Summary
Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.
Abstract
O objetivo deste protocolo é detectar e quantificar mudanças da expressão da proteína em uma maneira ciclo-dependente da pilha usando únicas pilhas isoladas da epiderme da pele do rato. Há sete etapas importantes: separação da epiderme da derme, digestão da epiderme, coloração das populações de células epidérmicas com cisplatina, amostra de Barcoding, coloração com anticorpos marcados com metal para marcadores de ciclo celular e proteínas de interesse, deteção de anticorpos metal-etiquetados pela citometria maciça, e a análise da expressão nas várias fases do ciclo de pilha. A vantagem desta aproximação sobre métodos histológicos é o potencial para ensaiar o teste padrão da expressão de > 40 marcadores diferentes em uma única pilha em fases diferentes do ciclo da pilha. Essa abordagem também permite a análise de correlação multivariada da expressão protéica que é mais quantificável do que os métodos histológicos/de imagem. A desvantagem deste protocolo é que uma suspensão de células individuais é necessária, o que resulta na perda de informações de localização fornecidas pela coloração de seções de tecido. Essa abordagem também pode requerer a inclusão de marcadores adicionais para identificar diferentes tipos de células em suspensões de células brutas. A aplicação deste protocolo é evidente na análise de modelos hyperplastic da doença de pele. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise do subtipo específico de pilhas (por exemplo, pilhas de haste) pela adição de anticorpos linhagem-específicos. Este protocolo também pode ser adaptado para a análise de células cutâneas em outras espécies experimentais.
Introduction
A correlação da expressão gênica com os estágios do ciclo celular continua sendo um desafio na análise de modelos animais de doenças hiperplásicas como o câncer. Parte deste desafio é a codetecção de proteínas de interesse (POI) com marcadores de proliferação. Células proliferativas podem ser encontradas em várias fases do ciclo celular, incluindo G1, S, G2 e M. o 67 é um dos marcadores mais comumente usados de proliferação e é expressa em todas as fases do ciclo celular. Tem sido amplamente utilizado na análise dos tecidos humanos e do camundongo1,2,3. No entanto, como outros marcadores de proliferação geral, o 67 não discernir as fases individuais do ciclo celular. Uma aproximação mais precisa usa a incorporação de análogos do nucleotide do timidina como bromodeoxyuridine (BrdU) em pilhas que estão replicando ativamente seu genoma (isto é, S-fase)4,5. Uma desvantagem para o uso de análogos de nucleotídeo é a necessidade de administrá-los a animais vivos horas antes da análise. O 67 e o BrdU são comumente detectados em seções de tecidos fixos pelo uso de anticorpos. Uma vantagem desta aproximação é que a posição dos POIs pode ser verificada dentro da arquitetura do tecido (por exemplo, a camada básica de epiderme da pele). Esta aproximação igualmente não exige a dissociação do tecido que pode conduzir às mudanças na expressão de Gene. Uma desvantagem é que a fixação do tecido ou o processamento do tecido para OCT congelado ou corte de parafina podem oclusos alvos de anticorpos (ou seja, antígenos). A recuperação de antígenos normalmente requer digestão de calor ou tecido. A quantificação das intensidades de coloração também pode ser desafiadora. Isto é devido às variações na mancha, na espessura de seção, na deteção do sinal, e no viés do experimentador. Além disso, um número limitado de marcadores pode ser detectado simultaneamente na maioria das configurações de laboratório típicas. No entanto, novas abordagens de coloração multiplex prometem superar essas limitações; exemplos são citometria de massa por imagem e amplificação de sinaldetiramida6,7.
A citometria de fluxo é outra tecnologia poderosa para detectar células proliferantes. Permite a deteção multiplex dos marcadores nas mesmas pilhas mas exige a dissociação do tecido para a maioria de tipos não-hematopoietic da pilha. A análise de células proliferantes é feita rotineiramente pelo uso de corantes que ligam o DNA (por exemplo, iodeto de Propiídio (PI))8. A citometria de fluxo também permite uma determinação mais precisa das fases do ciclo celular quando associada à detecção da incorporação de BrdU9. Embora uma abordagem poderosa, a citometria de fluxo de BrdU/PI tem suas desvantagens. Não é possível resolver as fases G2/M e G0/G1 sem a inclusão de anticorpos específicos da fase. No entanto, o número de anticorpos que podem ser utilizados é limitado por autofluorescência celular, derrame espectral de emissões de fluoróforo, e o uso de controles de compensação. Essa limitação a marca mais desafiadora e trabalhosa para codetectar a expressão de marcadores de ciclo celular com pis. Uma aproximação mais facile é usar a citometria maciça10,11. Esta tecnologia usa anticorpos conjugados metálicos que têm um espectro de detecção mais estreito. Uma vez que as pilhas são manchadas com os anticorpos metal-etiquetados, são vaporizado, e os metais detectados pela espectrometria maciça do tempo--vôo da citometria (CyTOF). Devido a essas propriedades, a citometria de massa possibilita a detecção multiplex de > 40 marcadores diferentes utilizando as plataformas existentes10,11. Além disso, é possível amostras de código de barras com metais que resultam na poupança de anticorpos preciosos, reduzindo a variabilidade da amostra para a amostra de coloração. Por outro lado, a citometria de massas tem várias desvantagens. Há um número limitado de anticorpos metal-etiquetados comercialmente disponíveis para as pilhas não derivadas do sangue. A quantificação do conteúdo de DNA é menos sensível em comparação com o uso de corantes fluorescentes de DNA e a citometria de massa tem uma faixa dinâmica reduzida de detecção de sinal em comparação com a citometria de fluxo de fluorescência.
O protocolo descrito aqui foi projetado analisar a dinâmica do ciclo de pilha dos queratinócitos recentemente isolados (KCS) da pele do rato e caracterizar a expressão específica da proteína do ciclo de pilha nestas pilhas usando a citometria maciça. Este protocolo também pode ser usado com células cultivadas ou adaptado para outros tipos de células.
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Protocol
A Universidade de Colorado Anschutz Medical campus ' institucional animal Care e use Committee aprovou as experiências animais descritas neste protocolo.
1. os preparativos
- Projete um painel metal-etiquetado do anticorpo. Use o software de design de painel online gratuito12 e inclua 127iododeoxyuridine (IdU), 164DY (DYSPROSIUM) ROTULADO como CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) e 150 Nd (neodímio)-proteína pRETINOBLASTOMASer807/811 (PRB)13. Adicione anticorpos adicionais marcados com metal que não se sobrepõem no sinal de canal14.
- Prepare uma solução de estoque de IdU. Dissolver o pó de IdU a 10 mg/mL em 0,1 N NaOH a 60 ° c. Solução de ações aliquot IdU em tubos de microcentrífuga e congelar a-20 ° c para armazenamento de longo prazo.
- Ajuste o pH da solução de IdU para 7,5 com 12 N HCl imediatamente antes do uso. Teste com uma faixa de pH em uma alíquota de descarte para garantir que a solução esteja em pH 7,5.
Nota: o tempo prolongado (> 5 min) de IdU a pH 7,5 resultará em precipitação e uma alíquota fresca de IdU é necessária quando isso acontece. - Use equipamento de proteção individual apropriado (por exemplo, luvas, jaleco e óculos de segurança) e trabalhe em um armário de segurança ao manusear soluções NaOH ou HCl.
- Ajuste o pH da solução de IdU para 7,5 com 12 N HCl imediatamente antes do uso. Teste com uma faixa de pH em uma alíquota de descarte para garantir que a solução esteja em pH 7,5.
- Prepare uma solução de fixação 2x paraformaldeído (PFA). Combine 5 mL de PBS 10x (pH 7,5) e 1 mL de 16% de PFA com 44 mL de grau molecular puro dH2O (3,2% de concentração final).
Nota: um estoque de PFA pode ser preparado como previamente publicado15 ou comprar 16% estoques livres de contaminar metais.- Use o equipamento de proteção pessoal apropriado e trabalhe em um armário de segurança ao segurar o pó e as soluções de PFA.
- Prepare O bário (BA2 +) 1X PBS livre combinando 5 ml do PBS 10x metal-livre (pH 7,5) com 45 ml da classe molecular pura DH2O.
Nota: a qualidade da PBS e outros reagentes é muito importante para evitar contaminar metais que podem introduzir ruídos de fundo durante a análise dos dados citométricos de massa. - Prepare uma solução de 100 mM de cisplatina. Dissolver 300,5 mg de cisplatina em pó em 10 mL de DMSO. Conservar em alíquotas a-80 ° c. Prepare uma solução de trabalho de cisplatina de 10 mM para experimentos a serem usados em 1 d.
- Prepare soluções de separação da epiderme/derme. Prepare uma solução de stock de 20x Dispase dissolvendo 30 mg em 1 mL de HBSS ou PBS. Filtro esterilizar através de um filtro de 0,22 μm e armazenar em alíquotas a-20 ° c. Prepare uma solução de colagenase tipo IV de 1x em 1 mg/mL em HBSS, esterilize o filtro através de um filtro de 0,22 μm, e armazene alíquotas a-20 ° c.
2. rotulagem da fase S pela incorporação de IdU
- Pese os ratos. Use filhotes neonatais P1-P3 ou camundongos adultos de 8-10 semanas de idade e use camundongos machos ou fêmeas de um C57Bl/6, FVB ou 129 fundos. Determine uma dose em 0,1 mg de IdU (pH 7,5)/g de peso corporal. Por exemplo, um rato de 25 g requer 0,25 mL de IdU.
- Administrar a dose de IdU por injeção intraperitoneal e aguardar 2 h antes da colheita das células. Use uma seringa tuberculina para injetar filhotes neonatais.
Nota: uma dose de 2 mg/mL de IdU pode ser utilizada com células de cultura tecidual com uma incubação de 1 h a 37 ° c antes da colheita e rotulagem para citometria de massas.
3. isolamento de células para rotulagem
- Descongelar soluções de estoque de Dispase e colagenase. Diluir a solução de stock 20x Dispase para 1x (1,5 mg/mL) em HBSS estéreis ou PBS. Mantenha no gelo até pronto para usar.
- Combine 2 volumes de Dispase com 1 volume de colagenase em um volume total que permita que a pele flutue livremente. Por exemplo, a digestão de 5 peles neonatais do rato pode ser flutuada em 8 ml do Dispase 1x com 4 ml do colagenase em um prato de Petri de 100 milímetros.
- Siga os métodos aprovados para eutanizar camundongos experimentais (por exemplo, overdose de isoflurano/Toe pinch check ou CO2 inalação/luxação cervical). Limpe a pele adulta da orelha com uma solução do iodo (veja a tabela dos materiais) e enxague com água estéril quando as pilhas isoladas devem ser usadas para a cultura do tecido.
- Retire cirurgicamente a orelha na base (Figura 1a). Lave as orelhas em PBS estéril quando células isoladas deve ser usado para a cultura do tecido. Coloc em um prato de Petri seco de 100 milímetros.
- Separe cuidadosamente anterior da pele posterior, criando inicialmente um bolso no meio ou borda da área de corte usando fórceps fino e puxando os dois retalhos de pele para além ( Figura 1b-D). Prossiga com as peles anterior e posterior.
Nota: as instruções detalhadas para dissecar a pele neonatal do rato são fornecidas por Litchi et al.16 além disso, o uso de um escopo de dissecação pode auxiliar na separação da pele anterior da posterior e na identificação da epiderme/lados dérmicos de dissecados pele: o cabelo é visível no lado da epiderme, enquanto a derme terá uma aparência gelatinosa. - Coloque cuidadosamente as peles anterior e posterior da orelha com o lado da derme da pele tocando a solução Dispase/Collagenase ( Figura 1e). Use 1 mL para a pele anterior e posterior de uma única orelha por poço de uma placa de cultura de 12 poços. Incubar a 37 ° c por 1 h. Alternativamente, as peles do flutuador na solução do Dispase 1x em 4 ° c para 16-18 h.3
Nota: trabalhe em uma capa da cultura do tecido com a técnica estéril quando as pilhas devem ser cultivadas. - Coloque a pele digerida com o lado da epiderme tocando a superfície de um prato de Petri limpo. Aplainar para fora a pele e deslizar delicadamente a derma fora da epiderme trabalhando do centro às bordas em um teste padrão circular.
- Descartar a derme ou digeri-lo ainda mais para liberar fibroblastos para a cultura do tecido ou análise16.
Nota: a derme será mais escura na aparência e tem uma composição gelatinosa e pegajosa. A derme deve facilmente sair. A falha ou a dificuldade em remover a derma sugerem a digestão insuficiente do tecido. Entretanto, a incubação prolongada no amortecedor da digestão reduzirá a viabilidade da pilha. A epiderme permanecerá no prato de Petri e terá uma aparência branqueada. - Retire suavemente a epiderme agarrando as bordas e retire-a da superfície do prato de Petri. Coloc com cuidado a epiderme na solução pre-warmed do destacamento da pilha (veja a tabela dos materiais) por 5 minutos em 37 ° c ou em 20 minutos em RT. Use 500 μL de solução de descolamento celular para 2 epidermes de orelha adulta por poço de uma placa de cultura de 12 poços e use 750 μL de descolamento celular solução para uma única epiderme neonatal por o poço de uma placa da cultura de 6 poços.
- Segure a epiderme usando fórceps estéril e esfregue arrastando a epiderme contra a parte inferior do prato para dissociar as células. Adicione 1 mL de DMEM contendo 1% de FBS (0, 1 mL) e passe por uma peneira de célula de 40 μm em um tubo de coleta. Enxague bem com um adicional de 2 mL de DMEM e adicione à suspensão celular.
- Centrifugador em 120 x g por 5 min. aspirar o sobrenadante com cuidado.
- Reressuscitem a pelota da pilha em 1-2 mL de DMEM que contem 1% FBS. Determine a célula e% contagens de células ao vivo usando o trypan Blue e um dispositivo de contagem automatizada ou hemociômetro. Células da pelota conforme descrito na etapa 3,11.
Nota: as células podem ser cultivadas em meios de cultura de tecidos apropriados após a etapa 3,12. 17 anos de
4. cisplatina rotulagem para determinar vivo/células mortas
- Ressuscitem 1-3 x 106 células por 1 ml de DMEM contendo 25 μm de cisplatina (2,5 μL de estoque/ml). Incubar durante 1 min e saciar com pipetagem com um volume igual de FBS (por exemplo, 1 mL).
- Centrifugue a 120 x g por 5 min. sobrenadante decante em uma taça contendo lixívia diluída e tubos invertidos para drenar a solução restante para uma toalha de papel. Bata suavemente para liberar a solução restante na pelota e parede lateral do tubo.
- Ressuspender a pelota da pilha em 2 mL de Ba+ 2-PBS livre. Células da pelota conforme descrito em etapa 4,2.
Nota: recomenda-se fixar as células se não puderem ser manchadas imediatamente.
5. fixação de células etiquetadas com cisplatina (opcional)
- Ressuscito 1-3 x 106 cisplatina rotulado células em 1 ml de Ba+ 2-livre de PBS. Células Vortex baixa potência contínua e adicionam gota gota 1 ml (1 volume) do tampão de fixação 2x PFA. Incubar em RT por 10 min em uma plataforma de balanço.
- Células da pelota como descrito na etapa 4,2, mas centrifugar a 500 x g por 5 min.
- Lave as células com 2 mL de Ba+ 2-livre de PBS e células da pelota, conforme descrito na etapa 5,2. Repita o passo 5,3 uma vez.
- Resuspend o pellet em 2 mL de Ba+ 2-livre PBS. Conservar a 4 ° c por < 3 d. Adicionar FBS a 3% (por exemplo, 0,3 mL de FBS/mL de células) do volume total se armazenar mais > 3 d, depois misturar e congelar a-80 ° c.
Nota: a fixação pode afetar a detecção de certos Epitopes. Os efeitos da fixação no sinal do anticorpo precisam de ser determinados empirically.
6. código de barras de amostras (opcional, mas recomendado)
- Células da pelota como descrito em Step 5,2 e, em seguida, ressuscite 1-3 x 106 células em 1 ml de 1x tampão de fixação (ver tabela de materiais). Incubar em RT por 10 min. células da pelota conforme descrito na etapa 5,2.
- Lave as células com 1 mL de tampão de permeabilização de código de barras (ver tabela de materiais). Células da pelota conforme descrito em etapa 5,2. Repita o passo 6,2 uma vez.
- Adicionar 100 μL de tampão de permeabilização de código de barras a códigos de barras (ver tabela de materiais)18 e misture imediatamente enquanto as células da etapa 6,2 são peletização.
- Ressuscitem o pellet celular em 800 μL de tampão de permeabilização de código de barras. Adicione a solução de código de barras às células, misture e incubar em RT por 30 min. células da pelota conforme descrito na etapa 5,2. Lave as células em 2 mL de célula de reserva de coloração (ver tabela de materiais) e pellet novamente.
Nota: até 20 amostras podem ser rotuladas com várias combinações de metais Palladium18. Outras estratégias de código de barras são descritas em outros lugares15.
7. rotulagem de células para citometria de massas
- Ressuscite 1-3 x 106 células em 1 ml de antígeno nuclear coloração solução tampão de trabalho (ver tabela de materiais). Combine amostras em um único tubo para etapas subseqüentes ao usar amostras com código de barras. Incubar em RT por 30 min. pellet conforme descrito na etapa 5,2.
- Ressuscite 1-3 x 106 células em 2 ml de antígeno nuclear que mancha o amortecedor da permeabilização (veja tabela dos materiais). Escala conforme necessário. Por exemplo, use 6 mL do buffer para 10 amostras combinadas com uma contagem de células de 9 x 106 células. Pellet conforme descrito na etapa 5,2.
- Repita o passo 7,2. Vórtice suavemente o pellet celular no volume residual deixado no tubo.
- Adicionar 50 μL de cocktail de anticorpos intracelulares por 1-3 x 106 células. Escala conforme necessário. Por exemplo, use 150 μL do coquetel de anticorpos para 10 amostras combinadas com uma contagem de células de 9 x 106 pilhas. Misture e incubar em RT para 45 min. adicionar 2 mL de pilha de mancha tampão e pellet como descrito na etapa 5,2.
- Resuspend 1-3 x 106 células pellet em 2 ml de célula mancha tampão. Células da pelota conforme descrito em etapa 5,2. Repita o passo 7,5 uma vez.
Nota: outras soluções de tampão podem ser usadas para manchar a membrana extracelular ou os marcadores cytoplasmic e o experimentador podem ter que aperfeiçoar a mancha se há uma necessidade de detectar resumos em posições celulares diferentes. As células também podem ser corrigidas no PFA após a etapa 7,5 ao usar células ao vivo para coloração. - Ressuscitação 1-3 x 106 células em 1 ml de solução de intercalação e armazenar para 1-3 d a 4 ° c.
- Armazene pilhas em-80 ° c no DMSO que contem a solução para > 3 d. pilhas da pelota como descrito em etapa 5,2 se as pilhas estão na solução do intercalação. Ressuspender a pelota (1-3 x 106 células) em 1 ml de células tampão de coloração da pilha e pilhas da pelota como descrito em etapa 5,2. Resuspend pellet em 1 mL de 10% DMSO/90% FBS19, transferência para um criovial, coloque em um isopropanol-congelamento recipiente, e armazenar a-80 ° c.
- Células da pelota conforme descrito em etapa 5,2. Lave 1-3 x 106 células com 2 ml de tampão de coloração celular, peletização conforme descrito na etapa 5,2. Realize duas lavas adicionais com 2 mL de água, peletização conforme descrito na etapa 5,2.
- Diluir a calibração do EQ Perla 1:9 na água (solução do estoque em 3,3 x 105 grânulos/ml).
- Resuspend a pelota da pilha em uma concentração de 1 x 106 Cells/ml com solução diluída do grânulo do EQ. Filtre as células através dos tubos de fluxo de 35 μm.
- Execute amostras no citômetro maciço e adquira dados. Os dados serão depositados em um formato de arquivo padrão de citometria de fluxo (FCS).
8. processamento e análise de arquivos de dados de citometria de massa
- Normalize arquivos FCS. Use um programa gratuito disponível em https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
- Arquivos de FCS com código de barras deconvolute. Separe a população de código de barras agrupada em arquivos com códigos de barra separados com um programa gratuito disponível em https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
- Analise arquivos normalizados de FCS. Use programas comerciais21,22 ou freeware (consulte Web.Stanford.edu/Group/Nolan/Resources.html).
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Representative Results
A tabela 1 mostra os rendimentos e a viabilidade celulares esperados da orelha de camundongo adulto (Figura 1) e da pele neonatal em condições não patológicas. A tabela também mostra dados representativos de animais de um fundo misto C57/126. Espera-se que a pele de outras cepas resultaria em rendimentos de células semelhantes e viabilidades. O rendimento aproximado é dependente da área superficial da pele e indica que a pele neonatal seria uma escolha melhor para experimentos que necessitem de maior número de células (tabela 1). Baixos rendimentos ou viabilidade reduzida (< 50%) indicaria problemas de digestão ou condições experimentais que reduziriam a integridade da pele ou induziriam a morte celular. A cultura de células com meios e suplementos adequados pode ajudar a avaliar a qualidade das preparações KC17.
Após a normalização20 e a despoluição18 dos arquivos do FCS, a gating de dados definirá as populações de células epidérmicas de interesse e demarca as fases individuais do ciclo celular (Figura 2). Em parcelas bivariadas comparando os canais 191ir vs 193ir, as células intactas podem ser bloqueadas no quadrante superior direito (Figura 2a). Traçando o comprimento do evento vs 191ir e selecionando para um conjunto apertado de células perto do eixo 191ir demarks células individuais. Células viáveis são selecionadas em um lote de 195pt vs 193ir Plot por gating para células com baixos níveis de 195pt. A amostra mostrada na Figura 2a tem detritos e aumento da presença de células não viáveis marcadas com cisplatina. Isso pode indicar que a amostra foi sobredigerida, duramente tratada, ou deixada no gelo ou RT por muito tempo antes de coloração para citometria de massa. Os perfis de células cultivadas em tecido tipicamente dão maiores porcentagens de células negativas de 195pt (Figura 2b). Alternativamente, a presença de células positivas de 195pt pode ser esperada se a morte celular de indução for uma característica do modelo experimental e/ou condições.
Idealmente, os marcadores que definem a população de interesse devem ser incluídos na análise de tipos de células específicas. Por exemplo, as células imunes que se espera estarem presentes em suspensões cruas do KC podem ser detectadas pela adição de um anticorpo CD4523 , que detecta células hematopoiéticas (Figura 2C). No que diz respeito ao painel de anticorpos de proliferação13, traçar IDU vs cyclin B1 resolve as fases do ciclo celular (Figura 2C) semelhante ao gráfico de fluxo BrdU/PI padrão (Figura 2D), permitindo a detecção de células S-Phase, G0/G1 e G2/M Populações. Nos lotes IdU vs pHH3, a alta pHH3 positividade identifica as células da fase M. Por fim, a gating células G0/G1 no sinal de alta pRB pode distinguir G0 (quiescente) de células no G1 (Figura 2C, esquerda mais painel).
Tendo identificado as diferentes fases do ciclo celular, então é possível construir uma representação gráfica de perfis de ciclo celular para diferentes tipos de células ou condições experimentais. Por exemplo, perfis de ciclo celular distintos emergem ao comparar populações de células CD45-vs CD45 + (Figura 3a) na suspensão KC mostrada na Figura 2. Como os KCs hiperplásicos esperados encontrados no grupo CD45 apresentaram menos células em G0 e mais células nas fases S, G2 e M3. Em contrapartida, as células imunes da mesma amostra apresentaram populações notáveis em G0 e G1. Além dos perfis do ciclo celular, também é possível a caracterização da expressão gênica em uma forma dependente do ciclo celular. Por exemplo, as proteínas de fosho que ajudam a definir a sinalização EGFR e mTOR/PI3K foram analisadas nos dados apresentados para a Figura 3a. A análise das fases G1 das células CD45-vs CD45 + revelou um perfil semelhante para as proteínas de sinalização EGFR e mTOR/PI3K, embora parecesse haver ligeiras diferenças no percentual de células positivas de pS6 e pEGFR (Figura 3B). Abordagens semelhantes podem ser adaptadas para caracterizar a expressão de outras proteínas da via de sinalização ou processos celulares em diferentes fases do ciclo celular.
Figura 1 : Preparação da pele da orelha do rato para a digestão. (A) primeiro, retire a orelha do animal e coloque-a num prato de Petri limpo. (B) Segure um lado da orelha no meio ou na borda usando o fórceps curvado da precisão. (C) lanç sobre e usando um outro par de fórceps e puxe delicadamente as metades da orelha distante até que a orelha rasgue no vinco. (D) Continue puxando até que os lados se separem em duas metades. (E) flutue as metades da orelha em meios da dissociação com o lado da derma que toca na solução. Barra de escala = 2 mm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Estratégia de gating para dados da citometria maciça. Os dados desta figura foram gerados a partir de um animal experimental tratado com o éster de forbol TPA como descrito anteriormente3. TPA é um ativador PKC que induz a inflamação da pele24. (A) os painéis mostram a estratégia de gating inicial após a normalização e a desvolução de dados com código de barras. Por gating no comprimento do evento, 191ir,193ir, e 195pt canais, é possível selecionar para intacto, único, e células viáveis. (B) células de SCC SRB-P93 tratadas com DMSO e, em seguida, foram coradas para citometria de massas. Os dados foram bloqueados como em (a) e o gráfico mostra os níveis de células ao vivo nesta amostra. (C) a inclusão de marcadores de linhagem permite a seleção de populações de células de interesse. Para este exemplo, as células viáveis de (a) foram bloqueadas no comprimento do evento versus CD45 para excluir células hematopoiéticas. Gating CD45-as pilhas para a incorporação de IdU contra CYCLIN B1 permitem a identificação de populações da pilha de S, de G0/G1, e de G2/M. A seleção de células elevadas de pHH3 define a fase M, enquanto a análise de G0/G1 para a positividade do pRB identifica as células no G1. (D) a parcela mostra os resultados representativos da análise do ciclo celular pela detecção de incorporação de BrdU e PI (conteúdo de DNA) com citometria de fluxo à base de fluorescência. Os dados mostrados são das células humanas Colo163 SCC cultivadas com BrdU por 1 h como descrito anteriormente3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Caracterização de perfis de ciclo celular e expressão protéica de fase específica. (A) os perfis do ciclo celular foram determinados na amostra da Figura 2 para as células CD45-vs cd45 +. (B) a análise das fases do G1 com anticorpos fosfatados específicos nas células CD45-(laranja) e CD45 + (azul) revelou perfis de expressão semelhantes para marcadores das vias de sinalização EGFR e mTOR/PI3K. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tecido | Área | Rendimento celular | Viabilidade |
| Orelha do rato | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% de |
| Pele neonatal | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% de |
Tabela 1: rendimentos típicos de células e viabilidade de orelha de rato adulto e pele neonatal. As contagens e a viabilidade da pilha pela exclusão azul de trypan foram médias dos KCs da orelha colhidas das orelhas de rato adultas velhas de n = 7 8-10 semanas ou das peles neonatais de n = 7 P3.
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Discussion
O protocolo esboçado neste papel pode ser terminado em aproximadamente 8 h. O resultado final é uma suspensão de células enriquecidas em KCs que podem ser analisadas para a expressão protéica de forma dependente do ciclo celular. Vários estudos anteriores têm delineado métodos para isolar KCS da pele humana e do rato16,25. Esses estudos também incluem protocolos para o isolamento de KCs para citometria de fluxo26. Entretanto, um protocolo detalhado não foi descrito previamente que combine o isolamento dos KCs com a análise da expressão da proteína e da dinâmica do ciclo de pilha usando a citometria maciça.
O maior obstáculo para a obtenção de resultados de alta qualidade neste protocolo é a qualidade das células ao vivo utilizadas. Na literatura, as condições e enzimas sugeridas para a separação da epiderme/derme variam muito16,25,26,27. No entanto, recomenda-se, portanto, manter o tempo de digestão da pele para a menor duração possível que permite a separação efetiva da epiderme da derme. Este protocolo apresenta a digestão com Dispase e o tipo colagenase de IV que permite a separação facile da pele neonatal da orelha e do rato dentro de 1 h. Isso resulta em rendimentos de células suficientes com alta viabilidade celular. Outro fator que pode afetar a qualidade das células é a localização da pele selecionada para a digestão. Supõe-se que os KCs se comportam similarmente das posições anatômicas diferentes no corpo. No entanto, a pele em diferentes locais pode ter propriedades diferentes e composição de células-tronco28,29. No entanto, o uso da pele neonatal e da orelha3,30 é preferível porque o isolamento de KCS é mais difícil de áreas de pele com uma alta densidade de folículos pilosos (por exemplo, pele traseira). Um maior grau de manipulação ou dissociação tecidual pode ser necessário para o isolamento eficiente de KCs de áreas peludas do mouse26. As condições experimentais antes da isolação de KCs podem igualmente afetar a qualidade de pilhas isoladas. Lesões cutâneas ou condições que afetam a barreira cutânea ou a integridade da pele podem reduzir a separação da epiderme da derme. Isso pode resultar em rendimentos reduzidos de células viáveis ou aumento da contaminação de células não-KC (por exemplo, células imunes). Por fim, os KCs isolados são suscetíveis a aglutintar. Podem igualmente perder a viabilidade da pilha se deixada demasiado por muito tempo no gelo ou no RT antes de processar para a citometria maciça ou a outra única análise da pilha.
A metodologia de coloração para citometria de massas é semelhante àquela utilizada para citometria de fluxo de fluorescência, mas com diferenças principais. Por exemplo, a deteção da replicação do ADN é realizada pela Deteção direta do IdU em vez pelo uso dos anticorpos de encontro aos análogos do nucleotide como BrdU. A deteção direta de IdU simplifica extremamente a identificação de pilhas da S-fase, porque a deteção do anticorpo de BrdU pode ser um procedimento involvido. Outra diferença é o uso de cisplatina para a discriminação de células mortas e ao vivo. Cisplatina preferencialmente rótulos células mortas. Esta etapa é similar ao uso do PI ou de outras manchas para experiências mortas/ao vivo de FACS. A cisplatina que mancha a etapa é importante porque as pilhas inoperantes podem ligar anticorpos e gerar desse modo sinais positivos falsos. A citometria de massa também usa anticorpos para detectar a expressão do marcador específico de fase no lugar da medição do conteúdo de DNA. Isto permite a discriminação facile de fases individuais do ciclo de pilha. Por fim, os arquivos de dados de citometria de massa (FCS) precisam ser normalizados usando o pico em grânulos de calibração devido à deterioração do sinal da amostra ao longo do tempo no instrumento CyTOF durante a mesma corrida e entre as corridas.
A coloração, a aquisição de dados, e a análise para a citometria maciça foram revisadas bem por publicações recentes14,15. A aplicação desta tecnologia para a análise de células hematopoiéticas e imunes está bem documentada. Isto é evidente por uma grande coleção de anticorpos metal-etiquetados comercialmente disponíveis e pela predominância de publicações imune-relacionadas usando esta tecnologia. A aplicação imediata da citometria de massa na pele seria para a análise de células imunes. Isto é particularmente relevante para modelos de pele de rato em doenças como o cancro onde a inflamação tem um papel importante. Para a análise não-imune da pilha, a falta de anticorpos metal-etiquetados comercialmente disponíveis pode ser um obstáculo. A vantagem de reagentes comerciais é que eles podem ser usados sem otimização considerável como seria o caso para em casa anticorpos etiquetados com metal. Entretanto, há anticorpos metal-etiquetados de encontro às etiquetas fluorescentes comumente usadas (por exemplo, FITC, PE, e APC) que permitisse que um experimentador adicione marcadores adicionais a seu painel de coloração. Esta solução alternativa também pode ser aplicada à análise de células da pele em diferentes espécies, onde pode haver um número limitado de anticorpos comerciais marcados com metal que mostram reatividade entre espécies. No entanto, esta solução alternativa também requer uma etapa de coloração adicional após a coloração de cisplatina e alguma otimização. Uma consideração adicional para construir um painel bem sucedido é discutida na literatura14. Outra desvantagem da citometria de massas é que a eficiência de coleta de dados dos citométricos de massa pode ser de 40-60% do número de células de entrada. Como tal, a análise de populações raras da pilha (por exemplo, pilhas de haste) das amostras maiorias pode exigir um número maior de pilhas, agrupamento das amostras para a deteção eficaz, ou outras aproximações para enriquecer a população da pilha do interesse antes da mancha para a citometria maciça a 24.
A citometria de massas é uma poderosa tecnologia emergente cujo uso continuará a crescer. Atualmente, a aplicação desta tecnologia está focada no uso de anticorpos etiquetados com metal, mas foi recentemente estendido para a detecção de mRNA31. Além disso, há o potencial de rotulagem de outros componentes celulares ou metabólitos com marcas de metal, o que expandiria a gama de aplicação para a citometria de massa na pele e outros tecidos de camundongos, humanos e outras espécies. Em resumo, este protocolo pode então estender as ferramentas experimentais disponíveis para que os biólogos da pele correlacionam a expressão da proteína de KC nas várias fases do ciclo celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O apoio para este trabalho veio do departamento de Dermatologia, o centro de Gates para medicina regenerativa da Universidade do Colorado e da Universidade do Colorado (UC) pele Disease Center morfologia e núcleos de fenotipagem (NIAMS p30 AR057212). Os autores reconhecem o recurso compartilhado da citometria de fluxo do centro do cancro UC e a concessão da sustentação (NCI p30 CA046934) para a operação do citômetro maciço e são gratos para Karen Helm e Christine Childs no núcleo para seu conselho perito no fluxo e na massa cytometric do Técnicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
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