Summary
Questo protocollo dimostra l'immunofluorescenza sequenziale e l'immunosofochimica sulle criosezioni degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale, consentendo precise analisi di co-localizzazione in specifiche popolazioni cellulari.
Abstract
Lo studio delle interazioni intercellulari spesso richiede un'etichettatura discreta di specifiche popolazioni cellulari e una localizzazione precisa delle proteine. L'embrione di pesce zebra è un ottimo strumento per esaminare tali interazioni con un modello in vivo. I saggi immunohisofalici e immunofluorescenza a montaggio intero sono spesso applicati negli embrioni di pesce zebra per valutare l'espressione proteica. Tuttavia, può essere difficile ottenere una mappatura accurata delle proteine co-localizzate nello spazio tridimensionale. Inoltre, alcuni studi possono richiedere l'uso di due anticorpi non compatibili con la stessa tecnica (ad esempio, l'anticorpo 1 è adatto solo per l'immunohistochimica e l'anticorpo 2 è adatto solo per l'immunofluorescenza). Lo scopo del metodo qui descritto è quello di eseguire l'immunofluorescenza sequenziale e/o l'immunohistochimica su criosezioni individuali derivate da embrioni di pesce zebra in fase iniziale. Qui descriviamo l'uso di cicli sequenziali di immunofluorescenza, imaging, immunohistochimica, imaging per una singola criosezione al fine di ottenere un'identificazione precisa dell'espressione proteica a livello di singola cellula. Questa metodologia è adatta per qualsiasi studio sugli embrioni di pesce zebra in fase iniziale che richiede l'identificazione accurata di più bersagli proteici nelle singole cellule.
Introduction
Il pesce zebra è un organismo modello estremamente robusto che è attualmente utilizzato in un'ampia varietà di discipline nella ricerca biomedica. In particolare, il rapido sviluppo esterno e la traslucenza degli embrioni di pesce zebra forniscono uno strumento eccellente per gli studi in vivo. Qui, descriviamo un metodo per l'immunofluorescenza sequenziale (IF) e le analisi immunostochimiche (IHC) di embrioni di pesce zebra criosezione. Questa nuova procedura utilizza l'applicazione sequenziale di due anticorpi su un singolo vetrino, consentendo l'identificazione accurata delle proteine colocalizzate a livello cellulare conservando le sezioni di tessuto. Questo protocollo è particolarmente utile per gli studi con il modello di pesce zebra, poiché un numero relativamente piccolo di anticorpi è stato convalidato per l'uso nelle applicazioni IF e/o IHC nel pesce zebra rispetto ai modelli murini.
L'osservazione delle interazioni intercellulari è un elemento essenziale in molti studi e può fornire informazioni chiave sui meccanismi molecolari che funzionano a livello cellulare che sono alla base dei fenotipi a livello di organismo. Inoltre, l'espressione proteica può fornire informazioni sulla funzione cellulare, specialmente quando si esamina l'espressione di più proteine contemporaneamente all'interno della cellula (co-localizzazione). Sebbene IHC e IF siano tecniche comunemente utilizzate per l'analisi dell'espressione proteica negli embrioni di pesce zebra1,2,3,4,5, le procedure di montaggio intero possono essere problematico per ottenere dati di co-localizzazione precisi. Nella nostra esperienza, può essere difficile distinguere tra strati di tessuto e visualizzare l'espressione proteica a livello di singola cellula in campioni di montaggio intero. I programmi software di imaging potrebbero generalmente non essere in grado di distinguere tra colorazione superficiale e colorazione più profonda. Le espressioni proteiche di livello non superficiale possono essere oscurate da un'espressione del livello della superficie più brillante, che porta a imprecisioni nella quantificazione. Inoltre, la maggior parte dei metodi tradizionali di compensazione dei pesci zebra sono abbastanza tossici6 e quindi meno desiderabili per l'uso.
Le tecniche basate sugli anticorpi, come IF e IHC, sono spesso utilizzate per rilevare l'espressione proteica nel materiale sezionato, semplificando l'identificazione di popolazioni di cellule discrete che esprimono una particolare proteina all'interno di tessuti complessi. IHC è comunemente usato per la colocalizzazione, più frequentemente utilizzando due diversi anticorpi coniugati in diverse specie ospiti e visualizzati con diversi cromogeni colorati4,7,8,9 , 10. Tuttavia, l'utilizzo di più cromogeni può portare a colorazione di sfondo non specifica o incompatibilità dei colori11,12.
Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per la rilevazione di più proteine mediante IF e IHC sequenziali sugli embrioni di pesce zebra criosezione in fase iniziale. La criosezione è particolarmente adatta a tessuti delicati come gli embrioni di pesce zebra, e le criosezioni sono superiori alle sezioni incorporate in paraffina per i saggi a base di fluorescenza13,14. Abbiamo scelto di ottimizzare IF e IHC combinati piuttosto che SE o IHC a doppio colore, per aggirare il problema dell'incompatibilità degli anticorpi per un singolo tipo di analisi. Questi problemi sono particolarmente rilevanti per la ricerca che coinvolge il pesce zebra a causa del numero limitato di anticorpi disponibili in commercio che vengono convalidati per l'uso nel pesce zebra. Infatti, uno studio condotto su quattro grandi aziende ha mostrato che gli anticorpi disponibili in commercio per l'uso nel mouse erano circa 112.000 contro circa 5.300 per l'uso nel pesce zebra15. Infine, abbiamo scelto di sviluppare un protocollo che potesse essere eseguito su una singola criosezione, che è essenziale quando si lavora con campioni di tessuto piccoli o limitati come si ottengono da embrioni di pesce zebra.
Questo protocollo è stato progettato per valutare il comportamento proliferativo delle cellule donatrici in 48 h dopo la fecondazione embrioni di zebra chimetrici che sono stati generati dal trapianto di blastula-to-blastula come descritto da Carmany-Rampey e Moens16. Gli embrioni del donatore sono stati iniettati nello stadio a una cellula con un coniugato dextran con etichetta fluorescente prima del trapianto di cellule donatrici in embrioni ricvenuto. Abbiamo usato l'immunofluorescenza per Ser 10 fosforolato Histone H3 (pH3) per rilevare le cellule che proliferano seguite dall'immunostochimica per la dextran etichettata per rilevare le cellule del donatore negli embrioni di pesce zebra chihimeric. Il rilevamento sequenziale del pH3 e del dextran etichettato all'interno di una singola criosezione ci ha permesso di identificare e quantificare le singole cellule che esprimevano entrambi i marcatori.
Questo protocollo sequenziale IF/IHC per il pesce zebra criosezione fornirà uno strumento utile per i ricercatori di pesci zebra che desiderano un protocollo di co-localizzazione per l'espressione delle proteine. I problemi che questo protocollo è stato progettato per affrontare, come piccoli campioni di tessuto e limitata disponibilità di anticorpi, non sono unici per il modello di pesce zebra. Questo metodo può quindi essere utile a qualsiasi ricercatore che desidera eseguire sequenziale IF/IHC.
DICHIARAZIONE ETICA:
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
1. Preparazione dell'embrione
- Fissare 48 h di embici di pesce zebra chimetriche post-fertilizzazione (hpf) generati dal trapianto di blastula-blastula tra embrioni di pesce zebra di tipo selvatico AB in paraformaldeide (PFA) durante la notte con dondolo a 4 gradi centigradi. Eseguire due lavatoi da 5 min con dondolo a temperatura ambiente utilizzando 500 l un'unità di 1x di fosfato buffer salina contenente lo 0,1% di un surfactant non ionico (1x PBSt; vedere la Tabella dei materiali)
NOT: La paraformaldeide è tossica e cancerogena e deve essere smaltita correttamente in base alle normative istituzionali. Il lavoro con la paraformaldeide deve essere eseguito in una cappa chimica e devono essere sempre utilizzati adeguati dispositivi di protezione personale (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza). - Disidratare gli embrioni lavandoli in sequenza con 500 gradi luna del 30%, 50% e 70% di metanolo (MeOH) diluiti con 1x PBSt per 10 min ciascuno a temperatura ambiente con dondolo. Incubare gli embrioni in 500 gradi l di 100% MeOH a -20 gradi centigradi per almeno 14 h.
NOT: Il metanolo è tossico e deve essere smaltito in modo adeguato in base alle normative istituzionali. Il lavoro con il metanolo deve essere eseguito in una cappa chimica e devono essere sempre utilizzati adeguati dispositivi di protezione personale (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza). - Reidratare gli embrioni lavandoli in sequenza con 500 gradi l di 70%, 50% e 30% MeOH diluiti con 1x PBSt per 10 min ciascuno a temperatura ambiente con dondolo. Eseguire due lava5 min con 500 l di 1x PBSt a temperatura ambiente con dondolo.
- Rimuovere l'1x PBSt e incubare in 500 : L del 30% di saccarosio diluito con acqua deionizzata a temperatura ambiente con dondolo fino a quando gli embrioni affondano sul fondo del tubo (circa 1 h). Sostituire il saccarosio con 500 o L del 15% di gelatina di pesce/25% di saccarosio (15/25; vedi la Tabella deiMateriali) e incubare a temperatura ambiente con dondolo durante la notte.
- Sostituire circa la metà del volume di 15/25 con un mezzo ottimale di temperatura di taglio (media OCT) e incubare a temperatura ambiente con dondolo fino a quando gli embrioni affondano sul fondo del tubo (circa 1 h).
- Sostituire circa la metà del volume con il supporto dello OCT e incubare a temperatura ambiente con dondolo per 1 h. Ripetere questo passaggio una volta.
- Durante le fasi di incubazione con 15/25 e media OCT, invertire o far scorrere il tubo in base alle esigenze per combinare questi reagenti.
2. Incorporamento e preparazione di embrioni di criosezioni
- Trasferire gli embrioni in uno stampo plastico (si veda la Tabella deiMateriali) con pinze, riducendo al minimo qualsiasi trasferimento della miscela 15/25-OCT. Riempire lo stampo circa la metà pieno con il mezzo OCT e mescolare delicatamente gli embrioni nel mezzo OCT.
- Preparare gli stampi di plastica etichettati e trasferire gli embrioni desiderati (di solito 1 embrioni da 1 a 20123) negli stampi di plastica vuoti etichettati, riducendo al minimo il riporto del mezzo dell'OCT. Una volta che gli embrioni desiderati sono nello stampo di plastica, riempire delicatamente con il mezzo di OCT alla parte superiore dello stampo.
- Utilizzare pinze o 25 G di aghi per disporre gli embrioni nell'orientamento desiderato, utilizzando uno stereoscopio chiaro per la visualizzazione (Figura 1A, B).
- Congelare gli stampi preparati sul ghiaccio secco in un contenitore isolato con una piattaforma metallica. Posizionare un secchio di ghiaccio o un dispositivo di raffreddamento della schiuma delicatamente sulla piattaforma metallica per creare una camera fredda (Figura 1C, D)
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Preparate le criosezioni di spessore 10-u201212 m utilizzando un criostato a -20 gradi centigradi.
- Impostare un blocco alla volta e utilizzare il supporto dello Strumento di personalizzazione di Office per congelare il blocco sul disco/chuck con la parte inferiore del blocco rivolto verso il pannello (Figura 2A). Assicurarsi che il blocco sia completamente congelato sul disco (il supporto dello Strumento di personalizzazione di Office diventerà bianco) prima di iniziare la sezione (Figura 2B).
- Posizionare criosezioni su vetrini di vetro caricati (Figura 2C, D) e asciugare l'aria i vetrini durante la notte a temperatura ambiente.
3. Immunofluorescenza per pH3
- Eseguire tre min lavamenti 5 min dei vetrini in 1x PBS in un contenitore appropriato, ad esempio un barattolo Coplin. Se i tessuti non sono ben aderiti allo scivolo, eseguire i lacci posando i vetrini su una superficie piana e convogliando delicatamente 500 - L di 1x PBS sulla superficie. Versare 1x PBS tra i suoi lavamenti ribaltando delicatamente i vetrini.
- Delineare le sezioni con una penna a barriera o una matita di cera per mantenere il liquido sui vetrini (Figura 3).
- Posare i vetrini su una superficie piana in una camera umida e pipetta 200 -L di blocco buffer per sezione sui vetrini. Incubare nel buffer a blocchi per 2 ore a temperatura ambiente o perunanotte a 4 gradi centigradi.
- Preparare la diluizione dell'anticorpo primario (anticorpo anti-pH3 del coniglio, 1:200; vedi Tabella dei materiali) nel buffer di blocco e mescolare bene pipettando. Punta delicatamente i vetrini per scaricare il buffer di blocco, tornare alla camera umida e pipetta 200 -L di soluzione anticorpale primaria per sezione sui vetrini. Per il controllo solo secondario, pipetta 200 - L di buffer di blocco sulle sezioni appropriate.
- Incubare gli scivoli a 4 gradi centigradi durante la notte in una camera umida piena di acqua deionizzata. Sigillare i bordi della camera umida per aiutare a trattenere l'umidità.
- Eseguire tre min lavamenti 5 min dei vetrini in 1x PBS in un contenitore appropriato, ad esempio un barattolo Coplin. Durante le fasi di lavaggio, preparare la diluizione dell'anticorpo secondario (anticorpo secondario fluorescente anti-coniglio, 1:2,000; vedi Tabella dei materiali) in blocco e mescolare bene con la pipettatura.
- Disporre i vetrini su una superficie piana in una camera umida e pipette 200 -L di soluzione anticorpale secondaria per sezione sui vetrini. Incubare i vetrini in soluzioni di anticorpi secondari a temperatura ambiente, schermati dalla luce, per 30 min.
- Eseguire tre lavamin 5 min dei vetrini in 1x PBS in un contenitore appropriato, come un barattolo Coplin, schermato dalla luce. Durante le fasi di lavaggio, preparare una soluzione di colorazione nucleare (vedere la Tabella dei materiali).
- Posizionare i vetrini su una superficie piana e sulla pipetta 200-u2012500 (a seconda delle dimensioni del campione) della soluzione di colorazione nucleare su ciascuna sezione. Incubare i vetrini nella soluzione di colorazione nucleare per 10 min, schermati dalla luce.
- Scolare la soluzione di colorazione nucleare e montare i vetrini con supporti di montaggio fluorescenti non induriti e un coperchio di vetro. Mantenere i vetrini al buio a 4 gradi centigradi fino a quando non viene eseguita l'imaging.
NOT: I migliori risultati si ottengono quando le diapositive vengono immagini nello stesso giorno o il giorno successivo. - Seguendo IF, visualizzare e immaginare le diapositive con un microscopio a fluorescenza confocale e fotocamera digitale utilizzando 555 nm (rosso) e 645 nm (far-red) filtri di emissione a 100x ingrandimento (10x ingrandimento oculare e 10volte ingrandimento obiettivo). Mantenere la potenza laser coerente durante l'imaging.
- Dopo l'imaging, posizionare i vetrini in singoli contenitori di 1x PBS e conservarli a 4 gradi centigradi durante la notte per preparare la rimozione dei coperchi. Quando si posizionano i vetrini in 1x PBS, agitare delicatamente i vetrini per facilitare la rimozione del coperchio.
NOT: Non premere verso il basso sulla coverslip o tentare di rimuovere il coverslip manualmente, in quanto ciò può compromettere la qualità delle sezioni. I copricopertine devono essere rimossi orizzontalmente con un minimo movimento forzato.
4. Immunoistochimica per Dextran etichettato
- Dopo aver rimosso i copricopertine, trasferire delicatamente i vetrini nel nuovo 1x PBS in un contenitore appropriato, ad esempio un barattolo Coplin. Rimuovere il 1x PBS ed eseguire tre incubazioni di 5 min dei vetrini in 1x salina tamponata da Tris con lo 0,1% di un surfactant non ionico (1x TBSt) a temperatura ambiente.
- Preparare 250 mL di perossido di idrogeno del 3% (H2O2)diluito in acqua deionizzata in un contenitore di dimensioni appropriate. Incubare i vetrini in 3% H2O2 soluzione a temperatura ambiente per 15 min.
NOT: Il perossido di idrogeno è corrosivo e deve essere smaltito in modo adeguato per le normative istituzionali. Devono essere sempre utilizzate attrezzature protettive personali appropriate (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza). - Sciacquare rapidamente i vetrini con acqua deionizzata. Eseguire tre lava5 min dei vetrini in 1x TBSt. Asciugare attentamente l'area intorno alle sezioni di tessuto e posizionare i vetrini piatti in una camera umida. Delineare le sezioni di tessuto con una penna barriera o una matita di cera per mantenere il liquido sulle sezioni, se necessario.
- Applicare una soluzione di blocco del siero 2,5% pronto all'uso fornita con un kit di etichettatura anticorpale secondario (vedere la tabella dei materiali) dropwise per ogni sezione. Incubare gli scivoli in una camera umida a temperatura ambiente per 20 min.
- Preparare l'anticorpo primario diluito in diluente anticorpo (coniglio anti-labeld, 1:7.500; vedi la tabella dei materiali) e mescolare con una leggera pipettatura. Puntare delicatamente i vetrini per svuotare il buffer di blocco, asciugare l'area intorno alle sezioni e posizionare i vetrini piatti in una camera umida.
- Non lavare prima di applicare la soluzione anticorpale primaria. Pipette 200 - L di soluzione anticorpale primaria per sezione sui vetrini e incubare in una camera umida a 4 gradi durante la notte. Per il controllo solo secondario, pipetta 200 -L di anticorpo diluente sulle sezioni appropriate.
- Punta delicatamente i vetrini per drenare la soluzione anticorpale primaria e metterli in 1x TBSt in un contenitore appropriato, come un barattolo Coplin. Eseguire due lava5 min dei vetrini in 1x TBSt. Asciugare l'area intorno alle sezioni e posizionare piatto in una camera umida.
- Applicare un reagente di blocco per la riduzione dello sfondo pronto all'uso (vedere la tabella dei materiali) dropwise per ogni sezione. Incubare gli scivoli in una camera umida a temperatura ambiente per 20 min.
- Puntare delicatamente i vetrini per svuotare il blocco, asciugare attentamente l'area intorno alle sezioni e posizionare i vetrini piatti in una camera umida. Non lavare prima di applicare la soluzione anticorpale secondaria.
- Applicare una soluzione anticorpale secondaria pronta all'uso (anticorpo polimero perossidasi perossidasi (HRP) anti-coniglio (HRP), vedere la Tabella dei Materiali) a ciascuna sezione dropwise e incubare in una camera umida a temperatura ambiente per 30 min.
- Puntare delicatamente i vetrini per drenare la soluzione anticorpale secondaria e mettere in 1x TBSt in un contenitore appropriato, come un barattolo Coplin. Eseguire due lavatoi 5 min delle diapositive in 1x TBSt.
- Preparare il substrato cromogenico HRP immediatamente prima dell'uso secondo il protocollo del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
- Asciugare l'area intorno alle sezioni, posizionare i vetrini su una superficie piana e applicare 200 -L del substrato cromogenico HRP ad ogni sezione. Incubare a temperatura ambiente per 3 min, avviando un timer quando il substrato è stato applicato alla prima diapositiva (Figura 4).
- Scolare la soluzione del substrato e sciacquare brevemente i vetrini in un barattolo Coplin contenente 1x PBS. Mettere i vetrini in acqua deionizzata in un contenitore appropriato, come un barattolo Coplin, ed eseguire due lava5 5 min in acqua deionizzata con agitazione delicata.
- Controstale i vetrini mettendoli in soluzione di colorazione dell'ematossilina fino a 30 s.
NOT: L'ematossinosa è tossica e deve essere smaltita secondo le normative istituzionali. Devono essere sempre utilizzate attrezzature protettive personali appropriate (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza). - Mettere i vetrini in acqua deionizzata in un contenitore appropriato, come un barattolo Coplin, ed eseguire tre lavamenti da 5 min in acqua deionizzata. Trasferire i vetrini in un contenitore contenente l'acqua del rubinetto di Scott (vedere la Tabella deiMateriali) e incubare per 1 min.
- Mettere i vetrini in acqua deionizzata in un contenitore appropriato, come un barattolo Coplin, ed eseguire tre lavamenti da 5 min in acqua deionizzata.
- Disidratare i vetrini attraverso una serie di gradi di etanolo (EtOH) (diluito in acqua deionizzata) e xilene in un cappuccio chimico. Eseguire un'incubazione di 2 min nel 70% EtOH, due incubazioni da 1 min nel 95% EtOH, due incubazioni da 1 min nel 100% EtOH e tre incubazioni da 1 min in xilene. Togliere i vetrini dallo xilene e posizionare un coperchio mentre è bagnato con un supporto di montaggio a base di toluene in una cappa chimica.
NOT: Xilene e toluene sono tossici e infiammabili e devono essere smaltiti correttamente secondo le normative istituzionali. Lavorare con lo xilene e il toluene devono essere eseguiti in una cappa chimica e devono essere sempre utilizzati adeguati dispositivi di protezione personale (guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza). - Seguendo IHC, visualizzare e immaginare le diapositive con un microscopio di luce composto e fotocamera digitale con ingrandimento 100x (10x ingrandimento oculare e ingrandimento oggettivo 10x). (Figura 5).
Representative Results
Abbiamo sviluppato questo protocollo al fine di identificare e analizzare l'espressione proteica nelle singole cellule donatrici in embrioni di pesce zebra chihimedi post-fertilizzazione 48 h che sono stati generati dal trapianto di blastula-blastula tra embrioni di pesce zebra wild type AB. Il successo dell'analisi dell'espressione proteica a livello di una cellula ha richiesto la preparazione di criosezioni con embrioni opportunamente orientati (Figura1 e Figura2) e un'attenta applicazione sequenziale delle tecniche IF e IHC a tali criosezioni (Figura 3 e Figura 4). L'uso di anticorpi specifici per rilevare simultaneamente le cellule proliferanti (anti-pH3, Figura 5A,B) e le cellule donatrici (dextran anti-etichettato, Figura 5D) può essere utilizzato per identificare e quantificare le cellule donatrici che proliferano attivamente ( Figura 5E). È essenziale generare immagini di alta qualità dopo IF (Figura 2A, B) e IHC ( Figura2D) al fine di identificare con precisione le singole celle. Un programma di analisi delle immagini deve essere utilizzato per eseguire la sovrapposizione dell'immagine (Figura 5E). A seconda del programma di analisi delle immagini utilizzato, è possibile eseguire conteggi automatizzati delle celle etichettate dovrebbe essere desiderato.
Figura 1: Preparazione di blocchi congelati dello OCT. (A) 50x vista microscopica degli embrioni in OCT in uno stampo criogenico preparato per il congelamento. Freccia rossa indica la testa della posizione dell'embrione di pesce zebra contro la superficie inferiore dello stampo; freccia nera indica la coda rivolta verso l'alto verso l'utente. (B) Stampi di plastica con embrioni e OCT posizionati su piattaforma metallica refrigerata. (C) Secchio di ghiaccio in schiuma posto su stampi di plastica per creare una camera di congelamento. (D) OCT diventa bianco da trasparente una volta che il blocco è completamente congelato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Criosezione dei blocchi congelati dello OCT. (A), l'applicazione del nuovo OCT sul disco criostato e il posizionamento del blocco congelato nello strumento Office, ruotato di 180 gradi rispetto all'orientamento di congelamento del blocco. (B) Vista laterale del blocco congelato su disco di sezionamento. (C) Vista del blocco di sezionamento con piastra rotolo in posizione. (D) Ritiro di sezioni utilizzando uno scivolo caricato dalla piattaforma metallica del criostato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Visualizzazione delle sezioni preparate dopo il posizionamento in una diapositiva. La freccia indica la barriera idrofobica e la linea tratteggiata delinea la zona contenente le sezioni all'interno del perimetro della barriera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Preparazione per l'applicazione di substrati cromogenici durante l'IHC. Il vetrino viene posto su una superficie piana ricoperta di involucro di plastica per consentire l'applicazione uniforme del substrato cromogenico, mentre contiene qualsiasi fuoriuscita di materiale pericoloso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Rappresentante IF e IHC etichettatura di embrioni di pesce zebra chihimerici criostati da 48 hpf generati dal trapianto di blastula-blastula tra embrionidi pesce zebra di tipo selvatico AB . (A) IF per rilevare Ser 10 fosforolato Histone H3 (anti-pH3, 1:200) espressione in 48 hpf embrione di zebra chihimici. Rosso : cellule pH3-positive; blu e nuclei. Le frecce gialle indicano esempi di celle positive. (B) La sottrazione della macchia nucleare blu nell'immagine digitale (software ImageJ) migliora la visualizzazione delle cellule pH3-positive per la quantificazione e la sovrapposizione delle immagini. (C) Controllo negativo (solo anticorpo secondario) per l'analisi IF in embrione criostrato di pesce zebra chihimoso da 48 hpf. La barra della scala rappresenta 50 m (applicabile a tutti i pannelli). (D) IHC per rilevare dextran etichettato (dextran anti-labeld, 1:7.500) in chimerico 48 hpzebrafish embrion generato dal trapianto di blastula-to-blastula tra embrioni di pesce zebra di tipo selvatico AB. Gli embrioni del donatore sono stati iniettati con un coniugato dextran fluorescente etichettato nello stadio a una cellula prima dell'uso per il trapianto di blastula-blastula. Il rosso indica le cellule etichettate con un coniugato dextran; blu indica i nuclei. Le frecce gialle indicano esempi di celle positive. (E) Sovrapposizione del pannello B (IF per pH3) e del pannello C (IHC per dextran etichettato) che mostra la colocalizzazione dell'espressione pH3 e l'etichettatura dextran nelle singole celle. Le frecce gialle indicano esempi di celle doppie. (F) Controllo negativo (solo anticorpo secondario) per il saggio IHC in criosezione 48 hpf embrione di pesce zebra chihimoso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Abbiamo presentato un nuovo metodo per l'immunofluorescenza combinata e l'immunohistochimica che rappresenta un importante passo avanti nell'esecuzione di esperimenti di colocalizzazione sugli embrioni di pesce zebra criosezione. C'è una mancanza critica di protocolli di co-localizzazione esistenti che sono ottimizzati per l'uso con piccoli embrioni e materiale criosezione17,18, entrambi altrimenti comunemente utilizzati negli studi molecolari14. I protocolli di colocalizzazione esistenti si concentrano principalmente sulla visualizzazione simultanea di due fluorofori17,18. Mentre questi protocolli possono funzionare bene, la loro utilità è limitata dalla disponibilità di anticorpi che (i) possono essere utilizzati nel pesce zebra e (ii) sono compatibili con if.
Riteniamo che l'uso della criosezione per gli embrioni di pesce zebra offra un vantaggio significativo in termini di morfologia dei tessuti conservati. Poiché l'IHC è più comunemente eseguito su sezioni di paraffina rispetto alle criosezioni7,8, è giustificata un'ulteriore esplorazione dei metodi IHC basati sulla criosezione per il rilevamento dell'espressione proteica. L'uso dell'intero monte IF è un metodo comune per visualizzare i livelli di espressione negli embrioni di pesce zebra ed è più comunemente descritto nella letteratura rispetto a IF utilizzando criosezioni1,2,3,4, 19. Tuttavia, i protocolli di montaggio completo hanno limitazioni, tra cui la mancanza di una localizzazione accurata delle proteine espressa nei tessuti profondi e il potenziale di espressione del livello superficiale per oscurare l'espressione proteica nei tessuti più profondi. Abbiamo costantemente osservato un'eccellente manutenzione della morfologia cellulare dopo la crioconservazione, la sezionamento e l'IF e L'IHC sequenziali. Per le applicazioni che richiedono una localizzazione precisa dell'espressione proteica a livello di singola cellula, c'è un vantaggio significativo per le procedure basate sulla sezione, come abbiamo descritto in questo protocollo. L'incorporamento di resine offre un'opzione alternativa per eseguire analisi IF o IHC su sezioni di embrioni di pesce zebra in fase iniziale20. Le sezioni di resina forniscono una conservazione superiore della morfologia dei tessuti rispetto alle criosezioni e possono essere preparate sezioni di tessuto relativamente più sottili. Tuttavia, i produttori generalmente non raccomandano l'uso di sezioni di resina per saggi immuno-based, poiché alcuni componenti delle resine non possono essere rimossi dalle sezioni e possono mascherare i siti di legame degli anticorpi21.
Sebbene l'intero protocollo sia essenziale per un'analisi accurata e proficua dei modelli di espressione, alcuni passaggi specifici sono fondamentali per il successo sperimentale. Il primo passo critico è la gestione degli embrioni durante l'incorporamento in OCT13,14. Può essere difficile orientare ogni embrione nello stesso piano trasversale in modo che le sezioni vengano tagliate approssimativamente dalla stessa area per tutti gli embrioni. Abbiamo scoperto che l'utilizzo di aghi di piccolo calibro per eseguire piccoli movimenti intenzionali attraverso il viscoso mezzo dello OCT per l'orientamento embrionale è superiore all'uso di pinze, che sono troppo grandi e sposto troppo medio OCT. Un secondo passaggio critico si verifica durante la sezionamento di blocchi congelati, in quanto può essere difficile ottenere sezioni di alta qualità che contengono i tessuti desiderati senza formazione ed esperienza significativi. Si consiglia quindi l'uso di campioni di prova fino a quando la tecnica è padroneggiata. Un terzo passo critico è la rimozione di coverslip, che ha il potenziale di disturbare o rimuovere campioni di tessuto. Abbiamo scoperto che una combinazione di agitazione delicata per allentare il coperchio e la lenta rimozione del vetrino dal contenitore PBS è l'approccio più efficace per rimuovere i copricoperture. Una mano dolce e ferma è la cosa migliore; i ricercatori possono scoprire che alcuni tentativi ed errori sono necessari per imparare a rimuovere i copricopertine in modo efficace.
Ulteriori passaggi importanti nel protocollo includono l'ottimizzazione degli anticorpi (anticorpi primari e secondari per i saggi IF e IHC) e l'esposizione dei vetrini al substrato cromogenico e alla controtendenza. Una ricerca approfondita sulla specificità primaria degli anticorpi e sulla concentrazione degli obiettivi è essenziale; in generale, è meglio raccogliere sufficienti campioni non preziosi per almeno due esperimenti separati per IF e IHC che verranno eseguiti per ottimizzare le concentrazioni di anticorpi primari prima di iniziare la combinazione IF/IHC. Includere un controllo positivo e negativo noto per ogni anticorpo primario è essenziale in ogni esperimento per garantire che i test IF e IHC funzionino in modo appropriato. Possono anche essere necessarie modifiche alla concentrazione secondaria degli anticorpi. È necessaria l'ottimizzazione dell'esposizione delle sezioni tissutali al substrato cromogenico e alla controvendita per il saggio IHC, poiché le linee guida del produttore spesso descrivono una vasta gamma di possibili tempi di esposizione. Non tutti i cromogeni possono essere compatibili con le contro-ine endogeni e la pigmentazione del tessuto endogeno, richiedendo un'attenta pianificazione per quanto riguarda la selezione dei cromogeni.
Ci sono numerose potenziali modifiche che possono essere applicate al protocollo descritto, e abbiamo eseguito con successo questo protocollo con altre combinazioni di anticorpi che non potevano essere entrambi utilizzati per IF. Come accennato all'alto, le sostanze cromogeniche hanno una netta compatibilità con controstains specifici. Abbiamo scoperto che questi componenti sono facilmente modificabili nel protocollo. Inoltre, i parametri per l'incubazione degli anticorpi sono abbastanza flessibili e possono essere aumentati o diminuiti a seconda dell'intensità di colorazione desiderata. Il processo di incorporamento può anche essere modificato. Mentre ci siamo concentrati su sezioni trasversali, gli embrioni possono essere facilmente orientati in qualsiasi direzione per affrontare particolari tessuti di interesse. Infine, ci sono più possibili punti di pausa in questo protocollo. Gli embrioni disidratati possono essere conservati in 100% MeOH a -20 gradi centigradi per alcuni mesi; i blocchi congelati possono essere conservati a -80 gradi centigradi per un massimo di tre mesi; e i vetrini preparati possono essere conservati a -80 gradi centigradi per un massimo di nove mesi in una scatola di diapositive.
A causa della relativa complessità di questo protocollo IF/IHC combinato, ci sono più possibili fonti di variazione o errore che possono richiedere la risoluzione dei problemi, che vanno dalla qualità dei tessuti all'esperienza del ricercatore alla gestione del campione. La maggior parte dei passaggi critici descritti in precedenza sono considerati critici perché richiedono l'ottimizzazione a livello di singolo utente o richiedono particolare destrezza, abilità ed esperienza. Tuttavia, abbiamo scoperto che la colorazione dello sfondo non specifico e la bassa intensità del segnale sono i problemi più significativi che richiedono l'ottimizzazione. Come con qualsiasi protocollo IF o IHC, affrontare questi problemi può richiedere molto tempo e laboriosa e può essere combinato con questo metodo poiché le due tecniche sono combinate. Per questo motivo, consigliamo vivamente di ottimizzare SE e IHC separatamente prima di procedere con il protocollo combinato.
Mentre prevediamo che questo metodo sarà utile per una vasta gamma di esperimenti, ci sono potenziali limitazioni. Il successo delle prestazioni di questa procedura dipende dal mantenimento di campioni di tessuto intatti attraverso due esperimenti sequenziali che includono numerose fasi di lavaggio. Per questo motivo, eventuali problemi che sorgono durante la sezionamento o la movimentazione dei tessuti, compreso l'uso di diapositive più vecchie che potrebbero essersi degradati in qualità, limiteranno significativamente la capacità dei ricercatori di eseguire questo protocollo con successo. Anche se i vetrini possono potenzialmente essere conservati a -80 gradi centigradi per un massimo di nove mesi, l'aderenza ai vetrini diminuisce nel tempo e abbiamo avuto il miglior successo con diapositive che vengono utilizzate entro un mese dalla preparazione o idealmente, il giorno successivo. Una seconda limitazione è la piccola impronta degli embrioni di pesce zebra. Anche se abbiamo scoperto che questo esperimento è utile per la visualizzazione delle proteine che sono relativamente abbondanti mente espresse in embrioni in fase iniziale, le proteine che vengono espresse in modo incoerente o a bassi livelli possono essere molto difficili da catturare in una sezione. Infine, dal momento che il protocollo utilizza criosezioni da 10-u201212 m, è più adatto per la valutazione dell'espressione proteica in strutture più grandi, come i nuclei, piuttosto che componenti subcellulari più piccoli.
In sintesi, il nostro protocollo combinato IF/IHC sarà vantaggioso per un'ampia varietà di studi sugli embrioni di pesce zebra in fase iniziale e rappresenta un'importante innovazione nell'analisi precisa dell'espressione proteica in tali campioni. Il nostro metodo, illustrato con successo nella Figura5, consentirà ai ricercatori di preservare la delicata morfologia degli embrioni di pesce zebra in fase iniziale nelle criosezioni, mentre si lavora con la gamma piuttosto limitata di anticorpi primari attualmente disponibili che sono convalidati per l'uso in IF o IHC in questa specie. Questo protocollo sarà probabilmente utile per studi condotti su altre specie di pesci e anfibi (ad esempio, Medaka e Xenopus spp.), che sono ostacolati da limitazioni simili alla disponibilità di anticorpi e possono essere applicabili ai modelli di mammiferi tradizionali bene.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH 5K01OD021419-02 e dal NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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