Summary
이 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아의 저온 절에 대한 순차적 면역 형광 및 면역 히스토화학을 입증하여 특정 세포 집단에서 정확한 동국화 분석을 가능하게합니다.
Abstract
세포 간 상호 작용의 조사는 수시로 특정 세포 인구및 정확한 단백질 현지화의 이산 표지를 요구합니다. 제브라피쉬 배아는 생체 내 모델과의 상호 작용을 검사하기 위한 훌륭한 도구입니다. 전체 마운트 면역히스토케미컬 및 면역형광 분석실험은 단백질 발현을 평가하기 위해 제브라피쉬 배아에 자주 적용된다. 그러나 3차원 공간에서 공동 국소화된 단백질의 정확한 매핑을 달성하기는 어려울 수 있습니다. 또한, 일부 연구는 동일한 기술과 호환되지 않는 2개의 항체의 사용을 요구할 수 있다(예를 들어, 항체 1은 면역조직화학에만 적합하고 항체 2는 면역형광에만 적합하다). 본 명세서에 기재된 방법의 목적은 초기 단계 제브라피시 배아로부터 유래된 개별 저온절에 대한 순차적 면역형광 및/또는 면역조직화학을 수행하는 것이다. 여기에서 우리는 단세포 수준에서 단백질 발현의 정확한 확인을 달성하기 위하여 면역형광, 화상 진찰, 면역성 화학, 단 하나 cryosection를 위한 화상 진찰의 순차적인 라운드의 사용을 기술합니다. 이 방법론은 개별 세포에 있는 다중 단백질 표적의 정확한 확인을 요구하는 초기 단계 zebrafish 태아에 있는 어떤 연구 든지 를 위해 적당합니다.
Introduction
제브라피쉬는 현재 생물 의학 연구에서 다양한 분야에서 사용되는 매우 견고한 모델 유기체입니다. 특히, 제브라피시 배아의 신속한 외부 개발과 투명도는 생체 내 연구를 위한 훌륭한 도구를 제공합니다. 본 명세서에서, 우리는 저온절제 제브라피쉬 배아의 순차적 면역형광(IF) 및 면역조직화학(IHC) 분석을 위한 방법을 기술한다. 이 새로운 절차는 단일 슬라이드에 두 개의 항체의 순차적 적용을 사용하여 조직 섹션을 보존하면서 세포 수준에서 동국화 단백질을 정확하게 식별할 수 있습니다. 이 프로토콜은 마우스 모델과 비교하여 제브라피시어의 IF 및/또는 IHC 응용 분야에서 상대적으로 적은 수의 항체가 검증되었기 때문에 제브라피시 모델에 대한 연구에 특히 유용합니다.
세포 간 상호 작용의 관찰은 많은 연구 결과에 있는 필수적인 요소이고, 유기체 수준에 표현형의 기초가 되는 세포 수준에서 작동하는 분자 기계장치에 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 추가적으로, 단백질 발현은 세포 기능, 특히 세포 내의 다중 단백질의 발현을 동시에 검토할 때 (공동 국소화)에 대한 정보를 제공할 수 있다. 전체 마운트 IHC 및 IF는 제브라피시 배아1,2,3,4,5,전체 마운트 절차에서 단백질 발현을 분석하는 데 일반적으로 사용되는 기술이지만, 전체 마운트 절차가 될 수 있습니다. 정확한 공동 지역화 데이터를 달성하는 데 문제가 있습니다. 우리의 경험에서, 조직의 층 사이 분화하고 전체 마운트 견본에 있는 단 하나 세포 수준에 단백질 발현을 구상하는 것은 어려울 수 있습니다. 이미징 소프트웨어 프로그램은 일반적으로 표면 염색과 더 깊은 염색을 구별하지 못할 수 있습니다. 비표면 수준의 단백질 발현은 보다 밝게 발현된 표면 수준 발현에 의해 가려질 수 있으며, 이로 인해 정량화가 부정확해질 수 있습니다. 또한, 대부분의 전통적인 얼룩말 제거 방법은 매우 독성6 따라서 사용하기에 덜 바람직하다.
IF 및 IHC와 같은 항체 기반 기술은 종종 단면 물질에서 단백질 발현을 검출하는 데 사용되며, 복잡한 조직 내에서 특정 단백질을 발현하는 이산 세포 집단의 식별을 단순화합니다. IHC는 일반적으로 다른 숙주 종에서 공액된 두 개의 상이한 항체를 사용하여 동질화에 일반적으로사용되며, 다른 색깔의 염색체 4,7,8,9로 시각화됩니다. , 10. 그러나 여러 염색체를 사용하면 비특이적 인 배경 염색 또는 색상11,12의비호환성으로 이어질 수 있습니다.
우리는 냉동 절제 된 초기 단계 제브라피시 배아에 순차적으로 IF 및 IHC에 의해 여러 단백질을 검출하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 저온절제는 특히 제브라피쉬 배아와 같은 섬세한 조직에 적합하며, 저온절은 형광계 분석법13,14에대한 파라핀 내장 부편보다 우수하다. 우리는 단일 분석 유형에 대한 항체 비호환성 문제를 회피하기 위해 이중 색상 IF 또는 IHC가 아닌 결합 된 IF 및 IHC를 최적화하기로 결정했습니다. 이러한 문제는 제브라피시에 사용하기 위해 검증된 시판되는 항체의 수가 제한되어 있기 때문에 제브라피시와 관련된 연구에 특히 적합합니다. 실제로, 4개의 대기업의 연구 결과는 마우스에 사용하기 위한 상업적으로 유효한 항체가 제브라피시15에서사용하기 위한 대략 5,300 대 대략 112,000이었다는 것을 보여주었습니다. 마지막으로, 우리는 제브라피시 배아에서 얻은 작거나 제한된 조직 샘플로 작업 할 때 필수적인 단일 냉동 섹션에서 수행 할 수있는 프로토콜을 개발하기로 결정했습니다.
이 프로토콜은 Carmany-Rampey 및 Moens16에의해 기술된 바와 같이 blastula-to-blastula 이식에 의해 생성된 48시간 후 수정 후 키메라 제브라피시 배아에서 공여자 세포의 증식 거동을 평가하기 위해 고안되었다. 공여자 배아는 수용자 배아로 공여자 세포를 이식하기 전에 형광으로 표지된 덱스렌 컨쥬게이트를 가진 1세포 단계에서 주입되었다. 우리는 Ser 10 인산화 된 히스톤 H3 (pH3)에 대한 면역 형광을 사용하여 증식 세포를 감지하고 키메라 제브라피쉬 배아에서 기증자 세포를 검출하기 위해 표지 된 덱스 렌에 대한 면역 화학을 발견했습니다. pH3의 순차적 검출및 단일 저온 절 내에서 표지된 덱스렌은 두 마커를 발현하는 개별 세포를 식별하고 정량화할 수 있게 해 주었다.
저온 절제 제브라피시에 대한 이 순차적 IF/IHC 프로토콜은 단백질 발현을 위한 공동 국소화 프로토콜을 원하는 제브라피시 연구자들을 위한 유용한 도구를 제공할 것입니다. 이 프로토콜이 작은 조직 표본 및 제한된 항체 가용성과 같은 문제를 해결하기 위해 고안된 문제는 제브라피시 모델에만 국한되지 않습니다. 이 방법은 따라서 순차적 IF/IHC를 수행하고자하는 모든 연구자에게 사용될 수 있습니다.
윤리 성명서:
모든 동물 연구는 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다, 노스 캐롤라이나 주립 대학, 롤리, 노스 캐롤라이나, 미국.
Protocol
1. 배아 준비
- 48시간 후 수정 후 수정(hpf) 키메라 제브라피쉬 배아를 AB 야생형 제브라피쉬 배아 에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 배반-블라스쿨라 이식에 의해 생성된 4°C에서 흔들어. 비이온 계면활성제 0.1%를 함유한 1x 인산완충 식염수 500μL을 사용하여 실온에서 흔들림으로 2개의 5분 세척을 수행합니다(1x PBSt; 재료 표참조)
참고: 파라포름알데히드는 독성이 있으며 발암물질이며 기관 규정당 적절히 폐기해야 합니다. 파라포름알데히드와 함께 작업하는 것은 화학 후드에서 수행되어야하며, 적절한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야합니다. - 배아를 30% 30%, 50%, 70% 메탄올(MeOH)으로 순차적으로 세척하여 1x PBSt로 10분 동안 희석하여 실온에서 흔들림으로 탈수한다. 배아를 -20°C에서 100% MeOH의 500 μL에서 배아를 14시간 이상 배양한다.
참고: 메탄올은 독성이 있으며 기관 규정에 따라 적절히 폐기해야 합니다. 메탄올작업은 화학적 후드에서 수행해야 하며, 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야 합니다. - 500 μL의 70%, 50%, 30%의 MeOH로 순차적으로 세척하여 배아를 1x PBSt로 10분 동안 흔들어 서 재수화합니다. 실온에서 500 μL의 1x PBSt로 2개의 5분 세척을 수행합니다.
- 1x PBSt를 제거하고 배아가 튜브의 바닥으로 가라 앉을 때까지 흔들면서 실온에서 탈이온수로 희석된 30% 자당의 500 μL에서 배양합니다(약 1시간). 자당을 15 % 생선 젤라틴 / 25 % 자당 (15 /25; 재료 표참조)의 500 μL로 교체하고 하룻밤 흔들어 실온에서 배양하십시오.
- 15/25 부피의 약 절반을 최적의 절삭 온도 매체(OCT medium)로 교체하고 배아가 튜브 바닥(약 1시간)에 가라앉을 때까지 실온에서 배양합니다.
- 부피의 약 절반을 OCT 배지로 교체하고 실온에서 1 시간 동안 흔들면서 배양하십시오.
- 15/25 및 OCT 배지로 인큐베이션 단계에서, 이러한 시약을 결합하기 위해 필요에 따라 튜브를 반전 또는 플릭.
2. 배아 삽입 및 냉동 섹션의 준비
- 배아를 집게로 플라스틱 몰드(재료 표참조)로 옮기고 15/25-OCT 혼합물의 전달을 최소화합니다. 100만 개 배지로 곰팡이를 약 반으로 채우고 배아를 OCT 배지로 부드럽게 섞는다.
- 라벨이 부착된 플라스틱 몰드를 준비하고 원하는 배아(보통 1\u20123 배아)를 빈 라벨이 부착된 플라스틱 몰에 옮겨 OCT 배지의 이월을 최소화합니다. 원하는 배아가 플라스틱 몰드에 들어가면, OCT 배지를 곰팡이 의 상부로 부드럽게 채웁니다.
- 집게 또는 25 G 바늘을 사용하여 배아를 원하는 방향으로 배열하고, 시각화를 위해 가벼운 입체 현미경을 사용한다(그림1A,B).
- 금속 플랫폼으로 절연 용기에 드라이 아이스에 준비 된 금형을 동결. 얼음 양동이 또는 거품 쿨러를 금속 플랫폼에 부드럽게 놓아 차가운 챔버를 만듭니다 (그림1C,D)
-
-20°C에 설정된 저온 극저온을 사용하여 10\u201212 μm 두께의 저온 절을 준비합니다.
- 한 번에 하나의 블록을 설정하고 OCT 매체를 사용하여 블록을 블레이드를 향하도록 블록의 하단과 함께디스크/척에 고정합니다(그림 2A). 단면화(그림 2B)를 시작하기 전에 블록이 디스크에 완전히고정되어 있는지 확인합니다(OCT 매개체가 흰색으로 바뀝니다).
- 충전된 유리 슬라이드(그림2C,D)에 저온 절을 놓고 실온에서 밤새 슬라이드를 공기 건조시.
3. pH3에 대한 면역 형광
- 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x PBS로 슬라이드의 3개의 5분 세차량을 수행합니다. 조직이 슬라이드에 잘 부착되지 않은 경우, 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 표면에 1x PBS의 500 μL을 부드럽게 피펫팅하여 세안을 수행하십시오. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 세안 사이에 1x PBS를 붓습니다.
- 슬라이드에 액체를 유지하기 위해 배리어 펜이나 왁스연필로 섹션을 윤곽을 그립니다(그림 3).
- 밀기 챔버에 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 슬라이드에 섹션 당 블록 버퍼의 파이펫 200 μL. 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 블록 버퍼로 배양합니다.
- 1차 항체 희석(토끼 항-pH3 항체, 1:200; 물질표참조)을 블록 완충액으로 준비하고 파이펫팅하여 잘 섞는다. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고 습한 챔버로 되돌리고 섹션당 1차 항체 용액의 파이펫 200 μL을 슬라이드에 밀어 넣습니다. 보조 전용 컨트롤의 경우, 파이펫 200 μL의 블록 버퍼를 해당 섹션에.
- 탈이온수로 채워진 습한 챔버에서 밤새 4°C에서 슬라이드를 인큐베이션합니다. 습기가 많은 챔버의 가장자리를 밀봉하여 수분을 유지합니다.
- 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x PBS로 슬라이드의 3개의 5분 세차량을 수행합니다. 세척 단계 동안, 이차 항체 희석(항토끼 형광 이차 항체 컨쥬게이트, 1:2,000; 재료 표참조)을 블록 완충액으로 준비하고 파이펫팅하여 잘 혼합한다.
- 밀기 챔버에 평평한 표면에 슬라이드를 놓고 슬라이드에 섹션 당 이차 항체 용액의 파이펫 200 μL. 30 분 동안 빛으로부터 차폐 된 실온에서 이차 항체 용액으로 슬라이드를 배양하십시오.
- 빛으로부터 차폐된 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x PBS로 슬라이드의 3개의 5분 간 세차서를 수행합니다. 세척 단계에서 핵 염색 용액을 준비합니다(재료 표참조).
- 핵 염색 용액의 평평한 표면과 파이펫 200\u2012500 μL(시료 크기에 따라 다름)에 슬라이드를 각 섹션에 놓습니다. 빛으로부터 차폐된 10분 동안 핵 염색 용액에 슬라이드를 인큐베이션합니다.
- 핵 염색 용액을 빼내고 미경화 형광 장착 매체와 유리 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 이미징이 수행될 때까지 어두운 환경에서 슬라이드를 4°C로 유지합니다.
참고: 슬라이드가 같은 날 또는 다음 날에 이미지화될 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. - IF에 이어 100배 배율(10x 구형 배율 및 10배 객관적 배율)에서 555 nm(적색) 및 645nm(원적) 방출 필터를 사용하여 공초점 형광 현미경 및 디지털 카메라로 슬라이드를 시각화하고 이미지화합니다. 이미징 전반에 걸쳐 레이저 파워를 일관되게 유지합니다.
- 이미징 후 슬라이드를 1x PBS의 개별 용기에 놓고 밤새 4°C에서 평평하게 보관하여 커버슬립 제거를 준비합니다. 슬라이드를 1x PBS에 배치할 때 슬라이드를 부드럽게 교반하여 커버슬립을 제거하는 데 도움을 주십시오.
참고: 커버슬립을 누르거나 커버슬립을 수동으로 제거하지 마십시오. 커버슬립은 최소한의 강제 이동으로 수평으로 제거해야 합니다.
4. 표지된 덱스렌을 위한 면역성화학
- 커버슬립을 제거한 후, 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 슬라이드를 새 1x PBS로 부드럽게 옮김. 1x PBS를 제거하고 실온에서 비이온 계면활성제(1x TBSt)의 0.1%로 1x Tris 완충 식염수에서 슬라이드의 35분 배양을 수행합니다.
- 적절한 크기의 용기에 탈이온수에서 희석된과산화수소(H2O2)의 250 mL를 준비합니다. 슬라이드를 실온에서 3% H2O2 용액으로 15분 동안 배양합니다.
참고: 과산화수소는 부식성이며 기관 규정에 따라 적절히 폐기해야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야 합니다. - 탈이온수로 슬라이드를 빠르게 헹구십시오. 1x TBSt에서 슬라이드의 3 개의 5 분 세스를 수행하십시오. 필요한 경우 섹션에 액체를 유지하기 위해 장벽 펜이나 왁스 연필로 조직 부분을 윤곽.
- 즉시 사용 가능한 2.5% 혈청 차단 용액을 이차 항체 라벨링 키트와 함께 적용합니다(재료 표참조) 각 섹션에 드롭와이즈로. 20 분 동안 실온에서 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이션.
- 희석항체(토끼 표지 덱스트란, 1:7,500; 물질표참조)에서 희석된 1차 항체를 준비하고 부드러운 파이펫팅으로 혼합한다. 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고, 섹션 주변을 건조시키고, 슬라이드를 습한 챔버에 평평하게 놓습니다.
- 1차 항체 용액을 도용하기 전에 씻지 마십시오. 피펫 200 μL의 1차 항체 용액을 섹션상에 슬라이드 상에 상하여 밤새 4°C에서 습한 챔버에서 배양한다. 이차 전용 제어를 위해, 적절한 섹션 상에 희석된 항체의 파이펫 200 μL.
- 슬라이드를 부드럽게 팁하여 1차 항체 용액을 배출하고 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x TBSt에 넣습니다. 1x TBSt에서 슬라이드의 두 5 분 세차 작업을 수행합니다.
- 즉시 사용 가능한 백그라운드 감소 차단 시약을 적용합니다(재료 표참조) 각 섹션에 드롭와이즈로 적용합니다. 20 분 동안 실온에서 습한 챔버에서 슬라이드를 인큐베이션.
- 슬라이드를 부드럽게 팁하여 블록 버퍼를 빼내고, 조심스럽게 섹션 주변을 건조시키고, 슬라이드를 습한 챔버에 평평하게 놓습니다. 이차 항체 용액을 도용하기 전에 씻지 마십시오.
- 즉시 사용 가능한 이차 항체 용액 (항 토끼 고추 냉이 과산화 페록시다아제 (HRP) 폴리머 이차 항체를 각 섹션에 적하시키고 실온에서 습한 챔버에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 슬라이드를 부드럽게 팁하여 이차 항체 용액을 빼내고 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 1x TBSt에 넣습니다. 1x TBSt에서 슬라이드의 2개의 5분 세차서를 수행합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하기 직전에 HRP 염색체 기판을 준비하십시오(재료 표참조).
- 섹션 주위의 영역을 건조하고, 슬라이드를 평평한 표면에 놓고, 각 섹션에 HRP 발색 기판의 200 μL을 적용합니다. 실온에서 3분 동안 인큐베이션하고, 기판이 제1 슬라이드에 적용될때 타이머를 시작한다(도 4).
- 기판 용액을 빼내고 1x PBS가 들어있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 간략하게 헹구십시오. 슬라이드를 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 탈이온수에 넣고 부드러운 교반으로 탈이온 수에서 5분 간 2회 세서를 수행합니다.
- 최대 30s의 헤마톡실린 염색 용액에 넣어 슬라이드를 역염색하십시오.
참고: 헤마톡실린은 독성이 있으며 기관 규정에 따라 폐기되어야 합니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야 합니다. - 슬라이드를 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 탈이온수에 넣고 탈이온수에서 3개의 5분 간 세차서를 수행합니다. 슬라이드를 Scott의 수돗물이 들어 있는 용기로 옮기고(재료 표참조) 1분 동안 배양합니다.
- 슬라이드를 코플린 항아리와 같은 적절한 용기에 탈이온수에 넣고 탈이온수에서 3개의 5분 간 세차서를 수행합니다.
- 일련의 에탄올(EtOH) 등급(탈이온수에서 희석)과 자일렌을 화학 적 후드에 통해 슬라이드를 탈수합니다. 70% EtOH에서 2분 인큐베이션, 95% EtOH에서 2개의 1분 인큐베이션, 100% EtOH에서 2개의 1분 인큐베이션, 자일렌에서 3개의 1분 인큐베이션을 수행합니다. 자일렌에서 슬라이드를 제거하고 화학 후드에 톨루엔 기반 장착 매체로 젖은 상태에서 커버 슬립을 놓습니다.
참고: 자일렌과 톨루엔은 독성이 있고 인화성이 있으며 기관 규정에 따라 적절히 폐기해야 합니다. 자일렌과 톨루엔은 화학 후드에서 수행해야하며 적절한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트 및 안전 안경)를 항상 사용해야합니다. - IHC에 이어 100배 배율(10배 안구 배율 및 10배 객관적 배율)으로 복합 광 현미경 및 디지털 카메라로 슬라이드를 시각화하고 이미지화합니다. (그림5).
Representative Results
우리는 AB 야생 형 제브라피시 배아 사이의 배반 -투 - blastula 이식에 의해 생성 된 48 시간 후 수정 후 키메라 얼룩말 배아에서 개별 기증자 세포에서 단백질 발현을 식별하고 분석하기 위해이 프로토콜을 개발했습니다. 1 세포 수준에서 단백질 발현의 성공적인 분석은 적절하게 배아를 가진 저온절의 준비를 요구했습니다 (그림1 및 그림2) 및 이들에게 IF및 IHC 기술의 주의하고 순차적인 적용 (그림3 및 그림4). 증식 세포를 동시에 검출하기 위해 특정 항체를 사용하여 (항-pH3, 도 5A,B) 및 공여자 세포(항표지 덱스트란, 도 5D)는적극적으로 증식하는 공여자 세포를 식별하고 정량화하는 데 사용될 수 있다( 그림5E). 개별 셀을 정확하게 식별하려면 IF(그림2A,B)및 IHC(그림2D)모두에 이어 고품질 이미지를 생성하는 것이 필수적입니다. 이미지 분석 프로그램을 사용하여 이미지 오버레이를수행해야 합니다(그림 5E). 사용된 이미지 분석 프로그램에 따라, 정량화가 요구되어야 하는 표지된 셀의 자동화된 카운트를 수행할 수 있다.
그림 1: 냉동 OCT 블록의 준비. (A) 동결을 위해 제조된 극저온 형에서 OCT에서 배아의 50배 현미경보기. 적색 화살표는 금형의 바닥 면에 대한 제브라피시 배아 위치의 머리를 나타낸다; 검은색 화살표는 사용자를 가리키는 꼬리를 나타냅니다. (B) 차가운 금속 플랫폼에 배치 배아와 OCT와 플라스틱 금형. (C) 플라스틱 금형 위에 놓은 거품 얼음 양동이를 사용하여 동결 챔버를 만듭니다. (D) 블록이 완전히 고정되면 OCT가 투명에서 흰색으로 바뀝니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 냉동 OCT 블록의 냉동 섹션. (A), 저온 디스크에 신선한 OCT의 응용 프로그램과 OCT에 냉동 블록의 배치, 블록의 동결 방향에서 180 ° 회전. (B) 단면 디스크로 고정된 블록의 측면 보기입니다. (C) 롤 플레이트가 있는 단면 블록의 보기입니다. (D) 저온 유지의 금속 플랫폼에서 충전 된 슬라이드를 사용하여 섹션의 픽업. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 슬라이드에 배치한 후 준비된 섹션 보기 화살표는 소수성 장벽을 나타내고 점선은 장벽 둘레 내의 단면을 포함하는 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: IHC 동안의 염색체 기질 적용을 위한 준비. 슬라이드는 유해 물질의 유출을 포함하면서 염색체 기판의 균일 한 적용을 허용하기 위해 플라스틱 랩으로 덮여 평평한 표면에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대표적인 IF 및 IHC 라벨링 냉동48 hpf 키메라 제브라피쉬 배아AB 야생형 제브라피쉬 배아 사이에 배반-블래술라 이식에 의해 생성된다. (A) IF Ser 10 인산화 히스톤 H3(항-pH3, 1:200) 48 hpf 키메라 제브라피시 배아에서 발현. 적색 = pH3 양성 세포; 파란색 = 핵. 노란색 화살표는 양세포의 예를 나타냅니다. (B) 디지털 이미지(ImageJ 소프트웨어)에서 청색 핵 얼룩을 빼면 정량화 및 이미지 오버레이를 위해 pH3 양성 세포의 시각화가 향상됩니다. (C) 48 hpf 키메라 제브라피쉬 배아에서 IF 분석에 대한 음성 대조군(이차 항체만). 배율 막대는 50 μm를 나타냅니다(모든 패널에 적용 가능). (D) IHC는 AB 야생형 제브라피시 배아 사이의 블라스쿨라-블래쿨라 이식에 의해 생성된 키메라 48 hpf 제브라피쉬 배아에서 라벨이 부착된 덱스트란(anti-labeled dextran, 1:7,500)을 검출하였다. 기증자 배아는 블라스툴-투-블라쿨라 이식에 사용하기 전에 1세포 단계에서 형광표지된 덱스트란 컨쥬게이트를 주입했다. 빨간색은 덱스렌 컨쥬게이트로 표지된 세포를 나타냅니다. 파란색은 핵을 나타냅니다. 노란색 화살표는 양세포의 예를 나타냅니다. (E) 패널 B(pH3에 대한 IF) 및 패널 C(표지된 덱스트렌에 대한 IHC)의 오버레이는 개별 세포에서 pH3 발현 및 덱스트렌 라벨링의 공동 국소화를 나타냈다. 노란색 화살표는 이중 양성 세포의 예를 나타냅니다. (F) 극저온 48 hpf 키메라 제브라피쉬 배아에서 IHC 분석실험에 대한 음성 대조군(이차 항체만). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
우리는 저온 절제 된 제브라피시 배아에 대한 공동 국소화 실험을 수행하는 데 중요한 단계를 나타내는 결합 된 면역 형광 및 면역 조직 화학에 대한 새로운 방법을 제시했습니다. 기존 동국화 프로토콜의 중요한 부족이 작은 배아 및 저온 절제 물질17,18과함께 사용하기 위해 최적화되어 있으며, 둘 다 그렇지 않으면 일반적으로 분자 연구14에사용된다. 기존의 공동 국소화 프로토콜은 주로 두 개의 형광단17,18의동시 시각화에 초점을 맞추고 있다. 이러한 프로토콜은 잘 작동할 수 있지만, 그 유용성은 (i) 제브라피시에 사용될 수 있고 (ii) IF와 호환되는 항체의 가용성에 의해 제한된다.
우리는 제브라피시 배아에 대한 저온 절제의 사용이 보존 된 조직 형태측면에서 상당한 이점을 제공한다고 생각합니다. IHC는 극저온 절7,8보다파라핀 절에서 더 일반적으로 수행됨에 따라, 단백질 발현의 검출을 위한 저온절 기반 IHC 방법의 추가 탐구가 보증된다. 전체 마운트 IF의 사용은 제브라피시 배아의 발현 수준을 시각화하는 일반적인 방법이며, 저온절1, 2,3,4를 사용하는 IF보다 문헌에 보다 더 일반적으로 기술되어있다. 19. 그러나, 전체 마운트 프로토콜은 깊은 조직에서 발현되는 단백질의 정확한 국소화부족과 더 깊은 조직에서 단백질 발현을 모호하게 하는 표면 수준 발현 가능성을 포함하여 한계가 있다. 우리는 지속적으로 동결 보존, 단면화 및 순차적 IF 및 IHC 에 따라 세포 형태학의 우수한 유지 보수를 관찰했다. 단세포 수준에서 단백질 발현의 정확한 국소화를 요구하는 어플리케이션의 경우, 이 프로토콜에 설명된 바와 같이 단면도 기반 절차에 상당한 이점이 있다. 수지 내장은 초기 단계 제브라피시 배아20에서섹션에 IF 또는 IHC 검사를 수행하기위한 대안 옵션을 제공합니다. 수지 절은 저온 절에 비해 조직 형태학의 우수한 보존을 제공하고, 상대적으로 얇은 조직 섹션을 제조 할 수있다. 그러나, 제조사들은 일반적으로 면역계 분석제에 대한 수지 단면의 사용을 권장하지 않으며, 수지의 일부 성분은 단면도에서제거할 수 없고 항체 결합 부위(21)를 가릴 수 있다.
식 패턴을 정확하고 성공적으로 분석하는 데 는 프로토콜 전체가 필수적이지만 실험 성공에는 몇 가지 구체적인 단계가 중요합니다. 첫 번째 중요한 단계는 10월13,14에삽입하는 동안 배아를 처리하는 것입니다. 모든 배아에 대해 거의 동일한 영역에서 단면을 절단하도록 동일한 횡단 평면에서 각 배아의 방향을 지정하는 것이 어려울 수 있습니다. 우리는 작은 게이지 바늘을 사용하여 배아 배향을 위한 점성 OCT 매체를 통해 작고 의도적인 움직임을 수행하는 것이 너무 크고 너무 많은 OCT 매체를 대체하는 집게를 사용하는 것이 우수하다는 것을 것을을 발견했습니다. 두 번째 중요한 단계는 상당한 훈련과 경험없이 원하는 조직을 포함하는 고품질의 단면을 얻기 어려울 수 있기 때문에 냉동 블록의 절편 중에 발생합니다. 따라서 기술을 마스터할 때까지 테스트 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 세 번째 중요한 단계는 조직 샘플을 방해하거나 제거 할 수있는 커버 슬립 제거입니다. 우리는 커버 슬립을 느슨하게하고 PBS 용기에서 슬라이드를 느리게 제거하는 부드러운 교반의 조합이 커버 립을 제거하기위한 가장 효과적인 방법입니다 것으로 나타났습니다. 부드럽고 꾸준한 손이 가장 좋습니다. 연구원은 몇 가지 시행 착오가 효과적으로 커버 립을 제거하는 방법을 배울 필요가 있음을 발견 할 수있다.
프로토콜에 있는 추가 중요한 단계는 항체 최적화 (IF와 IHC 분석결과 둘 다를 위한 1 차적인 및 이차 항체) 및 염색체 기질 및 카운터스테인에 슬라이드의 노출을 포함합니다. 1 차적인 항체 특이성 및 표적 사격량에 관하여 철저한 연구는 필수적입니다; 일반적으로 IF/IHC 조합을 시작하기 전에 1차 항체 농도를 최적화하기 위해 수행될 IF 및 IHC에 대한 적어도 2개의 개별 실험에 대해 충분한 비-귀중한 샘플을 수집하는 것이 가장 좋습니다. 각 1차 항체에 대한 공지된 양성 및 음성 대조군을 포함하는 것은 IF 및 IHC 분석실험이 모두 적절히 수행되고 있는지 확인하기 위해 각 실험에서 필수적이다. 이차 항체 농도에 대한 조정도 필요할 수 있습니다. IHC 분석에 대한 발색성 기질 및 카운터스테인에 대한 조직 섹션의 노출 최적화는 제조업체 지침이 종종 광범위한 노출 시간을 설명하기 때문에 요구된다. 모든 염색체는 염색체 선택과 관련하여 신중한 계획이 필요한 카운터스테인 및 내인성 조직 색소 침착과 호환될 수 없습니다.
기재된 프로토콜에 적용될 수 있는 수많은 잠재적 수정이 있으며, IF를 위해 모두 사용될 수 없었던 다른 항체 조합으로 이 프로토콜을 성공적으로 수행했습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 발색 물질은 특정 카운터 스테인과 뚜렷한 호환성을 가지고있다. 이러한 구성 요소는 프로토콜에서 쉽게 수정할 수 있음을 발견했습니다. 부가적으로, 항체 배양에 대한 파라미터는 매우 유연하며, 원하는 염색 강도에 따라 증가 또는 감소될 수 있다. 포함 프로세스도 수정할 수 있습니다. 우리는 가로 절개에 집중하는 동안, 태아는 관심있는 특정 조직을 해결하기 위해 어떤 방향으로 쉽게 지향 될 수있다. 마지막으로 이 프로토콜에는 여러 개의 일시 중지 지점이 있습니다. 탈수된 배아는 몇 달 동안 -20°C에서 100% MeOH에 저장될 수 있다; 냉동 블록은 최대 3 개월 동안 -80 °C에서 보관 할 수 있습니다. 준비된 슬라이드는 슬라이드 박스에 최대 9개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
이 결합된 IF/IHC 프로토콜의 상대적 복잡성으로 인해 조직 품질부터 연구원 경험, 샘플 처리에 이르기까지 문제 해결이 필요할 수 있는 여러 가지 변형 또는 오류 소스가 있습니다. 위에서 설명한 대부분의 중요한 단계는 개별 사용자 수준에서 최적화가 필요하거나 특정 손재주, 기술 및 경험이 필요하기 때문에 중요한 것으로 간주됩니다. 그러나 비특이적 배경 염색과 낮은 신호 강도가 최적화를 필요로 하는 가장 중요한 문제라는 것을 발견했습니다. 모든 IF 또는 IHC 프로토콜과 마찬가지로 이러한 문제를 해결하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동이 많이 소요될 수 있으며 두 기술이 결합되기 때문에 이 방법으로 복합화될 수 있습니다. 따라서 결합된 프로토콜을 진행하기 전에 IF와 IHC를 별도로 최적화하는 것이 좋습니다.
이 방법은 광범위한 실험에 유용할 것으로 예상하지만 잠재적인 제한사항이 있습니다. 이 절차의 성공적인 성과는 수많은 세척 단계를 포함하는 2개의 순차적인 실험을 통해 손상되지 않은 조직 샘플을 유지하는 데 달려 있습니다. 이러한 이유로, 품질저하될 수 있는 오래된 슬라이드의 사용을 포함하여 단면화 또는 조직 처리 중에 발생하는 모든 문제는 연구원이 이 프로토콜을 성공적으로 수행하는 능력을 크게 제한할 것입니다. 슬라이드는 최대 9 개월 동안 -80 °C에 보관 할 수 있지만 시간이 지남에 따라 슬라이드에 대한 조직 준수가 감소하고 우리는 준비 또는 이상적으로 한 달 이내에 사용되는 슬라이드로 최고의 성공을 거두었습니다. 두 번째 제한은 제브라피시 배아의 작은 발자국입니다. 우리는 초기 단계 태아에서 상대적으로 풍부하게 표현되는 단백질을 구상하는 데 유용하다는 것을 이 실험을 발견하는 동안, 일관되게 또는 낮은 수준에서 표현되는 단백질은 단면도에서 붙잡기 아주 어려울 지도 모릅니다. 마지막으로, 프로토콜은 10\u201212 μm 저온 절을 사용하기 때문에 더 작은 하위 세포 성분보다는 핵과 같은 더 큰 구조에서 단백질 발현을 평가하는 데 가장 적합합니다.
요약하자면, 당사의 결합된 IF/IHC 프로토콜은 초기 단계 제브라피시 배아에서 다양한 연구에 유리할 것이며, 이러한 표본에서 정확한 단백질 발현 분석에서 중요한 혁신을 나타냅니다. 그림5에 성공적으로 표시된 우리의 방법은 연구원이 현재 사용 가능한 1 차 항체의 다소 제한된 범위로 작업하는 동안 저온 절에서 초기 단계 얼룩말 배아의 섬세한 형태를 보존 할 수 있게 합니다. 이 종에서 IF 또는 IHC에서 사용하기 위해 검증되었습니다. 이 프로토콜은 항체 가용성에 유사한 제한에 의해 방해되는 다른 물고기와 수륙 양용 종 (예를 들어, 메다카 및 제노푸스 종)의 연구에 유용 할 가능성이 있으며, 기존의 포유류 모델에 적용 될 수 있습니다. 잘.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부금 5K01OD021419-02및 수의학의 NC 주립 대학에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. Modern mosaic analysis in the zebrafish. Methods. 39, 228-238 (2006).
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
