Summary
Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.
Abstract
Bu protokolün amacı, fare derisinin epidermis izolasyonlu tek hücreleri kullanarak bir hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde protein ifade değişikliklerini algılamak ve ölçmek için. Yedi önemli adım vardır: dermis epidermis ayrılması, epidermis sindirim, cisplatin ile epidermal hücre nüfus boyama, örnek barkodlama, hücre döngüsü işaretçileri ve proteinleri için metal etiketli antikorlar ile boyama faiz, kütle sitometri tarafından metal etiketli antikorların tespiti, ve çeşitli hücre döngüsü aşamalarında ifade analizi. Histolojik yöntemler üzerinde bu yaklaşımın avantajı, hücre döngüsünün farklı aşamalarında tek bir hücrede > 40 farklı işaretçileri ifade deseni tahlil potansiyeldir. Bu yaklaşım, histolojik/görüntüleme yöntemlerinden daha ölçülebilir olan protein ifadesinin çok değişkenli korelasyon analizine de izin verir. Bu protokolün dezavantajı, tek hücrelerin süspansiyonunun gerekli olduğu, bu da doku bölümlerinin boyama tarafından sağlanan konum bilgilerinin kaybına neden olmaktadır. Bu yaklaşım da ham hücre süspansiyonları farklı hücre türlerini tanımlamak için ek işaretçileri eklenmesi gerektirebilir. Bu protokolün uygulanması hiperplastik cilt hastalığı modellerinin analizinde belirgindir. Dahası, bu protokol, belirli alt tür hücrelerin analizi için uyarlanabilir (örn., kök hücreler), köklere özgü antikorların ilavesi ile. Bu protokol Ayrıca diğer deneysel türlerin cilt hücrelerinin analizi için uyarlanabilir.
Introduction
Gen ifadesinin hücre döngüsü aşamaları ile korelasyon, kanser gibi hiperplastik hastalıkların hayvan modellerinin analizinde bir zorluk olarak kalır. Bu zorluk bir parçası proliferasyon işaretçileri ile ilgi proteinlerinin (POı) ortak algılanması olduğunu. Proliferatif hücreler G1, S, G2 ve M. Ki67 dahil olmak üzere çeşitli hücre döngüsü aşamalarında bulunabilir ve proliferasyon en sık kullanılan belirteçleri biridir ve hücre döngüsünün tüm aşamalarında ifade edilir. Hem insan hem de fare dokularında1,2,3analizinde yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, diğer genel proliferasyon işaretçileri gibi, Ki67 bireysel hücre döngüsü aşamalarını ayırt etmez. Daha hassas bir yaklaşım, bromodeoxyuridine (BrdU) gibi, genomu (örn., S-faz)4,5' i aktif olarak çoğalan hücrelere, thymidin nükritit analoglarının birleştirilmesini kullanır. Nükl analoglarının kullanımına yönelik bir dezavantajı, analizden önce hayvanları saatlerce yaşamaları için onları yönetmeniz gerekir. Ki67 ve BrdU genellikle antikor kullanımı ile sabit doku bölümlerinde algılanır. Bu yaklaşımın bir avantajı, POI 'nin konumunun doku mimarisi içinde (örn. Cilt epidermis bazal tabakası) tespit edilebilir olmasıdır. Bu yaklaşım da gen ifadesinde değişikliklere yol açabilir doku ayrışma gerektirmez. Bir dezavantajı, doku fiktosit veya EKIM dondurulmuş veya parafin sekleme için doku işlenmesi antikor hedefleri (yani, antijenler) okclude olabilir. Antijenlerin alınması genellikle ısı veya doku sindirimi gerektirir. Boyama yoğunluklarını ölçmek de zor olabilir. Bu, boyama, kesit kalınlığı, sinyal algılama ve deney giriş önyargı varyasyonları kaynaklanmaktadır. Dahası, çoğu tipik laboratuar kurulumunda aynı anda sınırlı sayıda Marker tespit edilebilir. Henüz, daha yeni Multiplex boyama yaklaşımlar bu sınırlamaları aşmak için söz; örnekler görüntüleme kütlesi sitometri ve tyramid sinyal amplifikasyon6,7.
Akış cytometri Proliferasyona hücreleri algılamak için başka bir güçlü teknolojidir. Aynı hücrelerde işaretçilerin Multiplex tespiti için izin verir ama çoğu olmayan hematopoetik hücre türleri için doku ayrışma gerektirir. Proliferasyon hücrelerinin analizi, DNA 'Yı bağlayan boyaların kullanımı ile rutin olarak yapılır (örn., Propidium Iyodide (PI))8. Akış sitometri Ayrıca BrdU kuruluşunda9algılanması ile birleştiğinde hücre döngüsü aşamalarının daha hassas bir şekilde belirlenmesine izin verir. Güçlü bir yaklaşım olsa da, BrdU/PI akış sitometri dezavantajları vardır. Faz spesifik antikorların eklenmesi olmadan G2/M ve G0/G1 aşamalarını çözemeyebilir. Ancak, kullanılabilecek antikorların sayısı hücresel autofluorescence ile sınırlıdır, fluorophore emisyonları spektral yayılma, ve tazminat kontrolleri kullanımı. Bu sınırlama, hücre döngüsü işaretleyicilerinin POI 'ler ile ifade edilmesini daha zorlu ve zahmetli bir şekilde işaretler. Daha facile bir yaklaşım kitle sitometri10,11kullanmaktır. Bu teknoloji, dar algılama yelpazesine sahip metal konjuge antikorları kullanır. Hücreler metal etiketli antikorlar ile lekelendikten sonra, buharlaştırılmış ve cytometri zaman-of-Flight (CyTOF) kütle spektrometresi tarafından algılanan metaller. Bu özellikler nedeniyle kitle sitometrisi, mevcut platformları10,11kullanarak > 40 farklı işaretçinin Multiplex algılamasını sağlar. Buna ek olarak, numune-Numune boyama değişkenliği azaltarak değerli antikorların tasarrufuna neden metaller ile barkod örnekleri mümkündür. Öte yandan, kitle sitometrisi çeşitli dezavantajları vardır. Non-kan türetilen hücreler için ticari olarak kullanılabilir metal etiketli antikorlar sınırlı sayıda vardır. DNA içeriğinin ölçülme özelliği, floresan DNA boyalarının kullanımına kıyasla daha az hassastır ve kitle sitometri floresan Akış sitometrisi ile karşılaştırıldığında düşük dinamik sinyal algılama aralığına sahiptir.
Burada açıklanan protokol, yeni izole keratinositlerden (KCs) gelen hücre döngüsü dinamiklerini fare derisinden analiz etmek ve kitle sitometrisi kullanarak bu hücrelerde hücre döngüsünün spesifik protein ifadesini karakterize etmek için tasarlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kültürlü hücrelerle de kullanılabilir veya diğer hücre türlerine adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Colorado Üniversitesi Anschutz tıp Kampüsü ' Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi bu protokolde açıklanan hayvan deneylerini onayladı.
1. preparatlar
- Metal etiketli bir antikor paneli tasarlayın. Ücretsiz online panel tasarım yazılımı kullanın12 ve 127iododeoxyuridine dahil (IDU), 164DY (disprosium) etiketli Anti-CCNB1 (cyclin B1), 175lu (Lutetium) Fosfo (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), ve 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA proteinSer807/811 (prb)13. Kanal sinyali14' te örtüşmeyen ek metal etiketli antikorlar ekleyin.
- IdU stok çözümünü hazırlayın. 0,1 N NaOH 'da 60 °C ' de 10 mg/mL 'de IdU tozu çözülür. Uzun süreli saklama için-20 °C ' de mikrosantrifüjli tüplere aliquot IdU Stock solüsyonu donuyor.
- Kullanmadan önce 12 N HCl ile 7,5 için IDU çözeltisi pH değerini ayarlayın. Bir pH şerit ile test solüsyonu sağlamak için bir atma kısım pH 7,5.
Not: uzun süre (> 5 dakika) Idu içinde pH 7,5, yağış ve yeni bir kısım bu olduğunda ihtiyaç duyulacaktır neden olur. - NaOH veya HCl çözümlerini kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipmanları (örn. eldiven, laboratuar ceket ve güvenlik gözlükleri) kullanın ve Güvenlik kabininde çalışın.
- Kullanmadan önce 12 N HCl ile 7,5 için IDU çözeltisi pH değerini ayarlayın. Bir pH şerit ile test solüsyonu sağlamak için bir atma kısım pH 7,5.
- 2x civarında formaldehite (PFA) sabitleme çözeltisi hazırlayın. 5 mL 10X PBS (pH 7,5) ve 1 mL% 16 PFA ile 44 mL saf moleküler Grade dH2O (% 3,2 son konsantrasyon) birleştirin.
Not: daha önce yayımlanan15 veya satın alma 16% stokları kontamine metaller ücretsiz olarak PFA bir stok hazırlanabilir.- PFA tozu ve çözümlerini kullanırken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın ve Güvenlik kabininde çalışın.
- 5 mL metal içermeyen 10X PBS (pH 7,5) ile 45 mL saf moleküler Grade dH2O ile birleştirerek baryum (ba2 +) ücretsiz 1x PBS hazırlayın.
Not: PBS ve diğer reaktiflerin kalitesi, kütle cytometrik verilerin analizi sırasında arka plan gürültüsü sunabilir metaller kontamine önlemek için çok önemlidir. - 100 mM sisplatin stok çözümünü hazırlayın. 10 mL DMSO 'da 300,5 mg sisplatin tozu çözülür. -80 °c ' de plakaya içinde saklayın. 1 d üzerinde kullanılmak üzere deneyler için 10 mM sisplatin çalışma çözümü hazırlayın.
- Epidermis/dermis ayırma çözümlerini hazırlayın. 1 mL HBSS veya PBS 'de 30 mg çözünerek 20X dispase Stock çözümünü hazırlayın. 0,22 μm filtre ile sterilize edilen filtre ve-20 °c ' de plakaya içinde saklayın. HBSS 'de 1 mg/ml 'de 1x tip IV kolajenaz Stock solüsyonu hazırlayın, 0,22 μm filtreli filtre sterilize edin ve-20 °c ' de plakaya 'ı saklayın.
2. IDU kuruluş tarafından S faz etiketleme
- Fareleri tartın. P1-P3 yenidoğan pups veya 8-10 hafta eski yetişkin fareler kullanın ve bir C57BL/6, fvb veya 129 arka planlar erkek veya kadın fareler kullanın. Bir doz belirlemek 0,1 mg IDU (pH 7.5)/g vücut ağırlığı. Örneğin, 25 g fare 0,25 mL IDU gerektirir.
- İntraperitoneal enjeksiyonu ile IDU dozunu yönetin ve hücre hasat etmeden önce 2 saat bekleyin. Yenidoğan yavruları enjekte etmek için tüberkülin şırınga kullanın.
Not: bir doz 2 mg/mL IDU, kütle sitometrisi için hasat ve etiketleme öncesinde 37 °C ' de 1 h inkübasyon ile doku kültürü hücreleri ile kullanılabilir.
3. hücreleri etiketleme için yalıtım
- Çözme dispase ve kolajenaz stok çözümleri. Steril HBSS veya PBS 1x (1,5 mg/mL) için 20X dispase stok solüsyonu seyreltmek. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
- Cilt serbestçe yüzer sağlar toplam hacim 1 hacim kolajenaz ile dispaz 2 hacimleri birleştirin. Örneğin, 5 yenidoğan fare derileri sindirimi 100 mm Petri çanak 4 ml kolajenaz ile 8 ml 1x dispase üzerinde yüzebilir.
- Deneysel fareler (örneğin, Isoflurane aşırı doz/ayak tutam kontrol veya CO2 inhalasyon/servikal dislocation) ötenize için onaylanmış yöntemleri izleyin. Yetişkin kulak cildinizi iyot çözeltisi ile temizleyin ( malzeme tablosunabakın) ve izole hücreler doku kültürü için kullanıldığında steril suyla durulayın.
- Tabanındaki kulağı cerrahi olarak çıkarın (Şekil 1a). İzole hücreler doku kültürü için kullanıldığında steril PBS 'de kulakları durulayın. Kuru 100 mm Petri tabağı üzerine yerleştirin.
- Başlangıçta ince forseps kullanarak kesim alanının ortasında veya kenarında bir cep oluşturarak ve iki deri flep ayırmak ( Şekil 1B-D) arka cilt dikkatle anterior ayrı. Anterior ve posterior derileri ile devam edin.
Not: Yenidoğan fare derisini incelemek için ayrıntılı talimatlar Litchi ve al.16 tarafından sağlanır buna ek olarak, bir diseksiyon kapsamı kullanımı arka deri anterior ayrılması ve disseke epidermis/dermal kenarların tanımlanması yardımcı olabilir Cilt: saç epidermis tarafında görülebilir, dermis bir jelatinli bir görünüme sahip olacak ise. - Dikkatle kulak ön ve arka derileri dispase/collagenase çözeltisi dokunmadan cilt dermis tarafı ile yerleştirin ( Şekil 1E). 12 iyi kültür plakasının iyi başına tek bir kulak hem anterior hem de posterior cilt için 1 mL kullanın. 37 °C ' de 1 saat boyunca kuluçk. alternatif olarak, 4 °C ' de 1x dispase solüsyonu üzerinde float Skins 16-18 h.3
Not: hücreler kültürlü olması gerektiğinde steril tekniği ile bir doku kültürü kaputu çalışma. - Temiz bir petri tabağı yüzeyine dokunmadan epidermis tarafı ile sindirilmiş cilt yerleştirin. Cildi yassılaştırın ve hafifçe dairesel bir desen kenarlarına merkezinden çalışarak epidermis kapalı dermis kaydırın.
- Dermis atmak veya doku kültürü veya analiz için fibroblastlar kurtarmak için daha fazla sindirmek16.
Not: dermis görünümünde koyu olacak ve bir jelatinli ve yapışkan kompozisyon var. Dermis kolayca çıkar. Başarısızlık veya dermis kaldırılması zorluk yetersiz doku sindirim öneriyor. Ancak, sindirim tamponunda genişletilmiş kuluçba hücre viability azaltacaktır. Epidermis Petri tabağı üzerinde kalacaktır ve ağartılmış bir görünüme sahip olacak. - Yavaşça kenarları kaparak epidermis kaldırın ve Petri tabak yüzeyini soymak. Dikkatli bir şekilde ön ısıtılmış hücre dekolmanı solüsyonu (bkz. malzeme tablosu) üzerinde 37 °c ' de 5 dakıka veya RT 'de 20 dakika üzerinde epidermis yerleştirin. 12 iyi kültür plakasının iyi başına 2 Yetişkin kulak epidermisleri Için 500 μL hücre ekme solüsyonu kullanın ve 750 μL hücre dekolmanı kullanın 6 iyi kültür plaka başına tek bir yenidoğan epidermis için çözüm.
- Epidermis hücreleri ayırmak için çanak alt karşı epidermis sürükleyerek steril forseps ve fırçalama kullanarak kavrayın. 1% FBS (0,01 ml) içeren DMEM 1 ml ekleyin ve bir toplama tüpüne 40 μm hücre elek geçirin. Ek bir 2 mL DMEM ile iyi durulayın ve hücre süspansiyon ekleyin.
- 120 x g 'de santrifüjün 5 dk. süpernatant dikkatle aspirate.
- 1% FBS içeren DMEM 1-2 ml resuspend hücre Pelet. Trypan Blue ve hemasitometre veya otomatik sayım cihazı kullanılarak hücre ve% canlı hücre sayılarını belirleyin. 3,11 adımda açıklandığı gibi Pellet hücreleri.
Not: hücreler adım 3,12 sonra uygun doku kültürü medyasında kültürlü olabilir. 17
4. canlı/ölü hücreleri belirlemek için Cisplatin etiketleme
- 25 μM Sisplatin (2,5 μL stok/mL) içeren 1 mL DMEM başına resuspend 1-3 x 106 hücre. Eşit hacimli FBS (örn. 1 mL) ile pipetleme ile 1 dakika boyunca kuluçk ve sönüm.
- 120 x g 'de santrifüjle 5 dk. decant süpernatant seyreltilmiş çamaşır suyu içeren bir kabı ve kağıt havlusu üzerine kalan solüsyonu drenaj Pelet ve tüpün yan duvarında kalan solüsyonu özgürmek için yavaşça dokunun.
- 2 ml ba+ 2-ücretsiz PBS olarak resuspend hücre Pelet. Adım 4,2 ' de açıklandığı gibi Pellet hücreleri.
Not: hemen lekelenemez hücreleri düzeltmek için tavsiye edilir.
5. sisplatin etiketli hücrelerin tespit edilmesi (opsiyonel)
- Resuspend 1-3 x 106 sisplatin etiketli hücreler 1 ml ba+ 2-ücretsiz PBS. Sürekli düşük güç altında Vortex hücreleri ve 2x PFA sabitleme tamponunun dropwise 1 mL (1 hacim) ekleyin. RT 'de 10 dakika boyunca sallanan bir platformda inküye yapın.
- 4,2 adımda açıklandığı gibi Pelet hücreleri, ancak 5 dakika için 500 x g Santrifüjü.
- 2 ml ba+ 2-ücretsiz PBS ve Pelet hücreleriyle, adım 5,2 ' de açıklandığı gibi yıkayın. Adım 5,3 bir kez yineleyin.
- 2 ml ba+ 2-ücretsiz PBS içinde Pelet resuspend. < 3 d için 4 °C ' de saklayın. daha uzun > 3 d depoluyorsanız, toplam hacminin% 3 ' ü (örn. 0,3 mL/mL hücre) FBS ekleyin, ardından-80 °C ' de karıştırın ve dondurabilirsiniz.
Not: Fixation bazı epitopes algılanmasını etkileyebilir. Antikor sinyalinde fiklasyon etkilerinin ampirik olarak belirlenmesi gerekir.
6. numunelerin barcoding (isteğe bağlı ama önerilir)
- Pellet hücreleri açıklandığı gibi adım 5,2 ve sonra pelletini 1-3 x 106 hücreler 1 ml 1x sabitleme tampon (bkz: malzeme tablosu). RT 'de 10 dk. Pellet hücrelerinin adım 5,2 ' de açıklandığı şekilde kulküat.
- 1 mL barkod geçirgen tamponunu içeren hücreleri yıkayın (bkz. malzeme tablosu). Adım 5,2 ' de açıklandığı gibi Pellet hücreleri. Adım 6,2 bir kez yineleyin.
- Ekle 100 barkod geçirgen tampon μL barkodlar (bkz. malzeme tablosu)18 ve mix hemen adım 6,2 hücreleri pelleting iken.
- 800 μL barkod geçirgen tamponunun içinde hücre Pelet resuspend. Hücrelere barkod çözüm ekleyin, mix ve RT 30 dk. Pellet hücreleri olarak açıklanan adım 5,2. 2 ml hücre boyama tampon (bkz. malzeme tablosu) ve Pelet yeniden yıkayın hücreleri.
Not: 20 ' ye kadar örnek Paladyum metaller18çeşitli kombinasyonları ile etiketlenebilir. Diğer barkodlama stratejileri başka bir yerde açıklanmıştır15.
7. kütle sitometri için hücrelerin etiketlenmesi
- Resuspend 1-3 x 106 hücreler 1 ml nükleer antijeni boyama tampon çalışma çözeltisi (bkz. malzeme tablosu). Barkodlu örnekleri kullanırken sonraki adımlar için örnekleri tek bir tüpte birleştirin. Adım 5,2 ' de açıklandığı gibi 30 dk. Pellet için RT 'de kulbirer atın.
- Resuspend 1-3 x 106 hücreler 2 ml nükleer antijeni boyama geçirgen tampon (bkz. malzeme tablosu). Gerektiğinde ölçeklendirin. Örneğin, 9 x 106 hücreli hücre sayısı ile 10 kombine numune Için 6 ml arabellek kullanın. Adım 5,2 ' de açıklandığı gibi Pellet.
- 7,2 adım yineleyin. Tüpte kalan hacimde hücre pelsini hafifçe girdap halinde bırakın.
- 1-3 x 106 hücreler başına 50 μL hücre içi antikor kokteyli ekleyin. Gerektiğinde ölçeklendirin. Örneğin, 9 x 106 hücreli hücre sayısına sahip 10 kombine numune için antikor kokteyli 150 μL kullanın. 45 dk için RT 'de karıştırın ve kulkarın. 5,2 adımda açıklandığı gibi 2 ml hücreli boyama tamponu ve Pelet ekleyin.
- Resuspend 1-3 x 106 hücreler 2 ml hücre boyama tampon içinde Pelet. Adım 5,2 ' de açıklandığı gibi Pellet hücreleri. Adım 7,5 bir kez yineleyin.
Not: diğer tampon çözümleri, farklı hücresel konumlarda epitonlar tespit etmek için bir ihtiyaç varsa boyama ekstrasellüler membran veya sitoplazmik işaretçileri için kullanılabilir ve deney boya optimize etmek zorunda olabilir. Hücreler Ayrıca, boyama için canlı hücreler kullanırken adım 7,5 sonra PFA 'da düzeltilebilir. - 1 mL intercalasyon çözeltisi içinde resuspend 1-3 x 106 hücre ve 4 °c ' de 1-3 d için mağaza.
- > 3 d için çözümü içeren DMSO 'da-80 °c ' de hücre saklayın. hücreler ardalaması çözümünde ise adım 5,2 ' de açıklandığı gibi Pellet hücreleri. Resuspend Pelet (1-3 x 106 hücreler) içinde 1 ml hücre boyama tampon ve Pelet hücreleri açıklandığı gibi adım 5,2. 1 ml% 10 DMSO/90% FBS19' da resuspend Pelet, bir kriyoşişeye transfer, isopropanol-donma konteynırı içine yerleştirin ve-80 °c ' de saklayın.
- Adım 5,2 ' de açıklandığı gibi Pellet hücreleri. Wash 1-3 x 106 hücreler Ile 2 ml hücre boyama tampon, peletleme açıklandığı gibi adım 5,2. 2 ml su ile iki ek yıkayan gerçekleştirin, adım 5,2 ' de açıklandığı gibi peletleme.
- Seyreltmeli EQ kalibrasyon boncukları su içinde 1:9 (3,3 x 105 boncuk/ml 'de stok solüsyonu).
- Seyreltilmiş EQ boncuk çözeltisi ile 1 x 106 hücreler/ml konsantrasyonunda hücre Pelet resuspend. 35 μm süzgeç kapağı akış tüpleri ile hücreleri filtreleyin.
- Kütle sitometresi örnekleri çalıştırın ve veri elde. Veriler bir akış sitometri standardı (FCS) dosya formatında yatırılacaktır.
8. kütle sitometri veri dosyalarının işlenmesi ve Analizi
- FCS dosyalarını Normalleştir. Https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20 ' de kullanılabilen ücretsiz bir program kullanın
- Deconvolute barkodlu FCS dosyaları. Https://github.com/nolanlab/Single-Cell-debarcoder/releases/latest18 ' de mevcut ücretsiz bir program ile ayrı barkodlu dosyalara havuza barkod nüfus ayrı
- Normalleştirilmiş FCS dosyalarını analiz edin. Ticari21,22 veya freeware programları kullanın (bkz. Web.Stanford.edu/Group/Nolan/resources.html).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1 , Yetişkin fare kulağı (Şekil 1) ve yenidoğan cildin patolojik olmayan koşullarda beklenen hücre verimleri ve canlılığı gösterir. Tablo ayrıca Mixed C57/126 arka planda hayvanların temsili verilerini gösterir. Diğer suşların cildin benzer hücre verimleri ve yeteneklerine neden olacağını bekleniyor. Yaklaşık verim cildin yüzey alanına bağlıdır ve yenidoğan cildin daha büyük sayıda hücre gerektiren deneyler için daha iyi bir seçim olacağını gösterir (Tablo 1). Düşük verim veya azalma (<% 50) Cilt bütünlüğünü azaltmak veya hücre ölümü teşvik sindirim veya deneysel koşullar ile ilgili sorunları gösterir. Uygun medya ve takviyeleri ile kültür hücreleri KC preparatları kalitesini değerlendirmek yardımcı olabilir17.
Normalleştirme20 ve FCS dosyaları deconvulation18 aşağıdaki, veri gating ilgi epidermal hücre nüfus tanımlayacak ve bireysel hücre döngüsü fazları DemarK (Şekil 2). 191IR vs 193IR kanallarını karşılaştıran iki değişkenli grafiklerde, sağlam hücreler sağ üst dörtgende (Şekil 2a) Gated edilebilir. Olay uzunluğu vs 191IR çizmek ve 191IR ekseni yakınında sıkı bir hücre kümesi için seçme tek hücreleri demarks. Uygun hücreler düşük 195PT seviyeleri ile hücreler için gating tarafından 195PT vs 193IR Plot bir arsa seçilir. Şekil 2a 'da gösterilen örnek, enkaz ve artan sisplatin etiketlenmemiş hücrelerin varlığı vardır. Bu örnek aşırı sindirilmiş olduğunu gösterebilir, sert ele, veya buz veya RT için çok uzun kitle sitometri için boyama önce sol. Doku-kültürlü hücrelerden profiller genellikle 195PT negatif hücrelerin daha yüksek yüzdeleri verir (Şekil 2B). Alternatif olarak, indüksiyon hücresi ölümü deneysel modelin ve/veya koşulların bir özelliği ise 195PT pozitif hücrelerin varlığı beklenebilir.
İdeal olarak, faiz popülasyon tanımlayan işaretçileri belirli hücre türlerinin analizinde dahil edilmelidir. Örneğin, ham KC süspansiyonları içinde bulunması beklenen immün hücreler, hematopoetik hücreleri algılayan bir CD4523 antikor eklenmesi ile tespit edilebilir (Şekil 2C). Proliferasyon antikor paneli13ile ilgili olarak, IDU vs Cyclın B1 grafik hücre döngüsü aşamalarını giderir (Şekil 2C) standart brdum/PI akış Plot benzer (Şekil 2D), S-faz tespiti için Izin, G0/G1 ve G2/M hücre Nüfus. IDU vs pHH3 çizimleri, yüksek pHH3 pozitifliği M faz hücrelerini tanımlar. Son olarak, yüksek pRB sinyali üzerinde G0/G1 hücreleri gating G0 (parlak) G1 hücrelerinden ayırt edebilirsiniz (Şekil 2C, en Panel sol).
Farklı hücre döngüsü aşamalarını tanımladıktan sonra, farklı hücre türleri veya deneysel koşullar için hücre döngüsü profillerinin grafik gösterimini oluşturmak mümkündür. Örneğin, Şekil 2' de gösterilen KC SÜSPANSIYONUNUN CD45-vs CD45 + hücre nüfuzunu (Şekil 3A) karşılaştırırken farklı hücre döngüsü profilleri ortaya çıkar. Beklendiği gibi CD45-grubunda bulunan hiperplastik KCs daha az hücre vardı G0 ve daha fazla hücre S, G2, ve M faz3. Buna karşılık, aynı örnekten bağışıklık hücreleri G0 ve G1 önemli nüfus vardı. Hücre döngüsü profillerine ek olarak, hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde Gen ifadesinin karakterizasyonu de mümkündür. Örneğin, EGFR ve mTOR/PI3K sinyallerini tanımlamanıza yardımcı olan Fosfo proteinleri Şekil 3Aiçin sunulan verilerde analiz edildi. CD45-vs CD45 + hücrelerinin G1 aşamalarının analizi, EGFR ve mTOR/Pı3K sinyalizasyon proteinleri için benzer bir profil ortaya koymuştur, ancak pS6 ve pEGFR pozitif hücrelerin yüzdesi küçük farklılıklar ortaya çıkmıştır (Şekil 3B). Benzer yaklaşımlar, hücre döngüsünün farklı aşamalarında diğer sinyalizasyon yolu proteinlerinin veya hücresel süreçlerin ifadesini karakterize etmek için uyarlanabilir.
Şekil 1 : Sindirim için fare kulak cildinin hazırlanması. (A) ilk olarak, hayvandan kulak çıkarın ve temiz bir petri tabak düz yatıyordu. (B) eğri hassas forseps kullanarak kulağın bir tarafını orta veya kenar üzerinde tutun. (C) üzerinde Flip ve başka bir forseps çifti kullanarak ve hafifçe kulak gözyaşı kadar ayrı kulakların yarısını çekin. (D) iki yarıya bölünene kadar çekmeye devam edin. (E) çözüm dokunmadan dermis tarafı ile ayrışma medyada kulak yarıya float. Ölçek çubuğu = 2 mm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2 : Kitle sitometri verisi Için gating stratejisi. Bu figürdeki veriler, önceden açıklandığı gibi forbol Ester TPA ile tedavi edilen deneysel bir hayvandan oluşturuldu3. TPA cilt iltihabı indükler bir PKC aktivatörü24. (A) paneller, barkodlu veri normalleştirme ve deconvolution sonra ilk gating stratejisi gösterir. Olay uzunluğu, 191ır,193IR ve 195PT kanallar üzerinde gating tarafından, bozulmamış, tek ve uygulanabilir hücreler için seçmek mümkündür. (B) insan SCC SRB-P93 hücre DMSO ile tedavi ve daha sonra kitle sitometri için lekelenmiş. Veri (A) olarak Gated ve çizim bu örnekteki canlı hücrelerin düzeylerini gösterir. (C) Lineage işaretçileri eklenmesi ilgi hücre nüfus seçimi için izin verir. Bu örnekte, (A) ' dan gelen uygun hücreler, hematopoetik hücreleri dışlamak için olay uzunluğuna karşı CD45. Gating CD45-IDU vs CYCLıN B1 birleşmesi için hücreler S, G0/G1 ve G2/M hücre nüfus tanımlaması sağlar. PHH3 yüksek hücrelerin seçimi M faz tanımlar, ancak pRB pozitifliği için G0/G1 Analizi G1 hücrelerinde tanımlar. (D) Arsa, floresans bazlı Akış sitometrisi Ile BrdU kuruluşu ve PI (DNA içeriği) tespiti ile hücre döngüsü analizinin temsili sonuçlarını gösterir. Gösterilen veriler insan Colo163 SCC hücreler BrdU ile yetiştirilen 1 h daha önce açıklandığı gibi3. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Hücre döngüsü profillerinin ve faza özgü protein ifadesinin karakterizasyonu. (A) CD45-vs CD45 + hücreleri için Şekil 2 ' den örnek olarak hücre döngüsü profilleri belirlendi. (B) CD45-(turuncu) ve CD45 + (mavi) hücrelerinde fosho spesifik antikorlarla G1 aşamalarının ANALIZI, EGFR ve mTOR/PI3K sinyalizasyon yollarının işaretçileri için benzer ifade profillerini ortaya koymuştur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Doku | Alan | Hücre verimi | Canlılık |
| Fare kulağı | 225-230 mm3 | 1-2x106 | 70-90% |
| Neonatal cilt | 1000-1100 mm3 | 5-10x106 | 80-99% |
Tablo 1: tipik hücre verimi ve yetişkin fare kulak ve yenidoğan cilt elde edilmesi. Trypan mavi dışlama tarafından hücre sayıları ve canlılık n = 7 8-10 hafta eski yetişkin fare kulakları veya n = 7 P3 yenidoğan derileri hasat kulak KCS ortalamasını aldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda özetlenen protokol yaklaşık 8 saat içinde tamamlanabilir. Sonuç, hücre döngüsüne bağımlı bir şekilde protein ifadesi için analiz edilebilir KCs zenginleştirilmiş hücrelerin bir süspansiyon olduğunu. Birkaç önceki çalışmalar insan ve fare cilt16,25KCS yalıtmak için yöntemler özetlenmiştir. Bu çalışmalar aynı zamanda akış cytometri26Için KCS izolasyonu için protokoller içerir. Ancak, ayrıntılı bir protokol daha önce, kütle sitometrisi kullanılarak protein ifadesi ve hücre döngüsü dinamiklerinin analiziyle KCs yalıtımını birleştiren açıklanmadı.
Bu protokolde yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için en büyük engel, kullanılan canlı hücrelerin kalitesidir. Literatürde, epidermis/dermis ayrımı için önerilen koşullar ve enzimler büyük ölçüde değişir16,25,26,27. Ancak, böylece dermis epidermis etkili ayrılması sağlayan en kısa süre için cildin sindirim zaman tutmak için tavsiye edilir. Bu protokol, 1 saat içinde hem kulak hem de fare yenidoğan derinin facile ayrılması sağlayan dispaz ve tip IV kolajenaz ile sindirim sunar. Bu, yüksek hücreli viability ile yeterli hücre verimi sonuçlanır. Hücrelerin kalitesini etkileyebilen başka bir faktör, sindirim için seçilen cildin konumdur. Bu KCs benzer vücutta farklı anatomik konumlarda davranır varsayılır. Ancak, farklı sitelerde cilt farklı özelliklere sahip olabilir ve kök hücre kompozisyon28,29. Yine de, yenidoğan ve kulak cildi3,30 kullanımı tercih edilir, çünkü KCS izolasyonu, saç folikülleri (örn. arka cilt) yüksek yoğunlukta cilt alanlarından daha zordur. Fare26tüylü alanlardan KCS verimli yalıtım için manipülasyon veya doku ayrışma daha yüksek bir ölçüde gerekli olabilir. KCs izolasyonlarından önceki deneysel koşullar izole hücrelerin kalitesini de etkileyebilmektedir. Deri lezyonları veya deri bariyerini veya cilt bütünlüğünü etkileyen koşullar dermis epidermis ayrılması azaltabilir. Bu, uygun hücrelerin azaltılmış verimleri veya KC olmayan hücrelerin (örn. bağışıklık hücreleri) artan kontaminasyonu ile sonuçlanır. Son olarak, yalıtılmış KCs kümeleme duyarlıdır. Ayrıca, kitle sitometri veya diğer tek hücreli analizler için işlem yapmadan önce, buz üzerinde veya RT 'de çok uzun bırakılırsa hücre canlaşmayı kaybedebilir.
Kütle sitometrisi için boyama metodolojisi, floresans Akış sitometrisi için kullanılan ama önemli farklılıklar ile benzerdir. Örneğin, DNA replikasyonu algılanması, BrdU gibi nüktiotid analogları karşı antikorların kullanımı yerine IdU doğrudan tespiti ile gerçekleştirilir. IDU doğrudan tespiti büyük ölçüde S-faz hücrelerinin tanımlanması basitleştirir, Brdum antikor tespiti dahil bir prosedür olabilir. Başka bir fark, ölü ve canlı hücrelerin ayrımcılık için sisplatin kullanımı. Cisplatin, ölü hücreleri tercihen Etiketler. Bu adım, ölü/canlı FACS denemeleri için PI veya diğer lekeleri kullanımına benzer. Sisplatin boyama adım önemlidir, çünkü ölü hücreler antikorları bağlayabilir ve böylece yanlış pozitif sinyaller üretir. Kütle sitometri Ayrıca DNA içeriğinin ölçülmesi yerine faza özgü işaretçinin ifadesini algılamak için antikorları kullanır. Bu, bireysel hücre döngüsü aşamalarının facile ayrımcılık sağlar. Son olarak, kütle sitometri veri (FCS) dosyaları aynı çalışma sırasında ve çalışır arasında CyTOF enstrüman zaman içinde örnek sinyal bozulması nedeniyle kalibrasyon boncuk başak kullanılarak normalleştirilmiş gerekir.
Kütle sitometri için boyama, veri edinme ve analiz son yayınlar tarafından iyi gözden geçirildi14,15. Bu teknolojinin hematopoetik ve immün hücrelerin analizine uygulanması iyi belgelenmiş durumdadır. Bu, ticari olarak kullanılabilir metal etiketli antikorların büyük bir koleksiyonu ve bu teknolojiyi kullanarak bağışıklık ile ilgili yayınların üstünlüğü ile belirgindir. Deride kitle sitometri hemen uygulanması bağışıklık hücrelerinin analizi için olacaktır. Bu özellikle inflamasyonun önemli bir rolü olduğu kanser gibi hastalıklarda fare cilt modelleri için ilgilidir. İmmün olmayan hücre analizi için, ticari olarak kullanılabilir metal etiketli antikorların eksikliği bir engel olabilir. Ticari reaktiflerin avantajı, ev metal etiketli antikorlar için durum gibi önemli optimizasyon olmadan kullanılabilir olmasıdır. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan floresan etiketlerine karşı metal etiketli antikorlar vardır (örn., FITC, PE ve APC), bir deneylerin boyama paneline ek işaretçiler eklemesine olanak tanır. Bu geçici çözüm Ayrıca farklı türlerde cilt hücrelerinin analizine uygulanabilir, türler arasında reaktivite gösteren ticari metal etiketli antikorların sınırlı sayıda olabilir. Yine de, bu geçici çözüm de sisplatin boyama ve bazı optimizasyon sonra ek bir boyama adım gerektirir. Literatürde başarılı bir panel oluşturmak için ek bir göz ele alınmaktadır14. Kitle sitometri bir başka dezavantajı kitle sitometreler veri toplama verimliliği giriş hücre numarasının% 40-60 olabilir olmasıdır. Bu nedenle, nadir hücre nüfusun Analizi (örn., kök hücreler) toplu örneklerden daha fazla sayıda hücre gerektirebilir, etkili algılama için numunelerin Havuzlanması, veya diğer yaklaşımlar kitle sitometri için boyama öncesinde ilgi hücre nüfusa zenginleştirmek için 24oldu.
Kitle sitometri, kullanımı büyümeye devam edecek olan güçlü bir gelişmekte olan teknolojidir. Şu anda, bu teknolojinin uygulanması metal etiketli antikorların kullanımına odaklanmıştır, ama geçenlerde mRNA31tespiti için uzatıldı. Dahası, diğer hücresel bileşenleri veya metal etiketleri ile metabolitleri etiketleme potansiyeli vardır, hangi cilt ve fareler, insan ve diğer türlerin diğer dokularda kitle sitometri için uygulama aralığını genişletmek olacaktır. Özetle, bu protokol daha sonra çeşitli hücre döngüsü aşamalarında KC protein ifadesi ilişkilendirmek için cilt biyologlar için kullanılabilir deneysel araçları genişletebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu iş için destek, Dermatoloji bölümü, Colorado Üniversitesi ve Colorado Üniversitesi (UC) Cilt Hastalıkları Merkezi Morfoloji ve phenotyping çekirdekleri (NıAMS P30 AR057212) rejeneratif tıp için Gates merkezi geldi. Yazarlar UC Kanser Merkezi akış Cytometri paylaşılan kaynak ve destek Grant (NCı P30 CA046934) kitle sitometrenin çalışması için kabul ve Karen Helm ve Christine Childs için çekirdek akış ve kitle sitometrik üzerinde uzman tavsiyeler için minnettar Teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM - Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
References
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- http://www.dvssciences.com. , http://www.dvssciences.com (2019).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- http://www.cytobank.org. , http://www.cytobank.org (2019).
- http://www.flowjo.com. , http://www.flowjo.com (2019).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
