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Developmental Biology

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353

Summary

このプロトコルは、皮膚ケラチノサイトをマウスモデルから単離し、金属タグ付き抗体で染色し、異なる細胞周期相で目的のタンパク質の発現パターンをプロファイリングするために質量サイトメトリーによって染色された細胞を分析する方法について説明する。

Abstract

このプロトコルの目的は、マウス皮膚の表皮から単一細胞を用いて細胞周期依存的な方法でタンパク質発現変化を検出し、定量することである。7つの重要なステップがあります:真皮からの表皮の分離、表皮の消化、シスプラチンを用した表皮細胞集団の染色、サンプルバーコード、細胞周期マーカーおよびタンパク質に対する金属タグ付き抗体での染色質量サイトメトリーによる金属タグ付き抗体の検出、および様々な細胞周期相における発現の分析に関心を持つ。組織学的方法に対するこのアプローチの利点は、細胞周期の異なる段階で1つの細胞における>40の異なるマーカーの発現パターンをアッセイする可能性である。このアプローチはまた、組織学的/イメージング法よりも定量化可能なタンパク質発現の多変量相関分析を可能にする。このプロトコルの欠点は、単一細胞の懸濁液が必要であり、組織切片の染色によって提供される位置情報の損失をもたらす。このアプローチはまた、粗細胞懸濁液中の異なる細胞型を識別するために追加のマーカーを含めることを必要とする場合もある。このプロトコルの応用は、過形成性皮膚疾患モデルの分析において明らかである。さらに、このプロトコルは、系統特異的抗体の添加によって特定のサブタイプの細胞(例えば、幹細胞)の分析に適合させることができる。このプロトコルはまた、他の実験種における皮膚細胞の分析に適合させることができる。

Introduction

遺伝子発現と細胞周期段階との相関は、がんのような過形成性疾患の動物モデルの解析において依然として課題である。この課題の一部は、増殖のマーカーを用いて目的タンパク質(POI)の共検出です。増殖細胞は、G1、S、G2、およびM.Ki67を含む様々な細胞サイクル段階で見つけることができ、増殖の最も一般的に使用されるマーカーの1つであり、細胞周期のすべての段階で発現される。それはヒトおよびマウス組織の両方の分析で広く使用されている1,2,3.しかし、他の一般的な増殖マーカーと同様に、Ki67は個々の細胞周期相を識別しない。より正確なアプローチは、ブロモデオキシリジン(BrdU)のようなチミジンヌクレオチド類似体を、ゲノムを積極的に複製している細胞(すなわち、S相)4、5を使用する。ヌクレオチド類似体の使用に対する欠点の1つは、分析の数時間前に生きた動物に投与する必要があることです。Ki67およびBrdUは、抗体の使用によって固定組織切片で一般的に検出される。このアプローチの1つの利点は、POIの位置が組織アーキテクチャ(例えば、皮膚表皮の基底層)内で確認できることである。このアプローチはまた、遺伝子発現の変化につながる可能性のある組織解離を必要としない。1つの欠点は、OCT凍結またはパラフィン断面に対する組織の固定または処理が抗体標的(すなわち、抗原)を閉塞しうる点である。抗原の検索は、通常、熱または組織の消化を必要とします。染色強度の定量化も困難な場合があります。これは、染色、断面厚、信号検出、および実験者バイアスの変動によるものです。さらに、限られた数のマーカーは最も典型的な実験室のセットアップで同時に検出することができる。しかし、新しい多重染色アプローチは、これらの制限を克服することを約束します。例は、質量サイトメトリーおよびチラミド信号増幅6、7をイメージングしている。

フローサイトメトリーは、増殖細胞を検出するもう一つの強力な技術です。それは同じ細胞のマーカーの多重検出を可能にするが、ほとんどの非血行細胞タイプのための組織の解離を要求する。増殖細胞の分析は、DNAを結合する染料(例えば、ヨウ化プロピジウム(PI))8を使用することによって日常的に行われる。フローサイトメトリーはまた、BrdU組み込み9の検出と組み合わせた場合、細胞周期相のより正確な決定を可能する。強力なアプローチですが、BrdU/PIフローサイトメトリーには欠点があります。相特異的抗体を含まないと、G2/MおよびG0/G1相を解決することができません。しかしながら、使用できる抗体の数は、細胞の自己蛍光、蛍光色素放出のスペクトル波及、および補償制御の使用によって制限される。この制限は、POI を使用して細胞サイクル マーカーの発現を共に検出するのがより困難で手間のかかることをマークします。より表面的なアプローチは、質量サイトメトリー10、11を使用することです。この技術は、より狭い検出スペクトルを持つ金属共役抗体を使用しています。細胞が金属タグ付き抗体で染色されると、それらは気化され、細胞メトリー飛行時間(CyTOF)質量分析によって検出された金属。これらの特性により、質量サイトメトリーは、既存のプラットフォーム10、11を使用して>40の異なるマーカーの多重検出を可能にします。さらに、サンプル間染色の変動を低減しながら、貴重な抗体の節約につながる金属でサンプルをバーコードすることが可能です。一方、質量サイトメトリーにはいくつかの欠点がある。非血液由来細胞に対して市販の金属タグ付き抗体の数は限られています。DNA含有量の定量化は、蛍光DNA色素および質量サイトメトリーの使用に比べて感受性が低く、蛍光流細胞メトリーと比較して信号検出のダイナミックレンジが低下している。

ここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚から新たに単離されたケラチノサイト(KC)からの細胞周期ダイナミクスを分析し、質量サイトメトリーを用いてこれらの細胞における細胞周期特異的タンパク質発現を特徴付けることを目的とした。このプロトコルは、培養細胞と共に使用することも、他の細胞型に適合させることもできる。

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Protocol

コロラド大学アンシュッツ医科キャンパスの施設動物ケアと使用委員会は、このプロトコルに記載されている動物実験を承認しました。

1. 準備

  1. 金属タグ付き抗体パネルを設計します。無料のオンラインパネル設計ソフトウェア12を使用し、127イオドデオキシウリジン(IdU)、164 Dy(ジスプロシウム)ラベル付き抗CCNB1(CYCLIN B1)、175 Lu(ルテチウム)ホスホ(p)-HISTONEH3 Ser28(pHH3)、および150を含みます。 Nd (ネオジム)-pRETINOBLASTOMAタンパク質Ser807/811 (pRB)13.チャネル信号14に重ならない金属タグ付き抗体を追加する。
  2. IdU ストック ソリューションを準備します。IdU粉末を0.1N NaOHで10mg/mLで60°Cで溶解する。アリコートIdUストック溶液をマイクロ遠心管に入れ、-20°Cで凍結し、長期保存します。
    1. 使用直前に 12 N HCl で IdU 溶液の pH を 7.5 に調整します。廃棄アリコート上のpHストリップでテストし、溶液がpH 7.5であることを確認します。
      注:pH 7.5でのIdUの長時間(>5分)は降水量になり、これが起こるときはIdUの新鮮なアリコートが必要になります。
    2. 適切な個人用保護具(手袋、ラボコート、安全メガネなど)を使用し、NaOHまたはHClソリューションを取り扱う際は安全キャビネットで作業してください。
  3. 2xパラホルムアルデヒド(PFA)固定液を調用する。10x PBS(pH 7.5)の5mLと16%PFAの1mLを純粋な分子グレードdH2Oの44 mL(3.2%最終濃度)と組み合わせます。
    注:PFAの在庫は、以前に公開された15として準備したり、汚染された金属を含まない16%の株式を購入することができます。
    1. PFA粉末および溶液を取り扱う場合は、適切な個人用保護具を使用し、安全キャビネットで作業してください。
  4. バリウム(Ba2+)を5mLの金属フリー10x PBS(pH 7.5)と純粋な分子グレードdH2 Oの45 mLを組み合わせて、バリウム(Ba 2+)を自由に1x PBSを調製します。
    注:PBSおよび他の試薬の品質は、質量サイトメトリックデータの分析中にバックグラウンドノイズを引き起こす可能性のある金属を汚染しないように非常に重要です。
  5. 100mMシスプラチンストック溶液を準備します。DMSOの10 mLにシスプラチン粉末の300.5mgを溶解します。アリコートで-80 °C.1d以上使用する実験用に10mMシスプラチン作動液を調融する。
  6. 表皮/真皮分離液を準備します。HBSSまたはPBSの1 mLで30mgを溶解することにより、20倍のディスパーゼストック溶液を調調します。フィルターは0.22 μmフィルターを通して殺菌し、-20 °Cでアリコートに貯える。HBSSで1mg/mLで1x型IVコラゲナーゼストック溶液を調製し、0.22 μmフィルターを通して殺菌し、アリコートを-20°Cで保存します。

2. IdUの定款によるS相のラベリング

  1. マウスの重量を量る。P1-P3新生児の子犬または8-10週齢の成人マウスを使用し、C57BL/6、FvB、または129の背景から雄または雌のマウスを使用する。0.1 mg IdU (pH 7.5)/g 体重で用量を決定します。.たとえば、25 g マウスには 0.25 mL の IdU が必要です。
  2. 経皮注射によるIdUの用量を投与し、細胞を収穫する前に2時間待つ。新生児の子犬を注入するためにツベルクリン注射器を使用してください。
    注:IdUの2mg/mLの用量は、質量サイトメトリーの収穫および標識の前に37°Cで1時間インキュベーションを有する組織培養細胞と共に使用することができる。

3. 標識用細胞の分離

  1. 解凍ディスパーゼとコラゲナーゼストックソリューション。20倍のジスパーゼストック溶液を無菌HBSSまたはPBSで1x(1.5mg/mL)に希釈します。使用する準備ができるまで氷の上に保管してください。
  2. 2巻のディスパーゼと1巻のコラゲナーゼを組み合わせ、肌が自由に浮かべるトータルボリュームで。例えば、5つの新生児マウススキンの消化は、100mmペトリ皿に4mLのコラゲナーゼを含む1xディスパーゼの8mLに浮かべることができる。
  3. 実験マウスを安楽死させる承認された方法に従ってください(例えば、イソファラン過剰摂取/つま先ピンチチェックまたはCO2吸入/頚部転位)。ヨウ素溶液で成人の耳の皮膚をきれいにし(材料の表を参照)、単離された細胞を組織培養に使用する場合は滅菌水で洗い流します。
  4. ベースの耳を外科的に取り外します(図1A)。単離された細胞が組織培養に使用される場合に無菌PBSで耳をすすいでする。乾燥した100mmペトリ皿の上に置きます。
  5. 最初に細かい鉗子を使用してカット領域の中央または端にポケットを作成し、2つの皮膚フラップを引き離すことによって、後部皮膚から慎重に前部を分離します(図1B-D)。 前皮と後部スキンの両方を続行します。
    注:新生児マウスの皮膚を解剖するための詳細な指示は、Litchi et al.16によって提供されています さらに、解剖範囲の使用は、後部皮膚からの前部の分離および解剖の表皮/皮膚側の同定に役立つ可能性がある皮膚:毛髪は表皮側に見えるが、真皮はゼラチン状の外観を持つ。
  6. 耳の前皮と後部の皮膚を、皮膚の真皮側がジスパーゼ/コラゲナーゼ溶液に触れ、慎重に置きます(図1E)。12ウェル培養プレートのウェルあたりの単一耳の前部および後部皮膚の両方に1 mLを使用します。37 °Cで1時間インキュベートする代わりに、1x dispase溶液上の浮遊皮膚を4°Cで16-18 h.3
    注:細胞を培養する場合は、無菌技術を用いた組織培養フードで作業する。
  7. 消化した皮膚を表皮側がきれいなペトリ皿の表面に触れて置きます。皮膚を平らにし、円形のパターンで中心から端まで働くことによって表皮から真皮をそっと滑り落とす。
  8. 真皮を捨てるか、さらに消化して組織培養または分析用線維芽細胞を解放する16.
    注:真皮は外観が暗くなり、ゼラチン状と粘着性の組成物を持ちます。真皮は簡単に抜け落ちるだろう。真皮を除去する障害または困難は、組織消化が不十分を示唆している。しかし、消化バッファー内の拡張インキュベーションは細胞生存率を低下させる。表皮はペトリ皿に残り、漂白された外観を持つことになります。
  9. 端をつかんで表皮をそっと持ち上げ、ペトリ皿の表面から剥がします。予め温められた細胞剥離液(材料の表を参照)に表皮を慎重に置き、RTで37°Cまたは20分で5分間、500 μLの細胞剥離液を使用して、12ウェル培養プレートの井戸あたり500 μLの細胞剥離液を使用し、750 μLの細胞剥離を使用します。 6ウェル培養プレートの井戸あたりの単一の新生児表皮のための解決。
  10. 無菌鉗子を使用して表皮をつかみ、細胞を解離するために皿の底に表皮をドラッグしてスクラブします。1% FBS (0.01 mL) を含む DMEM の 1 mL を追加し、40 μm セルのふるいを集採取チューブに通過します。DMEMの追加の2 mLでよくすすいで、セルサスペンションに追加します。
  11. 120 x gで5分間遠心分離機を慎重に上清を吸引する。
  12. 1%FBSを含むDMEMの1-2 mLで細胞ペレットを再ステースする。トリパンブルーとヘモサイトメーターまたは自動計数装置を使用して、細胞数と細胞数%を決定します。ステップ3.11に記載されているペレット細胞。
    注:細胞は、ステップ3.12の後に適切な組織培養培地で培養することができる。17歳

4. 生細胞/死細胞を決定するシスプラチン標識

  1. 25 μMシスプラチン(2.5 μLのストック/mL)を含むDMEMの1mL当たり1-3 x 106セルを再中断します。1分間インキュベートし、同じ体積のFBS(例えば1 mL)でピペッティングしてクエンチします。
  2. 120 x gで5分間120 x gの遠心分離機を希釈漂白剤を含むビーカーに入れ、チューブを反転させ、残りの溶液をペーパータオルに排出する。チューブのペレットとサイドウォールに残っている溶液を解放するために穏やかにタップします。
  3. Ba+2-フリーPBSの2 mLで細胞ペレットを再ステースする。ステップ4.2で説明したペレット細胞。
    注:細胞がすぐに染色できない場合は、細胞を固定することをお勧めします。

5. シスプラチン標識細胞の固定化(オプション)

  1. Ba+2-フリーPBSの1mLで1-3 x 106シスプラチン標識細胞を再中断する。連続的な低電力下の渦セルを、2x PFA固定バッファのドロップワイズ1 mL(1体)を追加します。ロッキングプラットフォームで10分間RTでインキュベートします。
  2. ステップ4.2に記載されているペレット細胞は、5分間500xgで遠心分離する。
  3. ステップ5.2に記載されているように、Ba+2-フリーPBSおよびペレット細胞の2 mLで細胞を洗浄する。手順 5.3 を 1 回繰り返します。
  4. Ba+2-フリー PBS の 2 mL でペレットを再中断します。<3 d. FBS を 3% (例えば、セルの 0.3 mL) に追加し、>3 d を長く保存する場合は、-80 °C で混合して凍結します。
    注:固定は、特定のエピトープの検出に影響を与える可能性があります。抗体シグナルに対する固定の効果は、経験的に決定する必要があります。

6. サンプルのバーコード(オプションですが推奨)

  1. ステップ5.2で説明したペレットセルを、1x固定バッファーの1mLで1-3 x 106細胞を再中断する(材料の表を参照)。ステップ5.2で説明するように、RTで10分間ペレット細胞をインキュベートする。
  2. バーコード透過性バッファーの1 mLで細胞を洗浄する(材料の表を参照)。ステップ 5.2 で説明するペレット セル。手順 6.2 を 1 回繰り返します。
  3. バーコードに100 μLのバーコード透過性バッファーを追加し(材料の表を参照)18を追加し、ステップ6.2の細胞がペレット化している間すぐに混ぜます。
  4. 800 μLのバーコード透過性バッファーで細胞ペレットを再ステーペンドします。ステップ5.2で説明するように、細胞にバーコード溶液を追加し、RTで30分間ペレット細胞を混合してインキュベートします。細胞染色バッファーの2 mLで細胞を洗浄し(材料の表を参照)、ペレットを再び。
    注:最大20個のサンプルは、パラジウム金属18の様々な組み合わせで標識することができます。その他のバーコード戦略については、他の場所で説明されています 15.

7. 質量細胞メトリーのための細胞の標識

  1. 核抗原染色バッファー作動溶液の1mLで1-3 x 106細胞を再中断する(材料の表を参照)。バーコードされたサンプルを使用する場合は、後続の手順のためにサンプルを単一のチューブに結合します。ステップ5.2で説明されているように、RTで30分間ペレットをインキュベートします。
  2. 核抗原染色透過透過性バッファーの2 mLで1-3 x 106細胞を再中断する(材料の表を参照)。必要に応じてスケールします。たとえば、セル数が 9 x 106セルの 10 サンプルの組み合わせサンプルには、6 mL のバッファーを使用します。ステップ 5.2 で説明したペレット。
  3. 手順 7.2 を繰り返します。チューブに残った残留体積の細胞ペレットを穏やかに渦にする。
  4. 1-3 x 106細胞あたり50 μLの細胞内抗体カクテルを加える。必要に応じてスケールします。例えば、9 x 106細胞の細胞数を持つ10の組み合わせサンプルに対して、150 μLの抗体カクテルを使用します。RTで45分間混合してインキュベートし、ステップ5.2に記載されているように、細胞染色バッファーとペレットの2 mLを追加します。
  5. 細胞染色バッファーの2 mLで1-3 x 106細胞ペレットを再中断する。ステップ 5.2 で説明するペレット セル。手順 7.5 を 1 回繰り返します。
    注:他の緩衝液は、細胞外膜または細胞質マーカーの染色に使用することができ、実験者は、異なる細胞位置でエピトープを検出する必要がある場合に染色を最適化する必要があります。細胞は、染色のために生細胞を使用する場合、ステップ7.5後にPFAで固定することもできる。
  6. インターカレーション溶液の1 mLで1-3 x 106セルを再中断し、4°Cで1-3 d用に保存します。
    1. 細胞がインターカレーション溶液中にある場合は、ステップ5.2で説明したように>3 d. ペレット細胞の溶液を含むDMSOで-80 °Cで細胞を保管する。ステップ5.2に記載されているように、細胞染色バッファーおよびペレット細胞の1mLにおけるペレット(1-3 x 106細胞)を再中断する。10%DMSO/90%FBS19の1mLでペレットを再サスペンドし、凍結に移し、イソプロパノール凍結容器に入れ、-80°Cで保存する。
  7. ステップ 5.2 で説明するペレット セル。1-3 x 106細胞を2mLの細胞染色バッファーで洗浄し、ステップ5.2に記載のペレット化する。ステップ 5.2 で説明したように、2 mL の水で 2 つの追加の洗い流しを実行します。
  8. 希釈EQキャリブレーションビーズ1:9水中(ストック溶液3.3 x 105ビーズ/mL)。
  9. 希釈EQビーズ溶液で1 x 106細胞/mLの濃度で細胞ペレットを再中断する。35 μmのストレーナーキャップフローチューブを通して細胞をフィルタリングします。
  10. 質量サイトメーターでサンプルを実行し、データを取得します。データはフローサイトメトリー標準(FCS)ファイル形式でデポジットされます。

8. 大量サイトメトリーデータファイルの処理と分析

  1. FCS ファイルを正規化します。20https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latestで利用可能な無料プログラムを使用してください
  2. デコンボルトバーコードFCSファイル。プールされたバーコードの人口を別々のバーコードファイルに分け、18https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latestで利用可能な無料プログラムを使用します。
  3. 正規化された FCS ファイルを分析します。商用21、22またはフリーウェア プログラムを使用します (web.stanford.edu/group/nolan/resources.html参照)。

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Representative Results

表1は、成人マウス耳(図1)および非病理学的条件下での新生児皮膚からの期待される細胞収量および生存率を示す。この表は、混合C57/126の背景からの動物の代表的なデータも示しています。他の株の皮膚は、同様の細胞収率と生存率をもたらすことが期待されます。おおよその収量は皮膚の表面積に依存し、新生児の皮膚がより多くの細胞を必要とする実験のためのより良い選択であることを示す(表1)。低収率または生存率の低下 (<50%)皮膚の完全性を低下させるか、細胞死を誘発する消化または実験条件の問題を示すだろう.適切な培養剤およびサプリメントを用いて細胞を培養することは、KC製剤17の品質を評価するのに役立つ。

FCSファイルの正規化20および減翌年18に続いて、データのゲーティングは、目的の表皮細胞集団を定義し、個々の細胞周期相をマークする(図2)。191Ir対193Irチャネルを比較する二変量プロットでは、無傷の細胞を右上象限(図2A)でゲートすることができる。イベント長対191Irをプロットし、191 Ir軸付近のセルのタイトなクラスターを選択すると、単一のセルがマークされます。生存細胞は、低195Ptレベルの細胞に対してゲーティングすることにより、195Pt対193Irプロットのプロットで選択される。 図2Aに示すサンプルは、破片およびシスプラチン標識非生存細胞の存在の増加を有する。これは、サンプルが過剰に消化され、過度に処理されたか、または大量サイトメトリーのために染色する前に氷またはRTに長時間放置されたことを示している可能性があります。組織培養細胞からのプロファイルは、通常、195Pt陰性細胞のより高い割合を与える(図2B)。あるいは、誘導細胞死が実験モデルおよび/または条件の特徴である場合、195Pt陽性細胞の存在が予想されてもよい。

理想的には、対象となる母集団を定義するマーカーを特定のセルタイプの分析に含める必要があります。例えば、粗KC懸濁液中に存在すると予想される免疫細胞は、血行細胞を検出するCD4523抗体を添加することによって検出することができる(図2C)。増殖抗体パネル13に関しては、IdU対CYCLIN B1のプロットは、標準的なBrdU/PIフロープロット(図2D)と同様の細胞周期相(図2C)を解決し、S相、G0/G1およびG2/M細胞の検出を可能にする。人口。IdU対pHH3プロットでは、高いpHH3陽性はM相細胞を識別する。最後に、高pRB信号上のG0/G1細胞をゲーティングすると、G1の細胞からG0(静止)を区別することができます(図2C、左のほとんどのパネル)。

異なる細胞周期相を同定した後、異なる細胞タイプまたは実験条件に対する細胞周期プロファイルのグラフィカルな表現を構築することができる。例えば、図2に示すKC懸濁液中のCD45-対CD45+細胞集団(図3A)を比較すると、異なるセルサイクルプロファイルが出現します。CD45-群で見つかった予想される過形成QCは、G0の細胞数が少なく、S相、G2、およびM相3でより多くの細胞を有していた。対照的に、同じサンプルからの免疫細胞は、G0およびG1において顕著な集団を有していた。細胞周期プロファイルに加えて、細胞周期依存的な方法での遺伝子発現の特性評価も可能である。例えば、EGFRおよびmTOR/PI3Kシグナル伝達の定義に役立つリンタンパク質を図3Aに提示したデータで分析した。CD45-vs CD45+細胞のG1相の分析は、EGFRおよびmTOR/PI3Kシグナル伝達タンパク質に対する同様のプロファイルを明らかにしたが、pS6およびpEGFR陽性細胞の割合に若干の差があるように見えた(図3B)。同様のアプローチは、細胞周期の異なる段階における他のシグナル伝達経路タンパク質または細胞プロセスの発現を特徴付けるために適応することができる。

Figure 1
図 1:消化のためのマウス耳の皮膚の調製。(A) まず、動物から耳を取り出し、きれいなペトリ皿の上に平らに横たわっています。(B) 曲面精密鉗子を使用して、耳の片側を中央または端でつかみます。(C) 別の鉗子をひっくり返し、耳が折り目に引き裂くまで耳の半分をそっと引き離します。(D) 両側が2つの半分に分けられるまで引っ張り続けます。(E) 溶液に触れる真皮側で解離媒体に耳の半分を浮かべる。スケールバー = 2 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 大量サイトメトリーデータのゲーティング戦略。この図のデータは、前述の3として、ファルボルエステルTPAで処理された実験動物から生成された。TPAは、皮膚炎症24を誘導するPKC活性化剤である。(A) パネルは、バーコードデータの正規化とデコンボリューション後の初期ゲーティング戦略を示しています。イベントの長さ、191Ir、193 Ir、および195Pt チャネルをゲーティングすることにより、無傷、単一、および生存可能なセルを選択できます。(B)ヒトSCC SRB-P93細胞をDMSOで処理し、次いで質量サイトメトリーのために染色した。データは(A)のようにゲートされ、プロットは、このサンプルの生細胞のレベルを示しています。(C) 系統マーカーを含めることで、目的の細胞集団を選択することができます。この例では、(A)からの生存細胞を、造血細胞を排除するためにイベント長対CD45にゲートした。IdU対CYCLIN B1の組み込みのためのゲーティングCD45-細胞は、S、G0/G1、およびG2/M細胞集団の同定を可能にする。pHH3高細胞の選択はM相を定義し、pRB陽性に対するG0/G1の分析はG1の細胞を識別する。(D) プロットは、蛍光ベースのフローサイトメトリーによるBrdU取り込みおよびPI(DNA含有量)の検出による細胞周期解析の代表的な結果を示す。示されたデータは、前述の3としてBrdUで1時間増殖させたヒトColo163SCC細胞からである。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 細胞周期プロファイルの特徴付けと位相特異的タンパク質発現(A) 細胞周期プロファイルは、CD45-対CD45+細胞の図2からサンプルで決定した。(B) CD45-(オレンジ)およびCD45+(青色)細胞におけるリン特異的抗体を用いたG1相の解析により、EGFRおよびmTOR/PI3Kシグナル伝達経路のマーカーに対する類似の発現プロファイルが明らかになった。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

組織 領域 セル収率 生存 率
マウスの耳 225-230のmm3 1-2×106 70~90パーセント
新生児の皮膚 1000-1100のmm3 5-10×106 80-99パーセント

表1:典型的な細胞の収量と成人マウスの耳および新生児の皮膚からの生存率。トリパンブルー排除による細胞数および生存率は、n=7 8-10週齢の成人マウスの耳またはn=7 P3新生児の皮膚から採取された耳のCSから平均された。

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Discussion

このホワイト ペーパーで概説されているプロトコルは、約 8 時間で完了できます。その結果、細胞周期依存的な方法でタンパク質発現を分析できる、KCで濃縮された細胞の懸濁液が得られます。いくつかの以前の研究は、ヒトおよびマウスの皮膚からKCを分離する方法を概説している16,25.これらの研究には、フローサイトメトリー26のためのKCの分離のためのプロトコルも含まれる。しかし、CSの単離と質量サイトメトリーを用いられたタンパク質発現および細胞周期ダイナミクスの分析を組み合わせた詳細なプロトコルは、これまで説明されていない。

このプロトコルで高品質の結果を得るための最大のハードルは、使用される生細胞の品質です。文献では、表皮/真皮分離のための推奨条件および酵素は、16、25、26、27と大きく異なる。しかし、したがって、皮膚の消化時間を、真皮から表皮を効果的に分離できる最短の持続時間に保つことをお勧めします。このプロトコルは、1時間以内に耳とマウスの新生児の皮膚の両方の顔分離を可能にするジスパーゼとタイプIVコラゲナーゼとの消化を提示します。この結果、細胞生存率が高い十分な細胞収率をもたらす。細胞の品質に影響を与えることができるもう一つの要因は、消化のために選択された皮膚の位置です。KC は、体内の異なる解剖学的位置から同様に振る舞う必要があります。しかしながら、異なる部位の皮膚は、異なる特性および幹細胞組成物28、29を有してもよい。それにもかかわらず、新生児および耳皮膚3、30の使用は、毛包の密度が高い皮膚の領域(例えば、背部皮膚)からKCの単離がより困難であるため好ましい。マウス26の毛深い領域からのKCの効率的な分離のために、より高いレベルの操作または組織解離が必要な場合がある。KCの単離前の実験条件は、単離された細胞の品質にも影響を与える可能性があります。皮膚バリアまたは皮膚の完全性に影響を与える皮膚病変または状態は、真皮からの表皮の分離を減少させる可能性がある。これにより、生存可能な細胞の収率が低下したり、非KC細胞(例えば、免疫細胞)の汚染が増加したりする可能性があります。最後に、分離された K は束に影響を受けやすくなります。また、大量細胞メトリーやその他の単一細胞分析を処理する前に、氷上またはRTに長時間放置すると細胞生存率を失う可能性があります。

質量サイトメトリーの染色方法は、蛍光フローサイトメトリーに用いられるものと似ていますが、主な違いがあります。例えば、DNA複製の検出は、BrdUのようなヌクレオチド類似体に対する抗体を使用する代わりに、IdUの直接検出によって達成される。IdUの直接検出は、BrdUの抗体検出が関与する手順であることができるため、S相細胞の同定を大幅に簡素化する。もう一つの違いは、死んだ細胞と生きている細胞の差別のためのシスプラチンの使用です。シスプラチンは、優先的に死んだ細胞を標識します。このステップは、死んだ/ライブFACS実験のためのPIまたは他の汚れの使用に似ています。死細胞は抗体を結合し、それによって偽陽性シグナルを生成する可能性があるため、シスプラチン染色工程は重要です。質量サイトメトリーはまた、DNA含有量を測定する代わりに位相特異的マーカーの発現を検出するために抗体を使用します。これにより、個々の細胞周期相の顔の差別が可能になります。最後に、質量サイトメトリーデータ(FCS)ファイルは、同じ実行中および実行間にCyTOF計測器の時間の経過に伴うサンプル信号の劣化に起因するキャリブレーションビーズのスパイクを使用して正規化する必要があります。

染色、データ取得、および質量サイトメトリーの分析は、最近の出版物14,15によってよくレビューされている。この技術を血行細胞および免疫細胞の分析に応用することは十分に文書化されている。これは、市販の金属タグ付き抗体の大規模なコレクションと、この技術を使用して免疫関連の出版物の優位性によって明らかです。皮膚における大量細胞メトリーの即時の適用は、免疫細胞の分析のためであろう。これは、炎症が重要な役割を持つ癌のような疾患におけるマウスの皮膚モデルに特に関連する。非免疫細胞分析の場合、市販の金属タグ付き抗体の欠如が障害となる可能性があります。市販の試薬の利点は、ハウスメタルタグ抗体の場合と同様に、かなりの最適化なしで使用できることです。しかし、一般的に使用される蛍光タグ(例えば、FITC、PE、APC)に対する金属タグ付き抗体があり、実験者は染色パネルにマーカーを追加することができます。この回避策は、種間で反応性を示す市販の金属タグ付き抗体の数が限られている異なる種の皮膚細胞の分析にも適用できます。それにもかかわらず、この回避策はまた、シスプラチン染色といくつかの最適化の後に追加の染色ステップを必要とします。成功したパネルを構築するための追加の考慮事項は、文献14で説明されています。質量サイトメトリーのもう一つの欠点は、質量サイトメータのデータ収集効率が入力細胞数の40〜60%になることができる点である。したがって、バルクサンプルからの希少細胞集団(例えば、幹細胞)の分析は、より多くの細胞を必要とし、効果的な検出のためのサンプルのプール、または質量サイトメトリーの染色前に目的とする細胞集団を豊かにする他のアプローチを必要とする場合があります。24.

質量サイトメトリーは、その使用が成長し続ける強力な新興技術です。現在、この技術の応用は金属タグ付き抗体の使用に焦点を当てているが、最近mRNA31の検出のために拡張された。さらに、他の細胞成分や代謝産物を金属タグで標識する可能性があり、これはマウス、ヒト、および他の種から皮膚および他の組織における集団細胞メトリーへの応用範囲を拡大する。要約すると、このプロトコルは、皮膚生物学者が様々な細胞周期相相においてKCタンパク質発現を相関させるために利用可能な実験ツールを拡張してもよい。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

この研究のサポートは、コロラド大学とコロラド大学(UC)皮膚疾患センターの再生医学のためのゲートセンター、皮膚科から来ました (NIAMS P30 AR00 AR057212).著者らは、UCがんセンターフローサイトメトリー共有リソースとサポート助成金(NCI P30 CA046934)を認め、カレン・ヘルムとクリスティン・チャイルズのフローと質量サイトメトリックに関する専門家のアドバイスに感謝しています。技術。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

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References

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発生生物学 問題 147 細胞周期 表皮 皮膚 ケラチノサイト単離 マウスモデル 質量サイトメトリー 増殖 タンパク質発現の相関 単一細胞分析
質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色
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Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

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