Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير من Saccharomyces سيريفيسياي وخلق الخميرة بكسل الفن

Published: May 28, 2019 doi: 10.3791/59350
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 1
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

Summary

نظام كريسبر/كاس12a في تركيبة مع صفيف crRNA واحد يتيح تحرير متعددة فعالة من الجينوم S. سيريفيسياي في موضع متعددة في وقت واحد. ويتجلى ذلك من خلال بناء الكاروتينات المنتجة سلالات الخميرة التي تستخدم في وقت لاحق لخلق الخميرة بكسل الفن.

Abstract

وقد سهلت كفاءة عالية، وسهولة الاستخدام وتعدد الاستخدامات من تكرارات قصيرة متباعدة بانتظام/ كريسبر المرتبطة البروتين 9 (CRISPR / Cas9) التعديل الوراثي المتقدم من Saccharomyces سيريفيسياي، وهو نموذج الكائن الحي وحصان العمل في التكنولوجيا الحيوية الصناعية. البروتين المرتبط بـ CRISPR 12a (Cas12a)، وهو إندونوكليس موجه من الحمض النووي الريبي مع ميزات يمكن تمييزها عن Cas9 يتم تطبيقه في هذا العمل، مما يزيد من توسيع الأدوات الجزيئية لأغراض تحرير الجينوم. ومن فوائد نظام CRISPR/Cas12a أنه يمكن استخدامه في تحرير الجينوم المتعدد مع العديد من الأبعاد RNAs الإرشادية التي يتم التعبير عنها من وحدة نسخ واحدة (صفيف واحد من RNA كريسبر (crRNA). نقدم بروتوكولاً لدمج الجينات المتعددة غير المتجانسة في مكان مستقل للجينوم S. cerevisiae باستخدام نظام CRISPR/Cas12a مع crRNAs متعددة يتم التعبير عنها من بناء صفيف crRNA واحد. وتستغل الطريقة المقترحة قدرة S. cerevisiae على القيام في عملية إعادة تركيب ة في الجسم الحي لشظايا الحمض النووي لتجميع صفيف crRNA واحد في بلازميد التي يمكن استخدامها لاختيار التحويل، فضلا عن تجميع الحمض النووي المانح التسلسلات التي تندمج في الجينوم في المواقف المقصودة. Cas12a هو قبل التعبير عن هامدة، مما يسهل الانقسام من الجينوم S. سيريفيسياي في المواقف المقصودة عند التعبير عن مجموعة crRNA واحدة. ويشمل البروتوكول تصميم وبناء صفيف crRNA واحد وأشرطة التعبير الحمض النووي المانحة، ويستغل نهج التكامل الاستفادة من تسلسلموصلات الحمض النووي 50-bp فريدة من نوعها وتسلسل الحمض النووي منفصلة الجانب التكامل، الذي يبسط التصميم التجريبي من خلال التوحيد والوحدات ويوسع نطاق التطبيقات. وأخيرا، ونحن نعرض تقنية مباشرة لخلق الخميرة بكسل الفن مع معالج السائل الصوتية باستخدام الكاروتينات الملونة بشكل مختلف إنتاج سلالات الخميرة التي تم بناؤها.

Introduction

وقد أحدثت إنزيمات كريسبر/كاس ثورة بلا شك في البيولوجيا الجزيئية واعتمدت على نطاق واسع كأدوات للجينوم الهندسي بسرعة لم تكن مجدية من قبل1. وقد أبلغ ديكارلو وآخرون عن التعديل الأول للجينوم السكري من قبل نظام تحرير الجينوم CRISPR/Cas9. 2، مما يدل على نجاح الجينات بالضربة القاضية وجعل الطفرات نقطة باستخدام oligonucleotides المقدمة خارجيا. وشملت التطورات الخميرة كريسبر مربع الأدوات الأخرى: تنظيم النسخ عن طريق دمج القتلى غير النشط الحفاز Cas9 (dCas9) مع المجالات تأثير النسخ لتمكين تفعيل وإسكات النسخ3، وتطبيق لكلا تحرير الجينوم والوظائف التنظيمية لهندسة المسار الأيضي عنطريق التنشيط المتزامن، والقمع والحذف 4، حذف أجزاء كبيرة من الجينوم S. سيريفيسياي 5،والانصهارات الكروموسوم المتعددة6 .

توجد أنظمة تحرير الجينوم CRISPR/Cas أصلها في أنظمة المناعة التكيفية للبكتيريا وarchaea وقد تم تكييف هذه الأنظمة من قبل علماء الأحياء الجزيئية لتحرير الجينوم. وتستند وظائفها على متفاوتالمسافات بانتظام قصيرة Palindromic يكرر (كريسبر) مناطق الحمض النووي ترميز RNA المسؤولة عن الاعتراف الحمض النووي الأجنبي أو الحمض النووي الريبي والجينات المرتبطة كريسبر (كاس) الذي ترميز RNA-guided 1 ,7,8,9. واستنادا إلى تحليل الجينوم الأخير لأنظمة كريسبر/كاس، اقتُرح تقسيم نظم كريسبر/كاس إلى فئتين، خمسة أنواع و 16 نوعا فرعيا10. يتم تمييز الفئتين على أساس تنظيم المجمعات التأثيرية المشاركة في الانقسام المستهدف. عادة، يتم تصنيف أنظمة CRISPR/Cas مع مؤسسة متعددة الوحدات الفرعية على أنها فئة 1، في حين أن مجمعات تأثير الوحدة الفرعية الأحادية تنتمي إلى الفئة 210و11 . في هذه الورقة، ونحن استكشاف فئة 2 نوع V Cas12a، ودعا سابقا Cpf110،12، وهو بديل للفئة 2 من النوع الثاني Cas9. على الرغم من أن Cas9 يتميز بشكل جيد ويستخدم على نطاق واسع في البحوث، Cas12a يقدم ميزات إضافية12. أولا، Cas12a يشكل مجمع مع RNA كريسبر (crRNA) من 42 إلى 44 النيوكليوتيدات دون الحاجة إلى تحويل تنشيط إضافية كريسبر RNA (تراكررنا). لذلك، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي دليل أقصر في تحرير الجينوم مع أنظمة CRISPR/Cas12a مقارنة مع CRISPR/Cas9. ثانيا، فإن النشاط الفريد من الإندونوكليس وendoribonuclease من Cas12a تمكن من النضج من قبل crRNA13. يسمح هذا النشاط RNase لترميز crRNAs متعددة على صفيف crRNA كريسبر واحد، في حين يتطلب Cas9 التعبير منفصلة عن كل ما يسمى الحمض النووي الريبي دليل واحد (sgRNA) أو بدلا من ذلك على سبيل المثال التعبير عن endonuclease إضافية ( على سبيلالمثال، Csy4) في تركيبة مع زخارف الاعتراف لCsy4 المحيطة بكل sgRNA14،15. ثالثاً، يتطلب التعرف على الموقع المستهدف Cas12a عزر متجاوب (PAM) في نهاية 5'من الهدف ويشق بعد وضع +18/+23 من PAM مما أدى إلى وجود الحمض النووي المُشق مع نهايات لزجة، في حين يتطلب Cas9 وجود بام يقع على الطرف 3 من الهدف ويشق بعد موقف -3 خلق تخفيضات نهاية حادة في الحمض النووي12. رابعا، تسلسل النيوكليوتيد توافق الآراء من PAM يختلف بين Cas12a ((T)TTV) وCas9 (NGG)، مما يجعل Cas12a مرشحا واعدا لاستهداف T-الغنية المروج وتسلسل المنهي16. وأخيرا، أفادت دراسة حديثة عن خصوصية هدف أكبر لCas12a من السكان الأصليين Cas917.

نقدم بروتوكولًا لاستخدام نظام CRISPR/Cas12a لتحرير الجينوم من S. cerevisiae مع التركيز بشكل خاص على إدخال أشرطة تعبير الحمض النووي المتعددة في موضع الجينوم المستقل في وقت واحد (تحرير الجينوم المتعدد) باستخدام تحرير الجينوم المتعدد) باستخدام صفيف crRNA واحد. يتم تصوير الخطوات الرئيسية للبروتوكول في الشكل 1. وكدليل على المفهوم، طُبق نظام CRISPR/Cas12a لإدخال ثلاثة أشرطة تعبير في جينوم S. cerevisiae التي تمكن من إنتاج β-carotene18 كما هو مبين تخطيطيا في الشكل 2. إنتاج بيتا كاروتين يؤثر على النمط الظاهري من S. سيريفيسياي: أي، عند إدخال ناجح لجميع الجينات الثلاثة غير المتجانسة المطلوبة للتخليق البيولوجي الكاروتينات، وخلايا S. cerevisiae البيضاء تتحول إلى اللون الأصفر أو البرتقالي، اعتمادا على قوة التعبير من المروج كل جين. نظرا لقراءة بصرية بسيطة من هذا المسار، وقد تم إدخال لتطوير النظم المتقدمة القائمة على كريسبر وطرق لتحرير الجينوم19،20. في هذا العمل، تم بناء أشرطة التعبير ترميز الجينات الكاروتينية crtE، crtYB وcrtI باستخدام نهج استنساخ البوابة الذهبية (GGC)21 مع المروجين غير متجانسة والمنهيات متجانسة تستخدم لدفع التعبير عن الجينات. تحاط أشرطة التعبير بتسلسلات فريدة من 50 قاعدة (bp)، تسمى الموصلات، التي تسمح في التجميع في الجسم الحي مع تسلسلات الحمض النووي للجناح التكامل (المناطق المحيطة) مع نفس تسلسلات 50 نقطة أساس، والتكامل اللاحق في الحمض النووي الجيني للخميرة في الموقف الذي تحدده المناطق المحيطة بها. باستخدام نقاط قوة المروج مختلفة، تم الحصول على سلالات مع مستويات مختلفة من إنتاج الكاروتينات مما أدى إلى اختلاف في لون الخلايا. وقد استخدمت هذه السلالات - مستوحاة من "مشروع الفن الخميرة"22 - في إعداد اكتشاف مع معالج السائل الصوتية لإنشاء 4-لون عالية الدقة "صورة الخميرة" من روزاليند فرانكلين. فرانكلين (1920-1958) كان الكيميائي الإنجليزية والأشعة السينية crystallographer معروفة جيدا لمساهمتها في اكتشاف هيكل الحمض النووي من قبل الصورة 5123,24,25.

Protocol

1. إعداد بلازميدات Cas12a

ملاحظة: البلازميد الذي يحتوي على بكتيريا Lachnospiraceae ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) codon الأمثل للتعبير في S. cerevisiae, تم بناؤها سابقا19, أودعت في مستودع بلازميد (انظر الجدول المواد). هذا هو نسخة واحدة الظهارية S. سيريفيسياي/E. القولونية المكوك بلازميد يحتوي على جين علامة المقاومة KanMX للسماح لاختيار S. s. سيريفيسياي التحويلية على علم الوراثة (G418).

  1. الحصول على pCSN067 بلازميد (انظر جدول المواد).
  2. تضخيم pCSN067 بلازميد للحصول على كمية عالية.
    1. تحويل 25 درجة مئوية من الخلايا القولونية المختصة كيميائيا مع pCSN067 بلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تمييع مزيج التحول 10 و 50 مرة في 2X peptone الخميرة (PY). طبق 10X و 50x تخفيف على 2X PY لوحات أجار تحتوي على أمبيسلين (0.1 غرام / لتر) وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. اختيار 2 إلى 3 مستعمرات وتلقيح كل مستعمرة في 3 مل من 2X PY وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
    3. تنقية بلازميد باستخدام عدة تنقية بلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. إعداد كاسيت التعبير صفيف crRNA واحد

  1. إعداد صفيف crRNA واحد.
    ملاحظة: مجموعة crRNA واحدة تضم SNR52 RNA بولميراز الثالث المروج من S. سيريفيسياي2، تكرار مباشر محدد لLbCas12a وفاصل (تسلسل الهدف الجينومي)، وكرر معا لكل هدف19 وينتهي مع المنهي SUP4 من S. سيريفيسياي2. يتم تجميع مجموعة crRNA واحدة من قبل في الجسم الحي إعادة تركيبها في pRN1120 بلازميد خطي لتوليد بلازميد دائري، وبالتالي المناطق متجانسة لبلازميد pRN1120 يجب أن تكون موجودة في بداية ونهاية مجموعة crRNA واحدة (انظر الشكل 2A ). من المستحسن أن تقيّم مسبقاً وظيفة عدد من الـ crRNAs المصممة بشكل منفصل19. يتم استخدام هذه المعلومات فيما بعد لتحديد crRNAs الأكثر وظيفية لدمج هذه في تسلسل التكرار المباشر والمسافة لإنشاء صفيف crRNA واحد لغرض تعدد الإرسال.
    1. طلب صفيف crRNA واحد لتجارب تحرير الجينوم متعددة كالحمض النووي الاصطناعية (انظر تسلسل الحمض النووي لمجموعة crRNA واحدة في الجدول التكميلي 1).
    2. تضخيم مجموعة crRNA واحدة أمر (علىسبيلالمثال، باستخدام التمهيديات KC-101 و KC-102 (الجدولالتكميلي2)). إعداد مزيج تضخيم PCR الذي يحتوي على: 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي، 10 ميكرولتر من 5X العازلة المطلوبة لبوليميراز الحمض النووي، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي، 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي بتركيز 5 نانوغرام / كيلولتر وفائق النقاء H 2 O تصل إلى حجم إجمالي من 50 درجة مئوية.
      1. إجراء رد الفعل في دراجة حرارية باستخدام البرنامج التالي: '1' 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، '2' 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، '3' 60 درجة مئوية لمدة 20 ق، '4' 72 درجة مئوية لمدة 15 ق - تكرار الخطوات من '2' إلى '4' 30 مرة، '5' 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (6) عقد عند 12 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
    3. تحليل منتجات PCR عن طريق الكهربائي عن طريق تشغيل العينات على هلام أجاروز 0.8٪ في 5 V / سم لمدة 40 دقيقة باستخدام صبغتحميل الحمض النووي وسلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي في مجموعة من 100 إلى 10،000 نقطة أساس.
    4. تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. إعداد بلازميد صفيف crRNA واحد المتلقي.
    ملاحظة: يتم التعبير عن مجموعة crRNA واحدة من S. سيريفيسياي/E. القولونية مكوك بلازميد pRN112019 (انظر جدول المواد). يحتوي هذا البلازميد متعدد النسخ على جين علامة مقاومة NatMX للسماح باختيار مُغيّرات S. cerevisiae على نورسيوثرينس (NTC).
    1. الحصول على pRN1120 بلازميد.
    2. تضخيم pRN1120 بلازميد للحصول على كمية عالية.
      1. تحويل 25 درجة مئوية من الخلايا القولونية المختصة كيميائيا مع pRN1120 بلازميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تمييع مزيج التحول 10 و 50 مرة في 2X PY. طبق 10X و 50x تخفيف على 2X PY لوحات أجار تحتوي على أمبيسلين (0.1 غرام / لتر) وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      2. اختيار 2 إلى 3 مستعمرات وتلقيح كل مستعمرة في 3 مل من 2X PY وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
      3. تنقية بلازميد باستخدام عدة تنقية بلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. خطي بلازميد pRN1120 مع ECORI-HF وXhoI. لهذا، إعداد مزيج الهضم يتكون من 1 ميكروغرام من pRN1120، 5 ميكرولتر من 10X العازلة (1X العازلة يحتوي على 50 مل خلات البوتاسيوم، 20 mM تريس خلات، 10 مليون متر خلات المغنيسيوم، 100 ميكروغرام / مل بومين المصل الألبومين [BSA]؛ درجة الحموضة 7.9)، 1 ميكرولتر من ECORI-HF (20 U) ، 1 ميكرولتر من XhoI (20 U) وUltrapure H2O تصل إلى حجم إجمالي قدره 50 درجة مئوية.
    4. تحليل بلازميد خطي عن طريق الكهربائي على هلام أغاروز (0.8٪، 40 دقيقة، 5 V / سم) باستخدام صبغة تحميل الحمض النووي وسلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي في مجموعة من 100 إلى 10،000 نقطة أساس. كتحكم يتضمّن [بلازميد] دائريّة في التحليل.
    5. تنقية بلازميد الخطية باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

3. إعداد المروج-ORF-المنهي (POT) الجهات المانحة يبني الحمض النووي

  1. طلب مجموعة من المروج (P) من قوة مختلفة، وإطار القراءة المفتوح (O) وتسلسل المنهي (T) والحمض النووي الاصطناعية بحيث يحتوي كل عنصر على تسلسل اتّعب التعرف بـ 4-bp الموحد الذي تحيط به مواقع BsaI لتمكين استنساخ البوابة الذهبية ( GGC) التجميع26 (انظر التصاميم التفصيلية في الجدول التكميلي 3 والتسلسلات في الجدول التكميلي 4).
  2. تجميع أشرطة التعبير POT تتألف من المروج، إطار القراءة المفتوحة، المنهي وتسلسل الموصلات عبر تجميع 4 أجزاء باستخدام رد فعل GGC21، في متجه الوجهة التي تحتوي بالفعل على تسلسل موصلات 50-bp محددة مسبقا ( انظر الجدول التكميلي 4 والمراجع26و27).
    1. قياس تركيز أجزاء الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تمييع كل جزء من الحمض النووي في H2O فائقة النقاء إلى تركيز نهائي قدره 15 فمول/ميكرولتر.
    2. إعداد مزيج التفاعل يتكون من شظايا الحمض النووي: 2 ميكرولتر من المروج، 2 ميكرولتر من إطار القراءة المفتوح، 2 ميكرولتر من المنهي و2 ميكرولتر العمود الفقري (متجهات الوجهة من المستوى 1 كما هو موضح في 26)،4 ميكرولتر من 5x T4 DNA ligase buffer، 2.5 ميكرولتر من 1 U/μL T4 DNA Ligase ، 1.5 ميكرولتر من 20 U /μL BsaI-HF وفائقة النقاء H2O تصل إلى حجم إجمالي قدره 20 درجة مئوية.
    3. إجراء رد فعل GGC في دراجة حرارية باستخدام البرنامج التالي: '1' 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، '2' 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق - تكرار الخطوات '1' و (2) 50 مرة، (3) 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، '4' 80 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، '5' عقد عند 12 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
  3. تحويل 25 درجة مئوية من الخلايا المؤهلة كيميائيا E.القولونية28 مع 3 ميكرولتر من مزيج رد فعل GGC وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تمييع مزيج التحول 10 و 50 مرة في 2X PY. طبق 10X و 50x تخفيف على 2X PY لوحات أجار تحتوي على أمبيسلين (0.1 غرام / لتر) وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. اختيار 2 إلى 3 مستعمرات وتلقيح كل مستعمرة في 3 مل من 2X PY وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة.
  5. تنقية بلازميدات باستخدام مجموعة تنقية بلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  6. تحقق مما إذا تم تجميع أشرطة تعبير POT بشكل صحيح في رد فعل GGC بواسطة PCR.
    1. تصميم التمهيديات المكملة لتسلسل الموصل الحالي في بداية ونهاية كل كاسيت التعبير (انظر الشكل 2B). بالنسبة للموصلات المختارة في هذا البروتوكول، تستخدم المواد التمهيدية KC-103 إلى KC-108 (انظر الجدول التكميلي2).
    2. إعداد خلطات تضخيم PCR لكل بلازميد يحتوي على: 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي التدقيق، 10 ميكرولتر من 5X العازلة المطلوبة لبوليميراز الحمض النووي، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي، 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي مع تركيز أيون 5 نانوغرام/ميكرولتر، وH2O فائق النقاء يصل إلى حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر.
    3. إجراء تفاعل PCR في دراجة حرارية باستخدام البرنامج التالي: '1' 98 درجة مئوية 3 دقائق، (2) 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، (3) 60 درجة مئوية لمدة 20 ق، (4) 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة 30 ق - تكرار الخطوات من '2' إلى '4' 30 مرة، '5' 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، '6' عقد عند 12 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
      ملاحظة: تتكون منتجات PCR الناتجة من 50 نقطة أساس من موصل 5'، المروج، إطار القراءة المفتوح، المنهي و50 نقطة أساس من موصل 3"..
  7. تحليل منتجات PCR عن طريق الكهربائي عن طريق تشغيل عينات على هلام أجاروز 0.8٪ في 5 V / سم لمدة 40 دقيقة باستخدام صبغة تحميل الحمض النووي وسلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي في مجموعة من 100 إلى 10،000 نقطة أساس.

4. إعداد تسلسل الحمض النووي الجناح التكامل التي تحتوي على تسلسل الموصلات

  1. تنقية الحمض النووي الجينومي من النوع البري S. سيريفيسياي CEN.PK113-7D29.
    1. تنمو سلالة في قارورة يهز 500 مل مليئة 100 مل من الخميرة استخراج peptone سكر العنب (YEPD، 2٪ الجلوكوز) المتوسطة في 30 درجة مئوية ويهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 48 ساعة.
    2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي من 2 مل من مرق في 16،000 × غرام لمدة دقيقة واحدة وتجاهل supernatant.
    3. إعادة تعليق الخلايا في الملح الفسيولوجي (200 ميكرولتر؛ 0.85٪ محلول حمض الكلة) مع RNase (10 ميكرولتر، 10 ملغ / مل) وإنزيم الخميرة اللتيك (4 ميكرولتر). احتضان تعليق الخلية في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    4. إضافة 300 درجة مئوية من محلول اللليس الخلية (انظر جدولالمواد) ودوامة قريبا.
    5. إضافة 168 درجة مئوية من محلول هطول الأمطار البروتين (انظر جدولالمواد) ودوامة بقوة لمدة 20 ثانية.
    6. فصل كسر البروتين عن طريق الطرد المركزي في 16،000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    7. استعادة الحمض النووي عن طريق الغزل إلى أسفل في 16،000 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    8. غسل بيليه مع 200 درجة مئوية من الإيثانول (70٪). الطرد المركزي في 16،000 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق وإزالة supernatant. يتبخر الإيثانول عن طريق احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق مع فتح الغطاء.
      ملاحظة: إذا كان السائل في الأنبوب لا يزال مرئياً كرر الخطوة 4.1.8. لا تجف بيليه لمدة أطول من 10 دقيقة لمنع انخفاض ذوبان الحمض النووي.
    9. حل الحمض النووي في 50 درجة مئوية من عازل TE. تخزين الحمض النووي النقي في 4 درجة مئوية.
  2. بالنسبة لكل موقع تكامل، تسلسل الحمض النووي لجناح تكامل التصميم (حوالي 500 نقطة في الثانية) بحيث تتم إزالة حوالي 1000 نقطة أساس من الحمض النووي الجينومي عند إدخال الحمض النووي للجهة المانحة (انظر التصميم التخطيطي في الشكل 2B والتسلسلات في الملحق الجدول4).
  3. تصميم التمهيديات لتوليد المناطق المحيطة بها من قبل PCR.
    1. بالنسبة للمنطقة المحيطةاليسرى، تصميم التمهيديات الأمامية والعكسية لتضخيم ما يقرب من 500 نقطة أساس من منطقة الحمض النووي الجينومي المتمركزة 5' (اليسار) من موقع التكامل موضع الاهتمام.
      ملاحظة: يتضمن التمهيدي الأمامي 20 نقطة أساس من الهومولوجيا مع المنطقة المحيطة المقصودة. يتضمن التمهيدي العكسي 20 نقطة أساس مع الهومولوجيا مع المنطقة المحيطة المقصودة ويحتوي على تسلسل موصل 50 نقطة أساس المطلوب لتمكين في تجميع الجسم الحي في تحرير Cas12a على الجينوم في وقت لاحق.
    2. للمنطقة المحيطة اليمنى،وتصميم التمهيديات إلى الأمام وعكس لتضخيم ما يقرب من 500 نقطة أساس من منطقة الحمض النووي الجينومي المتمركزة 3 ' (يمين) من موقع التكامل من الفائدة.
      ملاحظة: يتضمن التمهيدي الأمامي 20 نقطة أساس مع الهومولوجيا مع المنطقة المحيطة المقصودة ويحتوي على تسلسل موصل 50 نقطة أساس المطلوب لتمكين في تجميع الجسم الحي في تحرير Cas12a على الجينوم في وقت لاحق. يتضمن التمهيدي العكسي 20 نقطة أساس من الهومولوجيا مع المنطقة المحيطة المقصودة.
  4. تضخيم المناطق المحيطة بالمواد التمهيدية المصممة (علىسبيلالمثال، المواد التمهيدية KC-109 إلى KC-120 المرفقة في الجدول التكميلي2).
    1. قياس تركيز الحمض النووي الجينومي النقي الذي سيكون بمثابة القالب في PCR. ضبط تركيز الحمض النووي إلى 50 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. إعداد خلطات تضخيم PCR المكونة من الحمض النووي الجيني (1 - 4 ميكرولتر من 50 نانوغرام/ميكرولتر من تخفيف الحمض النووي الجينومي) النقية في الخطوة 4.1، التمهيدي الأمامي والعكسي (10 ميكرومتر لكل منهما)، 1 ميكرولتر من 10 mM dNTPs، 10 ميكرولتر من 5X العازلة المطلوبة للبوليميراز الحمض النووي، 0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (1.0 U) ، وفائقة النقاء H2O تصل إلى حجم إجمالي من 50 درجة مئوية.
    3. إجراء PCRs في دراجة حرارية باستخدام البرنامج التالي: '1' 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، '2' 98 درجة مئوية لمدة 20 ق، '3' 60 درجة مئوية لمدة 20 ق، '4' 72 درجة مئوية لمدة 15 ق، كرر الخطوات من '2' إلى '4' 30 مرة، '5' 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، '6' عقد عند 12 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.
  5. تحليل منتجات PCR عن طريق الكهربائي على هلام أغروس 0.8٪ في 5 V / سم لمدة 40 دقيقة باستخدام صبغة تحميل الحمض النووي وسلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي في مجموعة من 100 إلى 10،000 نقطة أساس.
  6. تنقية المنتجات PCR الصحيح باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

5. التحول إلى S. سيريفيسياي

ملاحظة: إجراء التحويل باستخدام بروتوكول استناداً إلى الأساليب التي تم تطويرها من قبل Gietz وآخرون. (1995) 30 وهيل وآخرون. 31 التي يمكن استخدامها لسلالات مختلفة من S. سيريفيسياي. البروتوكول الموضح أدناه كافٍ للتحول 1.

  1. إعداد الحلول اللازمة للتحول.
    1. إعداد حلول المخزون التالية وتعقيم التصفية: 10x TE العازلة التي تحتوي على 100 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 7.5)، 10 MM EDTA، الحجم الإجمالي من 50 مل؛ 1 M LiAc في الحموضة 7.5، حجم إجمالي قدره 50 مل؛ 50٪ PEG 4000، وحجم إجمالي 100 مل.
      ملاحظة: تحقق دائماً من أن سهم PEG 4000 في درجة الحموضة 5. لا ينبغي تخزين هذا المخزون لفترة أطول من شهر واحد.
    2. إعداد الحلول التالية باستخدام الأسهم: إعداد LiAc-TE الحل الذي يحتوي على 0.1 M LiAc، 10 MM Tris-HCl، 1 MM EDTA، الحجم الإجمالي من 0.5 مل. إعداد PEG-LiAc-TE الحل الذي يحتوي على 40٪ PEG 4000، 0.1 M LiAc، 10 MTs-HCl، 1 M EDTA، الحجم الإجمالي من 1 مل.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان للتحول الناجح أن يتم إعداد حلول PEG-LiAc-TE و LiAc-TE حديثًا.
  2. أول جولة التحول (إعداد سلالة قبل التعبير Cas12a).
    ملاحظة: في كافة خطوات التحويل، استخدم الماء مع درجة الحموضة أعلى من 5. من المستحسن استخدام المياه المنزوعة المعادن في جميع خطوات التحول.
    1. إعداد ما قبل الثقافة عن طريق تزايد سلالة CEN. PK113-7D في قارورة هزة 100 مل تحتوي على 20 مل من YEPD (2٪ الجلوكوز) المتوسطة وحضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع هز في 250 دورة في الدقيقة.
    2. قياس OD600 من ما قبلالثقافة (OD PC). حساب عامل التخفيف (df) بين حجم ما قبل الثقافة وحجم المتوسطة الطازجة اللازمة لإعداد الخلايا التي تعبر مسبقا Cas12a لاستخدامها في التحول (ثقافة التحول). في الحسابات تفترض الكثافة البصرية لثقافةالتحول (OD TC) لتكون 1.0 بعد خطوة الحضانة الموصوفة في 5.2.3 (ti).
      Equation 1
      حيث تي وتي هي وقت الحضانة ومضاعفة الوقت، على التوالي.
      1. حساب حجم ما قبل الثقافة(Vط)المطلوبة لتلقيح ثقافة التحول (VTC)على أساس عامل التخفيف.
        Equation 2
    3. إعداد ثقافة التحول عن طريق تلقيح 20 مل من YEPD(2٪ الجلوكوز) (VTC)مع حجم ما قبل الثقافة المحددة في الخطوة السابقة (Vط). حضانة في 30 درجة مئوية مع هز في 250 دورة في الدقيقة.
    4. قياس OD600 من ثقافة التحول حتى يتم التوصل إلى OD600 من 1.0.
    5. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي من مرق 20 مل في 2500 × ز لمدة 5 دقائق. كرر خطوة الطرد المركزي والحفاظ على بيليه الخلية.
    6. إعادة تعليق الخلايا في 100 درجة مئوية من محلول LiAc-TE ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    7. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل واحد الذين تقطعت بهم السبل (10 ملغ / مل السلمون الحيوانات المنوية الحمض النووي) ومزيج عن طريق الأنابيب.
    8. ماصة 1 ميكروغرام من بلازميد pCSN067 إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي لخليط الحمض النووي 100 ميكرولتر لمنع انخفاض كفاءة التحويل.
    9. إضافة 600 درجة مئوية من حل PEG-LiAc-TE ومزيج من الأنابيب. حضانة لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية في حين تهتز في 450 دورة في الدقيقة في كتلة الحرارة أعلى الجدول.
    10. إضافة 70 ميكرولتر من DMSO (100٪) إلى خليط التحول ومزيج من الأنابيب. قم بتسخين الصدمات عن طريق احتضان خليط التحويل عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حمام مائي.
    11. استعادة الخلايا عن طريق نقل الخليط إلى أنبوب أسفل جولة 15 مل وإضافة 10 مل من YEPD (2٪ الجلوكوز) إلى الأنبوب. حضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع هز في 250 دورة في الدقيقة.
    12. طرد مركزي مزيج التحول في 2500 × ز لمدة 5 دقائق.
    13. لوحة من 150 درجة مئوية من مزيج التحول وتخفيف 20X في YEPD (2٪ الجلوكوز) من مزيج التحول على YEPD (2٪ الجلوكوز) لوحات أجار تستكمل مع 0.2 غرام / لتر G418. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 - 72 ساعة.
    14. اختيار تحويل واحد وإعادة خط على YEPD (2٪ الجلوكوز) لوحة أجار تستكمل مع 0.2 غرام / لتر G418 للحصول على مستعمرات واحدة.
  3. جولة التحول الثانية (إجراء تحرير الجينوم متعددة مع كريسبر / Cas12a).
    1. إعداد ما قبل الثقافة عن طريق زيادة سلالة قبل التعبير Cas12a، التي تم إنشاؤها في جولة التحول الأول (الخطوة 5.2)، في قارورة يهز 100 مل تحتوي على 20 مل من YEPD (2٪ الجلوكوز) المتوسطة تستكمل مع 0.2 غرام / لتر G418. حضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع هز 250 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: للحصول على تحويلات متعددة، قم بتكييف حجم ما قبل الثقافة.
    2. اتبع الخطوات 5.2.2 إلى 5.2.7 لجولة التحويل الأولى.
      ملاحظة: للحصول على تحويلات متعددة، قم بتكييف وحدات تخزين الحلول المطلوبة وثقافة الضغط الذي سبق التعبير عنه Cas12a.
    3. ماصة 1 ميكروغرام من صفيف crRNA واحد، 1 ميكروغرام من بلازميد المتلقي الخطي لصفيف crRNA، 1 ميكروغرام من الحمض النووي المانح و1 ميكروغرام من كل منطقة محيطة (الخطوة 4.3) في أنبوب الطرد المركزي الصغير.
      ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي لخليط الحمض النووي 100 ميكرولتر لمنع انخفاض كفاءة التحويل.
    4. إعداد عناصر التحكم التالية للتحول: التحكم السلبي (Ultrapure H2O)؛ السيطرة الإيجابية لتحديد كفاءة التحول (1 ميكروغرام من pRN1120 الدائري)؛ عنصر تحكم يتحقق إذا تم إدخال الحمض النووي للجهة المانحة عن طريق تحرير كريسبر (1 ميكروغرام من pRN1120 الدائري، و1 ميكروغرام من جميع أشرطة التعبير الحمض النووي للمانحين و1 ميكروغرام من المناطق المحيطة ولكن لا يوجد صفيف crRNA واحد)؛ مراقبة التحقق مما إذا كان يمكن دمج الحمض النووي للجهة المانحة خارج الهدف (1 ميكروغرام من pRN1120 الخطي، و1 ميكروغرام من أشرطة التعبير الحمض النووي للجهة المانحة و1 ميكروغرام من صفيف crRNA واحد ولكن لا توجد مناطق محيطة)؛ عنصر تحكم يتحقق من الخطية الكاملة لـ pRN1120 (1 ميكروغرام من pRN1120 الخطي).
    5. اتبع الخطوات 5.2.9 إلى 5.2.12 لجولة التحويل الأولى.
    6. طبق 150 درجة مئوية من مزيج التحول و20x تخفيف في YEPD (2٪ الجلوكوز) من مزيج التحول على YEPD (2٪ الجلوكوز) أجار تستكمل مع 0.2 غرام / لتر G418 و 0.2 غرام / لتر NTC. لوحة خارج الضوابط على YEPD (2٪ الجلوكوز) أجار تستكمل مع اختيار المناسبة (G418 و / أو NTC أو أي اختيار). احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 - 72 ساعة.
    7. اختيار تحويل لون واحد وإعادة خط على YEPD (2٪ الجلوكوز) لوحة أجار للحصول على مستعمرات ملونة واحدة.

6- تقييم كفاءة تحرير الجينوم

  1. عد عدد المستعمرات الملونة والمستعمرات البيضاء على لوحات التحول.
  2. حساب كفاءة تحرير الجينوم عن طريق قسمة عدد المستعمرات الملونة على العدد الإجمالي للمستعمرات (البيضاء والملونة)، كما هو موضح في الجدول 1.

7- تأكيد إدماج الحمض النووي للجهات المانحة في المكان المقصود

  1. إعادة خط مستعمرة واحدة ملونة من لوحة التحول على YEPD (2٪ الجلوكوز) لوحة أجار دون G418 وNTC اختيار وحضانة لمدة 48 ساعة في 30 درجة مئوية.
  2. اختيار مستعمرة واحدة وتلقيح قارورة هزة 500 مل مليئة 100 مل من YEPD (2٪ الجلوكوز) المتوسطة. حضانة لمدة 48 ساعة في 30 درجة مئوية وتهتز في 250 دورة في الدقيقة.
  3. عزل الحمض النووي الجينومي كما هو موضح في القسم 4.1.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم بروتوكول لإعداد الخميرة للمستعمرة PCR المقترحة سابقا من قبل Looke وآخرون. 32- وفي هذه الحالة، يمكن تخطي النمو في الوسائط السائلة (القسم 7-2).
  4. تحقق من التكامل الصحيح عن طريق تضخيم جزأين لكل كاسيت تعبير متكامل.
    1. تصميم المواد التمهيدية التي من صلب إلى الحمض النووي الجينومي خارج المناطق المحيطة التي تحولت وجين الاهتمام (انظر الأمثلة في الجدول التكميلي2، KC-121 إلى KC-132). عند استخدام التمهيديات KC-121 إلى KC-132، تعيين درجة حرارة الصلب في برنامج PCR إلى 62 درجة مئوية.
    2. توسيع نطاق الاهتمام كما هو موضح في القسم 4-4-2. تكييف برنامج PCR، على وجه التحديد ضبط وقت خطوة التمديد في PCR وفقا لطول القالب وتوصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي.
  5. تحقق من حجم منتجات PCR عن طريق الكهربائي على هلام أغاروز (0.8٪، 40 دقيقة، 5 V / سم) باستخدام صبغة تحميل الحمض النووي وسلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي في مجموعة من 100 إلى 10،000 نقطة أساس.

8. إنشاء الخميرة بكسل الفن باستخدام معالج السائل الصوتية

  1. إعداد قالب صورة لفن بكسل الخميرة.
    1. تغيير حجم صورة RGB الأصلية (220 × 280 بكسل، راجع النتائج التمثيلية)، على سبيل المثال باستخدام ImageJ لإنشاء صورة نهائية 64 × 96 بكسل (العرض × الارتفاع) صورة رمادية النطاق تصورها بالألوان المقصودة (النتائج التمثيلية).
    2. تحويل صورة RGB إلى مقياس رمادي باستخدام هذه الصيغة:
      Equation 3
      حيث أناgr, أناص، أناز، أناب هي الكثافات الرمادية والحمراء والخضراء والزرقاء ، على التوالي.
    3. من أجل تصنيف بكسل، وتطوير البرنامج المساعد ImageJ تطبيق القواعد التالية: (أ) إذا كنتgr هو ≤ 64، واستخدام الخميرة البرتقالية الداكنة (سلالة 1، الجدول التكميلي3) لهذا بكسل. (ب) إذا كان 64 < Igr ≤ 128، استخدم الخميرة البرتقالية (سلالة 2، الجدول التكميلي3) لهذا البكسل. (ج) إذا استخدم 128 و 122 غرام ≤ 192 الخميرة الصفراء (سلالة 3، الجدول التكميلي3) لهذا البكسل. (د) إذا كنتغرام > 192، استخدم الخميرة البيضاء (CEN. PK113-7D) لهذا البكسل.
  2. بقعة خلايا الخميرة لخلق الخميرة بكسل الفن.
    1. تلقيح 500 مل يهز قوارير تحتوي على 100 مل من YEPD (2٪ الجلوكوز) المتوسطة مع ثلاثة كاروتينويد الملونة بشكل مختلف إنتاج سلالة S. سيريفيسياي ونوع البرية CEN. PK113-7D. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع هز في 250 دورة في الدقيقة.
    2. نقل 0.5 مل من الثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب مليئة 0.5 مل من المعقمة غير الأيونية كثافة التدرج المتوسطة (انظر جدول المواد). مزيج من دوامة لفترة وجيزة.
    3. نقل تعليق الخلية إلى خزان مؤهل، 2 × 3 جيدا. قم باكتشاف باستخدام أداة معالج سائل صوتي من لوحة مصدر خزان مؤهلة إلى لوحة ميكروبل (انظر جدولالمواد) تحتوي على 50 مل من أجار يبد (2٪ الجلوكوز). لتبسيط الطلاء، وتحديد الآبار على لوحة، على سبيلالمثال. استخدام لوحة صغيرة كلوحة جيدة 6144 (64 × 96).
    4. بقعة 25 nL من كل سلالة S. سيريفيسياي من 2X 3 لوحة مصدر خزان جيدا باستخدام ملف .csv مع إعداد معايرة السوائل 6RES_AQ_GPSA2 على لوحة الوجهة. تعريف كل من هذه قطرات nL 25 كبكسل في شبكة 64 × 96 التي تترجم إلى مواقف الآبار (A01، B01، C01 الخ.).
    5. حضانة ميكروبليت في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. لتكثيف ألوان سلالات تخزين لوحة أجار في 4 درجة مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل.

Representative Results

وقد تجلى بروتوكول لتحرير الجينوم متعددة باستخدام CRISRP / Cas12a من خلال بناء ثلاثة سلالات الكاروتينات المنتجة S. سيريفيسياي التعبير عن crtE، crtYB وcrtI الجينات باستخدام المروجين غير متجانسة من قوة عالية ومتوسطة ومنخفضة: سلالة 1 و 2 و 3 على التوالي (الجدولالتكميلي3). ويتطلب بناء هذه السلالات توليد ثلاثة أشرطة لتعبير الحمض النووي للمانحين وست مناطق محيطة لكل سلالة لاستهداف ثلاثة مواقع مختلفة في الحمض النووي الجيني (كما هو مبين في الشكل 2باء). كما هو موضح هنا، تم تجميع المروج، إطار القراءة المفتوح، المنهي واثنين من تسلسل موصلات 50-bp متجاورة في كاسيت التعبير عبر رد فعل استنساخ البوابة الذهبية وتم التحقق من التجميع من قبل PCR (الشكل3A). تم طلب مجموعة crRNA واحدة كجزء من الحمض النووي الاصطناعية وتضخيمها من قبل PCR (الشكل3B). وقد تم خطي بلازميد المتلقي لصفيف crRNA واحد (بلازميد pRN1120) مع ECORI-HF وXhoI وأكد الخطية بواسطة الكهربائي (الشكل3C). ويرد في الجدول التكميلي 3 والجدول التكميلي 4تسلسل اتّباع اشرطة التعبير عن الحمض النووي للجهات المانحة والمناطق المحيطة بها. ويرد تسلسل أشرطة تعبير صفيف crRNA المفرد في الجدول التكميلي1. تم اختبار وظائف الفواصل المضمنة في صفيف crRNA واحد مسبقا ً عن طريق تحرير الجينوم singleplex مع crRNAs الفردية19.

تم تقييم كفاءة تحرير الجينوم باستخدام Cas12a أولاً على أساس عدد المستعمرات الملونة التي تم الحصول عليها بعد التحول (الجدول1، الشكل4). وتراوحت كفاءة تحرير السلالات الثلاث المبنية بين 50% و94%. وتجدر الإشارة إلى أن إدخال أشرطة التعبير المستخدمة لتوليد سلالة 1 عرض أدنى كفاءةالتحرير، وربما بسبب طبيعة الحمض النووي المانح (أي، أشرطة التعبير هذه ترميز crtE، crtYB وcrtI من ثلاثة المروجين قوة عالية). ثانياً، تم تأكيد التكامل الصحيح لأشرطة التعبير الحمض النووي الثلاثة للمتبرعينفي الموقع المقصود على الحمض النووي الجينومي من قبل PCR (الشكل 5). وقد صُممت المواد التمهيدية بحيث يتم الحصول على منتجات الـ PCR عند حدوث التكامل الصحيح للحمض النووي للجهات المانحة في المكان المقصود. لكل تجربة تحويل، تم اختيار ثماني مستعمرات من لوحة التحويل واختبارها (لاحظ أن ثلاثة فقط معروضة في الشكل5). بشكل عام، من بين 8 مستعمرات تم اختبارها لكل DNA المانح، تم تأكيد التكامل الصحيح للحمض النووي للمتبرع crtE في موضع INT1، crtYB في موضع INT2 وcrtI في موضع INT3 في >90٪ من التحولات. توضح هذه النتائج نظام CRISPR/Cas12a في تركيبة مع صفيف crRNA واحد يتيح تحرير متعدد الفعالية من جينوم S. cerevisiae في موضع متعددة في وقت واحد.

بالإضافة إلى ذلك، نقوم بإظهار إنشاء "فن بكسل الخميرة" باستخدام سلالات إنتاج الكاروتينويد الثلاثة التي تم بناؤها جنبا إلى جنب مع سلالة غير ملونة من نوع البرية. بدءا من صورة بالأبيض والأسود من روزاليند فرانكلين (الشكل6A)، صورة 4 ألوان (الشكل6ب) وقائمة اكتشاف تم إنشاؤها التي استخدمت بعد ذلك لبقعة سلالات الخميرة الأربعة المختلفة على ميكروبلايت أجار باستخدام معالج السائل الصوتية، مما أدى إلى عالية الدقة "الخميرة اللوحة" من فرانكلين روزاليند (الشكل6C، D،E).

Figure 1
الشكل 1 سير العمل من بروتوكول كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير في S. سيريفيسياي. يتضمن سير العمل خطوات هامة للطريقة المعروضة. وللاطلاع على التفاصيل، انظر البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 مخطط تحرير الجينوم متعدد المضاعفات CRISPR/Cas12a باستخدام صفيف crRNA واحد. (أ) تتكون صفيفة crRNA واحدة من ثلاث وحدات crRNAs في شكلها ناضجة، وتكرار مباشر 20 نقطة أساس محددة لLbCas12a (المربعات الرمادية) مع تسلسل دليل 23 نقطة أساس (الماس الملون). يتم تمكين التعبير عن صفيف crRNA بواسطة المروج SNR52 و المنهي SUP4. تحويل S. سيريفيسياي مع pRN1120 الخطية وواحد crRNA صفيف التعبير كاسيت يحتوي على الهومولوجيا مع pRN1120 (خطوط قطري) يسمح لإعادة تركيب في الجسم الحي في بلازميد دائري في الخلايا التي تعبر مسبقا LbCas12a. تتم معالجة صفيف crRNA واحد فيما بعد بواسطة Cas12a. (B) يتم توجيه Cas12a إلى المواقع المستهدفة الجينية INT1 وINT2 وINT3 وinT3 وتخلق فواصل مزدوجة تقطعت بهم السبل. في خليط التحول، تم تضمين الحمض النووي المانح المكون من المناطق المحيطة وكاسيت التعبير الجيني الكاروتينويد. استهدفت جمعيات الحمض النووي المانحة إلى امتداد واحد من الحمض النووي في الحمض النووي الجينومي حول INT1(crtE),INT2(crtYB)و INT3(crtI)loci by in vivo recombination by the presence of 50-bp homologous connectors sequences, (أ) يشار إليها على أنها 5، ألف، باء، جيم، دال أو E. P1-P3، المروجين المختلفين؛ T1-T3، منهيون مختلفون. تم تعديل هذا الرقم من Verwaal وآخرون 201819. البنى الوراثية المعروضة باستخدام البيولوجيا الاصطناعية الرموز البصرية (SBOL)40. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 PCR التحقق من تجارب تحرير الجينوم. (أ) التحقق من تفاعلات استنساخ البوابة الذهبية من أشرطة الحمض النووي للمانحين المجمعة. النتائج التي تم الحصول عليها تتفق مع الأطوال المتوقعة. (B) PCR من مجموعة crRNA واحدة. (C) خطية pRN1120 بلازميد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 لوحات من S. التحولات سيريفيسياي باستخدام نهج تحرير الجينوم متعددة. (أ) سلالة 1 التعبير عن crtE، crtYB وcrtI من ثلاثة المروجين قوية (مستعمرات البرتقال الداكن). (ب) سلالة 2 التعبير عن crtE، crtYB وcrtI من ثلاثة المروجين قوة متوسطة (مستعمرات البرتقال). (C) سلالة 3 التعبير عن crtE، crtYB وcrtI من ثلاثة المروجين قوة منخفضة (المستعمرات الصفراء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 PCR التحقق من دمج أشرطة التعبير الحمض النووي المانحة في المكان المقصود داخل الحمض النووي الجينومي. (أ) التحقق من ثلاث مستعمرات من سلالة 1. (ب) التحقق من ثلاث مستعمرات من سلالة 2. (ج) التحقق من ثلاث مستعمرات من سلالة 3. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 الخميرة بكسل الفن من فرانكلين روزاليند. (A) صورة RGB بالأبيض والأسود من 220 × 280 بكسل من روزاليند فرانكلين التي تم استخدامها كقالب. (B) تحويل الكمبيوتر من الصورة بالأبيض والأسود من فرانكلين روزاليند إلى 4 ألوان 64 × 96 بكسل قائمة. (C) صورة من الخميرة بكسل الفن مع 64 × 96 مستعمرات الخميرة مع قسم التكبير. (د) صورة لمعالج سائل صوتي مع طبقين كاملين. (E) صورة لميكروبليت نمت كاملة مع 64 × 96 مستعمرات الخميرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سلالة 1 سلالة 2 سلالة 3
مستعمرات ملونة 16 سنة 279 220
مستعمرات بيضاء 16 سنة 18 سنة 18 سنة
مجموع المستعمرات 32 297 238
الكفاءه 50 في المائة 94 في المائة 92 في المائة

الجدول 1: كفاءة تحرير نهج تحرير الجينوم المتعدد.

سلسلة صفيف crRNAa,b,c,d,e,f
CATGTTTGACAGCATATCGATAATCCAGCAGCGTGGCGGTGTGTGTGTAACTGTGTGT TCTTTGAAAA
GATAATATATGCGTACTCATATTACATACAACTGTGTGTTTTCTCTCTCGTGTGTTTATACAAGG
تجاتاكاتجيتججاجااككاتكاتجاتتتاجتاجكجج جحجتاج جتاج
TTTTTTCACCACTACAATGTTCTGTGTATAAAAAAGATTGTGTGTGTGTGT
ATGTTTGTGCGTGTGTAACTTCTCCGGTGAAAGATAATCAATTTACTAAGTGTAGAT
CTGGTGTGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGtGTGTATGTGCCGTAC
دول مجلس التعاونالخليجي
TTTTTGTTTTTGTCTGGGGCCCGGTAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG
GTTAATCCCTTGGtAATGTGTGTGTGTTTGTGTGTGT
أ. الهوماولوجيا إلى pRN1120 (جريئة).
ب. SNR52 المروج (مائل).
(ج) التسلسلات الجينية المستهدفة (مسطرة).
د. دليل يكرر مباشرة محددة لLbCas12a (مائل، جريئة).
ه. SUP4 المنهي (مائل).
و. الهوماولوجيا إلى pRN1120 (جريئة).

الجدول التكميلي 1: صفيف crRNA واحد لLbCas12a يحتوي على الهومولوجيا مع pRN1120 بلازميد.

اسم تسلسلأ الوصف(ب) تستخدم في نقطة
KC-101 CATGTTTGACAGCTTATCATC FW التمهيدي لتضخيم مجموعة crRNA واحدة 2-1-4
KC-102 في الفرنسيّة RV التمهيدي لتضخيم مجموعة crRNA واحدة 2-1-4
KC-103 AAGCGACTTCCAATTTTTGC دليل يُعدّ لتضخيم الحمض النووي للمتبرعين مع الموصل 5 3-6-1
KC-104 في هذا الـ40من RV التمهيدي لتضخيم الحمض النووي المانح مع موصل A 3-6-1
KC-105 CGGATCGGTACACAACCG دليل يُبيّن لتضخيم الحمض النووي للجهة المانحة مع الموصل B 3-6-1
KC-106 CAACAGGaggCGGATATAC RV التمهيدي لتضخيم الحمض النووي المانح مع موصل C 3-6-1
KC-107 في هذا الـ10 من هذا العام دليل يُبيّن لتضخيم الحمض النووي للجهة المانحة مع الموصل D 3-6-1
KC-108 AGGTACAACAAGGACCG RV التمهيدي لتضخيم الحمض النووي المانح مع موصل E 3-6-1
KC-109 CACTATAGCAATCTATATG دليل مهاجم لتضخيم INT1 5 'مع موصل 5 4.4
KC-110 AAACGCCTGTGTGTGTTAC
TGGATATGCAAAGCGATTGGAA
GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC
فى الرّاطسة		 RV التمهيدي لتضخيم INT1 5 'مع موصل 5 4.4
KC-111 TTGCCCATCGAACGTACAAG
TACTCCTCTGTCTCTCTTTTTTTT
TGCTTTAAGCGTGAAGTTTC
TTTG		 دليل مهاجم لتضخيم INT1 '3' مع موصل A 4.4
KC-112 TGTCAACTGGAGAGCTATCG RV التمهيدي لتضخيم INT1 '3' مع موصل A 4.4
KC-113 أغاجاتتكتيتكايك دليل مهاجم لتضخيم INT2 '5' مع موصل B 4.4
KC-114 TGCTAGattGTGTGTT
TGGGTAGTGTGTGTACAT
CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC
TGGTTG		 RV التمهيدي لتضخيم INT2 '5' مع موصل B 4.4
KC-115 فى هذا العنونة
GACCACAGTATCCCCGCCT
CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG
GTGG		 دليل مهاجم لتضخيم INT2 '3' مع موصل C 4.4
KC-116 TCTCCTCTTCGATGACCGG RV التمهيدي لتضخيم INT2 3 'مع موصل C 4.4
KC-117 GTTGTGTGCATTG مزود بدليل للتضخيم من INT3 '5' مع موصل D 4.4
KC-118 GCGAAtGGCGGAACGG
اكاكانججاتاكت
GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG
فى الانجليزية		 RV التمهيدي لتضخيم INT3 '5' مع موصل D 4.4
KC-119 AAATAACCACAACATCCTT
في هذا الـ401
GTACCTGATGGGACGTCACT
GTAC		 FW التمهيدي لتضخيم INT3 '3' مع موصل E 4.4
KC-120 GAGCTTAATATTC RV التمهيدي لتضخيم INT3 '3' مع موصل E 4.4
KC-121 GTTACTAACTAACTGTG دليل FW للتحقق من دمج con5-crtE-conA إلى INT1 5' 7-4-1
KC-122 CACTGCTAACTGTTTTC دليل FW للتحقق من دمج con5-crtE-conA إلى INT1 3' 7-4-1
KC-123 في ما يُمْكُنُ أُمْرْمْ دليل FW للتحقق من دمج conB-crtYB-conC إلى INT2 5' 7-4-1
KC-124 GTCTCCAGCTGATGTCC دليل FW للتحقق من دمج conB-crtYB-conC إلى INT2 3' 7-4-1
KC-125 المركز دليل FW للتحقق من دمج conD-crtI-conE إلى INT3 5' 7-4-1
KC-126 GATCGGTCAATGTGAAG دليل FW للتحقق من دمج conD-crtI-conE إلى INT3 3' 7-4-1
KC-127 CCTTGTAGTAGGTCC RV التمهيدي للتحقق من التكامل con5-crtE-conA إلى INT1 5 ' 7-4-1
KC-128 فى هذا العنونة RV التمهيدي للتحقق من التكامل con5-crtE-conA إلى INT1 3 ' 7-4-1
KC-129 CTGGCAGTTGACAATTGC RV التمهيدي للتحقق من دمج conB-crtYB-conC إلى INT2 5 ' 7-4-1
KC-130 فى هذا العنونة RV التمهيدي للتحقق من دمج conB-crtYB-conC إلى INT2 3 ' 7-4-1
KC-131 CCTTACCTTGGAGCAG RV التمهيدي للتحقق من التكامل conD-crtI-conE إلى INT3 5 ' 7-4-1
KC-132 في ما إذا كان هذا هو الوقت الذي تم التوصل إلى هذا RV التمهيدي للتحقق من التكامل conD-crtI-conE إلى INT3 3 ' 7-4-1
أ. تشير التسلسلات الغامقة إلى تسلسلات الموصل.
ب. يتم تعيين التمهيديات الأمامية والعكسية على أنها FW وRV، على التوالي.

الجدول التكميلي 2: التسلسلات التمهيدية.

Supplementary Table 3
الجدول التكميلي 3: تصميم السلالات المشيدة.

Supplementary Table 4
الجدول التكميلي 4: تسلسلأشرطة تعبير الحمض النووي للجهات المانحة ومناطق التساقط. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

يصف البروتوكول المقدم تحرير الجينوم المتعدد من S. cerevisiae باستخدام Cas12a من بكتيريا Lachnospiraceae ND2006 في تركيبة مع صفيف crRNA واحد والحمض النووي المانح. يتم شرح تصميم مجموعة crRNA واحدة والحمض النووي للجهة المانحة بالتفصيل. على النقيض من نظام كريسبر / Cas9 الراسخة، وCRISPR / Cas12a لديه قدرة إضافية فريدة من نوعها لمعالجة crRNAs متعددة أعرب عنها من مجموعة crRNA واحدة13،33. ونظرًا لهذه الميزة، يكون من الأسهل إعداد التحرير المتزامن لأهداف متعددة ويمكن تحقيقه في تحويل واحد. وقد أظهر هذا النهج صفيف crRNA واحد من قبل Zetsche وآخرون. 34 الذين حرروا في وقت واحد ما يصل إلى أربعة جينات في خلايا الثدييات باستخدام AsCas12a، وسويات وآخرون. 35 الذين أدخلوا أربع شظايا الحمض النووي في جينوم الخميرة باستخدام FnCas12a. على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن عدد أكبر من التعديلات الجينية المتزامنة باستخدام نظام Cas12a ولم يتم بعد تحديد الحد الأقصى للأهداف لكل صفيف واحد لCas12a. مزيد من البحوث باستخدام صفائف crRNA واحدة في تركيبة مع Cas12a يتضمن تنظيم النسخ متعددة في مجموعة واسعة من الكائنات الحية33،36،37.

هناك بعض الخطوات الهامة في البروتوكول المعروض. تصميم بعناية جميع تسلسلات الحمض النووي التي تشارك في تجربة تحرير الجينوم Cas12a، وخاصة في حالة إدخال تسلسل الحمض النووي الجديد. تحديد وظيفة تسلسلات فاصلة جديدة جزء من crRNA، على سبيل المثال من خلال تجربة تحرير الجينوم singleplex كما هو موضح من قبل Verwaal وآخرون. 19 قبل الجمع بينهما في مجموعة crRNA واحدة. اتبع التوصيات لإعداد حلول التحول العازلة المستخدمة في تجربة تحرير Cas12a لتحقيق كفاءة تحويل جيدة من الخميرة.

هناك بعض التعديلات الاختيارية لهذه التقنية. من المستحسن استخدام 1 ميكروغرام من كل DNA المانح، الخطيpRN1120 أو واحد crRNA صفيف التعبير كاسيت في التحول، على الرغم من أن استخدام كمية الحمض النووي أقل من المتوقع أيضا أن يؤدي إلى كفاءة التحول مرضية. إجراء تحويل اختبار لتحديد ما إذا كان يمكن استخدام كميات الحمض النووي أقل. يمكن إجراء تحويل S. cerevisiae باستخدام طريقة مختلفة عن الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول، على سبيل المثال البروتوكول الذي وصفه Gietz وآخرون. (2007) 38.دليل RNA المتلقي بلازميد pRN1120 هو مناسبة للتعبير عن crRNA واحد ومجموعة crRNA واحدة من مختلف المتغيرات Cas12a (علىسبيل المثال، من Acidaminococcus spp. BV3L6 أو فرانسيسيلا novicida U112) وكذلك للتعبير عن sgRNA في تركيبة مع Cas919. ولا يلزم أن يقتصر الحمض النووي للجهة المانحة على أشرطة التعبير الجيني الكاروتينية والمناطق المحيطة التي تستهدف الحمض النووي للجهات المانحة إلى مواقع INT1 وINT2 وINT3 الموصوفة في الحمض النووي الجيني. ويمكن إدخال أي حمض نووي ذي أهمية، بطريقة متعددة، في الحمض النووي الجيني للمضيف من خلال مبادئ التصميم الموصوفة في هذا البروتوكول، أو بدلاً من ذلك يمكن استخدام الحمض النووي للمانحين لحذف الحمض النووي من الجينوم المضيف. هيكل وحدات من مجموعة crRNA واحدة يسهل سهولة التكيف من فاصل وتسلسل تكرار مباشر. ويسمح تعديل تسلسلات الحيز بإحداث تغيير في موضع التكامل المقصود الذي يمكن تصميمه بواسطة إحدى الأدوات لتحديد موقع هدف جيني، مثل برنامج GuideScan 1.039. فبدلاً من استخدام تسلسلات محيطية كبيرة تحتوي على تسلسلات موصلات، يمكن إدراج 50 نقطة أساس للمنطقة المحيطة في تسلسلات الحمض النووي للجهات المانحة عن طريق إدراج هذه التسلسلات المحيطة بالمنطقة التي تبلغ 50 نقطة أساس في المواد التمهيدية المستخدمة في PCR. في هذه الحالة، في المجموع، هناك حاجة فقط ثلاثة بدلا من تسعة أجزاء الحمض النووي المانحة لتجربة تحرير الجينوم متعددة الناجحة.

وباختصار، يوفر هذا البروتوكول توجيهات خطوة بخطوة لإجراء تحرير الجينوم المتعدد في S. cerevisiae باستخدام Cas12a في تركيبة مع نهج صفيف crRNA واحد. وقد تجلى البروتوكول في تحرير الجينوم المتعدد باستخدام 9 أجزاء من الحمض النووي للمانحين وترميز صفيف crRNA واحد لثلاث مرات. نعرض ترددات تحرير عامة عالية تتراوح بين 50% و94% لتصاميم السلالة الثلاثة التي تم الإبلاغ عنها هنا. ختاما، والسمة الفريدة من Cas12a هو القدرة على معالجة مجموعة crRNA واحدة في crRNAs الفردية في الخلية، مما يجعل Cas12a أداة ممتازة لتمكين تحرير الجينوم متعددة وتطوير وحدات التنظيم النسخي التي تستهدف متعددة أشرطة التعبير في واحد على سبيل العمل. في النهاية، تم الحصول على ثلاث سلالات تنتج الكاروتينات على مستوى مختلف والألوان في ظلال بين الأصفر والبرتقالي. مع تلك السلالات وسلالة من نوع البرية، أظهرنا كيف يمكن استخدام معالج السائل الصوتية مباشرة لجعل الخميرة بكسل الفن - وهذا تكريما لروزاليند فرانكلين الذي ساهم في اكتشاف هيكل الحمض النووي قبل 65 عاما من قبل صورتها الشهيرة 5123< /c1>.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ وجود تضارب في المصالح. وقد أودع المؤلفون الملكية الفكرية المتعلقة بالأساليب المقدمة.

Acknowledgments

تلقى هذا المشروع تمويلاً من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاق المنحة رقم 686070 (DD-DeCaf) و764591 (SynCrop)، ومن برنامج البحث "لبنات الحياة" الذي يحتوي على رقم المشروع 737.016.005 من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي. وقد حظيت هذه الوظيفة بدعم من الجمعية الملكية (منحة UF160357) وشركة BrisSynBio، وهي مركز بحوث البيولوجيا التركيبية التابع لـ BBSRC/EPSRC (grant BB/L01386X/1). نشكر زي دي وجيفري فان فيك على مساهمتهما في تجارب اكتشاف الخميرة لخلق الفن بكسل الخميرة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018 Electrophoresis
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl) New England BioLabs R353L Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer New England BioLabs B7204S Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma Aldrich D1626 Transfromation of
S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs Invitrogen 10297018 PCRs
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis Merck 100983 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid Sigma Aldrich ED Transformation of
S. cerevisiae
G418 disulfate salt Sigma Aldrich A1720 Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz Sigma Aldrich D2158  Yeast pixel art
Isopropanol Merck 100993 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate Sigma Aldrich L6883 Transformation of
S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain Sigma Aldrich 1494 Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells New England BioLabs C3019H Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin Jena Bioscience AB102 Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer New England BioLabs M0530L PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530L PCRs
Polyethylene glycol 4000 Merck 7490 Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye New England BioLabs B7024S Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix Thermo Fisher Scientific AM2286 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer Invitrogen 46300-018 Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl) Invitrogen 1705218 Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500 Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit Promega A9282 Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol New England BioLabs R0146S Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) Zymo Research E1006 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer Zymo Research E1004-B Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar Plate growth of E. coli
2*PY medium Cultivation of E. coli
Demineralized water Transformation of
S. cerevisiae
ELFO buffer Electrophoresis
MQ Multiple steps
Physiological salt solution Transformation of
S. cerevisiae
TE buffer Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar Plate growth of
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067 Addgene ID 101748 https://www.addgene.org/
pRN1120 Addgene ID 101750 https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN.PK113-7D		 EUROSCARF collection http://www.euroscarf.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  2. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  3. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  4. Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system. Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).
  5. Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).
  6. Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
  10. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).
  11. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), (2016).
  12. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  13. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  14. Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).
  15. Ferreira, R., et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).
  16. Swarts, D. C., Martin, J. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).
  17. Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).
  18. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  19. Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).
  20. Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).
  21. Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3 (11), 3647 (2008).
  22. Yeast Art project. , Available from: http://www.yeastart.org (2018).
  23. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  24. Watson, J. D., Crick, F. H. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 171, 737-738 (1953).
  25. Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature. 171, 738-740 (1953).
  26. Young, E. M., et al. Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast. Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).
  27. Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. Cloning Method. , WO2013144257 (2013).
  28. Mandel, M., Higa, A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).
  29. Van Dijken, J. P., et al. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).
  30. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).
  31. Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).
  32. Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).
  33. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  34. Zetsche, B., et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).
  35. Swiat, M. A., et al. FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).
  36. Li, L., et al. CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces. Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell Discovery. 3, 17018 (2017).
  38. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).
  39. Perez, A. R., et al. GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design. Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).
  40. Cox, R. S., et al. Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0. Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 147، كريسبر/كاس12a، كريسبر/Cpf1، كريسبر/كاس9، تحرير الجينوم المتعدد، Saccharomyces cerevisiae،الخميرة بكسل الفن
كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير من <em>Saccharomyces سيريفيسياي</em> وخلق الخميرة بكسل الفن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski,… More

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski, T. E., Roubos, J. A., Verwaal, R. CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art. J. Vis. Exp. (147), e59350, doi:10.3791/59350 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter