नियमों के अनुसार उचित रूप से निपटान किया जाना चाहिए। मेथनॉल के साथ काम एक रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (ग्लव्स, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा) हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  3. 70%, 50%, और 30% MeOH के साथ क्रमिक रूप से धोने से भ्रूण rehydrate 10 मिनट के लिए 1x PBSt के साथ पतला रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर प्रत्येक. रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर 1x PBSt के 500 $L के साथ दो 5 मिनट washes प्रदर्शन करते हैं।
  4. 1x पीबीटी निकालें और 30% sucrose के 500 $L में रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर deionized पानी के साथ पतला जब तक भ्रूण ट्यूब के नीचे करने के लिए सिंक (लगभग 1 ज). 15% मछली जिलेटिन/25% सुक्रोज के 500 डिग्री सेल्सियस के साथ सुक्रोज को बदलें (15/25; सामग्री की तालिकादेखें ) और रात भर रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  5. 15/25 की मात्रा के लगभग आधे को इष्टतम काटने के तापमान माध्यम (OCT माध्यम) के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर रॉकिंग के साथ तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि भ्रूण ट्यूब के नीचे तक डूब न जाएं (लगभग 1 ज)।
  6. 1 ज के लिए रॉकिंग के साथ कमरे के तापमान पर OCT मध्यम और इनक्यूबेट के साथ मात्रा का लगभग आधा बदलें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
  7. 15/25 और OCT माध्यम के साथ ऊष्मायन चरणों के दौरान, इन अभिकर्मकों गठबंधन करने के लिए आवश्यक के रूप में ट्यूब को उलटा या झटका।

2. भ्रूण एम्बेडिंग और Cryosections की तैयारी

  1. एक प्लास्टिक मोल्ड करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण (सामग्री की मेजदेखें) forceps के साथ, 15/25-OCT मिश्रण के किसी भी हस्तांतरण को कम से कम. ओसीटी माध्यम से लगभग आधा फुल मोल्ड भरें और धीरे से ओसीटी माध्यम में भ्रूणों को मिलाएं।
  2. लेबल प्लास्टिक मोल्ड तैयार करें और वांछित भ्रूणों को खाली, लेबल किए गए प्लास्टिक मोल्डों में स्थानांतरित करें, ओसीटी माध्यम के कैरी-ओवर को कम करदें। एक बार वांछित भ्रूण प्लास्टिक मोल्ड में हैं, धीरे मोल्ड के शीर्ष करने के लिए OCT माध्यम के साथ भरें.
  3. दृश्य के लिए एक हल्के स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए भ्रूणों को वांछित अभिविन्यास में व्यवस्थित करने के लिए संदंश या 25 जी सुइयों का प्रयोग करें (चित्र 1क, ख) ।
  4. एक धातु मंच के साथ एक अछूता कंटेनर में सूखी बर्फ पर तैयार मोल्ड फ्रीज. एक ठंडा कक्ष बनाने के लिए धातु मंच पर धीरे से एक बर्फ बाल्टी या फोम कूलर रखें (चित्र 1C, डी)
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर एक cryostat सेट का उपयोग कर 10$u201212 $m मोटी cryosections तैयार करें।
    1. एक समय में एक ब्लॉक सेट करें और ब्लॉक को डिस्क/चक पर ब्लॉक को फ्रीज करने के लिए OCT माध्यम का उपयोग करें, ब्लेड की ओर मुख ाुबूत के नीचे से (चित्र 2क) अनुभागीकरण प्रारंभ करने से पहले यह सुनिश्चित करें कि ब्लॉक पूरी तरह से डिस्क (OCT माध्यम सफेद हो जाएगा) पर स्थिर हो गया है (चित्र 2ख) .
    2. चार्ज किए गए कांच की स्लाइडों पर क्रायोसेक्शन रखें (चित्र 2C, डी) और कमरे के तापमान पर रात भर स्लाइड को हवा में सुखाएं।

3. पीएच 3 के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. इस तरह के एक कोपलिन जार के रूप में एक उपयुक्त कंटेनर में 1x पीबीएस में स्लाइड के तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन करते हैं। यदि ऊतकों को स्लाइड का अच्छी तरह से पालन नहीं किया जाता है, तो स्लाइड को समतल सतह पर रखकर और सतह पर 1x PBS के 500 डिग्री सेल्सियस को धीरे से पाइप करके washes करें। धीरे स्लाइड tipping द्वारा washes के बीच 1x पीबीएस डालो.
  2. स्लाइड पर तरल रखने के लिए अवरोध पेन या मोम पेंसिल से अनुभागों को बाह्यरेखांकित करें (चित्र3) .
  3. स्लाइड पर प्रति अनुभाग ब्लॉक बफर के एक आर्द्र कक्ष में एक सपाट सतह पर स्लाइड और pippette 200 $L पर रखें। कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए ब्लॉक बफर में इनक्यूबेट या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. ब्लॉक बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने (रैबिट एंटी-पीएच3 एंटीबॉडी, 1:200; सामग्री की तालिकादेखें) को ब्लॉक बफर में तैयार करें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। ब्लॉक बफर को निकालने के लिए स्लाइडको धीरे से टिप करें, आर्द्र कक्ष में वापस जाएं, और स्लाइड पर प्रति अनुभाग प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 डिग्री सेल्सियस पिपेट। द्वितीयक-केवल नियंत्रण के लिए, उपयुक्त अनुभागों पर ब्लॉक बफ़र के पिपेट 200 डिग्री सेल्सियस।
  5. डिऑनाइज्ड पानी से भरे एक आर्द्र कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड को इन्क्यूबेट करें। नमी बनाए रखने में मदद करने के लिए आर्द्र कक्ष के किनारों को सील करें।
  6. इस तरह के एक कोपलिन जार के रूप में एक उपयुक्त कंटेनर में 1x पीबीएस में स्लाइड के तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन करते हैं। धोने के चरणों के दौरान, ब्लॉक बफर में द्वितीयक एंटीबॉडी तनुकरण (एंटी-रैबिट फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी संयुग्मी, 1:2,000; सामग्री की तालिकादेखें) को ब्लॉक बफर में तैयार करें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  7. स्लाइड पर प्रति अनुभाग माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के एक आर्द्र कक्ष में एक फ्लैट सतह पर स्लाइड और पिपेट 200 डिग्री सेल्सियस रखें। 30 मिनट के लिए, प्रकाश से परिरक्षित कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान (ओं) में स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  8. एक उपयुक्त कंटेनर में 1x PBS में स्लाइड के तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन, इस तरह के एक Coplin जार के रूप में, प्रकाश से परिरक्षित. धोने के चरणों के दौरान, एक परमाणु धुंधला समाधान तैयार (सामग्री की मेजदेखें).
  9. प्रत्येक खंड पर परमाणु धुंधला समाधान के एक फ्लैट सतह और पिपेट 200$u2012500 (नमूना के आकार के आधार पर) पर स्लाइड प्लेस. 10 मिनट के लिए परमाणु धुंधला समाधान में स्लाइड इनक्यूबेट, प्रकाश से परिरक्षित.
  10. परमाणु धुंधला समाधान नाली और गैर सख्त फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया और एक गिलास coverslip के साथ स्लाइड माउंट. इमेजिंग किया जाता है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड बनाए रखें।
    नोट: सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त कर रहे हैं जब स्लाइड एक ही दिन या अगले दिन पर imaged हैं.
  11. निम्नलिखित यदि, कल्पना और एक confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और डिजिटल कैमरा के साथ स्लाइड कल्पना 555 एनएम (लाल) और 645 एनएम (दूर लाल) 100x आवर्धन (10x नेत्र आवर्धन और 10x उद्देश्य आवर्धन) पर उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर. इमेजिंग भर में लेजर शक्ति लगातार रखें.
  12. इमेजिंग के बाद, 1x पीबीएस के अलग-अलग कंटेनरों में स्लाइड रखें और कवरस्लिप हटाने के लिए तैयार करने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्लैट स्टोर करें। 1x पीबीएस में स्लाइड रखते समय, कवरस्लिप को हटाने में सहायता करने के लिए स्लाइड्स को धीरे से उत्तेजित करें।
    नोट: कवरस्लिप पर नीचे न दबाएं या कवरस्लिप को मैन्युअल रूप से निकालने का प्रयास न करें, क्योंकि यह वर्गों की गुणवत्ता से समझौता कर सकता है। कवरलिप्स को न्यूनतम मजबूर आंदोलन के साथ क्षैतिज रूप से हटाया जाना चाहिए।

4. लेबल Dextran के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. कवरलिप्स को निकाल दिए जाने के बाद, स्लाइड को एक उपयुक्त कंटेनर में नए 1x PBS में स्थानांतरित करें, जैसे कि कोपलिन जार. 1x पीबीएस निकालें और कमरे के तापमान पर एक गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट (1x TBSt) के 0.1% के साथ 1x Tris-बफर नमकीन में स्लाइड के तीन 5 मिनट इनक्यूबेशन प्रदर्शन करते हैं।
  2. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2व्2) का 250 एमएल उचित आकार के पात्र में विआयनित जल में पतला कीजिए। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 3% एच2हे2 समाधान में स्लाइडकोइन करें।
    नोट: हाइड्रोजन पेरोक्साइड संक्षारक है और संस्थागत विनियमों के अनुसार उचित रूप से निपटान किया जाना चाहिए। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (ग्लव्स, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा) हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  3. जल्दी deionized पानी के साथ स्लाइड कुल्ला. 1x TBSt में स्लाइड के तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन ध्यान से ऊतक वर्गों के आसपास के क्षेत्र सूखी और एक आर्द्र कक्ष में फ्लैट स्लाइड जगह है. यदि आवश्यक हो तो वर्गों पर तरल रखने के लिए एक बाधा कलम या मोम पेंसिल के साथ ऊतक वर्गों रूपरेखा।
  4. एक माध्यमिक एंटीबॉडी लेबलिंग किट के साथ प्रदान की एक तैयार करने के लिए उपयोग 2.5% सीरम अवरुद्ध समाधान लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक अनुभाग के लिए dropwise. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  5. एंटीबॉडी diluent में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें (रैबिट विरोधी लेबल डेक्सट्रन, 1:7,500; सामग्री की मेजदेखें) और कोमल पाइपटिंग द्वारा मिश्रण। ब्लॉक बफर को निकालने के लिए स्लाइड को धीरे से टिप करें, वर्गों के आसपास के क्षेत्र को सूखाएं, और स्लाइड को एक आर्द्र कक्ष में फ्लैट रखें।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान लागू करने से पहले धो नहीं है. स्लाइड पर प्रति अनुभाग प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 डिग्री सेल्सियल और एक आर्द्र कक्ष में रात 4 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट। द्वितीयक-केवल नियंत्रण के लिए, उपयुक्त वर्गों पर प्रतिशरीर के पिपेट 200 डिग्री सेल्सियस।
  7. एक उपयुक्त कंटेनर में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और 1x TBSt में जगह से दूर नाली के लिए स्लाइड धीरे टिप, इस तरह के एक Coplin जार के रूप में. 1x TBSt. खंड के आसपास के क्षेत्र सूखी और एक आर्द्र कक्ष में फ्लैट जगह में स्लाइड के दो 5 मिनट washes प्रदर्शन.
  8. एक तैयार करने के लिए उपयोग पृष्ठभूमि को कम करने अवरुद्ध अभिकर्मक लागू करें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक अनुभाग के लिए dropwise. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड इनक्यूबेट करें।
  9. ब्लॉक बफर को दूर करने के लिए स्लाइड को धीरे से टिप करें, वर्गों के आसपास के क्षेत्र को सावधानी से सूखाएं, और स्लाइड को एक आर्द्र कक्ष में फ्लैट रखें। माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान लागू करने से पहले धो मत करो.
  10. एक तैयार करने के लिए उपयोग माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान लागू करें (विरोधी रैबिट हॉर्सराडिश peroxidase (HRP) बहुलक माध्यमिक एंटीबॉडी; सामग्री की मेजदेखें) प्रत्येक अनुभाग ड्रॉपवार और एक आर्द्र कक्ष में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट.
  11. धीरे से एक उपयुक्त कंटेनर में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान और 1x TBSt में जगह से दूर नाली के लिए स्लाइड टिप, इस तरह के एक Coplin जार के रूप में. 1x TBSt में स्लाइड के दो 5 मिनट washes प्रदर्शन.
  12. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उपयोग करने से ठीक पहले एचआरपी क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  13. वर्गों के आसपास के क्षेत्र को सुखाएं, स्लाइडको एक समतल सतह पर रखें, और प्रत्येक अनुभाग में एचआरपी क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के 200 डिग्री सेल्सियस लागू करें। कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट, एक टाइमर शुरू जब सब्सट्रेट पहली स्लाइड पर लागू किया गया है (चित्र 4)।
  14. सब्सट्रेट समाधान से दूर नाली और 1x पीबीएस युक्त एक Coplin जार में संक्षेप में स्लाइड कुल्ला. एक उपयुक्त कंटेनर में deionized पानी में स्लाइड प्लेस, इस तरह के एक Coplin जार के रूप में, और कोमल आंदोलन के साथ deionized पानी में दो 5 मिनट washes प्रदर्शन.
  15. 30 s के लिए हेमेटोक्सीलिन धुंधला समाधान में रखकर स्लाइड को काउंटर करें।
    नोट: हेमेटॉक्सिलिन विषाक्त है और संस्थागत नियमों के अनुसार निपटान किया जाना चाहिए। उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (ग्लव्स, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा) हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  16. एक उपयुक्त कंटेनर में deionized पानी में स्लाइड प्लेस, इस तरह के एक Coplin जार के रूप में, और deionized पानी में तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन. स्लाइड को स्कॉट के टैप वाटर वाले कंटेनर में स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें) और 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  17. एक उपयुक्त कंटेनर में deionized पानी में स्लाइड प्लेस, इस तरह के एक Coplin जार के रूप में, और deionized पानी में तीन 5 मिनट washes प्रदर्शन.
  18. इथेनॉल की एक श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड निर्जलीकरण (EtOH) ग्रेड (deionized पानी में पतला) और एक रासायनिक हुड में xylene. 70% EtOH में एक 2 मिनट ऊष्मायन, 95% EtOH में दो 1 मिनट ऊष्मायन, 100% EtOH में दो 1 मिनट ऊष्मायन, और xylene में तीन 1 मिनट ऊष्मायन प्रदर्शन. xylene से स्लाइड निकालें और एक coverslip जगह है, जबकि एक toluene आधारित एक रासायनिक हुड में बढ़ते माध्यम के साथ गीला.
    नोट: Xylene और toluene विषाक्त और ज्वलनशील हैं और ठीक से संस्थागत नियमों के प्रति निपटान किया जाना चाहिए. xylene और toluene के साथ काम एक रासायनिक हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (ग्लव्स, प्रयोगशाला कोट, और सुरक्षा चश्मा) हमेशा इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  19. IHC के बाद, कल्पना और 100x आवर्धन (10x नेत्र आवर्धन और 10x उद्देश्य आवर्धन) पर एक यौगिक प्रकाश माइक्रोस्कोप और डिजिटल कैमरा के साथ स्लाइड कल्पना और छवि. (चित्र5) .

Representative Results

हमने इस प्रोटोकॉल को 48 एच पोस्ट-फर्टिलाइजेशन के बाद जेब्राफ़िश भ्रूणों में व्यक्तिगत दाता कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की पहचान और विश्लेषण करने के लिए विकसित किया है जो एबी वाइल्ड-टाइप जेब्राफ़िश भ्रूणों के बीच ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न किए गए थे। एक-सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सफल विश्लेषण के लिए उचित रूप से उन्मुख भ्रूणों के साथ क्रायोसेक्शन तैयार करने की आवश्यकता थी (चित्र 1 और चित्र 2) और इन के लिए आईएफ और आईएचसी तकनीकों के सावधान, अनुक्रमिक अनुप्रयोग क्राइओ सेक्शन्स (चित्र 3 और चित्र 4)। एक साथ बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग (एंटी-पीएच3, चित्रा 5ए, बी) और दाता कोशिकाओं (एंटी-लेबल डेक्सट्रन, चित्रा 5डी) का उपयोग दाता कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें परिमाणित करने के लिए किया जा सकता है जो सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं ( चित्र 5E) अलग-अलग कोशिकाओं की सही पहचान करने के लिए IF (चित्र 2A, B) और IHC ( चित्र2D) दोनों के बाद उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को उत्पन्न करना आवश्यक है। छवि ओवरले करने के लिए एक छवि विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग किया जाना चाहिए (चित्र 5E)। उपयोग किए गए छवि विश्लेषण प्रोग्राम के आधार पर, लेबल किए गए कक्षों की स्वचालित गणना करना संभव हो सकता है, परिमाणीकरण वांछित होना चाहिए.

Figure 1
चित्र 1: जमे हुए ओसीटी ब्लॉक की तैयारी। (ए) ठंड के लिए तैयार क्रायोजेनिक मोल्ड में ओसीटी में भ्रूणों का 50x सूक्ष्म दृश्य। लाल तीर मोल्ड के नीचे की सतह के खिलाफ ज़ेब्राफ़िश भ्रूण की स्थिति के सिर को इंगित करता है; काला तीर उपयोगकर्ता की ओर इंगित करने वाला पूंछ इंगित करता है। (बी) भ्रूण के साथ प्लास्टिक के मोल्ड और ठंडा धातु मंच पर रखा OCT. (ग) फोम बर्फ बाल्टी ठंड कक्ष बनाने के लिए प्लास्टिक के मोल्ड ों पर रखा. (घ) ब्लॉक पूरी तरह से जमजाने के बाद ओसीटी पारदर्शी से सफेद हो जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: जमे हुए ओसीटी ब्लॉक का क्रायोसेक्शनिंग। (क) क्रोओस्टैट डिस्क पर ताजा ओसीटी का अनुप्रयोग और ओसीटी पर जमे हुए ब्लॉक की नियुक्ति, ब्लॉक के हिम अभिविन्यास से 180 डिग्री घुमाया गया। (B) अनुभागी डिस्क पर जमे हुए ब्लॉक का साइड व्यू. (C) स्थिति में रोल प्लेट के साथ अनुभागिंग ब्लॉक का दृश्य। (घ) क्रायओस्टैट के धातु मंच से आवेशित स्लाइड का उपयोग करके अनुभागों का पिक-अप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: स्लाइड पर प्लेसमेंट के बाद तैयार अनुभागों का दृश्य. तीर हाइड्रोफोबिक बाधा इंगित करता है, और डॉटेड लाइन बाधा परिधि के भीतर वर्गों युक्त क्षेत्र delineates. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: IHC के दौरान क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट आवेदन के लिए तैयारी। स्लाइड को प्लास्टिक की चादर के साथ कवर एक सपाट सतह पर रखा गया है ताकि क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के समान आवेदन की अनुमति दी जा सके, जबकि खतरनाक सामग्री के किसी भी spillage युक्त। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: क्रायोसेक्शन्ड 48 एच.पी.एफ. के प्रतिनिधि आईएफ और आईएचसी लेबलिंग 48 एच.पी.एफ. (क) यदि सेर 10 फॉस्फोरिलेट हिस्टोन एच 3 (एंटी-पीएच3, 1:200) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए 48 एचएफ की चिमेरिक जेब्राफ़िश भ्रूण में। लाल ] pH3-सकारात्मक कोशिकाओं; नीला ] नाभिक. पीला तीर धनात्मक कोशिकाओं के उदाहरण दर्शाते हैं। (ख) डिजिटल छवि (ImageJ सॉफ्टवेयर) में नीले परमाणु दाग के घटाव परिमाणीकरण और छवि ओवरले के लिए pH3 सकारात्मक कोशिकाओं के दृश्य को बढ़ाता है. (ग) नकारात्मक नियंत्रण (माध्यमिक एंटीबॉडी केवल) के लिए यदि क्रायोसेक्शन्ड 48 एच.एफ.एफ. स्केल बार 50 डिग्री (सभी पैनलों के लिए लागू) का प्रतिनिधित्व करता है। (घ) आईएचसी एबी वाइल्ड-टाइप जेब्राफ़िश भ्रूणों के बीच ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न चिमेरिक 48 एचपीएफ जेब्राफ़िश भ्रूण में लेबल ्डएक्स्ट्रान (एंटी-लेबल डेक्सट्रान, 1:7,500) का पता लगाने के लिए। ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण के लिए उपयोग करने से पहले दाता भ्रूण को एक सेल चरण में एक फ्लोरोसेंट लेबल वाले डेक्सट्रान संयुग्मी के साथ इंजेक्ट किया गया था। लाल एक डेक्सट्रन संयुग्मी के साथ लेबल कोशिकाओं को इंगित करता है; नीले रंग नाभिक इंगित करता है. पीला तीर धनात्मक कोशिकाओं के उदाहरण दर्शाते हैं। (ई) पैनल बी (पीएच 3 के लिए आईएफ) और पैनल सी (लेबल ्ड्ट्रान के लिए आईएचसी) का ओवरले जिसमें अलग-अलग कोशिकाओं में पीएच3 अभिव्यक्ति और डेक्सट्रन लेबलिंग का सहस्थानीकरण दिखाया गया है। पीला तीर दोहरे-धनात्मक कोशिकाओं के उदाहरण दर्शाते हैं। (च) नकारात्मक नियंत्रण (माध्यमिक एंटीबॉडी केवल) के लिए IHC परख cryosectioned 48 hpf chimeric ज़ेब्राफ़िश भ्रूण. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हम संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसींस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक उपन्यास विधि प्रस्तुत किया है कि cryosectioned ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पर colocalization प्रयोगों के प्रदर्शन में एक महत्वपूर्ण कदम आगे का प्रतिनिधित्व करता है. मौजूदा सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल की कमी है , जिन्हें छोटे भ्रूणों और क्रायोसेक्शनेड सामग्री17,18के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जाता है , जो कि अन्यथा आण्विक अध्ययन14 में प्रयोग किया जाता है . मौजूदा सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल मुख्य रूप से दो फ्लोरोफोर्स17,18के एक साथ दृश्य पर ध्यान केंद्रित करते हैं . जबकि इन प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम कर सकते हैं, उनकी उपयोगिता एंटीबॉडी की उपलब्धता है कि (i) ज़ेब्राफ़िश में इस्तेमाल किया जा सकता है और (ii) IF के साथ संगत कर रहे हैं द्वारा सीमित है.

हमें लगता है कि जेब्राफ़िश भ्रूण के लिए cryosectioning का उपयोग संरक्षित ऊतक आकारिकी के मामले में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. के रूप में IHC अधिक सामान्यतः cryosections7,8से पैराफिन वर्गों पर प्रदर्शन किया जाता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए cryosection आधारित IHC तरीकों के आगे अन्वेषण warranted है. पूरे माउंट IF का उपयोग ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में अभिव्यक्ति के स्तर को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक आम विधि है, और अधिक सामान्यतः यदि क्रायोसेक्शन1,2,3,4, का उपयोग कर के बजाय साहित्य में वर्णित है, 19. हालांकि, पूरे माउंट प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं, जिसमें गहरे ऊतकों में व्यक्त प्रोटीन के सटीक स्थानीयकरण की कमी और गहरे ऊतकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को अस्पष्ट करने के लिए सतह स्तर की अभिव्यक्ति की क्षमता शामिल है। हम लगातार cryopservation के बाद सेलुलर आकारिकी के उत्कृष्ट रखरखाव मनाया है, अनुभागीकरण, और अनुक्रमिक IF और IHC. अनुप्रयोगों है कि एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सटीक स्थानीयकरण की आवश्यकता के लिए, वहाँ अनुभाग आधारित प्रक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ के रूप में हम इस प्रोटोकॉल में वर्णित है. राल embedding प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण20से वर्गों पर IF या IHC assays प्रदर्शन के लिए एक वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है. राल वर्गों cryosections की तुलना में ऊतक आकृति विज्ञान के बेहतर संरक्षण प्रदान करते हैं, और अपेक्षाकृत पतली ऊतक वर्गों तैयार किया जा सकता है. हालांकि, निर्माताओं आम तौर पर इम्यूनो आधारित परख के लिए राल वर्गों के उपयोग की सिफारिश नहीं है, के रूप में रेजिन के कुछ घटकों वर्गों से हटाया नहीं जा सकता है और एंटीबॉडी बाध्यकारी साइटों मुखौटा हो सकता है21.

जबकि प्रोटोकॉल के पूरे अभिव्यक्ति पैटर्न का सटीक और सफल विश्लेषण के लिए आवश्यक है, कुछ विशिष्ट कदम प्रयोगात्मक सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. पहला महत्वपूर्ण कदम ओटी13,14में एम्बेडिंग के दौरान भ्रूणों की हैंडलिंग है . यह एक ही अनुप्रस्थ विमान में प्रत्येक भ्रूण उन्मुख करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है ताकि वर्गों सभी भ्रूण के लिए लगभग एक ही क्षेत्र से काट रहे हैं. हमने पाया है कि छोटे गेज सुइयों का उपयोग करने के लिए छोटे, भ्रूण अभिविन्यास के लिए चिपचिपा OCT माध्यम के माध्यम से जानबूझकर आंदोलनों forceps, जो बहुत बड़े हैं और बहुत ज्यादा OCT माध्यम विस्थापित का उपयोग करने के लिए बेहतर है. एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम जमे हुए ब्लॉक के अनुभागीकरण के दौरान होता है, क्योंकि यह महत्वपूर्ण प्रशिक्षण और अनुभव के बिना वांछित ऊतक (ओं) होते हैं कि उच्च गुणवत्ता वाले वर्गों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है। हम इस प्रकार परीक्षण के नमूने के उपयोग की सिफारिश जब तक तकनीक में महारत हासिल है. एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम कवरस्लिप हटाने है, जिसमें ऊतक के नमूनों को परेशान करने या पट्टी करने की क्षमता है। हमने पाया है कि पीबीएस कंटेनर से स्लाइड की कवरस्लिप और धीमी गति से हटाने को ढीला करने के लिए कोमल आंदोलन का एक संयोजन कवरलिप्स को हटाने के लिए सबसे प्रभावी तरीका है। एक कोमल और स्थिर हाथ सबसे अच्छा है; शोधकर्ताओं ने पाया जा सकता है कि कुछ परीक्षण और त्रुटि coverss को प्रभावी ढंग से दूर करने के लिए सीखने के लिए आवश्यक है.

प्रोटोकॉल में अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम एंटीबॉडी अनुकूलन (प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी दोनों IF और IHC परख के लिए) और क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट और counterstain के लिए स्लाइड के जोखिम शामिल हैं. प्राथमिक एंटीबॉडी विशिष्टता और लक्ष्य एकाग्रता के बारे में पूरी तरह से अनुसंधान आवश्यक है; आम तौर पर, यह IF/IHC संयोजन शुरू करने से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता का अनुकूलन करने के लिए किया जाएगा कि IF और IHC के लिए कम से कम दो अलग-अलग प्रयोगों के लिए पर्याप्त गैर कीमती नमूने इकट्ठा करने के लिए सबसे अच्छा है। प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ज्ञात सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित प्रत्येक प्रयोग में आवश्यक है सुनिश्चित करने के लिए कि दोनों आईएफ और IHC assays उचित प्रदर्शन कर रहे हैं. माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता के लिए समायोजन भी आवश्यक हो सकता है. IHC परख के लिए क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट और counterstain करने के लिए ऊतक वर्गों के जोखिम के अनुकूलन की आवश्यकता है, के बाद से निर्माता दिशा निर्देशों अक्सर संभव जोखिम समय की एक विस्तृत श्रृंखला का वर्णन. नहीं सभी क्रोमोजन counterstains और अंतर्जात ऊतक pigmentation के साथ संगत हो सकता है, क्रोमोजन चयन के संबंध में सावधान योजना की आवश्यकता होती है.

वहाँ कई संभावित संशोधन है कि वर्णित प्रोटोकॉल के लिए लागू किया जा सकता है, और हम सफलतापूर्वक एंटीबॉडी के अन्य संयोजन है कि दोनों IF के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है के साथ इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया है. जैसा कि ऊपर बताया गया है, क्रोमोजेनिक पदार्थों में विशिष्ट प्रतिपक्षों के साथ अलग-अलग संगतता होती है। हमने पाया है कि इन घटकों प्रोटोकॉल में आसानी से संशोधन कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए पैरामीटर काफी लचीला कर रहे हैं, और वृद्धि या वांछित धुंधला तीव्रता के आधार पर कम किया जा सकता है. एम्बेडिंग प्रक्रिया भी संशोधित किया जा सकता है। जबकि हम अनुप्रस्थ वर्गों पर ध्यान केंद्रित किया है, भ्रूण आसानी से ब्याज की विशेष ऊतकों को संबोधित करने के लिए किसी भी दिशा में उन्मुख किया जा सकता है. अंत में, इस प्रोटोकॉल में एक से अधिक संभव विराम बिंदु हैं। निर्जलित भ्रूण कुछ महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% MeOH में संग्रहीत किया जा सकता है; जमे हुए ब्लॉक अप करने के लिए तीन महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है; और तैयार स्लाइड एक स्लाइड बॉक्स में नौ महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

इस संयुक्त IF/IHC प्रोटोकॉल की सापेक्ष जटिलता के कारण, भिन्नता या त्रुटि के कई संभावित स्रोत हैं जिन्हें समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है, ऊतक गुणवत्ता से शोधकर्ता अनुभव से नमूना हैंडलिंग तक। ऊपर वर्णित अधिकांश महत्वपूर्ण कदम महत्वपूर्ण माने जाते हैं क्योंकि उन्हें या तो व्यक्तिगत उपयोगकर्ता स्तर पर ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता होती है या उन्हें विशेष निपुणता, कौशल और अनुभव की आवश्यकता होती है. हालांकि, हमने पाया है कि nonspecific पृष्ठभूमि धुंधला और कम संकेत तीव्रता अनुकूलन की आवश्यकता सबसे महत्वपूर्ण मुद्दों रहे हैं. किसी भी IF या IHC प्रोटोकॉल के साथ के रूप में, इन मुद्दों को संबोधित समय लगता है और श्रम गहन हो सकता है, और इस विधि के साथ संयुक्त किया जा सकता है के बाद से दो तकनीकों संयुक्त कर रहे हैं. इस कारण से, हम अत्यधिक IF और IHC अलग से संयुक्त प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से पहले अनुकूलन की सलाह देते हैं.

हालांकि हम भविष्यवाणी करते हैं कि यह विधि प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होगी, फिर भी संभावित सीमाएँ हैं. इस प्रक्रिया के सफल प्रदर्शन कई धोने कदम शामिल है कि दो अनुक्रमिक प्रयोगों के माध्यम से बरकरार ऊतक के नमूने को बनाए रखने पर निर्भर है. इस कारण से, अनुभागिंग या ऊतक हैंडलिंग के दौरान उत्पन्न होने वाली कोई भी समस्या, जिसमें गुणवत्ता में निम्नीकृत हो सकने वाली पुरानी स्लाइड्स का उपयोग शामिल है, शोधकर्ताओं की इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक करने की क्षमता को सीमित कर देगा. हालांकि स्लाइड संभावित रूप से नौ महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, स्लाइड के ऊतक पालन समय के साथ गिरावट आती है और हम स्लाइड है कि तैयारी या आदर्श के एक महीने के भीतर उपयोग किया जाता है के साथ सबसे अच्छी सफलता थी, अगले दिन. एक दूसरी सीमा ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के छोटे पदचिह्न है. जबकि हमने पाया है कि इस प्रयोग को प्रोटीन है कि अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में प्रारंभिक चरण भ्रूण में व्यक्त कर रहे हैं visualizing में उपयोगी हो, प्रोटीन है कि असंगत या निम्न स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं बहुत मुश्किल हो सकता है एक खंड में कब्जा. अंत में, के बाद से प्रोटोकॉल का उपयोग करता है 10-u201212 $m cryosections, यह सबसे अच्छा बड़े संरचनाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त है, जैसे नाभिक के रूप में, बजाय छोटे उप-कोशिकीय घटकों.

संक्षेप में, हमारे संयुक्त IF/IHC प्रोटोकॉल प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में अध्ययन की एक विस्तृत विविधता के लिए फायदेमंद होगा, और ऐसे नमूनों में सटीक प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में एक महत्वपूर्ण नवाचार का प्रतिनिधित्व करता है. हमारी विधि, चित्रा 5में सफलतापूर्वक दिखाया गया है, शोधकर्ताओं को क्रायोसेक्शन में प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के नाजुक आकारिकी को संरक्षित करने की अनुमति देगा, जबकि वर्तमान में उपलब्ध प्राथमिक एंटीबॉडी की कुछ सीमित सीमा के साथ काम कर रहे हैं इस प्रजाति में IF या IHC में उपयोग के लिए मान्य. इस प्रोटोकॉल की संभावना अन्य मछली और उभयचर प्रजातियों में अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा (जैसे, Medaka और Xenopus spp.), जो एंटीबॉडी उपलब्धता के लिए इसी तरह की सीमाओं से बाधित कर रहे हैं, और पारंपरिक स्तनधारी मॉडल के लिए लागू हो सकता है के रूप में अच्छा.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस कार्य को NIH अनुदान 5K01OD021419-02 और नेकां राज्य पशु चिकित्सा विश्वविद्यालय कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15/25 N/A N/A 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O
Alexa 555 secondary antibody Invitrogen A21429 used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF
Antibody Diluent Dako S3022
Background Buster Innovex NB306
block buffer (IF) N/A N/A 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS
cellSens imaging software Olympus cellSens imaging software used with compound light microscope
chimeric zebrafish embryos N/A N/A AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf 
Compound light microscope Olympus BX51 used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC
Confocal fluorescence microscope Leica DM 2500 used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF
Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm Ted Pella 27147-2
Digital camera, light microscope Olympus DP27
Digital camera, fluorescence microscope Leica TCS SPE
Ethanol Koptec V1001
Fish gelatin Sigma G7041
Glass slides Fisher 12-550-15
Hydrogen peroxide, 30% Fisher H325-100
ImmPRESS HRP Polymer detection kit Vector MP-7401 anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer
Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software Leica LAS AF 2.3.6 imaging software used with confocal fluorescence microscope
Methanol Fisher A452-4
Modified Meyer's Hematoxylin Thermo 72804
Normal Goat Serum MP Biomedical 191356
OCT medium Tissue-Tek/Fisher 4583/4585
anti-Oregon Green antibody Molecular Probes/Life Technologies A889 used at 1:7500 dilution for IHC
Oregon Green Dextran Invitrogen P7171 used at 2.5% in 0.2 M KCl
Paraformaldehyde, 4% Acros Organics 416780030 made in lab in 1x PBS
Permount Fisher SP15
1x phosphate-buffered saline made in lab N/A 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O
10x phoshpate-buffered saline made in lab N/A use Cold Spring Harbor protocol
1x PBSt made in lab N/A 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O
anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody Santa Cruz sc-8656-R used at 1:500 dilution for IF
Scott's Tap Water Electron Microscopy Sciences 26070-06 have used other brands successfully in addition to EMS
Sucrose Amresco 335
Tween-20 Fisher BP337
TO-PRO3 Invitrogen T3605 used at 1:1,000 in 1x PBS for IF
1x Tris-buffered saline made in lab N/A 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O
10x Tris-buffered saline made in lab N/A 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O
1x TBSt made in lab N/A 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O
Triton X-100 Acros Organics 327371000
Vectashield Vector H-1000 non-hardening mounting media
Vector NovaRed substrate Vector SK-4800 HRP substrate
Xylene Fisher X3P-1GAL

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References

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Ferguson, J. L., Shive, H. R.… More

Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (147), e59344, doi:10.3791/59344 (2019).

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