Summary
Mikrobiyal biyofilmler interfazlarda karmaşık mimariler oluşturur ve yüksek ölçekli-bağımlı uzamsal desenler halinde gelişirler. Burada, 3D optik koherens tomografisi (OCT) veri kümelerinin otomatik olarak edinimi için deneysel bir sistem (sert ve yazılım) sıyoruz. Bu araç seti, uzay ve zamanda biyofilm morfogenezinin non-invaziv ve çok ölçekli karakterizasyonuna olanak sağlar.
Abstract
Biyofilmler en başarılı mikrobiyal yaşam tarzı dır ve çok sayıda çevresel ve mühendislik ortamlarında hakimdir. Biyofilm morfogenezi anlamak, yani topluluk meclisi sırasında biyofilmlerin yapısal çeşitlendirilmesi, mekansal ve zamansal ölçekler arasında dikkate değer bir meydan okumayı temsil etmektedir. Burada optik koherens tomografisine (OKT) dayalı otomatik bir biyofilm görüntüleme sistemi salıyoruz. OCT biyofilm araştırmalarında ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir. Ancak, şu anda elde edilebilen ve işlenebilen veri miktarı, biyofilm morfolojisinde büyük ölçekli desenlerin istatistiksel çıkarımını engellemektedir. Otomatik OCT görüntüleme sistemi biyofilm büyüme büyük mekansal ve genişletilmiş zamansal ölçekler kapsayan sağlar. Bir robot konumlandırma platformu ve OCT tarama sondasının konumlandırılmasını kontrol etmek için bir dizi yazılım çözümleri ile ticari olarak kullanılabilir bir OCT sistemini birleştirir, ayrıca 3D biyofilm görüntüleme veri kümelerinin edinimi ve işlenmesini de. Bu kurulum biyofilm geliştirme yerinde ve non-invaziv otomatik izleme sağlar ve daha fazla makrofotoğrafçılık ve mikrosensör profilleme ile çift OCT görüntüleme için geliştirilebilir.
Introduction
Biyofilmler son derece başarılı bir mikrobiyal yaşam tarzı adaptasyon ve mikroorganizmaların bu interfaz ilişkili ve matris kaplı topluluklar doğal ve endüstriyel ortamlarda mikrobiyal yaşam hakim1,2. Orada, biyofilmler karmaşık mimariler oluşturur, uzatılmış flamalar gibi3, dalgalanmalar4 veya mantar gibi kapaklar5 biyofilm büyüme için önemli sonuçları ile, yapısal istikrar ve strese direnç6. Biyofilm yapısal farklılaşma hakkında çok minyatür akış odalarında yetiştirilen mono-tür kültürleri üzerinde çalışma öğrenilmiş olsa da, çoğu biyofilm genelliklehayatıntüm etki alanları nın üyeleri de dahil olmak üzere son derece karmaşık topluluklar 6 . Bu karmaşık biyofilmlerin mikrobiyal manzaralar7 olarak takdir edilerek, biyofilm yapısının ve işlevinin karmaşık topluluklarda nasıl etkileştiğini anlamak biyofilm araştırmalarında ön plandadır.
Çevresel ipuçlarına yanıt olarak karmaşık biyofilmlerin morfogenezinin mekanistik bir şekilde anlaşılması, biyofilm fiziksel yapısının mekansal ve zamansal olarak çözümlenmiş gözlemleri ile birlikte dikkatle tasarlanmış deneyler gerektirir. ölçekler8. Ancak, deneysel sistemlerde biyofilm büyümesinin tahribatsız gözlemi, numunelerin (örneğin mikroskoba) taşınması ihtiyacı gibi lojistik kısıtlamalarla ciddi ölçüde sınırlandırılmıştır.
Burada sunulan protokol, biyofilm morfogenezinin mezoölçekte (mm aralığında) insitu, non-invaziv olarak izlenmesine olanak tanıyan optik koherens tomografisine (OCT) dayalı tam otomatik bir sistem sunmaktadır. OCT su arıtma ve biyofouling araştırma, tıp9 ve akarsu ekoloji10uygulamaları ile biyofilm araştırma ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir. OCT'de, düşük tutarlılıklı bir ışık kaynağı örnek ve referans koluna ayrılır; biyofilm (örnek kol) tarafından yansıyan ve dağılan ışığın paraziti ve referans kolunun ışığı analiz edilir. Derinliği çözülmüş yapısal bilgileri içeren bir dizi eksenel yoğunluk profili (A-taramaları) elde edilir ve B-taraması (bir kesit) ile birleştirilir. Bitişik B-taramaları bir dizi son 3D hacim tarama10oluşturur. OCT yaklaşık 10 μm aralığında bir yanal optik çözünürlük sağlar ve bu nedenle iyi biyofilmlerin mezoskopik yapısal farklılaşma incelemek için uygundur10,12. OCT daha ayrıntılı bir açıklama için, Drexler ve Fujimoto13ve Fercher ve meslektaşları14bakın. Tek bir OCT xy-scan'ın görüş alanı yüzlerce mikrometreye kadar ulaşsa da, daha büyük ölçekli desenler tek bir tarak OCT ile ölçülemez. Akarsu ve nehir gibi doğal habitatlarda biyofilmler ile ilgili olarak, bu şu anda yaşam alanının fiziksel ve hidrolik şablonu eşleşen ölçeklerde biyofilm morfogenez değerlendirmek için yeteneğimizi sınırlar.
Bu uzamsal sınırları aşmak ve OCT taramalarını otomatik olarak elde etmek için 3 eksenli bir konumlandırma sistemine spektral etki alanı OCT görüntüleme probu monte edilmiştir. Kurulum, 100 cm 2'ye kadar yüzey alanlarının tomografik görüntülemesini etkin bir şekilde sağlayarak, çakışan mozaikdesenli (çini taraması) birkaç OCT taramasının elde edilmesine izin verir. Ayrıca, bu sistemin yüksek konumlandırma hassasiyeti, uzun süreli deneyler sırasında belirli sitelerdeki biyofilm özelliklerinin büyümesini ve gelişimini güvenilir bir şekilde izlemenizi sağlar. Sistem modüler ve tek tek bileşenleri (yani, konumlandırma cihazı ve OCT) kurulum bağımsız çözümler olarak kullanılabilir veya esnek kombine. Şekil 1, kurulumun sabit ve yazılım bileşenlerine genel bir bakış sağlar.
Sistem, ticari olarak kullanılabilen GRBL kontrollü CNC konumlandırmacihazı (Malzeme Tablosu) ile test edilmiştir. Bu özel konumlandırma platformunun çalışma mesafeleri 600×840×140 mm olup, üretici tarafından +/- 0,05 mm ve 0,005 mm. GRBL programlanabilir çözünürlüğe sahip bir açık kaynak (GPLv3 Lisansı), CNC için yüksek performanslı hareket kontrolü Aygıtları. Bu nedenle, her GRBL tabanlı (sürüm > 1)'lik konumlandırma cihazı burada sunulan yönergeler ve yazılım paketleriyle uyumlu olmalıdır. Ayrıca, yazılım birkaç değişiklik ile STEP-DIR giriş türü ile diğer stepmotor denetleyicileri adapte edilebilir.
Sistemin performansını değerlendirmek için kullanılan OCTcihazı (Tablo Malzemeler) 930 nm (bant genişliği = 160 nm) merkezi dalga boyuna ve ayarlanabilir referans kol uzunluğu ve yoğunluğuna sahip düşük tutarlılık ışık kaynağına sahiptir. Burada sunulan örnekte, OCT probu akan suya daldırılan bir daldırma adaptörü de kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Otomatik OCT tsam alımı için burada geliştirilen yazılım paketi kritik sdk belirli OCT sistemi ile birlikte sağlanan bağlıdır, ancak, farklı tsam lensler ve merkezi dalga boyları ile aynı üreticinin OCT sistemleri olmalıdır kolayca uyumludur.
GRBL aygıtı tek kartlı bir bilgisayara yüklenen birweb sunucusu tarafından kontrol edilir (Şekil 1). Bu, yerel ağ veya internet erişimi olan herhangi bir bilgisayardan aygıtın uzaktan kontrol sağlar. OCT cihazı ayrı bir bilgisayar tarafından kontrol edilir ve OCT sisteminin otomatik deneysel kurulumu bir kenara bırakarak çalışmasını sağlar. Son olarak, yazılım paketleri, OCT sonda konumlandırma ve OCT taraması edinimi (yani, otomatik olarak mozaik desen veya tanımlanmış pozisyonlar kümesi nde 3D görüntüleme veri setleri elde etmek) senkronize etmek için kütüphaneler içerir. OCT probunun 3B'deki konumunun etkin bir şekilde tanımlanması, odak düzleminin (bölgesel) tarama kümeleri için özel olarak ayarlanmasına olanak tanır. Özellikle, pürüzlü yüzeylerde, her OCT tarariçin farklı odak düzlemleri (yani z yönünde farklı konumlar) belirtilebilir.
Ham OCT taramalarını işlemek için bir dizi yazılım paketi geliştirilmiştir (Tablo 1). Konumlandırma cihazının navigasyonu, OCT tarak edinimi ve veri seti işleme, yazılımın geliştirilmesi ve optimizasyonunda dikkate değer esneklik sağlayan Python kodlu Jupyter dizüstü bilgisayarlarla gerçekleştirilir. Bu tür defterlerin iki çalışılan ve açıklamalı örnekleri (sırasıyla görüntü edinme ve işleme için) https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Özelleştirme için başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır yönteminin. Jupyter dizüstü bilgisayar, açıklamalı Python koduna sahip hücreleri içeren web tarayıcısı tabanlı bir uygulamadır. Her adım, ayrı olarak yürütülebilen not defterinin bir hücresinde bulunur. Tarama merceğinden ışık yolunun farklı uzunluğu nedeniyle (küresel sapma)15, ham OCT taramaları bozuk görünür (Şekil 2A). Edinilmiş OCT taramalarında bu bozulmayı otomatik olarak düzeltmek için bir algoritma geliştirdik (ImageProcessing.ipynb, Ek Dosya1'de yeralmaktadır). Ayrıca, biyofilm morfolojisi daha önce membran sistemlerinde 16 olarak kullanılanbir 2D yükseklik haritası olarak görselleştirilebilir ve fayans dizisinde çekilen taramalardan elde edilen yükseklik haritalarının nasıl dikilebildiğini gösteriyoruz.
Son olarak, açıklanan laboratuvar kurulumunun işlevselliği, fototrofik akarsu biyofilminin akış hızının bir degradesine maruz kıldığı bir flume deneyi kullanılarak gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konumlandırma Cihazının Kurulumu
- https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl'daki talimatları izleyerek konumlandırma cihazını bir mikrodenetleyici panosuna bağlayın.
- Mikrodenetleyiciyi USB kablosu üzerinden internet bağlantısı olan tek kartlı bir bilgisayara bağlayın ve https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git açıklandığı gibi GRBL sunucusunu kurun. Şimdi konumlandırma cihazı http://IP:5020/ barındırılan bir web sayfasından gezilebilir olmalıdır. Alternatif olarak, konumlandırma aygıtı bir Python komut dosyası ile gezinilebilir, çalışılan örnek ImagesAcquisition.ipynb ilk bölümünde gösterildiği gibi (Ek Dosya 2).
2. OCT Kurulumu
- OCT probu, uyumlu bir güvercin kuyruk tutucusu kullanarak konumlandırma cihazına monte edin. Gerekirse, objektif lens üzerinde bir daldırma adaptörü yükleyin.
- Bilgisayarı ve OCT baz ünitesini deneyin yanındaki bir bankta yerleştirin (örn. mikroakışkan cihazlar, akış odaları, bacalar, filtrasyon sistemleri). Optik kablonun (yaklaşık 1,8 m maksimum uzunlukta) serbestçe hareket halinde olduğundan, amaçlanan tüm konumlara ulaşacak kadar uzun olduğundan ve deneysel kuruluma müdahale etmediğinden emin olun.
- OCT sistemini üretici tarafından açıklandığı gibi kullanılabilir yazılımla birlikte yükleyin.
- https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git açıklandığı gibi otomatik OCT tarar edinimi için yazılım paketlerini yükleyin.
3. Görüntü Edinimi
- OCT sisteminde ve konumlandırma cihazında güç. Aygıtın serbestçe hareket edediğinden emin olun.
- Config.json dosyasını metin düzenleyicisinde açın. Config.json dosyasını, kırılma indisi (20 °C'de su için 1,33, hava için 1,00) ve elde edilen veriler ve meta veriler için hedef klasörü gibi varsayılan görüntü edinme parametresini(Tablo2) ayarlamak için edin.
- Config.json'dagörüş alanının (FOV) boyutunu ve B taraması başına A-taramalarının sayısını tanımlayın.
NOT: Bu iki parametre, son veri kümesinin voxel'lerinin boyutunu ve çıkış dosyasının boyutunu belirler ve probun optik çözünürlüğüyle eşleşmelidir (x-y voxel boyutu optik çözünürlüğün yarısından küçük olmamalıdır). A- ve B-taramalarının sayısı, mevcut disk alanı ve işlem gücüne karşı hangi takas-off kapsanacak mekansal ölçüde etkiler. - Config.json'daçıkış OCT tonu'nun sinyal sınırlarını tanımlayın. Bunlar numunenin türüne bağlıdır. Bu nedenle, bir dizi ön taramanın yoğunluk histogramlarına göre bu parametrelerin belirlenmesi önerilir. config.json'dakideğişiklikleri kaydedin.
- OCT sondasını ilgi çekici bir siteye yönlendirin. En iyi görüntü kalitesi için numuneyi odaklayın ve referans kolunu ve ışık kaynağı yoğunluğunu ayarlayın. Bir dizi pozisyon için bu yordamı tekrarlayın ve koordinatları not edin.
NOT: Bu, bu referans noktaları etrafında sonraki otomatik OCT taşma kaydedinimi sağlayacaktır. Referans kol uzunluğu ve yoğunluğunun otomatik görüntü edinimi sırasında değiştirilemeyeceğini unutmayın. - Juypter Notebook'ta ImageAcquisition.ipynb dosyasını (EkDosya2) açın. Her hücre belirli görevleri gerçekleştirmek için kod içerir ve Hücre tuşuna basarak ayrı ayrı çalıştırılabilir | Çalıştırveya Ctrl + Enter veya Shift + Enter.
- Gerekli kitaplıklara ve varsayılan yapılandırma parametrelerine giden yolu ayarlayın. Alternatif olarak, geçici parametrelerin yeni bir kümesi tanımlayın.
- Konumlandırma cihazına bağlanın ve OCT'yi başlatma.
- Konumlandırma cihazını kalibre edin (yanibir "homing" gerçekleştirin).
- Tek taşma veya mozaik desendeki ilgi alanlarını kapsayan veri kümelerini elde ederek sayıyı ve çakışmayı belirterek (örn., %30) komşu karolar.
NOT: Bellek, bilgisayar kaynağı kullanımını en iyi duruma getiren tamadan önce ayrılır. Veriler depolama alanını kaydetmek için 8 bit *.ham formatta, config.json'datanımlanan hedef klasöre, zaman damgası ve adlandırma kuralı olarak konum (yani% Y%m%d_%H%M%S_) kaydedilir. OCT ayarlarını ve koordinatlarını içeren meta veriler, aynı adlandırma kuralına sahip *.srm dosyasındaki aynı klasöre kaydedilir. FOV ve çözünürlük gibi ayarlara bağlı olarak, dosya boyutu OCT tarası başına 1,5 GB'a kadar ulaşabilir.
- Veri toplamanın kürtajını önlemek için, yeterli boş disk alanı olduğundan emin olun veya OCT veri kümelerini sürekli olarak harici bir sabit diske taşıyın.
4. Görüntü Düzeltme ve Görüntüleme
- OCT görüntü işleme (bozulma düzeltme, arka plan çıkarma, yükseklik haritaları nın hesaplanması, yükseklik harita dikiş) çalışmış bir örnek için Jupyter dizüstü ImageProcessing.ipynb (EkDosya1) açın.
- Gerekirse, sahte sinyalleri dışlamak ve veri kümesini yeniden yönlendirmek için OCT taramaları ekin (biyofilm substratum üzerinde görünmelidir).
- Küresel sapma için doğru. Bu düz olduğu bilinen son derece yansıtıcı referans yüzeyi kullanan bir düzeltme algoritması tarafından gerçekleştirilir (örneğin, baca alt, substratum). İlk olarak, algoritma 20 × 20 dikey çizgiler düzenli OCT scan xy düzlemi boyunca aralıklı bir ızgara tanımlar. Daha sonra, her noktanın etrafında dairesel bir alan seçer ve dikey profil boyunca sinyal yoğunluklarını ortalamar (Şekil2B). Dikey profiller değiştirilmiş bir Gauss filtresi ile işlenir:
x giriş sinyali ve σ standart sapma, C gibi belirlenir ise nerede:
Referans yüzeyi, bu profillerin her birinde yerel maxima olarak yerelleştirilmiştir. Yanlış tanımlanan noktalar komşularının konumlarına göre üç boyutlu olarak filtrelenir (Şekil2C). Son olarak, tazyik lensin getirdiği bozulmayı yansıtan2. Daha sonra monte edilen yüzey, her pikseli z yönünde kaydırmak için kullanılır ve böylece düzleştirilmiş bir görüntü elde edilir. Bu algoritmanın parametreleri OCT tolasının özelliklerine göre ayarlanmalıdır. - Arka plan gürültüsü için doğru. Görüntünün boş bir alanını (genellikle biyofilm üzerinde) belirleyin ve düzeltme algoritmasını kullanarak görüntünün yoğunluk değerlerinden ortalama arka plan yoğunluğunu çıkararak son düzeltilmiş BIR OCT görüntüsü (Şekil2D)üretin.
- 3D OCT veri kümesinden bir yükseklik haritası hesapla. Bu adımda, belirli deney (örneğin, substratum) için ilgi bir referans yüzeyi ve uygun bir eşik yoğunluğu tanımlayın. Daha sonra, ikili maskenin her koordinatı (x,y) için biyofilmin kalınlığını hesaplamak ve yeni bir 2B matris (Şekil3A)atamak için yükseklik haritası hesaplama algoritmasını kullanın. Kalınlık değerleri daha sonra x ve y yönünde orijinal görüntünün boyutu 2B matris atanır. Bir görüntü, yüzeyin yüksekliğinin gri tonlama değeri olarak raporlandığı bir görüntü haline getirilir (Şekil 3B).
- Birkaç OCT taramasımozaik bir desenle alınırsa, satır ve sütun sayısını tanımlayın ve ilgili yükseklik haritalarını dikin. Şekil 5, açıklanan kurulumla ulaşılabilecek geniş mekansal ölçek ve çözünürlük yelpazesini kapsayan dikişli yükseklik haritalarının örneklerini sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fototrofik akarsu biyofilmlerinin spatio-temporal morfogenezini incelemek üzere tasarlanmış bir flume deneyi kullanarak otomatik OCT görüntüleme sisteminin işlevselliğini gösteriyoruz. Flumes'in yavaş yavaş daralan geometrisi, baca merkezi boyunca akış hızında degradelere neden olur (bkz. referans17). Hidrodinamik koşulların biyofilm morfogenezi üzerindeki etkilerini daha iyi anlamak amacıyla biyofilmin zamansal gelişimi ve yapısal farklılaşması 18 gün boyunca izlendi. Şekil 4, 18 günlük büyümeyi takip eden bir biyofilm mikrokolonisinin büyümesini göstermektedir. Biyofilmin yüzey morfolojisi yukarıda açıklanan araç seti kullanılarak ölçüldü (Şekil 4A). Biyohacim hesaplanmıştır (bkz: bkz: çalışılan örnek ImageProcessing.ipynb, Ek Dosya 1) akış hızı degradesi boyunca her pozisyon için 3,6 mm kenar uzunluğuna (Şekil4B)sahip bir kare hareketli pencere için (Şekil 4C). Biyofilm birikimi artan akış hızı ile önemli ölçüde azaldı (flume en geniş kısmından mesafe olarak gösterilir; Şekil 4). Daha da önemlisi, bu deneysel kurulum, büyük uzamsal degradeler boyunca yapısal parametrelerin (örn. biyohacim, kalınlık, pürüzlülük) sürekli olarak ölçülmesine olanak sağlar. Bu nedenle, bu yeni araç biyofilm yapısı ve çevresel ipuçları arasındaki ilişkiler hakkında bilgi edinmek için araçlar sağlar.
| Yazılım bileşeni | Açıklama |
| stepcraft.py | Konumlandırma aygıtını denetlemek için bir Python kitaplığı. Aygıtı gezinmek ve yönlendirme tanımlarını içerir. |
| OctControl.cpp | OCT sistemi yle dağıtılan Yazılım Geliştirme Kiti'nden (SDK) türetilen C++ kodu. Bu işlem VisualStudio 2017, PythonC/API ve SDK kullanılarak derlenmiştir. |
| ImagesAcquisition.py | Oct taramalarını seçili konumlara almak ve tarama döşeme deseni tanımlamak için komutları içeren bir Python kitaplığı. |
| ImagesAcquisition.ipynb | Konumlandırma aygıtında gezinmek, OCT taramaları elde etmek ve otomatik görüntü edinimi için kullanılan Jupyter dizüstü bilgisayar. |
| OctCorrection.py | Ham OCT görüntülerinin düzeltilmesi ve arka plan çıkarma için kullanılan işlevleri tanımlayan bir Python kitaplığı. |
| OctProcessing.py | Yükseklik haritalarını hesaplamak ve dikmek için işlevleri içeren bir Python kitaplığı. |
| OctProcessing.ipynb | Jupyter dizüstü bilgisayar görselleştirmek için, doğru ve OCT taramaları işlemek. Bu da biyohacim hesaplama bir örnek içerir. |
Tablo 1. Yazılım bileşenleri.
| Parametre | Değer | Açıklama |
| Ganymede | 1, 2, 3 | OCT sistemi ve sürümü seçimi |
| Sonda | 1, 2 | Tazyik lisi seçimi |
| nAscans | 32-900 | B-taraması başına A-tarar sayısı |
| nBscans | 1-900 | B-taramalarının sayısı |
| nCscans | 128-1024 | Derinlik piksel sayısı |
| X | 0.1-10 | X yönünde görüntü boyutu (mm) |
| Y | 0.1-10 | Y yönünde görüntünün boyutu (mm) |
| refr | 1-1.6 | Kırılma indisi (hava için 1, su için 1,33) |
| avg_Ascans | 3 | A-tcan ortalama sayısı |
| scanspeed | 1,2,3 | A-tazyik hızı (5,5, 15 ve 36 kHz) |
| Yolu | ".. / %Y-%m-%d_%H_%M_%S" | Edinilen OCT taramaları için hedef klasörü, adlandırma confention olarak zaman damgası kullanır |
| colorBoundaries | [0.0-256.0,0.0-256.0] | Edinilen taramaların renk sınırları |
Tablo 2. OCT parametre ayarları.
Şekil 1. Sabit ve yazılım bileşenlerine genel bakış. GRBL kontrollü bir konumlandırma cihazının step motorları, USB üzerinden tek kartlı bir bilgisayara bağlanan bir mikrodenetleyiciye bağlanır. GRBL sunucusu ikinci ye yüklenir ve konumlandırma cihazının hareketi TCP/IP bağlantısı üzerinden herhangi bir web tarayıcısından kontrol edilebilir. Alternatif olarak, konumlandırma aygıtının gezintisi python kodlu Bir Jupyter dizüstü bilgisayardan(ImagesAcquisition.ipynb, Ek Dosya 2) GRBLServer.py kitaplığı kullanılarak gerçekleştirilebilir. OCT sistemi, python komut dosyası aracılığıyla otomatik OCT tbmsi edinimi yapılabilen ayrı bir bilgisayara baÄ lıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. OCT tcan düzeltme iş akışı. Panel A, düz pleksiglas bir yüzeyüzerinde büyüyen biyofilmin işlenmemiş bir B-tonu gösterir. Görüntü, merceğin içinden geçen düşük tutarlılık ışığının yol uzunluğundaki farklılıklar nedeniyle deforme olur (bükülür). OCT görüntü bozulması, görüntüde güçlü bir şekilde yansıtan, düz bir referans yüzeyi tanımlayarak düzeltilebilir. İlk olarak, 20× 20 referans noktaları eşit görüntü tüm yığını boyunca dağıtılır. Bu noktaların her birinde, görüntü sinyali her derinlik (z düzlemi) için dairesel bir alan (x-y yönünde) boyunca ortalama olarak, sinyal yoğunluğunun ortalama bir derinlik profili elde edilir. Daha sonra, 400 başvuru profilinin her birine değiştirilmiş bir Gaussian filtresi uygulanır. Panel B, Panel A'daki dikey kırmızı çizgi, ortalama derinlik profili ve değiştirilmiş Gauss filtresi uygulandıktan sonra aynı profille gösterilen derinlik profili boyunca orijinal sinyalin bir örneğini sağlar. Modifiye Gauss filtresi, sinyal yoğunluğunda yerel maksimanın tanımlanmasına olanak tanıyan ve böylece güçlü bir şekilde yansıtan referans yüzeyinin konumunu belirler. Doğru tanımlanmış referans noktaları daha sonra komşularının koordinatlarına göre üç boyutlu olarak seçilir. C panelindeki örnekte, sarı noktalar sonraki görüntü düzeltmesi için tutulurken, mor noktalar atılmıştır. 2. sıralı polinom yüzeyi daha sonra doğru yerleştirilmiş referans noktalarına sığar ve pikselleri z yönünde kaydırarak orijinal OCT görüntüsündeki bozulmayı düzeltmek için kullanılır. Ortalama arka plan yoğunluğu görüntünün boş bir alanından tahmin edilir ve düzeltilmiş görüntülerden çıkarılır. Panel D düzeltme ve arka plan çıkarma sonra aynı B-tonu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Yükseklik haritaları. Biyofilm topolojisi, biyokütlekalınlığının renk kodlu olduğu 2D yükseklik haritaları olarak görselleştirilebilir. Bunun için 3D OCT görüntüsü eşiklenir ve biyofilm kalınlığı en üstteki sinyalin substrata olan uzaklığı olarak hesaplanır. Panel A, eşik ledikten sonra elde edilen B-tonu ikili maskesini gösterir. Mavi çizgi en üstteki sinyali gösterirken, kırmızı çizgi referans yüzeyini gösterir. Panel B, OCT sondasının eksenel çözünürlüğüne göre ölçeklenmiş elde edilen yükseklik haritasının bir örneğini gösterir. Kırmızı çizgi, Panel A'daki B-tonu konumunu gösterir.
Şekil 4. Akış hızının biyofilm büyümesi üzerindeki etkisini gösteren temsili sonuçlar. Flüt deneylerini kullanarak akış hızında bir degrade boyunca fototrofik akım biyofilm morfogenezi üzerinde çalıştık. Akış hızı, baca girişinden uzaklıkla artmıştır. Büyüme 10 gün sonra, biyofilm morfolojisi farklı çözünürlükte otomatik OCT ile karakterize edildi ve farklı mekansal ölçekleri kapsayan. Yükseklik haritaları (A, B ve C) biyofilmin morfolojisini sırasıyla düşük, orta ve yüksek akış hızı altında göstermektedir. Bu yükseklik haritaları x, y yönünde 4 μm yönünde voxels boyutuile OCT taramalarından hesaplanır. Talan yüzey alanı 3,6 mm kenar uzunluğunda bir karedir. D, E ve F panelleri, xy yönünde 11 μm yönünde voxel boyutu, 10 mm2 tarama alanı ve %30 komşu taramalar arasında örtüşme ile 3×3 OKT taramaları nın dikilmesiyle elde edilen yükseklik haritalarını (sırasıyla düşük, orta ve yüksek akış hızı) gösterir. Panel G, bu flume deneyinde elde edilen tüm hız degradesi boyunca büyüyen biyofilmin yükseklik haritasını gösterir. Xy yönünde 40 m yönünde voxel boyutu, 10 mm2 tarama alanı ve komşu taramalar arasında %30 örtüşme ile 3×51 OCT taramaları dikilerek elde edildi. Elde edilen toplam tbmm alanı 24×353 mm. Panel H, 3,6 mm kenarlık kare hareketli pencerede biyohacim rapor eder. Ortalama biyohacim, girişten uzaklık fonksiyonu olarak önemli ölçüde azalmıştır (I). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. Konumlandırma cihazı için hassas test. Konumlandırma cihazının hassasiyeti, konumlandırma cihazına 35 mm makro lensle donatılmış ve renkli bir iz üzerinde odaklanmış 20,2 Megapiksel kamera monte edilerek değerlendirildi. Konumlandırma cihazı işaretten rasgele bir yönde hareket ettirildi ve toplam 80 döngü boyunca geri konumlandırıldı. İşaretin konumu daha sonra karşılaştırıldı. Şekil, ilk resme göre x ve y yönündeki kaymayı gösterir. Maksimum kaymanın y yönünde yaklaşık 16 μm ve x yönünde daha az olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1. ImageProcessing.ipynb. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Dosya 2. ImagesAcquisition.ipynb. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT görüntüleme de birkaç milimetre kare bir FOV ile mikrometre aralığında yapıları çözmek için uygundur. Böylece biyofilm araştırma için güçlü bir araçtır10,18. Ancak, OCT şu anda 100 maksimum tazyik alanı ile sınırlıdır - 256 mm2, biyofilm yapısal desenler genellikle bu mekansal ölçek aşaniken 19, özellikle morfolojik farklılaşma büyük ölçekli çevresel degradeler tarafından tahrik edilir 20- Bu protokolde tanımlanan otomatik OCT görüntüleme sistemi, OCT ile karakterize yüzey alanını birkaç santimetre kareye kadar genişleterek, biyofilm morfolojik farklılaşmasını ilgili mekansal ölçekler üzerinde etkin bir şekilde izleyebilmekte (birkaç milimetreden birkaç santimetreye kadar). Yüksek konumlandırma doğruluğu (16 μm içinde; Şekil 5) biyofilmlerin yapısal gelişimini uzun süreler boyunca doğru birşekilde izlemenizi sağlar (Şekil 4), biyofilmlerin morfolojik farklılaşmasının sürücülerinin mekanistik bir anlayış elde etme olanaklarını etkin bir şekilde artırır . Aynı zamanda, bu in situ biyofilm karakterizasyon tekniği non-invaziv ve biyofilm büyüme ile girişim en aza indirir. Burada sunulan görüntü işleme çözümleri biyofilm OCT datasets16daha önce istihdam analizleri üzerine inşa , henüz otomasyon benzeri görülmemiş zaman araçları sağlar- ve alan çözümlü OCT veri seti analizleri.
Bu sistem, protokolde açıklandığı gibi belirli bir OCT aygıtı ile tasarlandı ve kıyaslandı. Protokoldeki kritik adımlar esas olarak, yüksek görüntü kalitesi için kritik öneme sahip oct çözünürlüğü ve odaklama ile ilgilidir. Küresel sapmaların düzeltilmesinin bir sınırlaması, son derece yansıtıcı düz bir yüzeyin varlığına bağlı olmasıdır. Alternatif olarak, standart bir düzeltme yüzeyi ölçülebilir ve daha sonra OCT taramalarını düzeltmek için kullanılabilir. Ayrıca, OCT taramalarının dikişi komşu taramaları hizalamak için yeterli yapısal özelliklere bağlıdır. Tek tip biyofilm dağıtımı veya düşük biyofilm kapsama alanı durumunda, dikiş sadece konumlandırma cihazının hassasiyetine bağlı olarak elde edilebilir. Son olarak, diğer görüntü işleme ardışık düzenbazında olduğu gibi, bu araçları kurarken, görüntü toplu işlemeden önce bir dizi temsili taramada işlem algoritmasının performansını dikkatle değerlendirmek önemlidir.
Hem sabit hem de yazılım, tek tek parçaların tam modülerliğini sağlamak üzere tasarlanmıştır. Daha spesifik olarak, bu sistem kolayca hiperspektral kameralar veya mikrosensör profilleme kullanarak makro-fotoğraf görüntüleme gibi biyofilm karakterizasyonu için diğer araçlar ile çalışmak için adapte edilebilir. Yapısal bilgilerin biyofilmlerin etrafındaki ve içindeki kaynaklardaki yerelleştirilmiş degradelerle birleştirilmesi, biyofilmlerin kaynak tahsisini optimize etmek için nasıl uyarlandıklarına dair yeni ve önemli bilgiler sağlayacaktır. Esneklik aynı zamanda açık erişimli, hızlı ve çok yönlü bir yazılım geliştirme aracı olan Jupyter dizüstü bilgisayarların kullanımı yla da uygulanır.
Genel olarak OCT görüntülemenin kritik bir sınırlaması, hızla hareket eden nesneleri çözme engeli olmaya devam etmektedir. Örneğin, akışa uzayan ve akışla hareket eden flamalar doğru şekilde tasvir edilmez. Bu aracın uygulanabilirliği nispeten sabit, hareket etmeyen biyofilm yapıları ile sınırlıdır. Sistem, ancak, ilk ayarları ve gerekirse, odak ve aydınlatma manuel ayarlama, hala gereklidir özerk çalışması için optimize edilmiştir. Örnekler yoğunluk ve yansıtıcı özellikler açısından önemli ölçüde farklılık gösterirse, bu önemli bir sınırlamayı temsil eder. Ancak, yazılım güdümlü odaklama ve aydınlatma ayarlaması da dahil olmak üzere tam otomasyon, benzer ilkeler (örneğin, step motorlar ve yazılım donanım geri bildirimleri) kullanılarak sağlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sebastian Schäfer, Thorlabs Inc.'de çalışmaktadır.
Acknowledgments
Mauricio Aguirre Morales'e bu sistemin gelişimine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan T.J.B.'ye finansal destek geldi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer Verlag. (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
