Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии

Published: May 9, 2019 doi: 10.3791/59353
Automatic Translation
1, 1
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Этот протокол описывает, как изолировать кератиноциты кожи от моделей мыши, пятно с металлическими помеченными антителами, и анализировать окрашенные клетки массой цитометрии, чтобы профилировать экспрессионную модель белков, представляющих интерес в различных фазах клеточного цикла.

Abstract

Целью этого протокола является обнаружение и количественное определение изменений экспрессии белка в зависимости от клеточного цикла с использованием одиночных клеток, выделенных из эпидермиса мышиной кожи. Есть семь важных шагов: отделение эпидермиса от дермы, переваривание эпидермиса, окрашивание популяций эпидермальных клеток цисплатином, проба баркодирования, окрашивание металлическими помеченными антителами для маркеров клеточного цикла и белков интерес, обнаружение металлических антител с помощью массовой цитометрии и анализ экспрессии в различных фазах клеточного цикла. Преимуществом этого подхода над гистологическими методами является возможность анализировать шаблон выражения в одной клетке на разных этапах клеточного цикла. Этот подход также позволяет многовариантный анализ корреляции экспрессии белка, что является более количественной, чем гистологические / методы визуализации. Недостатком этого протокола является то, что приостановка одиночных клеток необходима, что приводит к потере информации о местоположении, предоставляемой окрашиванием секций тканей. Такой подход может также потребовать включения дополнительных маркеров для определения различных типов клеток в сырых суспензиях клеток. Применение этого протокола проявляется в анализе моделей гиперпластических кожных заболеваний. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для анализа конкретных подтипов клеток (например, стволовых клеток) путем добавления линейных антител. Этот протокол также может быть адаптирован для анализа клеток кожи у других экспериментальных видов.

Introduction

Корреляция экспрессии генов с стадиями клеточного цикла остается проблемой при анализе моделей животных гиперпластических заболеваний, таких как рак. Частью этой проблемы является совместное обнаружение белков, представляющих интерес (POI) с маркерами распространения. Пролиферативные клетки могут быть найдены в различных фазах клеточного цикла, включая G1, S, G2 и M. Ki67 является одним из наиболее часто используемых маркеров распространения и выражается во всех фазах клеточного цикла. Он широко используется в анализе как человеческих,так и мышей тканей 1,2,3. Однако, как и другие общие маркеры распространения, Ki67 не различить отдельные фазы цикла клеток. Более точный подход использует включение аналогов тимидина нуклеотида, таких как Bromodeoxyuridine (BrdU) в клетки, которые активно реплицируют их геном (т.е. S-фаза)4,5. Одним из недостатков использования нуклеотидных аналогов является необходимость введения их живым животным за несколько часов до анализа. Ki67 и BrdU обычно обнаруживаются на стационарных участках ткани с помощью антител. Одним из преимуществ такого подхода является то, что расположение POIs может быть установлено в архитектуре тканей (например, базальный слой эпидермиса кожи). Этот подход также не требует диссоциации тканей, что может привести к изменениям в экспрессии генов. Одним из недостатков является то, что фиксация тканей или обработка ткани для OCT замороженных или парафинов секции может окклюзии антитела целей (т.е. антигены). Извлечение антигенов обычно требует тепла или пищеварения тканей. Количественная оценка окрашивания интенсивности также может быть сложной задачей. Это связано с изменениями в окрашивании, толщине секций, обнаружении сигнала и предвзятости экспериментатора. Кроме того, ограниченное количество маркеров может быть обнаружено одновременно в наиболее типичных лабораторных установках. Тем не менее, новые мультиплексные подходы к окрашиванию обещают преодолеть эти ограничения; примерами являются визуализация массовой цитометриии усиливаем сигнала тирамид6,7.

Цитометрия потока является еще одной мощной технологией для обнаружения размножающихся клеток. Это позволяет мультиплекс обнаружения маркеров в тех же клетках, но требует диссоциации тканей для большинства негематопоиетических типов клеток. Анализ размножающихся клеток обычно осуществляется с помощью красителей, которые связывают ДНК (например, Propidium Iodide (PI))8. Цитометрия потока также позволяет более точное определение фаз клеточного цикла всочетании с обнаружением регистрации BrdU 9. Хотя мощный подход, BrdU / PI потока цитометрии имеет свои недостатки. Он не в состоянии решить G2/M и G0/G1 фазы без включения фазовых антител. Однако количество антител, которые могут быть использованы, ограничено клеточной ауфлуоресценцией, спектральным распространением выбросов фторрора и использованием компенсационного контроля. Это ограничение отмечает более сложным и трудоемким совместное обнаружение выражения маркеров клеточного цикла с помощью POIs. Более поверхностный подход заключается в использовании массовой цитометрии10,11. Эта технология использует металлические конъюгированные антитела, которые имеют более узкий спектр обнаружения. Как только клетки окрашиваются металлическими антителами, они испаряются, а металлы обнаруживаются масс-спектрометрией цитометрии (CyTOF). Благодаря этим свойствам, массовая цитометрия позволяет мультиплекс ночлегобнаружения йgt;40 различных маркеров с использованием существующих платформ10,11. Кроме того, можно проб штрих-кодов с металлами, которые приводят к экономии драгоценных антител при одновременном снижении вариабельности окрашивания образца к образцу. С другой стороны, массовая цитометрия имеет несколько недостатков. Существует ограниченное число коммерчески доступных металлических антител для некровных клеток. Количественная оценка содержания ДНК менее чувствительна по сравнению с использованием флуоресцентных красителей ДНК, а массовая цитометрия имеет уменьшенный динамический диапазон обнаружения сигналов по сравнению с цитометрией потока флуоресценции.

Описанный здесь протокол был разработан для анализа динамики клеточного цикла от недавно изолированных кератиноцитов (KCs) из кожи мыши и характеристики специфического экспрессии белка клеточного цикла в этих клетках с помощью массовой цитометрии. Этот протокол также может быть использован с культивируемыми ячейками или адаптирован к другим типам клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Комитет по институциональному уходу и использованию животных Медицинского кампуса университета Колорадо Аншутц одобрил эксперименты на животных, описанные в этом протоколе.

1. Подготовка

  1. Дизайн металлических помеченных антитела панели. Используйте бесплатное программное обеспечение для разработки панелей12 и включает в себя 127IododeoxyUridine (IdU), 164Dy (Dysprosium) помечены анти-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Лу (Lutetium) фосфо (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), и 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA белокSer807/811 (pRB)13. Добавьте дополнительные металлические антитела, которые не перекрываются в сигнале канала14.
  2. Подготовьте акционерное решение IdU. Растворите порошок IdU при 10 мг/мл при 0,1 Нн НаОХ при 60 градусах Цельсия. Раствор запаса Aliquot IdU в микроцентрифуговых трубках и замораживается при -20 градусов для длительного хранения.
    1. Отрегулируйте рН решения IdU до 7,5 с 12 N HCl непосредственно перед использованием. Тест с полосой рН на отбрасывать aliquot, чтобы убедиться, что решение находится на рН 7.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное время (No gt;5 мин) IdU на рН 7,5 приведет к осадкам и свежий aliquot IdU необходимо, когда это произойдет.
    2. Используйте соответствующее оборудование для индивидуальной защиты (например, перчатки, лабораторное пальто и защитные очки) и работайте в защитном шкафу при работе с решениями NaOH или HCl.
  3. Подготовьте 2x параформальдегид (PFA) фиксирующий раствор. Комбинат 5 мл 10x PBS (pH 7.5) и 1 мл 16% PFA с 44 мл чистого молекулярного класса dH2O (3,2% конечной концентрации).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запас Ы PFA может быть подготовлен, как ранее опубликованные15 или купить 16% запасов, свободных от загрязняющих металлов.
    1. Используйте соответствующее индивидуальное защитное оборудование и работайте в шкафу безопасности при обработке порошка PFA и растворов.
  4. Подготовка бария (Ba2 ")бесплатно 1x PBS путем объединения 5 мл металла бесплатно 10x PBS (pH 7.5) с 45 мл чистого молекулярного класса dH2O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Качество PBS и других реагентов очень важно, чтобы избежать загрязнения металлов, которые могут ввести фоновый шум во время анализа массовых цитометрических данных.
  5. Приготовьте раствор цисплатина объемом 100 мм. Растворите 300,5 мг цисплатинового порошка в 10 мл ДМСО. Хранить в aliquots при -80 градусах по Цельсию. Подготовьте 10 мМ цисплатин рабочего решения для экспериментов, которые будут использоваться в течение 1 г.
  6. Подготовьте решения для разделения эпидермиса/дермы. Подготовьте 20-x растворите в запасе, растворив 30 мг в 1 мл HBSS или PBS. Фильтр стерилизовать через фильтр 0,22 мкм и хранить в aliquots при -20 градусах Цельсия. Подготовьте коллагенеза 1x типа IV при 1 мг/мл в HBSS, процедите стерилизовать через фильтр 0,22 мкм и храните аликвоты при -20 градусов по Цельсию.

2. Маркировка фазы S корпорацией IdU

  1. Взвешивать мышей. Используйте P1-P3 неонатальные щенки или 8-10 недель взрослых мышей и использовать мужчин или женщин мышей из C57BL/6, FvB, или 129 фонов. Определить дозу на 0,1 мг IdU (pH 7.5)/g масса тела. Например, мышь 25 г требует 0,25 мл IdU.
  2. Администрирование дозы IdU путем интраперитонеальной инъекции и ждать 2 ч до сбора клеток. Используйте шприц туберкулина для введения неонатального щенка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доза 2 мг/мл IdU может быть использована с клетками культуры ткани с инкубации 1 ч при 37 градусах Цельсия перед уборкой и маркировкой для массовой цитометрии.

3. Изоляция клеток для маркировки

  1. Оттепель диспазировать и коллагенеза фондовых решений. Разбавить 20x раствор диспасы бульона до 1x (1,5 мг/мл) в стерильных HBSS или PBS. Держите на льду до готовности к использованию.
  2. Объедините 2 тома диспазы с 1 томом коллагенеза в общем объеме, что позволяет коже свободно плавать. Например, переваривание 5 шкур неонатальной мыши можно плавать на 8 мл 1x dispase с 4 мл коллагенана в 100 мм чашку Петри.
  3. Следуйте утвержденным методам эвтаназии экспериментальных мышей (например, передозировка изофлуран/проверка щепотки носка или ингаляция CO 2/вывих шейки матки). Очистите кожу взрослого уха раствором йода (см. ТаблицаМатериалов) и промойте стерильной водой, когда изолированные клетки должны быть использованы для культуры тканей.
  4. Хирургически удалить ухо на базе(рисунок 1A). Промыть уши в стерильных PBS, когда изолированные клетки должны быть использованы для культуры тканей. Поместите на сухую 100 мм чашку Петри.
  5. Отделить тщательно передней от задней кожи, первоначально создавая карман в середине или краю разреза области с помощью тонких щипц и потянув две кожи закрылки друг от друга (Рисунок 1B-D). Продолжить как с передней и задней кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по вскрытию кожи неонатальной мыши предоставляются Litchi et al.16 Кроме того, использование расчленяющей области может помочь в отделении передней от задней кожи и выявлении эпидермиса/дермальных сторон вскрытой кожа: волосы видны на стороне эпидермис в то время как дерма будет иметь желатиновый вид.
  6. Аккуратно поместите передние и задние шкуры уха с дермой стороны кожи касаясь dispase / коллагенеза решение ( Рисунок 1E). Используйте 1 мл как для передней, так и для задней кожи одного уха на колодец 12 хорошо культуры пластины. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 1 ч. В качестве альтернативы, поплавок шкуры на 1x dispase раствор при 4 C для 16-18 ч.3
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работа в капюшоне культуры ткани с стерильной техникой, когда клетки должны быть культивированы.
  7. Поместите переваренный кожи с эпидермис стороны касаясь поверхности чистой чашкой Петри. Сгладить кожу и осторожно сдвиньте дерму с эпидермиса, работая от центра к краям в круговой узор.
  8. Отбросьте дерму или переварить его дальше, чтобы освободить фибробластов для культуры тканей или анализа16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: дерма будет темнее по внешнему виду и имеет желатиновый и липкий состав. Дермы должны легко оторваться. Отказ или трудность в удалении дермы предполагает недостаточное пищеварение тканей. Однако расширенная инкубация в буфере пищеварения снизит жизнеспособность клеток. Эпидермис останется на чашке Петри и будет иметь отбеленный вид.
  9. Аккуратно снимите эпидермис, захватив по краям и снимите его с поверхности чашки Петри. Тщательно поместите эпидермис на предварительно разогретый раствор отслоения клеток (см. Таблица Материалов) в течение 5 мин при 37 КС или 20 мин на RT. Используйте 500 qL раствора отслоения клеток для 2 взрослых эпидермизов уха на скважину 12 хорошо культуры пластины и использовать 750 л отслоения клеток раствор для одного неонатального эпидермиса на скважину 6 хорошо культуры пластины.
  10. Возьмитесь за эпидермис с помощью стерильных щипц и скраб, перетаскивая эпидермиса против нижней части блюда, чтобы разъединить клетки. Добавьте 1 мл DMEM, содержащий 1% FBS (0,01 мл) и пройдите через сито ячейки 40 мкм в коллекторской трубке. Хорошо промыть дополнительными 2 мл DMEM и добавить в суспензию ячейки.
  11. Центрифуга при 120 х г в течение 5 мин. Тщательно аспирируйте супернатант.
  12. Отсеивайте клеточные гранулы в 1-2 мл DMEM, содержащего 1% FBS. Определите количество клеток и % живых клеток с помощью Trypan Blue и гемоситометра или автоматизированного прибора учета. Клетки пеллета, описанные в шаге 3.11.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть культивированы в соответствующих носителей культуры тканей после шага 3.12. 17 Лет

4. Маркировка цисплатина для определения живых/мертвых клеток

  1. Повторно езмите 1-3 х 106 ячеек на 1 мл DMEM, содержащий 25 мкм цисплатин (2,5 л запаса/мл). Инкубировать в течение 1 мин и утолить трубацией с равным объемом FBS (например, 1 мл).
  2. Центрифуга при 120 х г в течение 5 мин. Декант супернатант в стакан, содержащий разбавленный отбеливатель и инвертные трубки, чтобы слить оставшийся раствор на бумажное полотенце. Нажмите осторожно, чтобы освободить решение, оставшееся на гранулы и боковины трубки.
  3. Resuspend клеточные гранулы в 2 мл BaNo 2-бесплатно PBS. Клетки пеллета, как описано в шаге 4.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется исправить клетки, если они не могут быть окрашены немедленно.

5. Фиксация цисплатинпомеченных клеток (по желанию)

  1. Resuspend 1-3 х 106 цисплатин помечены клетки в 1 мл BaNo 2-бесплатно PBS. Vortex клетки при непрерывной низкой мощности и добавить dropwise 1 мл (1 объем) из 2x PFA фиксирования буфера. Инкубировать на RT в течение 10 минут на качалке платформы.
  2. Клетки пеллет, как описано в шаге 4.2, но центрифуга на 500 х г в течение 5 мин.
  3. Вымойте клетки с 2 мл BaNo 2-свободных PBS и клетки гранул, как описано в шаге 5.2. Повторите шаг 5.3 один раз.
  4. Приостановите гранулы в 2 мл от BaNo2-бесплатно PBS. Храните при 4-c для злт;3 d. Добавить FBS до 3% (например, 0,3 мл FBS/мл клеток) от общего объема при хранении дольше, 3 d, затем перемешать и заморозить при -80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация может повлиять на обнаружение некоторых эпитопов. Эффекты фиксации на сигнале антител необходимо определить эмпирически.

6. Штрихокодирование образцов (необязательно, но рекомендуется)

  1. Клетки пеллет, как описано в шаге 5.2, а затем resuspend 1-3 х 106 ячеек в 1 мл 1x Fixation буфера (см. Таблица материалов). Инкубировать на RT в течение 10 мин. Пелле клетки, как описано в шаге 5.2.
  2. Вымойте ячейки с 1 мл буфера проникания штрих-кодов (см. Таблицаматериалов). Клетки пеллета, как описано в шаге 5.2. Повторите шаг 6.2 один раз.
  3. Добавьте 100 зликодах буфера проникания штрих-кодов к штрихкодам (см. ТаблицуМатериалов)18 и немедленно перемешайте, пока клетки из шага 6.2 гранулируются.
  4. Повторное использование клеточных гранул в 800 л буфера проникания штрих-кода. Добавьте раствор штрих-кода в клетки, перемешайте и инкубифицировать на RT в течение 30 мин. Клетки пеллета, как описано в шаге 5.2. Вымойте клетки в 2 мл клеточного буфера окрашивания (см. Таблицаматериалов) и гранулы снова.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До 20 образцов могут быть помечены различными комбинациями металлов палладия18. Другие стратегии штрихкодирования описаны в другом месте15.

7. Маркировка клеток для массовой цитометрии

  1. Resuspend 1-3 х 106 клеток в 1 мл ядерного антигена окрашивания буфера рабочего решения (см. Таблица материалов). Объедините образцы в одну трубку для последующих шагов при использовании образцов со штрих-кодом. Инкубировать на RT в течение 30 мин. Пелле, как описано в шаге 5.2.
  2. Resuspend 1-3 х 106 клеток в 2 мл ядерного антигена окрашивания permeabilization буфера (см. Таблица материалов). Масштабирование по мере необходимости. Например, используйте 6 мл буфера для 10 комбинированных образцов с количеством клеток 9 х 106 ячеек. Пелле, как описано в шаге 5.2.
  3. Повторите шаг 7.2. Аккуратно вихрем клетки гранулы в остаточном объеме, оставленном в трубке.
  4. Добавьте 50 кл внутриклеточного антитела коктейль на 1-3 х 106 клеток. Масштабирование по мере необходимости. Например, используйте 150 кл антитела коктейль для 10 комбинированных образцов с количеством клеток 9 х 106 клеток. Смешайте и инкубировать на RT в течение 45 мин. Добавить 2 мл клеточного окрашивания буфера и гранулы, как описано в шаге 5.2.
  5. Отдохните 1-3 x 106 ячеек гранулы в 2 мл клеточного буфера окрашивания. Клетки пеллета, как описано в шаге 5.2. Повторите шаг 7.5 один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие буферные решения могут быть использованы для окрашивания внеклеточной мембраны или цитоплазмических маркеров и экспериментатор, возможно, придется оптимизировать окрашивание, если есть необходимость обнаружить эпитопы в различных клеточных местах. Клетки также могут быть исправлены в PFA после шага 7.5 при использовании живых клеток для окрашивания.
  6. Отдохните 1-3 x 106 ячеек в 1 мл межкалуационного раствора и храните 1-3 г при 4 градусах Цельсия.
    1. Храните клетки при -80 градусах по Цельсию в DMSO, содержащий раствор для клеток ,3 d. Пелле, как описано в Шаге 5.2, если клетки находятся в растворе интеркалации. Resuspend гранулы (1-3 х 106 клеток) в 1 мл клеточного окрашивающего буфера и клеток гранул, как описано в шаге 5.2. Resuspend гранулы в 1 мл 10% DMSO/90% FBS19, передача на кривиной, место в изопропанол-замораживания контейнера, и хранить при -80 градусов по Цельсию.
  7. Клетки пеллета, как описано в шаге 5.2. Вымойте 1-3 х 106 ячеек с 2 мл клеточного буфера окрашивания, гранулы, как описано в шаге 5.2. Выполните два дополнительных моетания с 2 мл воды, гранулы, как описано в шаге 5.2.
  8. Разбавлять ээш-бисер 1:9 в воде (запасной раствор на 3,3 х 105 бусин/мл).
  9. Приостановите действие клеточных гранул в концентрации 1 х 106 ячеек/мл с разбавленным раствором биса эквалайзера. Фильтр клетки через 35 мкм ситечко крышка потока труб.
  10. Запустите образцы на масс-цитометре и приобретите данные. Данные будут депонированы в формате flow Cytometry Standard (FCS).

8. Обработка и анализ файлов данных массовой цитометрии

  1. Нормализация файлов FCS. Воспользуйтесь бесплатной программой, доступной вhttps://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest 20
  2. Deconvolute штрих-кодирует файлы FCS. Разделите объединенные группы штрих-кодов на отдельные штрих-кодированные файлы с бесплатной программой, доступной вhttps://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest 18
  3. Анализ нормализованных файлов FCS. Используйте коммерческие21,22 или бесплатные программы (см. web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Таблица 1 показывает ожидаемые выходы клеток и жизнеспособность от взрослого мышле(рисунок1) и неонатальной кожи в непатологических условиях. В таблице также показаны репрезентативные данные животных со смешанного фона C57/126. Ожидается, что кожа других штаммов приведет к аналогичным урожайности клеток и viabilities. Приблизительный выход зависит от площади поверхности кожи и указывает на то, что неонатальная кожа будет лучшим выбором для экспериментов, которые требуют большего количества клеток (Таблица 1). Низкая доходность или снижение жизнеспособности (0,50%) будет указывать на проблемы с пищеварением или экспериментальных условиях, которые снижают целостность кожи или вызывают гибель клеток. Культивирование клеток с соответствующими носителями и добавками может помочь оценить качество препаратов KC17.

После нормализации20 и депонвуляции18 файлов FCS, gating данных будет определять эпидермальные популяции клеток, представляющих интерес и демаркировать отдельные фазы клеточного цикла (рисунок2). В бивариатных участках, сравнивая 191Ir против 193Ir каналов, нетронутые клетки могут быть закрыты в правом верхнем квадранте (Рисунок 2A). Длина события по сравнению с 191Ir и выбор плотного кластера ячеек вблизи оси 191Ir demarks одиночных ячеек. Жизнеспособные клетки выбираются в участке 195Pt против 193Ir участок gating для клеток с низким уровнем 195Pt. Образец, показанный на рисунке 2A, имеет мусор и увеличенное присутствие цисплатина помечены нежизнеспособных клеток. Это может свидетельствовать о том, что образец был переваренный, жестко обрабатываются, или оставили на льду или RT слишком долго, прежде чем окрашивание для массовой цитометрии. Профили из тканевых культивированных клеток обычно дают более высокий процент 195Pt отрицательных клеток(рисунок 2B). Кроме того, присутствие 195Pt положительных клеток можно ожидать, если индукционная гибель клеток является особенностью экспериментальной модели и / или условий.

В идеале маркеры, определяющие интересуемую популяцию, должны быть включены в анализ конкретных типов клеток. Например, иммунные клетки, которые, как ожидается, будут присутствовать в сырой СК суспензии могут быть обнаружены путем добавления CD4523 антитела, которое обнаруживает гематопоэтиные клетки (Рисунок 2C). Что касается пролиферации антитела панели13, построение IdU против CYCLIN B1 разрешает фазы цикла клеток (Рисунок 2C) похож на стандартный BrdU / PI потока участка (Рисунок 2D), что позволяет обнаружить S-фазы, G0/G1 и G2/M ячейки Населения. В участках IdU vs pHH3 высокая положительность pHH3 определяет фазовые ячейки M. Наконец, gating G0/G1 клетки на высоком сигнале pRB может отличить G0 (quiescent) от ячеек в G1(Рисунок 2C, левая большинство панели).

Определив различные фазы клеточного цикла, можно построить графическое представление профилей клеточного цикла для различных типов клеток или экспериментальных условий. Например, различные профили клеточного цикла возникают при сравнении CD45- против CD45 "популяций клеток (Рисунок 3A) в подвеске KC показано на рисунке 2. Как и ожидалось, гиперпластические KCs, найденные в группе CD45, имели меньше клеток в G0 и больше клеток в S, G2 и M фазах3. В отличие от этого, иммунные клетки из той же выборки имели заметные популяции в G0 и G1. В дополнение к профилям клеточного цикла, характеристика экспрессии гена в клетковом цикле-зависимом образе также по возможности. Например, фосфо-белки, которые помогают определить сигналы EGFR и mTOR/PI3K, были проанализированы в данных, представленных для рисунка 3A. Анализ фаз G1 клеток CD45- против CD45 показал аналогичный профиль для сигнальных белков EGFR и mTOR/PI3K, хотя, как представляется, были небольшие различия в проценте положительных клеток pS6 и pEGFR (Рисунок 3B). Подобные подходы можно адаптировать для характеристики экспрессии других сигнальных белков пути или клеточных процессов на различных этапах клеточного цикла.

Figure 1
Рисунок 1 : Подготовка мышиной кожи уха для пищеварения. (A) Во-первых, удалить ухо от животного и лежал и на чистой чашке Петри. (B) Возьмите одну сторону уха либо на середине или краю с помощью изогнутых щипцвы точность. (C) Переверните и с помощью другой пары щипцы и осторожно потяните половинки уха друг от друга, пока ухо слезы на складке. (D) Продолжайте тянуть до тех пор, пока стороны разделены на две половинки. (E) Float ухо половинки на диссоциации средств с дермы стороны касаясь решения. Шкала бар 2 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Стратегия Gating для данных массовой цитометрии. Данные на этой цифре были получены из экспериментального животного, обработанного phorbol ester TPA, как ранее описано3. TPA является активатором PKC, который вызывает воспаление кожи24. (A) Панели показывают начальную стратегию gating после нормализации и deconvolution штрихкодированных данных. Путем gating на длине случая, 191Ir,193Ir, и 195каналов Pt, по возможности выбрать для неповрежденных, одиночных, и жизнеспособных клеток. (B) Человек SCC SRB-P93 клетки, обработанные DMSO и затем были окрашены для массовой цитометрии. Данные были закрыты, как в (A) и сюжет показывает уровни живых клеток в этом образце. (C) Включение линейных маркеров позволяет для выбора клеточных популяций, представляющих интерес. Для этого примера, жизнеспособные клетки от (A) были закрыты на длину события против CD45, чтобы исключить гематопоиэтитические клетки. Gating CD45- ячейки для включения IdU против CYCLIN B1 позволяет идентифицировать S, G0/G1 и G2/M ячейки населения. Выбор pHH3 высоких ячеек определяет фазу M, в то время как анализ G0/G1 для положительности pRB определяет клетки в G1. (D) Сюжет показывает репрезентативные результаты анализа клеточного цикла путем обнаружения включения BrdU и PI (содержание ДНК) с цитометрией на основе флуоресценции. Данные, показанные из человека Colo163 SCC клеток, выращенных с BrdU для 1 ч, как ранее описано3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Характеристика профилей клеточного цикла и фазового экспрессии белка. (A) Профили клеточного цикла были определены в образце из рисунка 2 для клеток CD45- против CD45. (B) Анализ фаз G1 с фосфоспецифическими антителами в клетках CD45-(оранжевый) и CD45 (Blue) выявил аналогичные профили выражений для маркеров сигнальных путей EGFR и mTOR/PI3K. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Ткани Области Выход ячеек Жизнеспособность
Мышь ухо 225-230 мм3 1-2x106 70-90%
Неонатальная кожа 1000-1100 мм3 5-10x106 80-99%

Таблица 1: Типичные выходы клетки и жизнеспособность от взрослого уха мыши и неонатальной кожи. Количество клеток и жизнеспособность Трипан синий исключение были усреднены из уха KCs собраны из n'7 8-10 недель старых взрослых ушей мыши или n'7 P3 неонатальных шкур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, изложенный в настоящем документе, может быть завершен примерно за 8 ч. Конечным результатом является приостановление клеток, обогащенных в KCs, которые могут быть проанализированы для экспрессии белка в клеточном цикле-зависимым образом. Несколько предыдущих исследований изложили методы изоляции KCs от человека и мыши кожи16,25. Эти исследования также включают протоколы для изоляции KCs для потока цитометрии26. Однако, детальный протокол ранее не был описан, который сочетает в себе изоляцию KCs с анализом экспрессии белка и динамики клеточного цикла с использованием массовой цитометрии.

Самым большим препятствием для получения высококачественных результатов в этом протоколе является качество используемых живых клеток. В литературе, предлагаемые условия и ферменты для эпидермиса / дермы разделения сильно различаются16,25,26,27. Однако, Поэтому рекомендуется держать время пищеварения кожи до кратчайшей возможной продолжительности, что позволяет эффективное отделение эпидермиса от дермы. Этот протокол представляет пищеварение с dispase и тип IV коллагенеза, что позволяет легкое разделение как ухо и мышь неонатальной кожи в течение 1 ч. Это приводит к достаточному выходу клеток с высокой жизнеспособностью клетки. Другим фактором, который может повлиять на качество клеток является расположение кожи, выбранной для пищеварения. Предполагается, что КК ведут себя одинаково из разных анатомических мест в организме. Тем не менее, кожа на разных участках может иметь различные свойства и состав стволовых клеток28,29. Тем не менее, использование неонатальной и ухо кожи3,30 является предпочтительным, поскольку изоляция KCs является более трудным из областей кожи с высокой плотностью волосяных фолликулов (например, задней кожи). Более высокая степень манипуляции или диссоциации тканей может потребоваться для эффективной изоляции KCs от волосатых областей мыши26. Экспериментальные условия до изоляции КК могут также влиять на качество изолированных клеток. Поражения кожи или условия, которые влияют на барьер кожи или целостность кожи может уменьшить отделение эпидермиса от дермы. Это может привести к снижению урожайности жизнеспособных клеток или увеличению загрязнения не-KC клеток (например, иммунных клеток). Наконец, изолированные KCs восприимчивы к слипанию. Они также могут потерять жизнеспособность клеток, если оставить слишком долго на льду или на RT перед обработкой для массовой цитометрии или других анализа одной клетки.

Методология окрашивания для массовой цитометрии аналогична той, которая используется для цитометрии потока флуоресценции, но с ключевыми различиями. Например, обнаружение репликации ДНК достигается путем прямого обнаружения IdU, а не с помощью антител против нуклеотидных аналогов, таких как BrdU. Прямое обнаружение IdU значительно упрощает идентификацию S-фазных клеток, так как обнаружение антител BrdU может быть вовлеченной процедурой. Другим отличием является использование цисплатина для дискриминации мертвых и живых клеток. Цисплатин преимущественно маркирует мертвые клетки. Этот шаг похож на использование PI или других пятен для мертвых / живых экспериментов FACS. Шаг по окрашиванию цисплатина имеет важное значение, поскольку мертвые клетки могут связывать антитела и тем самым генерировать ложноположительные сигналы. Массовая цитометрия также использует антитела для обнаружения экспрессии фазового маркера вместо измерения содержания ДНК. Это позволяет осуществлять поверхностную дискриминацию отдельных фаз клеточного цикла. Наконец, файлы данных о массовой цитометрии (FCS) должны быть нормализованы с помощью всплеска калибровочных бусин из-за износа пробного сигнала с течением времени в инструменте CyTOF во время одного и того же запуска и между пробегами.

Окрашивание, получение данных и анализ массовой цитометрии были хорошо рассмотрены в последних публикациях14,15. Применение этой технологии для анализа гематопоитических и иммунных клеток хорошо документировано. Об этом свидетельствует большая коллекция коммерчески доступных металлических антител и преобладание публикаций, связанных с иммунитетом, с использованием этой технологии. Немедленное применение массовой цитометрии в коже будет для анализа иммунных клеток. Это особенно актуально для моделей кожи мыши при таких заболеваниях, как рак, где воспаление играет важную роль. Для неиммунного анализа клеток, отсутствие коммерчески доступных металлических помеченных антител может быть помехой. Преимущество коммерческих реагентов заключается в том, что они могут использоваться без значительной оптимизации, как это было бы в доме металлических антител. Тем не менее, есть металлические антитела против широко используемых флуоресцентных тегов (например, FITC, PE и APC), которые позволили бы экспериментатору добавить дополнительные маркеры в их окрашивание панели. Этот обходной путь также может быть применен к анализу клеток кожи у различных видов, где может быть ограниченное количество коммерческих металлических помеченных антител, которые показывают реактивность между видами. Тем не менее, этот обходной путь также требует дополнительного шага окрашивания после цисплатинового окрашивания и некоторой оптимизации. Дополнительное соображение для создания успешной панели обсуждаются в литературе14. Еще одним недостатком массовой цитометрии является то, что эффективность сбора данных массовых цитометров может составить 40-60% от числа входных клеток. Таким образом, анализ популяций редких клеток (например, стволовых клеток) из массовых образцов может потребовать большего количества клеток, объединения образцов для эффективного обнаружения или других подходов к обогащению группы, представляющих интерес перед окрашиванием для массовой цитометрии 24.

Массовая цитометрия является мощной развивающейся технологией, использование которой будет продолжать расти. В настоящее время применение этой технологии ориентировано на использование металлических антител, но недавно было продлено для обнаружения мРНК31. Кроме того, существует потенциал маркировки других клеточных компонентов или метаболитов металлическими метками, что расширит диапазон применения массовой цитометрии в коже и других тканях мышей, человека и других видов. Таким образом, этот протокол может затем расширить экспериментальные инструменты, доступные для биологов кожи, чтобы соотнести экспрессию белка KC в различных фазах клеточного цикла.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Поддержка этой работы пришла из Департамента дерматологии, Гейтс Центр регенеративной медицины в Университете Колорадо и Университета Колорадо (UC) Кожных заболеваний центр морфологии и фенотипипинговых корей (NIAMS P30 AR057212). Авторы признают UC онкологический центр потока Цитометрии Общие ресурсы и поддержку гранта (NCI P30 CA046934) для работы массового цитометра и благодарны за Карен Хелм и Кристин Чайлдс в центре за их экспертные советы по потоку и массового цитометрического Методы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plate Cell Treat 229512
Intercalator solution Fluidigm 201192A 125 µM - Ir intercalator solution
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 30525-89-4 16 %  PFA
Strainer cap flow tubes Fisher/Corning 352235 35 µm pore size 
Cell sieve Fisher 22363547 40 μm pore size 
Cell detatchment solution CELLnTEC CnT-ACCUTASE-100 Accutase
Iodine Solution ThermoFisher/Purdue 67618-151-17 Betadine 7.5%-iodine surgical scrub
Barcode permeabilization buffer  Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
Barcodes Fluidigm 201060 Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit
pH strips EMD 9590 colorpHast
DMEM Hyclone SH30022.01 Dulbecco’s Modified Eagle Media
Fine forceps Dumont & Fils 0109-5-PO Dumostar #5
Curved precision forceps Dumont & Fils 0109-7-PO Dumostar #7
Calibration Beads Fluidigm 201078 EQ Four Element Calibration Beads
HBSS Gibco 14175-095 Hank's Balanced Salt Solution
Water Fisher SH30538.03 Hyclone Molecular Biology grade water
Iododeoxyuridine  Sigma I7125 IdU
Cryo vials ThermoFisher 366656PK internal thread
Cell Staining buffer Fluidigm 201068 Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Perm buffer Fluidigm 201067 Maxpar Fix & Perm buffer
Fix I buffer Fluidigm 201065 Maxpar Fix I buffer
Phosphate buffered saline Rockland MB-008 Metal free 10x PBS
isopropanol-freezing container ThermoFisher 5100-0001 Mr.Frosty
Sodium hydroxide Fisher BP359-500 NaOH
Petri dish Kord-Valmark 2900 Supplied by Genesee 32-107 
15 mL conical Olympus/Genesee 28-101
50 mL conical Olympus/Genesee 28-106
6-well plate Cell Treat 229506
Cisplatin Sigma 479306
Dispase II Sigma/Roche 4942078001
DMSO Sigma D2650
FBS Atlanta Biologicals S11150
Hydrochloric acid Fisher A144-212
Nuclear Antigen Staining  permeabilization buffer Fluidigm 201063
Nuclear Antigen Staining buffer Fluidigm 201063
Trypan blue Sigma T8154
Tuberculin syringe BD 309626
Type IV Collagenase  Worthington Bioscience CLSS-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
  2. Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
  3. Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
  4. Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
  5. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  8. Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
  9. Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
  10. Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  11. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
  12. http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
  13. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
  14. Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
  15. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
  16. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
  17. Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
  18. Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
  19. Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
  20. Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
  21. http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
  22. http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
  23. Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
  24. Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
  25. Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
  26. Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
  27. Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
  28. Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
  29. Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
  30. Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
  31. Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).

Tags

Биология развития Выпуск 147 Цикл клеток Эпидермис Кожа Изоляция Кератиноцитов Модели мыши Массовая цитометрия Пролиферация Корреляция экспрессии белка Анализ одноклеточных
Изоляция и окрашивание мыши кожи кератиноцитов для клеточного цикла Специфический анализ выражения клеточного белка массой цитометрии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, J., Torchia, E. C.… More

Fernandez, J., Torchia, E. C. Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59353, doi:10.3791/59353 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter