Summary
تشكل الأغشية الحيوية الميكروبية بنيات معقدة في المراحل البينية وتتطور إلى أنماط مكانية تعتمد على النطاق إلى حد كبير. هنا، نقدم نظام تجريبي (الثابت والبرمجيات) للاقتناء الآلي للتصوير المقطعي للتماسك البصري 3D (OCT). تسمح مجموعة الأدوات هذه بالتوصيف غير الغازي والمتعدد النطاق لمورفوجينيسيس الفيلم الحيوي في المكان والزمان.
Abstract
Biofilms هي أسلوب حياة الميكروبية الأكثر نجاحا وتسود في العديد من البيئات البيئية والمهندسة. فهم النفيمور biofilm، وهذا هو التنويع الهيكلي للأفلام الحيوية أثناء التجمع المجتمعي، يمثل تحديا ملحوظا عبر المقاييس المكانية والزمنية. هنا، نقدم نظام التصوير الآلي للأفلام الحيوية على أساس التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT). OCT هو تقنية التصوير الناشئة في البحوث biofilm. ومع ذلك، فإن كمية البيانات التي يمكن الحصول عليها ومعالجتها حاليا تعوق الاستدلال الإحصائي لأنماط واسعة النطاق في مورفولوجيا الأفلام الحيوية. يسمح نظام التصوير الآلي OCT بتغطية المقاييس المكانية والزمنية الموسعة لنمو الأفلام الحيوية. وهو يجمع بين نظام OCT متاح تجارياً مع منصة تحديد المواقع الروبوتية ومجموعة من حلول البرمجيات للتحكم في تحديد مواقع مسبار المسح الضوئي OCT، فضلاً عن الحصول على مجموعات بيانات التصوير الحيوي ثلاثي الأبعاد ومعالجتها. يسمح هذا الإعداد بالرصد الآلي في الموقع وغير الغازية لتطوير الأفلام الحيوية، ويمكن تطويره بشكل أكبر لاقتران التصوير بالتصوير بالتصوير الكلي وتوصيف أجهزة الاستشعار الدقيقة.
Introduction
Biofilms هي التكيف نمط الحياة الميكروبية ناجحة للغاية وهذه المجتمعات بين phase المرتبطةومصفوفة المغلقة من الكائنات الحية الدقيقة تهيمن على الحياة الميكروبية في البيئات الطبيعية والصناعية 1،2. هناك، biofilms تشكل البنى المعقدة، مثل الدفق ممدود3، تموجات4 أو الفطر مثل قبعات5 مع عواقب هامة لنمو biofilm ، والاستقرار الهيكلي ومقاومة للإجهاد6. في حين تم تعلم الكثير عن التمايز الهيكلي biofilm من العمل على الثقافات أحادية الأنواع نمت في غرف تدفق مصغرة، ومعظم biofilms هي مجتمعات معقدة للغاية في كثير من الأحيان بما في ذلك أعضاء من جميع مجالات الحياة6. ومن ثم فإن تقدير هذه الأفلام الحيوية المعقدة على أنها مناظر طبيعية ميكروبية7 وفهم كيفية تفاعل هيكل الأغشية الحيوية ووظيفتها في المجتمعات المعقدة هو في طليعة أبحاث الأفلام الحيوية.
يتطلب الفهم الآلي لنشأة الأغشية الحيوية المعقدة استجابة للإشارات البيئية تجارب مصممة بعناية بالاقتران مع عمليات رصد تم حلها مكانياً وزمنياً للبنية الفيزيائية للأفلام الحيوية عبر المجالات ذات الصلة جداول8. ومع ذلك، فإن المراقبة غير المدمرة لنمو الفيلمالحيوية في النظم التجريبية كانت محدودة للغاية بسبب القيود اللوجستية مثل الحاجة إلى نقل العينات (على سبيل المثال، إلى المجهر) التي غالباً ما تضر ببنية الأفلام الحيوية الحساسة.
يقدم البروتوكول المعروض هنا نظامًا مؤتمتًا بالكامل يستند إلى التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT)، والذي يسمح بالرصد غير الغازي في الموقع لمورفوجينيسيس البيوفيلم في النطاق المتوسط (مم). OCT هو تقنية التصوير الناشئة في البحوث biofilm مع التطبيقات في معالجة المياه والبحوث biofouling، والطب9 وتيار الإيكولوجيا10. في OCT، يتم تقسيم مصدر ضوء التماسك المنخفض إلى عينة وذراع مرجعية; يتم تحليل تداخل الضوء المنعكس والمتناثر من قبل biofilm (ذراع العينة) وضوء الذراع المرجعية. يتم الحصول على سلسلة من التشكيلات الجانبية المحورية الكثافة (A-scans) التي تحتوي على معلومات هيكلية تم حلها بعمق ودمجها في مسح ب (مقطع عرضي). سلسلة من عمليات المسح الضوئي B المجاورة يؤلف المسح الضوئي 3D حجم النهائي10. OCT يوفر دقة بصرية جانبية في نطاق ما يقرب من 10 م، وبالتالي هو مناسب تماما لدراسة التمايز الهيكلي التنظيري من biofilms10،12. للحصول على وصف أكثر تفصيلا من OCT، يرجى الرجوع إلى دريكسلر وفوجيموتو13وفيرشر والزملاء14. على الرغم من أن مجال الرؤية من مسح xy OCT واحد يصل إلى مئات من ميكرومتر مربع، لا يمكن قياس أنماط أكبر حجماً عن طريق OCT في مسح واحد. وفيما يتعلق بالأفلام البيولوجية في الموائل الطبيعية مثل الجداول والأنهار، فإن هذا يحد حاليا من قدرتنا على تقييم تكوين الأغشية الأحيائية على مستويات مطابقة للقالب المادي والهيدروليكي للموئل.
من أجل تجاوز هذه الحدود المكانية والحصول على عمليات المسح OCT تلقائيا، تم تركيب مسبار التصوير OCT المجال الطيفي على نظام تحديد المواقع 3 محاور. يسمح التثبيت بالحصول على عدة عمليات مسح OCT في نمط فسيفساء متداخلة (مسح البلاط)، وتحقيق التصويرالمقطعي للمناطق السطحية تصل إلى 100 سم 2. وعلاوة على ذلك، فإن دقة تحديد المواقع العالية لهذا النظام تمكن من رصد نمو وتطوير السمات الحيوية في مواقع محددة خلال التجارب الطويلة الأجل رصدا موثوقا. النظام هو وحدات والمكونات الفردية (أي، جهاز تحديد المواقع وOCT) من التثبيت يمكن استخدامها كحلول مستقلة أو مجتمعة بمرونة. ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن مكونات التثبيت الثابتة والبرمجية.
تم اختبار النظام مع جهاز تحديد المواقع CNC التيتسيطر عليها GRBL المتاحة تجاريا (جدول المواد). مسافات التشغيل من هذه المنصة تحديد المواقع هي 600 × 840 × 140 ملم، مع دقة وأشار من قبل الشركة المصنعة من +/- 0.05 ملم ودقة قابلة للبرمجة من 0.005 ملم. الاجهزه. لذلك، يجب أن يكون كل جهاز تحديد المواقع المستند إلى GRBL (الإصدار > 1.1) متوافقًا مع الإرشادات وحزم البرامج المعروضة هنا. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف البرنامج مع وحدات تحكم stepmotor أخرى مع نوع الإدخال STEP-DIR مع تعديلات قليلة.
يتميز جهاز OCT المستخدم لتقييم أداءالنظام (جدول المواد) بمصدر ضوء منخفض التماسك مع طول موجة وسطي يبلغ 930 نانومتر (عرض النطاق الترددي = 160 نانومتر) وطول الذراع المرجعي وكثافته القابل للتعديل. في المثال المعروض هنا، تم استخدام محول الغمر لغمس التحقيقOCT في المياه المتدفقة (جدول المواد). حزمة البرمجيات التي تم تطويرها هنا للحصول على المسح الضوئي OCT الآلي يعتمد بشكل حاسم على SDK المقدمة جنبا إلى جنب مع نظام OCT محددة، ومع ذلك، يجب أن تكون أنظمة OCT من نفس الشركة المصنعة مع عدسات المسح الضوئي المختلفة والأطوال الموجية المركزية متوافقة بسهولة.
يتم التحكم في جهاز GRBL بواسطة ملقم ويبمثبت على كمبيوتر أحادي اللوحة (الشكل 1). وهذا يمنح التحكم عن بعد للجهاز من أي جهاز كمبيوتر مع شبكة محلية أو الوصول إلى الإنترنت. يتم التحكم في جهاز OCT بواسطة كمبيوتر منفصل، مما يسمح بتشغيل نظام OCT جانبا الإعداد التجريبي الآلي. وأخيراً، تتضمن حزم البرامج مكتبات لمزامنة تحديد موضع مسبار OCT والحصول على المسح الضوئي لـ OCT (أي للحصول تلقائيًا على مجموعات بيانات التصوير ثلاثي الأبعاد في نمط فسيفساء أو في مجموعة من المواضعالمحددة). تحديد موقف التحقيق OCT في 3D يسمح بشكل فعال لضبط المستوى البؤري على وجه التحديد لمجموعات (الإقليمية) من المسح الضوئي. على وجه التحديد، على الأسطح غير المستوية، يمكن تحديد طائرات محورية مختلفة (أي مواقع مختلفة في اتجاه z) لكل مسح OCT.
تم تطوير مجموعة من حزم البرامج لمعالجةعمليات المسح الخام OCT (الجدول 1). يتم تنفيذ الملاحة من جهاز تحديد المواقع، والحصول على المسح الضوئي OCT ومعالجة مجموعة البيانات مع أجهزة الكمبيوتر المحمولة Jupyter مشفرة بيثون، والتي تسمح مرونة ملحوظة في تطوير وتحسين البرنامج. وهناك مثالان يعملان ومشروحان لهذه الدفاتر (للحصول على الصور ومعالجتها، على التوالي) متاحان من https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git يقصد بها أن تكون احتياج للتخصيص من الأسلوب. دفتر ملاحظات Jupyter هو تطبيق متصفح ويب يستند إلى الخلايا مع رمز بيثون المشروح. يتم تضمين كل خطوة في خلية من دفتر الملاحظات، والتي يمكن تنفيذها بشكل منفصل. نظرا لطول مختلف من مسار الضوء من خلال عدسة المسح الضوئي (انحراف كروية)15، والمسح الخام OCT تظهر مشوهة (الشكل2A). قمنا بتطوير خوارزمية لتصحيح تلقائيا لهذا التشويه في عمليات المسح المكتسبة OCT (الواردة في ImageProcessing.ipynb، ملف تكميلي 1). وعلاوة على ذلك، يمكن تصور مورفولوجيا الفيلم الحيوي كخريطة ارتفاع ثنائية الأبعاد، كما كان يستخدم سابقا في أنظمة الغشاء16،ونحن نوضح كيف يمكن خياطة خرائط الارتفاع التي تم الحصول عليها من عمليات المسح التي تم التقاطها في صفيف تبليط.
وأخيراً، تُوضَّح وظيفة تركيب المختبر الموصوف باستخدام تجربة فلوم يتعرض فيها الفيومتر الحيوي للتيار الضوئي إلى تدرج في سرعة التدفق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد جهاز تحديد المواقع
- قم بسلك جهاز تحديد المواقع إلى لوحة تحكم دقيق، باتباع التعليمات في https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
- قم بتوصيل وحدة التحكم الدقيقة بجهاز كمبيوتر أحادي اللوحة مع اتصال بالإنترنت عبر كبل USB وقم بتثبيت خادم GRBL كما هو موضح في https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. الآن يجب أن يكون جهاز تحديد المواقع قابل للملاحة من صفحة ويب مستضافة في http://IP:5020/. بدلا من ذلك، يمكن التنقل جهاز تحديد المواقع مع البرنامج النصي بيثون، كما هو موضح في الجزء الأول من المثال عملت ImagesAcquisition.ipynb (ملفتكميلي 2).
2. إعداد OCT
- قم بتركيب مسبار OCT على جهاز تحديد المواقع باستخدام حامل حمامة ذيل متوافق. إذا لزم الأمر، قم بتثبيت محول الغمر على العدسة الهدف.
- ضع وحدة الكمبيوتر وقاعدة OCT على مقعد بجوار التجربة (على سبيل المثال، الأجهزة الدقيقة، وغرف التدفق، والمداخن، وأنظمة الترشيح). تأكد من أن الحبل البصري (الحد الأقصى لطول حوالي 1.8 م) يتحرك بحرية، طويل بما فيه الكفاية للوصول إلى جميع المواقع المقصودة وعدم التداخل مع الإعداد التجريبي.
- قم بتثبيت نظام OCT مع البرامج المتوفرة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
- قم بتثبيت حزم البرامج للحصول على فحص OCT تلقائي كما هو موضح في https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.
3. الحصول على الصور
- الطاقة على نظام OCT وجهاز تحديد المواقع. تأكد من أن الجهاز يمكن أن تتحرك بحرية.
- افتح الملف config.json في محرر نص. تحرير الملف config.json لضبط المعلمة الافتراضية الحصول على الصورة (الجدول2)،مثل فهرس الانكسار (1.33 للمياه عند 20 درجة مئوية، 1.00 للهواء) والمجلد الوجهة للبيانات والبيانات الوصفية المكتسبة.
- حدد حجم حقل العرض (FOV) وعدد عمليات المسح الضوئي A لكل B-المسح الضوئي في config.json.
ملاحظة: تحدد هذه المعلمات اثنين حجم voxels من مجموعة البيانات النهائية وحجم ملف الإخراج ويجب أن تتطابق مع الدقة البصرية للمسبار (x-y voxel الحجم يجب أن لا يكون أصغر من نصف الدقة البصرية). يؤثر عدد عمليات المسح A-وB على النطاق المكاني الذي يجب تغطيته مقابل المساحة المتاحة للقرص وطاقة المعالجة. - حدد حدود الإشارة للإخراج OCT المسح الضوئي في config.json. هذه تعتمد على نوع العينة. وبالتالي فمن المستحسن لتحديد هذه المعلمات على أساس المخططات كثافة من مجموعة من المسح الأولي. حفظ التغييرات في config.json.
- انتقل التحقيق OCT إلى موقع الفائدة. قم بتركيز العينة وضبط الذراع المرجعي وكثافة مصدر الضوء للحصول على جودة الصورة المثلى. كرر هذا الإجراء لعدد من المواقف ولاحظ الإحداثيات.
ملاحظة: سيسمح هذا الحصول على فحص OCT التلقائي اللاحقة حول هذه النقاط المرجعية. لاحظ أنه لا يمكن تغيير طول الذراع المرجعي وكثافته أثناء الامتلاك التلقائي للصورة. - افتح الملف ImageAcquisition.ipynb (ملف تكميلي 2) في دفتر ملاحظات Juypter. تحتوي كل خلية على تعليمات برمجية لتنفيذ مهام محددة ويمكن تشغيلها بشكل منفصل عن طريق الضغط على الخلية | تشغيل،أو Ctrl + أدخل أو إزاحة + Enter .
- تعيين المسار إلى المكتبات المطلوبة ومعلمات التكوين الافتراضية. بدلاً من ذلك، قم بتعريف مجموعة جديدة من المعلمات المؤقتة.
- الاتصال بجهاز تحديد المواقع وتهيئة OCT.
- معايرة جهاز تحديد المواقع (أي، إجراء "توجيه").
- الحصول على مجموعات البيانات التي تغطي مواضع المصالح في نمط المسح الأحادي أو الفسيفساء، مع تحديد العدد والتداخل (على سبيل المثال، 30 في المائة) من البلاط المجاورة.
ملاحظة: يتم تخصيص الذاكرة قبل الفحص الذي يحسن استخدام موارد الكمبيوتر. يتم حفظ البيانات بتنسيق 8 بت *.raw لتوفير مساحة التخزين، في المجلد الوجهة المعرّف في config.json، باستخدام الطابع الزمني والموضع كاصطلاح التسمية (أي %Y%m%d_%H%M%S_). يتم حفظ بيانات التعريف بما في ذلك إعدادات OCT والإحداثيات في نفس المجلد في ملف. اعتماداً على إعدادات مثل FOV والدقة، قد يصل حجم الملف إلى 1.5 غيغابايت لكل OCT المسح الضوئي.
- لتجنب الإجهاض من الحصول على البيانات، تأكد من وجود مساحة حرة كافية على القرص أو نقل مجموعات بيانات OCT باستمرار إلى محرك أقراص ثابتخارجي.
4. تصحيح الصورة وعرضها
- افتح دفتر Jupyter ImageProcessing.ipynb (ملفتكميلي1) للحصول على مثال عملي لمعالجة الصور OCT (تصحيح التشويه، طرح الخلفية، حساب خرائط الارتفاع، خياطة خريطة الارتفاع).
- إذا لزم الأمر، المحاصيل OCT المسح الضوئي من أجل استبعاد إشارات زائفة وإعادة توجيه مجموعة البيانات (يجب أن تظهر biofilm فوق الطبقة الفرعية).
- تصحيح للانحراف كروية. ويتم ذلك بواسطة خوارزمية تصحيح تستخدم سطح مرجعي عاكس للغاية معروف بأنه مسطح (على سبيل المثال، الجزء السفلي من المداخن، الطبقة الفرعية). أولاً، تحدد الخوارزمية شبكة من خطوط عمودية 20×20 متباعدة بانتظام عبر مستوى س ص من المسح الضوئي OCT. ثم، فإنه يختار منطقة دائرية حول كل نقطة ومتوسطات إشارة كثافة على طول التشكيل الجانبي الرأسي (الشكل2B). تتم معالجة التشكيلات الجانبية العمودية باستخدام عامل تصفية غاوسي معدل:
حيث x هي إشارة الإدخال، والانحراف المعياري الخاص بها، في حين يتم تحديد C مثل:
يتم ترجمة السطح المرجعي كـ maxima محلي في كل من هذه التشكيلات الجانبية. يتم تصفية النقاط التي تم تحديدها بشكل خاطئ استنادًا إلى مواقف جيرانها في ثلاثة أبعاد (الشكل2C). وأخيرا، يتم تركيب سطح متعدد الحدود منأجل 2 ND يعكس التشويه الذي أدخلته عدسة المسح الضوئي عبر هذه النقاط (الشكل2C). ثم يتم استخدام السطح المجهزة لتحويل كل بكسل في اتجاه z، وبالتالي الحصول على صورة مسطحة. يجب ضبط معلمات هذه الخوارزمية إلى خصائص الفحص OCT. - تصحيح لضوضاء الخلفية. تحديد منطقة فارغة من الصورة (عادة فوق biofilm) واستخدام خوارزمية التصحيح لطرح متوسط كثافة الخلفية من قيم كثافة الصورة لإنتاج صورة OCT تصحيح النهائي (الشكل2D).
- حساب مخطط ارتفاع من مجموعة بيانات OCT ثلاثية الأبعاد. في هذه الخطوة، حدد سطح مرجعي للاهتمام للتجربة المحددة (مثل الطبقة الفرعية) وكثافة عتبة مناسبة. ثم استخدم خوارزمية حساب خريطة الارتفاع لحساب سمك الفيلم الحيوي لكل إحداثيات (س، y) من القناع الثنائي وتعيينه إلى مصفوفة ثنائية الأبعاد جديدة (الشكل3A). ثم يتم تعيين قيم السماكة إلى مصفوفة 2D من حجم الصورة الأصلية في اتجاهين س وص. يتم تقديم صورة يتم فيها الإبلاغ عن ارتفاع السطح كقيمة تدرج الرمادي (الشكل3B).
- في حالة أخذ العديد من عمليات المسح OCT في نمط الفسيفساء، حدد عدد الصفوف والأعمدة وغرزة خرائط الارتفاع ذات الصلة. ويقدم الشكل 5 أمثلة على خرائط الارتفاع المخيطة، التي تغطي النطاق الواسع للنطاقات المكانية والقرارات التي يمكن تحقيقها مع الإعداد الموصوف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نقوم بتوضيح وظيفة نظام التصوير الآلي OCT باستخدام تجربة فلوم مصممة لدراسة المورفيكوجينية الصدغية الزمنية للأغشية الحيوية للتيار الضوئي. الهندسة تضييق تدريجيا من المداخن الناجمة عن التدرجات في سرعة التدفق على طول مركز الفلوم (انظر المرجع17). تم رصد التطور الزمني والتمايز الهيكلي للأفلام الحيوية على مدى 18 يوما بهدف فهم أفضل لآثار الظروف الهيدروديناميكية على مورفوجينيسيس الفيلم الحيوي. ويبين الشكل 4 نمو مستعمرة ميكروفيلم حيوية تلت هاعلى مدى 18 يوما من النمو. تم قياس المورفولوجيا السطحية للفيلم الحيوي باستخدام مجموعة الأدوات الموضحة أعلاه (الشكل4A). تم حساب الحجم الحيوي (انظر مثال العمل ImageProcessing.ipynb، ملف تكميلي1) لنافذة تتحرك مربع مع طول حافة 3.6 مم (الشكل4B)لكل موقف على طول تدرج سرعة التدفق (الشكل4C). انخفض تراكم الافلام الحيوية بشكل كبير مع زيادة سرعة التدفق (يشار إليها على أنها المسافة من أوسع جزء من المداخن؛ الشكل4). والأهم من ذلك، يسمح هذا الإعداد التجريبي بقياس مستمر للبارامترات الهيكلية (مثل الحجم الحيوي، وسمك، خشونة) على طول التدرجات المكانية الكبيرة. وبالتالي، توفر هذه الأداة الجديدة وسيلة للحصول على رؤى في العلاقات بين هيكل الفيلم الحيوي والعظة البيئية.
| مكون البرنامج الحاسوبي | وصف |
| stepcraft.py | مكتبة بيثون للتحكم في جهاز تحديد المواقع. يحتوي على تعريفات للتنقل وتوجيه الجهاز. |
| أوكترول.ب | التعليمات البرمجية C++ مشتقة من مجموعة تطوير البرامج (SDK) الموزعة مع نظام OCT. يجب ترجمة هذا باستخدام VisualStudio 2017، بيثونك/API وSDK. |
| ImagesAcquisition.py | مكتبة Python تحتوي على الأوامر لأخذ عمليات مسح OCT في مواضع محددة وتحديد نمط تجانب المسح الضوئي. |
| صور اكتساب.ipynb | كمبيوتر جوبيتر المحمول المستخدمة للتنقل في جهاز تحديد المواقع، والحصول على عمليات المسح OCT وللحصول على صورة الآلي. |
| OctCorrection.py | مكتبة بيثون تحدد الوظائف المستخدمة لتصحيح الصور OCT الخام والطرح الخلفية. |
| OctProcessing.py | مكتبة بيثون تحتوي على وظائف لحساب وغرزة خرائط الارتفاع. |
| أوكبروسينغ.إيبينب | Jupyter الدفتري لتصور وتصحيح ومعالجة عمليات المسح OCT. وهذا يحتوي أيضا على مثال على حساب الحجم الحيوي. |
الجدول ١ مكونات البرامج.
| المعلمه | قيمه | وصف |
| جانيميد | 1, 2, 3 | اختيار نظام OCT والإصدار |
| التحقيق | 1, 2 | اختيار عدسة المسح الضوئي |
| nAscans | 32-900 | عدد عمليات المسح الضوئي A لكل B-المسح الضوئي |
| nBscans | 1-900 | عدد عمليات المسح الضوئي B |
| nCscans | 128-1024 | عدد وحدات البكسل للعمق |
| عاشرا | 0.1-10 | حجم الصورة في اتجاه س (مم) |
| Y | 0.1-10 | حجم الصورة في اتجاه y (مم) |
| الفرنكات | 1-1.6 | مؤشر الانكسار (1 للهواء، 1.33 للمياه) |
| محمد الدوسري | 3 | عدد متوسط المسح الضوئي |
| سرعة المسح الضوئي | 1,2,3 | A-معدل المسح الضوئي (5.5 و 15 و 36 كيلو هرتز) |
| مسار | ".. / %Y-%m-%d_%H_%M_%S" | المجلد الوجهة للمسح الضوئي OCT المكتسبة، يستخدم الطابع الزمني كتسمية confention |
| لون الحدود | [0.0-256.0,0.0-256.0] | حدود الألوان للمسح المكتسب |
الجدول ٢ إعدادات المعلمة OCT.
الشكل 1 نظرة عامة على مكونات البرامج الثابتة. يتم توصيل المحركات الأمامية لجهاز تحديد المواقع الذي يتم التحكم فيه بـ GRBL بوحدة تحكم دقيقة، متصلة عبر USB بجهاز كمبيوتر أحادي اللوحة. يتم تثبيت خادم GRBL على هذا الأخير، ويمكن التحكم في حركة جهاز تحديد المواقع من أي مستعرض ويب عبر اتصال TCP/IP. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ الملاحة من جهاز تحديد المواقع من دفتر Jupyter ترميز بيثون(ImagesAcquisition.ipynb، ملف تكميلي 2) باستخدام مكتبة GRBLServer.py. يتم توصيل نظام OCT إلى كمبيوتر منفصل يمكن من خلاله إجراء الحصول الآلي على المسح الضوئي OCT عبر برنامج نصي Python. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 OCT سير عمل تصحيح المسح الضوئي. يُظهر الفريق A مسحًا ب غير معالجة للأفلام الحيوية التي تنمو على سطح زجاج شبكي مسطح. الصورة مشوهة (الانحناء) بسبب الاختلافات في طول المسار من ضوء التماسك المنخفض من خلال العدسة. يمكن تصحيح تشويه صورة OCT عن طريق تحديد سطح مرجعي مسطح عاكس بقوة في الصورة. أولا، يتم توزيع 20 × 20 نقطة مرجعية بالتساوي عبر كومة كاملة من الصور. في كل نقطة من هذه النقاط، يتم متوسط إشارة الصورة عبر منطقة دائرية (في اتجاه س-y) لكل عمق (مستوى z)، مع الحصول على متوسط عمق لشدة الإشارة. ثم يتم تطبيق عامل تصفية Gaussian معدلة على كل من ملفات التعريف المرجعية 400. ويقدم الفريق باء مثالاً للإشارة الأصلية على طول ملف تعريف العمق المشار إليه بالخط الأحمر الرأسي في اللوحة ألف، وملف تعريف العمق المتوسط، ونفس الملف الشخصي بعد تطبيق مرشح غاوسيين المعدل. يسمح مرشح غاوسي المعدل بتحديد الحد الأقصى المحلي في شدة الإشارة، وبالتالي تحديد موقع السطح المرجعي الذي يعكس بقوة. ثم يتم تحديد النقاط المرجعية المحددة بشكل صحيح استناداً إلى إحداثيات جيرانهم في ثلاثة أبعاد. في المثال في اللوحة C، تم الاحتفاظ بالنقاط الصفراء لتصحيح الصورة اللاحقة في حين تم التخلص منها الأرجواني. ثم يتم احتواء سطح متعدد الحدود من أجل 2nd إلى النقاط المرجعية الموضوعة بشكل صحيح ويستخدم لتصحيح التشويه في صورة OCT الأصلية عن طريق تحويل وحدات البكسل في اتجاه z. يتم تقدير متوسط كثافة الخلفية من منطقة فارغة من الصورة ويتم طرحها من الصور التي تم تصحيحها. تعرض اللوحة D نفس المسح الضوئي B بعد التصحيح والطرح في الخلفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 خرائط الارتفاع. يمكن تصور طبولوجيا Biofilm على أنها خرائط ارتفاع 2D حيث يتم ترميز سمك الكتلة الحيوية بالألوان. لهذا، يتم عتبة صورة OCT 3D وسمك biofilm تحسب كمسافة من إشارة أعلى إلى الركيزة. تعرض اللوحة A القناع الثنائي للمسح الضوئي B الذي تم الحصول عليه بعد العتبات. يشير الخط الأزرق إلى الإشارة العلوية بينما يظهر الخط الأحمر السطح المرجعي. تُظهر اللوحة B مثالاً على خريطة الارتفاع التي تم الحصول عليها، وتحجيمها وفقًا للاستبانة المحورية للتحقيق في OCT. يشير الخط الأحمر إلى موضع المسح الضوئي B في اللوحة A.
الشكل 4 النتائج التمثيلية التي تبين تأثير سرعة التدفق على نمو الأفلام الحيوية. لقد درسنا مورفوجينيسيس الميكروفيلم الحيوي للتيار الضوئي على طول تدرج في سرعة التدفق باستخدام تجارب الفلوم. زادت سرعة التدفق مع المسافة من مدخل المداخن. بعد 10 أيام من النمو، تم اتسم مورفولوجيا الفيلم الحيوي من قبل OCT الآلي في دقة مختلفة وتغطي نطاقات مكانية مختلفة. وتبين خرائط الارتفاع (ألف وباء وجيم) مورفولوجيا الفيلمالحيوية المزروعة تحت سرعة تدفق منخفضة ومتوسطة وعالية، على التوالي. يتم حساب خرائط الارتفاع هذه من عمليات المسح الضوئي OCT مع حجم voxels في x، y اتجاه 4 ميكرومتر. تبلغ مساحة سطح المسح مربعًا يبلغ طوله 3.6 مم. تظهر الألواح D وE وF خرائط الارتفاع (سرعة التدفق المنخفض والمتوسط والعالي، على التوالي) التي تم الحصول عليها عن طريق خياطة 3×3 OCT المسح الضوئي مع حجم voxel في اتجاه س ص من 11 م، ومنطقة المسح الضوئي من 10 ملم2 والتداخل بين المسح الضوئي المجاورة من 30٪. تُظهر اللوحة G خريطة ارتفاع للأفلام الحيوية التي تنمو على طول تدرج السرعة الكامل الذي تحقق في هذه التجربة. تم الحصول عليها عن طريق خياطة 3 × 51 OCT المسح الضوئي مع حجم voxel في اتجاه س ص من 40 درجة مئوية، ومنطقة المسح الضوئي من 10 ملم2 والتداخل بين المسح الضوئي المجاورة من 30٪. يبلغ إجمالي مساحة المسح الضوئي المحققة 24×353 مم. انخفض متوسط الحجم الحيوي بشكل كبير كدالة للمسافة من مدخل (I). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 اختبار دقيق لجهاز تحديد المواقع. تم تقييم دقة جهاز تحديد المواقع من خلال تركيب كاميرا بدقة 20.2 ميجابكسل مجهزة بعدسة ماكرو 35 مم على جهاز تحديد المواقع، مع التركيز على علامة ملونة. تم نقل جهاز تحديد المواقع في اتجاه عشوائي بعيدا عن العلامة ومن ثم وضعه مرة أخرى لما مجموعه 80 دورات. ثم تمت مقارنة موضع العلامة. يظهر الشكل التحول في اتجاه x و y فيما يتعلق بالصورة الأولى. لاحظ أن الحد الأقصى للإزاحة هو حوالي 16 ميكرومتر في اتجاه y وحتى أقل في اتجاه س. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1. ImageProcessing.ipynb. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2. Imagesacquisition.ipynb. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصوير OCT هو مناسبة تماما لحل الهياكل في نطاق ميكرومتر مع FOV من عدة ملليمترات مربعة. وبالتالي فهي أداة قوية لبحوث الأفلام الحيوية10،18. ومع ذلك، يقتصر OCT حاليا على منطقة المسح الأقصى من100 - 256 مم 2، في حين أن الأنماط الهيكلية biofilm غالبا ما تتجاوز هذا النطاق المكاني19، وخاصة عندما يكون الدافع وراء التمايز المورفولوجي من التدرجات البيئية واسعة النطاق 20-ويوسع نظام التصوير الآلي لـ OCT الوارد وصفه في هذا البروتوكول المساحة السطحية التي تتميز بـ OCT إلى عدة سنتيمترات مربعة، مما يمكّن بشكل فعال من رصد التمايز المورفولوجي للأفلام الحيوية على نطاق ذي صلة من المقاييس المكانية (من بضعة ملليمترات إلى عدة سنتيمترات). دقة تحديد المواقع العالية (في غضون 16 درجة مئوية؛ الشكل 5) يسمح برصد بدقة التطور الهيكلي للأفلام الحيويةعلى مدى فترات طويلة من الزمن (الشكل 4)، مما يعزز بشكل فعال فرص الحصول على فهم ميكانيكي لدوافع التمايز المورفولوجي للأفلام الحيوية . وفي الوقت نفسه، فإن تقنية توصيف الفيوفيلم الحيوي في الموقع هذه غير غازية وتقلل من التداخل مع نمو الأفلام الحيوية. تعتمد حلول معالجة الصور المعروضة هنا على التحليلات المستخدمة سابقاً لمجموعات بيانات OCT biofilm16،ومع ذلك توفر الأتمتة أدوات لتحليل مجموعة بيانات OCT التي لم يسبق لها مثيل.
تم تصميم هذا النظام ومقارنته بجهاز OCT محدد، كما هو موضح في البروتوكول. الخطوات الحاسمة في البروتوكول تتعلق أساسا وضع قرار OCT والتركيز، وكلاهما حاسم لجودة الصورة العالية. الحد من تصحيح روتين الانحرافات كروية هو أنه يعتمد على وجود سطح مستو عاكس للغاية. بدلاً من ذلك، يمكن قياس سطح تصحيح قياسي، ومن ثم استخدامه لتصحيح عمليات مسح OCT. وعلاوة على ذلك، فإن خياطة عمليات المسح OCT يعتمد على ميزات هيكلية كافية لمحاذاة عمليات المسح المجاورة. في حالة توزيع الأفلام الحيوية الموحدة أو انخفاض تغطية الأفلام الحيوية، يمكن تحقيق خياطة تعتمد فقط على دقة جهاز تحديد المواقع. وأخيرا، كما هو الحال في أي خط أنابيب معالجة الصور الأخرى، عند إعداد هذه الأدوات، من المهم تقييم أداء خوارزمية المعالجة بعناية على مجموعة من عمليات المسح التمثيلي قبل التعامل مع دفعات من الصور.
وقد صُممت البرمجيات الصلبة والثابتة لتوفير وحدات نمطية كاملة للأجزاء الفردية. وبشكل أكثر تحديداً، يمكن تكييف هذا النظام بسهولة للعمل مع أدوات أخرى لتوصيف الأغشية الحيوية مثل التصوير الفوتوغرافي الكلي باستخدام الكاميرات الطيفية الفائقة أو توصيف أجهزة الاستشعار الدقيقة. ومن بين اقتران المعلومات الهيكلية والتدرجات المحلية في الموارد المحيطة وداخل الأفلام البيولوجية، سيوفر رؤى جديدة ومحورية في كيفية تكييف الأفلام البيولوجية لتحسين تخصيص الموارد. كما يتم تنفيذ المرونة من خلال استخدام أجهزة الكمبيوتر المحمولة Jupyter، وهي أداة مفتوحة الوصول وسريعة ومتعددة الاستخدامات لتطوير البرمجيات.
يبقى أحد القيود الحرجة لتصوير OCT بشكل عام الإعاقة لحل الأجسام المتحركة بسرعة. على سبيل المثال، لا يتم تصوير الدفقات التي تمدّد إلى التدفق وتتحرك معه بدقة. وبالتالي فإن إمكانية تطبيق هذه الأداة تقتصر على هياكل الأفلام الحيوية الثابتة نسبياً وغير المتحركة. وقد تم تحسين النظام للعمل بشكل مستقل، ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى الإعدادات الأولية، وإذا لزم الأمر، والتعديل اليدوي للتركيز والإضاءة. وهذا يمثل قيدا كبيرا إذا كانت العينات تختلف اختلافا كبيرا في الكثافة والخصائص العاكسة. ومع ذلك، يمكن تحقيق التشغيل الآلي الكامل، بما في ذلك التركيز على البرامج الموجهة وتعديل الإضاءة باستخدام مبادئ مماثلة (مثل محركات السائر والتغذية المرتدة من الأجهزة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعمل سيباستيان شيفر في شركة ثورلابس
Acknowledgments
ونشكر موريسيو أغيري موراليس على إسهامه في تطوير هذا النظام. جاء الدعم المالي من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم إلى T.J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer Verlag. (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
