Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering av Saccharomyces cerevisiae og opprettelse av gjær pixel art

Published: May 28, 2019 doi: 10.3791/59350
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 1
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

Summary

CRISPR/Cas12a-systemet i kombinasjon med en enkelt crRNA-matrise muliggjør effektiv multiplex redigering av S. cerevisiae -Genova på flere Loci samtidig. Dette er demonstrert ved å konstruere karotenoid produsere gjær stammer som senere brukes til å lage gjær piksel kunst.

Abstract

Høy effektivitet, brukervennlighet og allsidighet av gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner/CRISPR-assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet har tilrettelagt avansert genetisk modifisering av Saccharomyces cerevisiae, en modell organisme og arbeidshest i industriell bioteknologi. CRISPR-assosiert protein 12a (Cas12a), en RNA-styrt endonuclease med funksjoner som kan skilles fra Cas9 brukes i dette arbeidet, og videre utvide den molekylære verktøykasse for bruk i Genova. En fordel av CRISPR/Cas12a system er det alt den kan brukes inne multiplex Genova redigere bort med mangfoldig guide RNAs uttrykt fra en enkelt transcriptional enhet (enkelt CRISPR RNA (crRNA) oppstille). Vi presenterer en protokoll for multiplex integrering av flere heterologous gener i uavhengige Loci av S. cerevisiae Genova ved hjelp av CRISPR/Cas12a system med flere crRNAs uttrykt fra en enkelt crRNA array konstruere. Den foreslåtte metoden utnytter evnen til S. cerevisiae å utføre in vivo rekombinasjon av DNA-fragmenter å montere singelen crRNA array i en plasmider som kan brukes til transformant utvalg, samt montering av donor DNA sekvenser som integreres i Genova ved tiltenkte posisjoner. Cas12a er pre-uttrykt constitutively, tilrettelegge kløft av S. cerevisiae Genova på de tiltenkte stillingene ved uttrykk for singelen crRNA array. Protokollen omfatter design og bygging av en enkelt crRNA array og donor DNA-uttrykk kassetter, og utnytter en integrerings tilnærming som gjør bruk av unike 50-BP DNA-kontakter sekvenser og egen integrasjon flanke DNA-sekvenser, noe som forenkler eksperimentell design gjennom standardisering og Modularisering og utvider utvalget av applikasjoner. Til slutt viser vi en grei teknikk for å lage gjær pixel kunst med en akustisk flytende handler med forskjellig fargede karotenoid produsere gjær stammer som ble konstruert.

Introduction

CRISPR/CAS enzymer har utvilsomt revolusjonert molekylærbiologi og vært allment vedtatt som verktøy for Engineering genomer med en hastighet som tidligere var unfeasible1. Det for det første modifisering av en Saccharomyces cerevisiae Genova av det CRISPR/Cas9 Genova redigere bort system var rapportere av DiCarlo et al. 2, demonstrere vellykket gen knock-out og gjøre punkt mutasjoner bruker eksternt innført oligonukleotider. Videre gjær CRISPR verktøykasse utviklingen inkludert: transcriptional regulering av fusjon av katalytisk inaktive døde Cas9 (dCas9) med transcriptional effektor domener for å muliggjøre aktivering og deaktivering av transkripsjon3, søknad for både Genova redigering og regulatoriske funksjoner for metabolske banen Engineering ved samtidig aktivering, undertrykking og sletting4, sletting av store fragmenter fra S. cerevisiae Genova5, og flere-kromosom fusjoner6 .

CRISPR/CAS Genova redigering systemer finner sin opprinnelse i adaptive immun systemer av bakterier og Archaea og disse systemene har blitt tilpasset av molekylær biologer for Genova redigering. Deres funksjonalitet er basert på gruppert regelmessig oppdelt Short Palindromic gjentar (CRISPR) DNA regioner koding RNA ansvarlig for anerkjennelse av det utenlandske DNA eller RNA og CRISPR tilhørende gener (CAS) som koder RNA-guidet endonucleases1,7,8,9. Basert på de siste Genova analyse av CRISPR/CAS systemer ble det foreslått å dele CRISPR/CAS systemer i to klasser, fem typer og 16 under typer10. De to klassene skilles basert på organiseringen av effektor komplekser involvert i mål kløften. Vanligvis kategoriseres CRISPR/CAS-systemer med en multi-delenhet organisasjon som klasse 1, mens enkelt delenhet effektor komplekser tilhører klasse 210,11. I dette dokumentet, Utforsker vi klasse 2 type V Cas12a, tidligere kalt Cpf110,12, som er et alternativ til klasse 2 type II Cas9. Selv om Cas9 er godt preget og mye brukt i forskning, Cas12a tilbyr flere funksjoner12. For det første danner Cas12a et kompleks med CRISPR RNA (crRNA) på 42 til 44 nukleotider uten å kreve ytterligere trans-aktivering CRISPR RNA (tracrRNA). Derfor kan en kortere guide RNA benyttes i Genova redigering med CRISPR/Cas12a systemer sammenlignet med CRISPR/Cas9. For det andre, den unike endonuclease og endoribonuclease aktivitet av Cas12a muliggjør modning av sin pre-crRNA13. Dette RNase aktivitet tillater koding av flere crRNAs på en enkelt CRISPR crRNA array, mens Cas9 krever separate uttrykk for hver såkalte single-guide RNA (sgRNA) eller alternativt for eksempeluttrykk for en ekstra endonuclease ( f. eksCsy4) i kombinasjon med anerkjennelse motiver for Csy4 rundt hver sgRNA14,15. For det tredje, Cas12a mål sted gjenkjennelse behøver en protospacer tilstøtende motiv (PAM) for det 5 ' end fra målet og kløyver etter det 18/+ 23 holdning fra dens PAM resulterer inne kløyvde DNA med klebrig ender, mens Cas9 behøver en PAM lokalisert på 3 ' end fra det mål og kløyver etter at-3 posisjon skaper sløv ende kutt i DNA12. Det fjerde, er konsensus nukleotid sekvensen av PAM forskjellig mellom Cas12a ((T) TTV) og Cas9 (NGG), som gjør Cas12a en lovende kandidat for målretting T-rik promoter og Terminator sekvenser16. Endelig, en fersk studie rapportert større mål spesifisitet for Cas12a enn for de innfødte Cas917.

Vi presenterer en protokoll for bruk av CRISPR/Cas12a system for Genova redigering av S. cerevisiae med et spesielt fokus på innføring av flere DNA-uttrykk kassetter i uavhengige genomisk Loci samtidig (multiplex Genova redigering) ved hjelp en enkelt crRNA array. De viktigste trinnene i protokollen er avbildet i figur 1. Som et bevis på konseptet ble CRISPR/Cas12a systemet søkt om innføring av tre uttrykk kassetter i Genova av S. cerevisiae som muliggjør produksjon av β-karoten18 som skjematisk vist i figur 2. Produksjon av β-karoten påvirker fenotype av S. cerevisiae: dvs, etter vellykket innføring av alle tre heterologous gener som kreves for karotenoider biosyntesen, den hvite S. cerevisiae celler blir gule eller oransje, avhengig av uttrykket styrke hvert gen promoter. På grunn av den enkle visuelle lese-ut av denne veien, har det blitt innført for å utvikle avanserte CRISPR-baserte systemer og metoder for Genova redigering19,20. I dette arbeidet, uttrykks kassetter koding av karotenoid gener crtE, crtYB og crtI har blitt bygget ved hjelp av en Golden Gate kloning (GGC) tilnærming21 med heterologous arrangører og homologe terminatorer brukes til å lede uttrykk for genene. Uttrykket kassetter er omgitt av unike 50-base par (BP) sekvenser, kalt kontakter, som tillater in vivo forsamling med integrering flanke DNA-sekvenser (flankerer regioner) med samme 50-BP sekvenser, og påfølgende integrering inn i genomisk DNA av gjær på posisjonen bestemmes av flankerer regioner. Ved å bruke ulike promoter styrker, ble stammer med ulike nivåer av karotenoider produksjon oppnådd resulterer i variasjon i fargen på cellene. Disse stammer-inspirert av "gjær Art Project"22 -ble brukt i en spotting oppsett med en akustisk flytende handler å lage en 4-fargers høyoppløselig "gjær fotografi" av Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kjemiker og X-ray crystallographer kjent for sitt bidrag til oppdagelsen av DNA-strukturen ved bilde 5123,24,25.

Protocol

1. utarbeidelse av Cas12a plasmider

Merk: plasmider som inneholder Lachnospiraceae bakterien ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) Codon optimalisert for uttrykk i S. cerevisiae, ble tidligere bygget19, avsatt på et plasmider Depot (se tabellen over Materialer). Dette er en enkelt-kopi episomal s. cerevisiae/E. coli shuttle plasmider inneholder en KanMX motstand markør genet å tillate for valg av S. cerevisiae transformants på geneticin (G418).

  1. Skaff deg pCSN067-plasmider (se tabell over materialer).
  2. Forsterk pCSN067-plasmider for å oppnå et høyt beløp.
    1. Transformer 25 μL av kjøpte kjemisk kompetente E. coli celler med plasmider pCSN067 henhold til produsentens protokoll. Fortynne transformasjonen Mix 10 og 50 ganger i 2x peptone-gjær (PY). Plate ut 10x og 50x fortynninger på 2x PY agar plater inneholder Ampicillin (0,1 g/L) og ruge over natten ved 37 ° c.
    2. Plukk 2 til 3 kolonier og vaksinere hver koloni i 3 mL 2x PY og vokser over natten ved 37 ° c i en risting inkubator ved 180 RPM.
    3. Rens plasmider ved hjelp av et plasmider rensesett i henhold til produsentens anvisninger.

2. utarbeidelse av enkelt crRNA array uttrykk kassett

  1. Klargjør én crRNA-matrise.
    Merk: singelen crRNA array består av en SNR52 RNA polymerase III promoter fra S. cerevisiae2, en direkte gjenta spesifikke for LbCas12a og en spacer (genomisk mål sekvens), sammen gjentas for hvert mål19 og ender med en SUP4 Terminator fra S. cerevisiae2. Singelen crRNA array er montert av in vivo rekombinasjon inn i linearized plasmider pRN1120 å generere en sirkulær plasmider, og dermed regioner homologe til plasmider pRN1120 må være til stede ved starten og slutten av enkelt crRNA array (se figur 2a ). Det anbefales å på forhånd evaluere funksjonaliteten til en rekke utformet crRNAs separat19. Denne informasjonen brukes senere til å velge de mest funksjonelle crRNAs for å kombinere disse i direkte repetisjons-og avstands sekvenser for å opprette en enkelt crRNA-matrise for multipleksing formål.
    1. Bestill singelen crRNA array for multiplex Genova redigering eksperimenter som syntetisk DNA (se DNA sekvensen av singelen crRNA array i supplerende tabell 1).
    2. Forsterk den bestilte enkelt crRNA array (f.eks.ved bruk av primere KC-101 og KC-102 (tilleggs tabell 2)). Forbered PCR forsterknings blandingen som inneholder: 0,5 μL av DNA-polymerase, 10 μL av 5x buffer som er nødvendig for DNA-polymerase, 1 μL av 10 mM dNTPs, 2,5 μL av 10 μM fremover primer, 2,5 μL på 10 μM omvendt primer, 2 μL DNA-mal ved en konsentrasjon på 5 ng/μL og ultrarent H 2 andre priser O opp til et total volum på 50 μL.
      1. Utfør reaksjonen i en thermocycler ved hjelp av følgende program: (i) 98 ° c i 3 min, (II) 98 ° c i 10 s, (III) 60 ° c i 20 s, (IV) 72 ° c i 15 s-Gjenta trinn (II) til (IV) 30 ganger, (v) 72 ° c i 5 min (vi) Hold ved 12 °
    3. Analysere PCR produkter ved elektroforese ved å kjøre prøvene på en 0,8% agarose gel på 5 V/cm for 40 min ved hjelp av en DNA lasting fargestoff og DNA stige med DNA-fragmenter i en rekke 100 til 10 000 BP.
    4. Rens PCR-produkter ved hjelp av en PCR rensing kit i henhold til produsentens anvisninger.
  2. Forbered enkelt crRNA array-mottaker plasmider.
    Merk: singelen crRNA array er uttrykt fra S. cerevisiae/E. coli shuttle plasmider PRN112019 (se tabell over materialer). Denne multi-kopi plasmider inneholder en NatMX motstand markør genet å tillate valg av S. cerevisiae transformants på NOURSEOTHRICIN (NTC).
    1. Skaff deg pRN1120-plasmider.
    2. Forsterk pRN1120-plasmider for å oppnå et høyt beløp.
      1. Transformer 25 μL av kjøpte kjemisk kompetente E. coli celler med plasmider pRN1120 henhold til produsentens protokoll. Fortynne transformasjonen Mix 10 og 50 ganger i 2x PY. Plate ut 10x og 50x fortynninger på 2x PY agar plater inneholder Ampicillin (0,1 g/L) og ruge over natten ved 37 ° c.
      2. Plukk 2 til 3 kolonier og vaksinere hver koloni i 3 mL 2x PY og vokser over natten ved 37 ° c i en risting inkubator ved 180 RPM.
      3. Rens plasmider ved hjelp av et plasmider rensesett i henhold til produsentens anvisninger.
    3. Linearize plasmider pRN1120 med Ecori-HF og XhoI. For dette, utarbeide en fordøyelse blanding bestående av 1 mikrogram pRN1120, 5 μL av 10x buffer (1x buffer inneholder 50 mM kalium acetate, 20 mM Tris, 10 mM magnesium acetate, 100 μg/mL storfe serum albumin [BSA]; pH 7,9), 1 μL av Ecori-HF (20 U) , 1 μL av Xhoi (20 U) og ultrarent H2O opp til et total volum på 50 μL. ruge fordøyelsen Mix ved 37 ° c for 2 H og Deaktiver ved 65 ° c i 20 min.
    4. Analyser linearized plasmider ved elektroforese på en agarose gel (0,8%, 40 min., 5 V/cm) ved hjelp av en DNA-lasting fargestoff og DNA stige med DNA-fragmenter i en rekke 100 til 10 000 BP. Som en kontroll inkluderer en sirkulær plasmider i analysen.
    5. Rens linearized plasmider ved hjelp av et PCR rensesett i henhold til produsentens anvisninger.

3. utarbeidelse av promoter-ORF-Terminator (POT) donor DNA-konstruksjoner

  1. Bestill et sett med promoter (P) av forskjellig styrke, åpen lese ramme (O) og Terminator (T) sekvenser som syntetisk DNA slik at hvert element inneholder standardiserte 4-BP anerkjennelse sekvenser som er flankert av BSAjeg nettsteder Slik aktiverer Golden Gate kloning ( GGC) montering26 (se detaljerte utforminger i tilleggs tabell 3 og sekvenser i supplerende Tabell 4).
  2. Monter POT uttrykk kassetter bestående av en promoter, åpen lese ramme, Terminator og kontakter sekvenser via en 4-del montering ved hjelp av en GGC reaksjon21, i en destinasjon vektor som allerede inneholder pre-spesifiserte 50-BP kontakter sekvenser ( se supplerende tabell 4 og referanser26,27).
    1. Mål konsentrasjonen av DNA-deler ved hjelp av en spektrofotometer. Fortynne hver DNA-del i ultrarent H2O til en endelig konsentrasjon på 15 Fmol/μL.
    2. Forbered en reaksjons miks bestående av DNA-fragmenter: 2 μL av arrangøren, 2 μL av åpen lese ramme, 2 μL av Terminator og 2 μL ryggrad (nivå 1 destinasjons vektorer som beskrevet i 26), 4 μL av 5X T4 DNA ligase buffer, 2,5 μL av 1 U/ΜL T4 DNA-ligase , 1,5 μL av 20 U/μL BSAi-HF og ultrarent H2O opp til et total volum på 20 μL.
    3. Utfør GGC-reaksjonen i en thermocycler ved hjelp av følgende program: (i) 37 ° c i 2 min, (II) 16 ° c i 5 min – Gjenta trinn (i) og (II) 50 ganger, (III) 50 ° c for 60 min, (IV) 80 ° c for 45 min., (v) Hold ved 12 ° c inntil videre analyse.
  3. Transformer 25 μL av kjøpte kjemisk kompetente E. coli28 celler med 3 μL av GGC reaksjons miks i henhold til produsentens protokoll. Fortynne transformasjonen Mix 10 og 50 ganger i 2x PY. Plate ut 10x og 50x fortynninger på 2x PY agar plater inneholder Ampicillin (0,1 g/L) og ruge over natten ved 37 ° c.
  4. Plukk 2 til 3 kolonier og vaksinere hver koloni i 3 mL 2x PY og vokser over natten ved 37 ° c i en risting inkubator ved 180 RPM.
  5. Rens plasmider ved hjelp av et plasmider rensesett i henhold til produsentens anvisninger.
  6. Sjekk om POT uttrykks kassetter ble montert riktig i GGC reaksjonen ved PCR.
    1. Design primere komplementær til kontakten sekvensen stede ved starten og slutten av hver uttrykks kassett (se figur 2b). For koblinger valgt i denne protokollen, bruk primere KC-103 til KC-108 (se tilleggs tabell 2).
    2. Forbered PCR-forsterkning for hver plasmider som inneholder: 0,5 μL av polymerase, 10 μL av 5x buffer som er nødvendig for DNA-polymerase, 1 μL av 10 mM dNTPs, 2,5 μL av 10 μM fremover primer, 2,5 μL med omvendt primer på 10 μM, 2 μL av DNA-mal med en concentrat 5 ng/μL, og ultrarent H2O opp til et total volum på 50 μL.
    3. Utfør PCR-reaksjonen i en thermocycler ved hjelp av følgende program: (i) 98 ° c 3 min, (II) 98 ° c i 10 s, (III) 60 ° c for 20 s, (IV) 72 ° c i 2 min 30 s – Gjenta trinn (II) til (IV) 30 ganger, (v) 72 ° c i 5 min , (vi) Hold ved 12 ° c inntil videre analyse.
      Merk: resulterende PCR-produkter består av 50-BP av 5-kontakten, promoter, åpen lese ramme, Terminator og 50-BP på 3-kontakten.
  7. Analysere PCR produkter ved elektroforese ved å kjøre prøver på en 0,8% agarose gel på 5 V/cm for 40 min ved hjelp av en DNA lasting fargestoff og DNA stige med DNA-fragmenter i en rekke 100 til 10 000 BP.

4. utarbeidelse av integrering flanke DNA-sekvenser som inneholder kontakter sekvenser

  1. Rens genomisk DNA fra vill type S. cerevisiae Centre PK113-7d29.
    1. Vokse belastningen i en 500 mL riste kolbe fylt med 100 mL gjærekstrakt peptone druesukker (YEPD, 2% glukose) medium ved 30 ° c og risting ved 250 RPM for 48 timer.
    2. Høste cellene ved sentrifugering av 2 mL buljong ved 16 000 x g i 1 min og kast supernatanten.
    3. Resuspend cellene i fysiologisk salt (200 μL; 0,85% NaCl oppløsning) med RNase (10 μL, 10 mg/mL) og gjær lytisk enzym (4 μL). Ruge celle fjæringen ved 37 ° c i 15 minutter.
    4. Tilsett 300 μL av cellelyse oppløsning (se tabell over materialer) og Vortex kort tid.
    5. Tilsett 168 μL av protein nedbør løsning (se tabell over materialer) og Vortex kraftig i 20 s.
    6. Skill protein fraksjonen ved å sentrifugering ved 16 000 x g og 4 ° c i 10 min. Collect 600 μL av supernatanten i et nytt rør og bland med 600 μL av isopropanol og Vortex kort tid.
    7. Komme seg DNA ved å spinne ned på 16 000 x g ved romtemperatur i 10 min. kast supernatanten og hold pellet.
    8. Vask pellet med 200 μL av etanol (70%). Sentrifuger ved 16 000 x g ved romtemperatur i 10 min og fjern supernatanten. Fordampe etanol ved å incubating røret ved romtemperatur i 10 minutter med lokket åpnet.
      Merk: Hvis væsken i slangen fortsatt er synlig, gjentar du trinn 4.1.8. Ikke tørk pellet i mer enn 10 minutter for å hindre redusert løselighet av DNA.
    9. Oppløse DNA i 50 av TE-buffer. Oppbevar renset DNA ved 4 ° c.
  2. For hver integrering området, design integrasjon flanken DNA-sekvenser (ca. 500 BP) slik at ca 1000 bp av genomisk DNA vil bli fjernet ved innføring av donor DNA (se skjematisk design i figur 2b og sekvenser i supplerende Tabell 4).
  3. Design primere for å generere flankerer regioner av PCR.
    1. For venstre flankerer regionen, design fremover og omvendt primere å forsterke ca 500 BP av genomisk DNA regionen plassert 5 ' (venstre) av integreringen stedet av interesse.
      Merk: den fremre primer inkluderer 20 BP av homologi med den tiltenkte flankerer regionen. Omvendt primer inneholder 20 BP med homologi med den tiltenkte flankerer regionen og inneholder ønsket 50-BP kontakt sekvens for å aktivere in vivo forsamlingen i Cas12a redigering på Genova senere.
    2. For høyre flankerer regionen, design fremover og omvendt primere å forsterke ca 500 BP av genomisk DNA-regionen plassert 3 ' (høyre) av integreringen stedet av interesse.
      Merk: frem primer inkluderer 20 BP med homologi med den tiltenkte flankerer regionen og inneholder ønsket 50-BP kontakt sekvens for å aktivere in vivo forsamlingen i Cas12a redigering på Genova senere. Omvendt primer inkluderer 20 BP av homologi med den tiltenkte flankerer regionen.
  4. Forsterk de flankerer regionene med designet primere (f. eks, primere KC-109 til KC-120 vedlagt i supplerende tabell 2).
    1. Mål konsentrasjonen av renset genomisk DNA som vil tjene som mal i PCR. Juster DNA-konsentrasjonen til 50 ng/μL.
    2. Forbered PCR forsterkning mikser sammensatt av genomisk DNA (1 – 4 μL av 50 ng/μL genomisk DNA-fortynning) renset i trinn 4,1, forover og bakover primer (10 μM hver), 1 μL av 10 mM dNTPs, 10 μL av 5x buffer som kreves for DNA-polymerase, 0,5 μL av DNA-polymerase (1,0 U) og ultrarent H2O opptil total volum på 50 μL.
    3. Utfør PCRene i en thermocycler ved hjelp av følgende program: (i) 98 ° c i 3 min, (II) 98 ° c for 20 s, (III) 60 ° c for 20 s, (IV) 72 ° c for 15 s, Gjenta trinn (II) til (IV) 30 ganger, (v) 72 ° c i 5 min , (vi) Hold ved 12 ° c inntil videre analyse.
  5. Analysere PCR produkter ved elektroforese på en 0,8% agarose gel på 5 V/cm for 40 min ved hjelp av en DNA lasting fargestoff og DNA stige med DNA-fragmenter i en rekke 100 til 10 000 BP.
  6. Rens riktige PCR-produkter ved hjelp av et PCR rensesett i henhold til produsentens anvisninger.

5. transformasjon til S. cerevisiae

Merk: Utfør transformasjon ved hjelp av en protokoll basert på metodene utviklet av Gietz et al. (1995) 30 og Hill et al. 31 som kan brukes til ulike stammer av S. cerevisiae. Protokollen som er beskrevet nedenfor, er tilstrekkelig for 1 transformasjon.

  1. Klargjør løsninger som kreves for transformasjon.
    1. Klargjør følgende lager løsninger og filter sterilisering: 10x TE-buffer som inneholder 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, totalt volum på 50 mL; 1 M LiAc ved pH 7,5, totalt volum på 50 mL; 50% PEG 4000, totalt volum på 100 mL.
      Merk: Sjekk alltid at PEG 4000 lager er ved pH 5. Denne aksjen bør ikke lagres lenger enn en måned.
    2. Klargjør følgende løsninger ved hjelp av aksjer: Forbered LiAc-TE løsning som inneholder 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, totalt volum på 0,5 mL. Forbered PEG-LiAc-TE løsning som inneholder 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, totalt volum på 1 mL.
      Merk: det er avgjørende for en vellykket transformasjon av at PEG-LiAc-TE og LiAc-TE-løsninger er ferskt tilberedt.
  2. Første transformasjon runde (forberede belastningen pre-uttrykker Cas12a).
    Merk: i alle transformasjon trinnene, bruke vann med en pH høyere enn 5. Det anbefales å bruke demineralisert vann i alle trinnene i transformasjonen.
    1. Forbered en pre-kultur ved å vokse belastning Centre. PK113-7D i en 100 mL riste kolbe som inneholder 20 mL YEPD (2% glukose) medium og ruge over natten ved 30 ° c med risting ved 250 RPM.
    2. Mål OD600 av pre-KULTUREN (ODPC). Beregn fortynning faktor (DF) mellom volumet av pre-kultur og volumet av friskt medium som kreves for utarbeidelse av cellene pre-uttrykker Cas12a skal brukes i transformasjonen (transformasjon kultur). I beregningene forutsetter at den optiske tettheten til transformerings kulturen (ODTC) blir 1,0 etter inkubasjons trinnet som er beskrevet i 5.2.3 (ti).
      Equation 1
      der ti og τ er inkubasjonstid og dobling tid, henholdsvis.
      1. Beregn volumet av pre-kulturen (vi) kreves for inoculation av transformasjon kultur (vTC) basert på fortynning faktor.
        Equation 2
    3. Forbered transformasjon kultur ved inoculation av 20 mL YEPD (2% glukose) (VTC) med volumet av pre-kulturen bestemmes i forrige trinn (vi). Ruge ved 30 ° c med risting ved 250 RPM.
    4. Mål OD600 av transformasjon kultur til en OD600 av 1,0 er nådd.
    5. Høste cellene ved sentrifugering av 20 mL buljong ved 2 500 x g i 5 min. forkaste supernatanten og vaske cellene i 20 ml romtemperatur demineralisert vann. Gjenta sentrifugering trinnet og hold celle pellet.
    6. Resuspend cellene i 100-μL av LiAc-TE-løsning og Overfør til et mikrosentrifugen rør.
    7. Tilsett 5 μL av enkelt-strandet bære DNA (10 mg/mL lakse sæd DNA) og bland med pipettering.
    8. Pipetter 1 mikrogram plasmider pCSN067 til mikrosentrifugen røret.
      Merk: det totale volumet av DNA-blandingen bør ikke overstige 100 μL for å hindre en lavere transformasjon effektivitet.
    9. Tilsett 600 μL av PEG-LiAc-TE-løsning og bland med pipettering. Ruge i 30 min ved 30 ° c mens du rister ved 450 RPM i en bordplate varme blokk.
    10. Tilsett 70 μL av DMSO (100%) til transformasjon blandingen og bland av pipettering. Utfør varme sjokk ved å incubating i transformerings blandingen ved 42 ° c i 15 minutter i et vannbad.
    11. Gjenopprett cellene ved å overføre blandingen til en 15 mL rund bunn tube og tilsett 10 mL YEPD (2% glukose) til slangen. Ruge over natten ved 30 ° c med risting ved 250 RPM.
    12. Sentrifuger transformasjonen Mix ved 2 500 x g i 5 min. kast supernatanten og resuspend celle pellet i ca. 200 μL av gjenværende oppløsning.
    13. Plate ut 150 μL av transformasjon mix og en 20x fortynning i YEPD (2% glukose) av transformasjon Mix på YEPD (2% glukose) agar plater supplert med 0,2 g/L G418. Ruge platene ved 30 ° c for 48 – 72 timer.
    14. Velg en enkelt transformant og re-stripe på en YEPD (2% glukose) agar plate supplert med 0,2 g/L G418 å få enkelt kolonier.
  3. Andre transformasjon runde (utføre multiplex Genova redigering med CRISPR/Cas12a).
    1. Forbered en pre-kultur ved å vokse belastningen pre-uttrykker Cas12a, opprettet i den første transformasjonen runde (trinn 5,2), i en 100 mL riste kolbe inneholder 20 mL YEPD (2% glukose) medium supplert med 0,2 g/L G418. Ruge over natten ved 30 ° c med risting 250 RPM.
      Merk: for flere transformasjoner, tilpasse volumet av pre-kulturen.
    2. Følg trinnene 5.2.2 til 5.2.7 for den første transformasjonen runden.
      Merk: for flere transformasjoner, tilpasse volumene av nødvendige løsninger og kultur av belastningen pre-uttrykker Cas12a.
    3. Pipetter 1 μg av singelen crRNA array, 1 μg av den linearized mottakeren plasmider for crRNA array, 1 mikrogram donor DNA og 1 μg av hver flankerer region (trinn 4,3) i mikrosentrifugen røret.
      Merk: det totale volumet av DNA-blandingen bør ikke overstige 100 μL for å hindre en lavere transformasjon effektivitet.
    4. Klargjør følgende kontroller for transformasjonen: negativ kontroll (ultrarent H2O); positiv kontroll for bestemmelse av transformasjon effektivitet (1 μg av sirkulære pRN1120); en kontroll som bekrefter om innføringen av donor DNA utføres via CRISPR-redigering (1 μg av sirkulær pRN1120, 1 μg av alle donor DNA-uttrykks kassetter og 1 μg av flankerer regioner, men ingen enkelt crRNA array); kontroll verifisere om donor DNA kan integreres utenfor målet (1 μg av linearized pRN1120, 1 mikrogram DNA-uttrykks kassetter og 1 μg av singelen crRNA array, men ingen flankerer regioner); en kontroll som verifiserer full linearization av pRN1120 (1 mikrogram linearized pRN1120).
    5. Følg trinnene 5.2.9 til 5.2.12 for den første transformasjonen runden.
    6. Plate ut 150 μL av transformasjon mix og 20x fortynning i YEPD (2% glukose) av transformasjon Mix på YEPD (2% glukose) agar supplert med 0,2 g/L G418 og 0,2 g/L NTC. Plate ut kontroller på YEPD (2% glukose) agar supplert med riktig valg (G418 og/eller NTC eller ingen valg). Ruge platene ved 30 ° c for 48 – 72 timer.
    7. Velg en enkelt farget transformant og re-stripe på en YEPD (2% glukose) agar plate for å få enkelt fargede kolonier.

6. evaluering av Genova redigering effektivitet

  1. Telle antall fargede kolonier og hvite kolonier på transformasjon platene.
  2. Beregn Genova redigering effektivitet ved å dele antall fargede kolonier av det totale antall kolonier (både hvite og fargede), som vist i tabell 1.

7. bekreftelse av integrering av giver DNA ved tiltenkt Loci

  1. Re-stripe en farget enkelt koloni fra en transformasjon plate på en YEPD (2% glukose) agar plate uten G418 og NTC utvalg og ruge for 48 timer ved 30 ° c.
  2. Plukk en enkelt koloni og vaksinere en 500 mL riste kolbe fylt med 100 mL YEPD (2% glukose) medium. Ruge for 48 timer ved 30 ° c og risting ved 250 RPM.
  3. Isoler det genomisk DNA-et som beskrevet i Seksjon 4,1.
    Merk: Alternativt kan du bruke en protokoll for utarbeidelse av gjær for kolonien PCR tidligere foreslått av looke et al. 32. i dette tilfellet kan veksten i flytende medium (Seksjon 7,2) hoppes over.
  4. Bekreft riktig integrering med forsterkning av to fragmenter per integrert uttrykks kassett.
    1. Design primere som anneal å genomisk DNA utenfor transformert flankerer regionene og genet av interesse (se eksempler i supplerende tabell 2, KC-121 til KC-132). Ved bruk av primere KC-121 til KC-132, Still inn den annealing temperaturen i PCR-programmet til 62 ° c.
    2. Forsterk interesseområdet som beskrevet i avsnitt 4.4.2. Tilpass PCR-programmet, Juster spesifikt tiden for forlengelses trinnet i PCR i henhold til lengden på malen og produsentens anbefalinger for DNA-polymerase.
  5. Sjekk størrelsen på PCR-produktene ved elektroforese på en agarose gel (0,8%, 40 min., 5 V/cm) ved hjelp av en DNA-lasting fargestoff og DNA stige med DNA-fragmenter i en rekke 100 til 10 000 BP.

8. opprettelse av gjær pixel kunst ved hjelp av en akustisk flytende handler

  1. Forbered en bilde mal for gjær piksel kunsten.
    1. Endre størrelsen på det opprinnelige RGB-bildet (220 × 280 piksler, se representative resultater), for eksempel bruke ImageJ til å opprette en endelig 64 × 96 piksler (bredde × høyde) gråskala bilde avbildet i tiltenkte farger (representative resultater).
    2. Konverter RGB-bildet til gråskala ved hjelp av denne formelen:
      Equation 3
      hvor jeggr, jeg r, jegg, jegb er grå, rød, grønn og blå intensitet, henholdsvis.
    3. For å kategorisere pikslene, utvikle en ImageJ plugin bruke følgende regler: (a) Hvis jeggr er ≤ 64, bruk Dark Orange gjær (stamme 1, supplerende tabell 3) for denne pixel. (b) hvis 64 < igr ≤ 128, bruk appelsin gjær (stamme 2, tilleggs tabell 3) for denne pikselen. (c) hvis 128 < igr ≤ 192, bruk den gule gjær (stamme 3, supplerende tabell 3) for denne pikselen. (d) Hvis jeggr > 192, bruk hvit gjær (Centre PK113-7D) for denne pikselen.
  2. Spot gjærceller for å lage gjær pixel kunst.
    1. Vaksinere 500 mL riste flasker som inneholder 100 mL YEPD (2% glukose) medium med tre forskjellige fargede karotenoid som produserer S. cerevisiae stamme og vill type sentral. PK113-7D. Ruge kulturer over natten ved 30 ° c med risting ved 250 RPM.
    2. Overfør 0,5 mL av natten kulturen til et rør fylt med 0,5 mL sterilt ikke-ioniske tetthet gradient medium (se tabell over materialer). Bland med virvlingen kort.
    3. Overfør celle fjæringen til et kvalifisert reservoar, 2 x 3 brønn. Utfør spotting ved hjelp av et akustisk flytende håndterings instrument fra en kvalifisert reservoar kilde plate til en mikroplate (se tabell over materialer) som inneholder 50 ml YEPD (2% glukose) agar. For å forenkle plating, definere brønner på plate, f. eks Bruk en mikroplate som en 6144 brønn plate (64 × 96).
    4. Spot 25 nL av hver S. cerevisiae stamme fra 2x 3 brønn reservoaret kilde plate ved hjelp av en. CSV fil med væsken kalibrering innstillingen 6RES_AQ_GPSA2 på destinasjonen mikroplate. Definer hver av disse 25 nL dråper som en piksel i 64 x 96 rutenettet som er oversatt til brønnen posisjoner (A01, B01, C01 etc.).
    5. Ruge mikroplate ved 30 ° c i 48 timer. For å intensivere fargene på stammene lagre agar platen ved 4 ° c i minst 72 timer.

Representative Results

Protokollen for multiplex Genova redigering ved hjelp av CRISRP/Cas12a ble demonstrert ved å konstruere tre karotenoid produsere S. cerevisiae stammer uttrykker crtE, crtYB og crtI gener ved hjelp av heterologous arrangører av høy, middels og lav styrke: stamme 1, 2 og 3 henholdsvis (supplerende tabell 3). Byggingen av disse stammene kreves generasjon av tre donor DNA-uttrykk og seks flankerer regioner per stamme for målretting til tre forskjellige Loci i genomisk DNA (vist i figur 2B). Som beskrevet heri, arrangøren, åpen lesing ramme, Terminator og to sammenhengende 50-BP kontakter sekvenser ble samlet inn i et uttrykk kassett via en Golden Gate kloning reaksjon og forsamlingen ble verifisert av PCR (Figur 3a). Singelen crRNA array ble bestilt som et syntetisk DNA-fragment og ble forsterket av PCR (Figur 3B). Mottakeren plasmider for singelen crRNA array (plasmider pRN1120) ble linearized med Ecori-HF og Xhoi og linearization ble bekreftet av elektroforese (Figur 3C). Design og nukleotid sekvenser av de innførte donor DNA uttrykks kassetter og flankerer regioner er vist i supplerende tabell 3 og supplerende tabell 4. Sekvensen av enkelt crRNA array uttrykks kassetter er gitt i supplerende tabell 1. Funksjonaliteten til avstandsstykker inkludert i singelen crRNA array ble testet på forhånd av singleplex Genova redigering med individuelle crRNAs19.

Effektiviteten av Genova redigere bort benytter Cas12a var for det første vurdert basert på antallet av farget kolon oppnådd etter transformasjon (bord 1, skikkelsen 4). Redigering effektiviteten av de tre konstruerte stammene varierte fra 50% til 94%. Spesielt, innføring av uttrykks kassetter som brukes til å generere belastning 1 vist lavest redigering effektivitet, muligens forårsaket av arten av donor DNA (dvs.disse uttrykks kassetter kode crtE, crtYB og crtI fra tre høy styrke arrangører). For det andre, korrekt integrering av de tre donor DNA-uttrykks kassettene på den tiltenkte Loci på genomisk DNA ble bekreftet av PCR (figur 5). Primere ble utformet på en slik måte at PCR-produkter ble innhentet når korrekt integrering av donor DNA på det tiltenkte geometriske sted inntraff. For hver transformasjon eksperiment ble åtte kolonier plukket fra transformasjon plate og testet (Merk at bare tre er presentert i figur 5). Generelt, av 8 kolonier testet per giver DNA, korrekt integrering av crtE donor DNA på INT1-geometrisk, crtYB ved INT2-geometrisk og crtI ved INT3, ble bekreftet i > 90% av transformants. Disse resultatene demonstrere CRISPR/Cas12a systemet i kombinasjon med en enkelt crRNA array muliggjør effektiv multiplex redigering av S. cerevisiae Genova på flere Loci samtidig.

I tillegg viser vi opprettelsen av "gjær pixel kunst" ved hjelp av tre karotenoid produsere stammer som ble konstruert sammen med en ikke-farget vill-type belastning. Starter fra et svart-hvitt bilde av Rosalind Franklin (figur 6a), en 4-farge bilde (figur 6B) og spotting listen ble opprettet som deretter ble brukt til å oppdage de fire forskjellige gjær stammer på en agar mikroplate ved hjelp av en akustisk væske handler, noe som resulterer i en høyoppløselig "gjær Maleri" av Rosalind Franklin (figur 6C, D, E).

Figure 1
Figur 1 : Arbeidsflyt av protokollen for CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering i S. cerevisiae. Arbeidsflyten inneholder viktige trinn i den presenterte metoden. Se protokoll for mer informasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Scheme av CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering ved hjelp av en enkelt crRNA array. (A) singelen crRNA array består av tre crRNAs enheter i sin modne form, en 20-BP direkte gjenta spesifikke for LbCas12a (grå firkanter) med en 23-BP guide sekvens (fargede diamanter). Uttrykk for crRNA-matrisen er aktivert av SNR52 promoter og SUP4 Terminator. Transformasjon av S. cerevisiae med en linearized pRN1120 og singelen crRNA array uttrykk kassett som inneholder homologi med pRN1120 (Diagonal striper) gjør det mulig for in vivo rekombinasjon i en sirkulær plasmider i cellene pre-uttrykker LbCas12a. Den enkle crRNA-matrisen behandles deretter av Cas12a. (B) Cas12a er rettet til den tiltenkte INT1, INT2 og INT3 genomisk målområder og skaper doble strandet pauser. I overgangs blandingen ble donor DNA bestående av flankerer regioner og karotenoid gen uttrykks kassett inkludert. Donor DNA forsamlinger var rettet mot en strekning av DNA i genomisk DNA rundt INT1 (crtE), INT2 (CRTYB) og INT3 (crtI) Loci av in vivo rekombinasjon på grunn av tilstedeværelsen av 50-BP homologe kontakter sekvenser, indikert som 5, A, B, C, D eller E. P1 – P3, ulike arrangører; T1 – T3, forskjellige terminatorer. Dette tallet er blitt modifisert fra Verwaal et al. 201819. Genetiske konstruksjoner vist ved hjelp av syntetisk biologi Open Language (SBOL) visuelle symboler40. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : PCR bekrefter redigerings forsøkene for Genova. (A) verifisering av Golden Gate kloning reaksjoner av MONTERTE donor DNA-kassetter. Oppnådde resultater er i overensstemmelse med forventet lengde. (B) PCR av singelen crRNA array. (C) linearization av plasmider pRN1120. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Plater av S. cerevisiae transformasjoner bruker multiplex Genova redigering tilnærming. (A) stamme 1 uttrykker crtE, crtYB og crtI fra tre sterke arrangører (Dark Orange kolonier). (B) stamme 2 uttrykker crtE, crtYB og crtI fra tre middels styrke arrangører (oransje kolonier). (C) stamme 3 uttrykker crtE, crtYB og crtI fra tre lav styrke arrangører (gule kolonier). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : PCR bekrefter integreringen av DNA-Loci i donor-kassettene i den tiltenkte GENOMISK DNA-en. (A) verifikasjon av tre kolonier av stammen 1. (B) verifikasjon av tre kolonier av stammen 2. (C) verifikasjon av tre kolonier av stammen 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Gjær pixel kunst av Rosalind Franklin. (A) svart og hvitt RGB bilde av 220 × 280 piksler av Rosalind Franklin som ble brukt som en mal. (B) computer konvertering av svart og hvitt bilde av Rosalind Franklin i en 4-fargers 64 × 96 pixel liste. (C) bilde av gjær pixel kunst med 64 × 96 gjær kolonier med en zoomet inn delen. (D) bilde av en akustisk væske handler med to fulle vokst plater. (E) bilde av en full vokst mikroplate med 64 × 96 gjær kolonier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Stamme 1 Stamme 2 Stamme 3
Fargede kolonier 16 279 220
Hvite kolonier 16 18 18
Antall kolonier 32 297 238
Effektivitet 50 prosent 94 prosent 92 prosent

Tabell 1: redigering effektiviteten av multiplex Genova redigering tilnærming.

crRNA array sekvensa, b, c, d, e, f
CATGTTTGACAGCTTATCATCGATAATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAG TCTTTGAAAA
GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG
TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA
TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC
ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAATTTCTACTAAGTGTAGAT
CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGTGTAGATGTGCCGTAC
GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT
TTTTTGTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG
GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
a. homologi til pRN1120 (fet).
b. SNR52 promoter (kursiv).
c. genomisk mål sekvenser (understreket).
d. guide direkte gjentar spesifikke for LbCas12a (kursiv, fet).
e. SUP4 Terminator (kursiv).
f. homologi til pRN1120 (fet).

Supplerende tabell 1: enkel crRNA array for LbCas12a inneholder homologi med plasmider pRN1120.

navn Sekvensa Beskrivelseb Brukes i punkt
KC-101 CATGTTTGACAGCTTATCATC FW primer for forsterkning av enkelt crRNA array 2.1.4
KC-102 CACACAGGAAACAGCTATGAC RV primer for forsterkning av enkelt crRNA array 2.1.4
KC-103 AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC FW primer for forsterkning av donor DNA med kontakt 5 3.6.1
KC-104 AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC RV primer for forsterkning av donor DNA med kontakt A 3.6.1
KC-105 CGGATCGATGTACACAACCG FW primer for forsterkning av donor DNA med kontakt B 3.6.1
KC-106 CAACAGGAGGCGGATGGATATAC RV primer for forsterkning av donor DNA med kontakt C 3.6.1
KC-107 AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC FW primer for forsterkning av giver DNA med kontakt D 3.6.1
KC-108 AGGTACAACAAGCACGACCG RV primer for forsterkning av donor DNA med kontakt E 3.6.1
KC-109 CACTATAGCAATCTGGCTATATG FW primer for forsterkning av INT1 5 ' med kontakt 5 4,4
KC-110 AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC
TGGATATGCAAAGCGATTGGAA
GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC
ATTCC		 RV primer for forsterkning av INT1 5 ' med kontakt 5 4,4
KC-111 TTGCCCATCGAACGTACAAG
TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT
TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC
TTTG		 FW primer for forsterkning av INT1 3 ' med kontakt A 4,4
KC-112 TGTCAACTGGAGAGCTATCG RV primer for forsterkning av INT1 3 ' med kontakt A 4,4
KC-113 AGAAGATTTCTCTTCAATCTC FW primer for forsterkning av INT2 5 ' med kontakt B 4,4
KC-114 TGCTAAGATTTGTGTTCGTT
TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT
CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC
TGGTTG		 RV primer for forsterkning av INT2 5 ' med kontakt B 4,4
KC-115 ACGCTTTCCGGCATCTTCCA
GACCACAGTATATCCATCCGCCT
CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG
GTGG		 FW primer for forsterkning av INT2 3 ' med kontakt C 4,4
KC-116 TCTCCTCTTCGATGACCGGG RV primer for forsterkning av INT2 3 ' med kontakt C 4,4
KC-117 GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG FW primer for forsterkning av INT3 5 ' med kontakt D 4,4
KC-118 GCGGAATATTGGCGGAACGG
ACACACGTGGATACAAACCTG
GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG
AAGAACG		 RV primer for forsterkning av INT3 5 ' med kontakt D 4,4
KC-119 AAATAACCACAAACATCCTT
CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT
GTACCTGATGGGACGTCAGCACT
GTAC		 FW primer for forsterkning av INT3 3 ' med kontakt E 4,4
KC-120 GAGCTTACTCTATATATTCATTC RV primer for forsterkning av INT3 3 ' med kontakt E 4,4
KC-121 GTTACTAAACTGGAACTGTCCG FW primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 5 ' 7.4.1
KC-122 CACTGCTAACTACGTTTACTTC FW primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 3 ' 7.4.1
KC-123 CACTGGAACTTGAGCTTGAG FW primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 5 ' 7.4.1
KC-124 GTCTCCAGCTGAATTGGTCC FW primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 3 ' 7.4.1
KC-125 CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC FW primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 5 ' 7.4.1
KC-126 GATCGGTCAATTAGGTGAAG FW primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 3 ' 7.4.1
KC-127 CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC RV primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 5 ' 7.4.1
KC-128 GCTGTCATGATCTGTGATAAC RV primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 3 ' 7.4.1
KC-129 CTGGCAATGTTGACCAATTGC RV primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 5 ' 7.4.1
KC-130 CCAACGTGCCTTAAAGTCTG RV primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 3 ' 7.4.1
KC-131 CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG RV primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 5 ' 7.4.1
KC-132 CTGGTTACTTCCCTAAGACTG RV primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 3 ' 7.4.1
a. fet sekvenser betegner koblings sekvenser.
b. forover og bakover primere er utpekt som FW og RV, henholdsvis.

Supplerende tabell 2: primer sekvenser.

Supplementary Table 3
Supplerende tabell 3: design av konstruerte stammer.

Supplementary Table 4
Supplerende tabell 4: sekvenser av DONOR DNA uttrykks kassetter og flass regioner. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Den oppgitte protokollen beskriver multiplex Genova redigering av S. cerevisiae bruke Cas12a fra Lachnospiraceae bakterien ND2006 i kombinasjon med en enkelt CRRNA array og donor DNA. Design av singelen crRNA array og donor DNA er forklart i detalj. I motsetning til det veletablerte CRISPR/Cas9-systemet har CRISPR/Cas12a den unike tilleggs evnen til å behandle flere crRNAs uttrykt fra en enkelt crRNA array13,33. På grunn av denne funksjonen, er samtidig redigering av flere mål enklere å sette opp og kan oppnås i en enkelt transformasjon. Denne singelen crRNA array tilnærming ble demonstrert før av Zetsche et al. 34 som samtidig redigerte opptil fire gener i pattedyrceller ved hjelp av AsCas12a, og av Swiat et al. 35 som INTRODUSERTE fire DNA-fragmenter til en gjær-Genova ved hjelp av FnCas12a. Til vår kunnskap, et høyere antall samtidige genomisk modifikasjoner ved hjelp av et Cas12a system har ikke blitt rapportert og maksimal grense på mål per enkelt array for Cas12a er ennå ikke bestemt. Videre forskning utnytte single crRNA arrays i kombinasjon med Cas12a inkluderer multiplex transcriptional regulering i et bredt spekter av organismer33,36,37.

Det er noen kritiske trinn i den presenterte protokollen. Nøye designe alle DNA-sekvenser som er involvert i Cas12a Genova redigering eksperiment, spesielt i tilfelle når romanen DNA-sekvenser er innført. Bestem funksjonaliteten til nye spacer sekvenser del av en crRNA, for eksempel ved et singleplex Genova redigering eksperiment som beskrevet av Verwaal et al. 19 før kombinere dem i en enkelt crRNA array. Følg anbefalingene for utarbeidelse av transformasjon buffer løsninger som brukes i Cas12a redigering eksperimentet for å oppnå en god transformasjon effektiviteten av gjær.

Det er noen valgfrie modifikasjoner av teknikken. Det anbefales å bruke 1 μg av hver donor DNA, linearized pRN1120 eller enkelt crRNA array uttrykk kassett i transformasjonen, selv om bruken av et lavere DNA-beløp er også forventet å resultere i en tilfredsstillende transformasjon effektivitet. Utfør en test transformasjon for å bestemme om lavere DNA-beløp kan brukes. Transformasjonen av S. cerevisiae kan utføres ved hjelp av en annen metode enn den som er beskrevet i denne protokollen, for eksempel protokollen beskrevet av Gietz et al. (2007) 38. The guide RNA mottaker plasmider pRN1120 er egnet for uttrykk for en enkelt crRNA og enkelt crRNA rekke forskjellige Cas12a varianter (f. eks, fra Acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) så vel som for uttrykk for sgRNA i kombinasjon med Cas919. Giveren DNA trenger ikke å være begrenset til karotenoid genuttrykk kassetter og flankerer regioner som mål giver DNA til de beskrevne INT1, INT2 og INT3 steder i genomisk DNA. Enhver DNA av interesse kan innføres, i en multiplex måte, inn genomisk DNA av verten av design prinsipper beskrevet i denne protokollen, eller alternativt donor DNA kan brukes til å slette DNA fra en vert Genova. Den modulære strukturen av enkelt crRNA array forenkler enkel justering av spacer og direkte gjenta sekvenser. Modifisering av avstands sekvenser muliggjør en endring av det tiltenkte integrasjons-stedet som kan utformes av et av verktøyene for identifisering av et genomisk målområde, for eksempel GuideScan programvare 1,039. I stedet for å bruke store flankerer sekvenser som inneholder kontakter sekvenser, 50-BP av flankerer regionen kan inngå i donor DNA-sekvenser ved å innlemme disse 50-BP flankerer regionen sekvenser i primere brukes i PCR. I dette tilfellet, i alt bare tre i stedet for ni donor DNA fragmenter er nødvendig for en vellykket multiplex Genova redigering eksperiment.

Oppsummert denne protokollen gir steg-for-steg retninger for å utføre multiplex Genova redigering i S. cerevisiae bruker Cas12a i kombinasjon med en enkelt crRNA array tilnærming. Protokollen ble demonstrert av multiplex Genova redigering ved hjelp av 9 donor DNA fragmenter og enkelt crRNA array koding for tre gRNAs. Vi viser høy samlet redigering frekvenser mellom 50% og 94% for de tre belastningen design rapportert her. Avsluttende, det enestående ansiktstrekk av Cas12a er evnen å forarbeide en enkelt crRNA oppstille i individ crRNAs inne en cellen, hvilke lager Cas12a en utmerket verktøyet å sette i stand multiplex Genova redigere bort og utvikle transcriptional regulering moduler målretter mangfoldig uttrykks kassetter på én gang. Til slutt ble trestammer oppnådd produsere karotenoider på et annet nivå og farger i nyanser mellom gult og oransje. Med disse stammer og en vill-type belastning, viste vi hvordan en akustisk væske handler kan brukes oversiktlig å gjøre gjær pixel kunst-dette til ære for Rosalind Franklin som bidro til oppdagelsen av DNA-strukturen 65 år siden av hennes berømte bilde 5123 < /c1>.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det er en interessekonflikt. Forfatterne har arkivert IP relatert til presenterte metoder.

Acknowledgments

Dette prosjektet fikk støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram i henhold til avtale nr. 686070 (DD-koffeinfri) og 764591 (SynCrop), og fra forskningsprogrammet byggeklosser i livet med prosjektnummer 737.016.005 av Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO). T.E.G. ble støttet av Royal Society (Grant UF160357) og BrisSynBio, et BBSRC/EPSRC syntetisk biologi forskningssenter (Grant BB/L01386X/1). Vi takker Zi di og Jeffrey van Wijk for deres bidrag til gjær spotting eksperimenter for å lage gjær pixel kunst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher Scientific 10787018 Electrophoresis
Ampicillin sodium salt Sigma Aldrich A9518 Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl) New England BioLabs R353L Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer New England BioLabs B7204S Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma Aldrich D1626 Transfromation of
S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs Invitrogen 10297018 PCRs
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis Merck 100983 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid Sigma Aldrich ED Transformation of
S. cerevisiae
G418 disulfate salt Sigma Aldrich A1720 Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz Sigma Aldrich D2158  Yeast pixel art
Isopropanol Merck 100993 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate Sigma Aldrich L6883 Transformation of
S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain Sigma Aldrich 1494 Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells New England BioLabs C3019H Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin Jena Bioscience AB102 Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer New England BioLabs M0530L PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0530L PCRs
Polyethylene glycol 4000 Merck 7490 Transformation of
S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) QIAGEN 854016 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye New England BioLabs B7024S Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix Thermo Fisher Scientific AM2286 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer Invitrogen 46300-018 Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl) Invitrogen 1705218 Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose Invitrogen 16500500 Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit Promega A9282 Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol New England BioLabs R0146S Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) Zymo Research E1006 Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer Zymo Research E1004-B Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar Plate growth of E. coli
2*PY medium Cultivation of E. coli
Demineralized water Transformation of
S. cerevisiae
ELFO buffer Electrophoresis
MQ Multiple steps
Physiological salt solution Transformation of
S. cerevisiae
TE buffer Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar Plate growth of
S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067 Addgene ID 101748 https://www.addgene.org/
pRN1120 Addgene ID 101750 https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain
CEN.PK113-7D		 EUROSCARF collection http://www.euroscarf.de

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  2. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  3. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  4. Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system. Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).
  5. Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).
  6. Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
  10. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).
  11. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), (2016).
  12. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  13. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  14. Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).
  15. Ferreira, R., et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).
  16. Swarts, D. C., Martin, J. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).
  17. Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).
  18. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  19. Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).
  20. Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).
  21. Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3 (11), 3647 (2008).
  22. Yeast Art project. , Available from: http://www.yeastart.org (2018).
  23. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  24. Watson, J. D., Crick, F. H. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 171, 737-738 (1953).
  25. Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature. 171, 738-740 (1953).
  26. Young, E. M., et al. Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast. Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).
  27. Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. Cloning Method. , WO2013144257 (2013).
  28. Mandel, M., Higa, A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).
  29. Van Dijken, J. P., et al. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).
  30. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).
  31. Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).
  32. Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).
  33. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  34. Zetsche, B., et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).
  35. Swiat, M. A., et al. FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).
  36. Li, L., et al. CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces. Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell Discovery. 3, 17018 (2017).
  38. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).
  39. Perez, A. R., et al. GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design. Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).
  40. Cox, R. S., et al. Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0. Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).

Tags

Bioteknologi CRISPR/Cas12a CRISPR/Cpf1 CRISPR/Cas9 multiplex Genova redigering Saccharomyces cerevisiae gjær pixel kunst
CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering av <em>Saccharomyces cerevisiae</em> og opprettelse av gjær pixel art
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski,… More

Ciurkot, K., Vonk, B., Gorochowski, T. E., Roubos, J. A., Verwaal, R. CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art. J. Vis. Exp. (147), e59350, doi:10.3791/59350 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter