Summary
ここでは、文化人間 enteroid または colonoid 単分子膜細胞および生化学的レベルでホスト上皮細菌相互作用を研究するそのままバリア機能を持つプロトコルを提案する.
Abstract
人間 3 次元 (3 D) enteroid または colonoid 文化地下基地の幹細胞から派生は、現在腸上皮の最も先進的な前のヴィヴォモデル。それらの閉鎖の構造と重要な支持細胞外マトリックスのため 3 D 文化、宿主-病原体研究のため適していません。Enteroids または colonoids が内腔の両方の操作を許可するように透過性の組織培養膜上皮膜として育てることができる基底細胞の表面とそれに伴う流体。この高度な内腔表面アクセシビリティ容易に腸管出血性大腸菌(EHEC) 大腸上皮の粘液分解能力などは、細菌のホスト上皮の相互作用をモデル化します。3次元培養フラグメンテーション、単分子膜の播種と上皮電気抵抗 (テル) 測定の confluency と分化に向けた進捗状況を監視する方法を説明します。Colonoid 単分子膜の分化には、蛍光抗体または免疫ブロット法によって学ぶことができます分泌された粘液が得られます。もっと一般に、enteroid または colonoid の単分子膜は、病原性や共生細菌叢に狙われるので特定の細胞集団を評価する生理学的に関連するプラットフォームを有効にします。
Introduction
腸 organoids、enteroids、および colonoids は、多くの幹細胞の挙動、腸管発達、バリア/トランスポート機能と細胞分化の理解の進歩につながっています。1ただし、3次元培養上皮病原体との相互作用の研究ために制限内腔を細菌に直接アクセスできないか病原因子閉じた構造はマイクロインジェクションの影響を受ける場合を除き、されます。2,3また、分泌蛋白質、小さい分子のような材料または粘液下流解析のための三次元培養から簡単にサンプリングできず。蛍光染料と微速度顕微鏡観察を用いた三次元培養における上皮バリア機能4とイオン輸送5病原体の影響が評価されているが、単分子膜透過性培養担体上栽培に適しています。テル測定、Ussing 商工会議所/電圧クランプ記録など追加のテクニック。6,7
多数の出版物は、enteroids/colonoids の 2D または単一層文化のためのプロトコルを説明しています。上皮細胞接着を促進するために見つけられる材料を含める8,9 0.1% ゼラチン、コラーゲン ゲル10薄層マウス肉腫由来基底膜マトリックス (BMM),11,12、 13と人間のコラーゲン IV。6,7,14,15,16,17 にはシードのアプローチには6,14,15および/またはトリプシン,10,11を使用して細胞接着因子の解離をピペッティングによる機械的断片化が含まれます当期、13または EDTA。9いくつかのプロトコルは、シーディングのため非多孔性の組織培養容器を使用、ので、透過性の組織培養挿入に依存するほとんどのアプリケーション、これは基底アクセスを制限します。安定してコンフルエント単層の形成と維持のドキュメントは、文書とは大きく異なります。また、人間文化の成長と分化のメディアの組成は様々 なグループの間で異なる、多くの研究者が採用し、自分のアプリケーションや使用可能なリソースに合わせて方法を調整と進化し続けます。
宿主-病原体相互作用の研究で 3 D 腸上皮文化の制限に対処するため 3 D 人間 enteroids または colonoids を単層に変換するための修正されたプロトコルを提案する.クリプトのような未熟な状態の密度を達成した後成長因子 WNT3A、RSPO1、A-83-01 ・ SB 202190 阻害剤の回収は小さい腸粘膜や大腸上皮の代表的な差別化に します。我々 は理想的なマトリックス、人間のコラーゲン type IV、挿入をコートし、めっき用制服 enteroid または colonoid のフラグメントを取得について説明します。Ex vivo法や免疫染色による粘液病原体相互作用の研究を可能にするこのプロトコルがコンフルエント単層 TER. Colonoid 単分子膜が厚い頂粘液層を分泌する高を生成することを紹介します。是非、大腸粘液層を維持するために変更された固定方法についても述べる.このメソッドは、感染初期の腸宿主-病原体相互作用の研究に解き得るモデルを提供しています。
Protocol
このプロトコルは、著者が以前に発表された研究に基づいています。6,7,14,15,16次の手順は、適切な無菌技術を使用して滅菌の安全キャビネットでを実施する必要があります。人体標本を含むすべてのメソッドは、制度的レビュー ボードのジョンズ ・ ホプキンス大学医学部 (IRB NA_00038329) によって承認されています。
1 細胞外マトリックスでコート セル文化挿入
- ストック コラーゲン IV 溶液 (1 mg/mL) 100 mM 酢酸 5 mL を準備します。完全に水和物/溶解する 4 h 約 4 ° C で立ってみましょう。
- 分注コラーゲン IV ソリューションをストックし、4 ° C (≤ 1 ヶ月) または-20 ° C (> 1 ヶ月) を格納します。
- コーティング直前に無菌の組織培養グレード水 34 μ g/mL の最終的な集中にコラーゲン IV 原液を希釈します。24 ウェル プレート細胞培養の挿入します、コートを 100 μ、10 μ g/cm2に対応するソリューションのそれぞれを挿入します。
- 標準的な CO2組織文化のインキュベーターで 37 ° c ≥ 2 h のプレートを孵化させなさい、便宜上、パラフィン フィルムとプレートの縁をシールや 4 ° C 夜間または最大 1 週間で孵化させなさい。
2. enteroids/colonoids 3 D 文化からの分離します。
注: の Enteroids または colonoids がドナーのバイオプシーから確立・前述の標準プロトコルによると 3 D の文化で維持します。14,18簡単に、陰窩は、腸生検またはキレートと機械的攪拌による切除から収穫されます。陰窩洗浄、収穫、BMM のメッキします。拡張メディア (4.2 の手順で説明) は文化に追加され、2 日おきを交換してください。3 D 文化形成、めっき後時間以内に表示されます。
- 24 ウェル プレートから培養液を吸引し、1 mL 冷たい収穫ソリューションに置き換え (材料表参照) ウェルあたり。
- 取り除くと決別しても端に近い任意の材料に特に注意を払って、基底膜マトリックス ペレットにミニ細胞スクレーパーを使用します。
- 約 200 rpm の 30-45 分のための 4 ° C で軌道シェーカーでプレートを揺り動かしなさい。
3. 分離 3 D enteroids/colonoids
- 細胞懸濁液をカップ刻んだ P200 シングル チャンネル ピペットや滅菌フィルター ヒント装備マルチ チャンネル ピペットを使用します。
- 15 mL コニカル バイアルでセル suspension(s) をプールします。総懸濁液量は 6 mL > 場合は、複数のバイアルを使用します。
- 10 mM HEPES、L-アラニル-L-グルタミン ジペプチド (1 x)、ペニシリン ・ ストレプトマイシン (1 x) を含む DMEM/f12 のキー培地の等しい量を追加 (洗濯中)。3-4 回チューブを反転をミックスします。300 × g、10 分、4 ° C で遠心分離
- 必要に応じて、洗浄媒体を吸引し、0.5 mL/ウェル トリプシンに置き換えます (材料の表を参照してください)。P200 ピペットと colonoids を再懸濁します、チューブをキャップし、37 ° C の水浴約 2 分すぐにチューブを削除、10 mL の最終巻に洗浄媒体を追加、およびステップ 3.3 のように遠心分離を繰り返し配置します。
注: この手順は製粉の均一サイズのフラグメントで結果がない場合は望ましいことです。
- 必要に応じて、洗浄媒体を吸引し、0.5 mL/ウェル トリプシンに置き換えます (材料の表を参照してください)。P200 ピペットと colonoids を再懸濁します、チューブをキャップし、37 ° C の水浴約 2 分すぐにチューブを削除、10 mL の最終巻に洗浄媒体を追加、およびステップ 3.3 のように遠心分離を繰り返し配置します。
4. めっき enteroid/colonoid ペンション
- コーティング チップが 4 ° C で保存されている場合は、セルめっき前に少なくとも 30 分間 37 °C/5% CO2培養インキュベーターで平衡します。
- めっきされる挿入するたびに 1 mL (25-37 ° C) の間に暖かい展開中 (EM) を準備し、10 μ M Y-27632 と 10 μ CHIR 99021 を追加します。
注: EM 構成の高度な DMEM/F12 B27 を含む (1 x)、50 %wnt3a エアコン中、15% エアコン RSPO1 中、10% エアコン頭中、50 ng/mL 人間 EGF, 500 nM 10 μ M SB 202190、抗生物質/抗真菌薬カクテル (1 x)、10 mM HEPES、A-83-01L-アラニル-L-グルタミン ジペプチド (1 x)、およびペニシリン-ストレプトマイシン (1 x) (材料の表を参照してください)。 - 細胞ペレットを含むチューブから洗浄媒体を吸引し、EM の少なくとも 100 μ L/挿入を生成するのに十分な量で再懸濁します。
- 各挿入からコラーゲン IV 溶液を吸引し、挿入 1 回あたりの洗浄中の 150 μ L で 2 回洗ってください。
- ピペット 600 μ L の EM の各挿入の下の空間に。
- ピペット 100 μ l 中、各挿入に細胞懸濁液。
- プレートを培養孵卵器に戻り、少なくとも 12 h を行わないでください。
注: 揺れ挿入膜上の colonoid フラグメントの偏在を防ぐためにプレートを鋭く傾斜を防ぐため。 - 携帯添付ファイルを監視し、2.5 の下で位相差顕微鏡に板を置くことによってコンフルエント単層を形成する拡散対物レンズ × x-10。
- 1-2 日後ほとんどのフラグメントは、コラーゲン マトリックスに従う必要があります。培養液を更新し、Y-27632 と CHIR 99021 治療を中止します。媒体合流まで 2-3 日毎の更新を続けてください。密度は通常 7 〜 10 日に達されます。
5. メジャー上皮電気抵抗
- 電極リードと上皮の voltohmmeter (EVOM) の電源を接続します。測定機能が ω に設定されているを確認します。
- 70% エタノールで簡単に電極先端を浸し、研究所ティッシュで拭いて乾かして。約 5 分間洗浄媒体の 5 mL で電極を平衡します。
- 挿入中に短い電極先端部の下のウェル プレートに長い電極先端部の方向します。EVOM 読書が比較的安定するまで完全に垂直方向にまたはもはや 60 以上の電極を維持 s。
注: 電極アセンブリが垂直から傾いている場合、チップの高さを調整する不適切な短いヒント可能性がありますとの接触に来るし、単層細胞を混乱させます。 - EVOM 測定の confluency または差別化に向けての進行を評価するための培地の水没携帯無料挿入から取得した値を比較します。
6. 合流 enteroid/colonoid 単分子膜の分化
- 分化培地 (DM) のための EM の交換し、メディアを 5 日目まで 1 日おき更新を続けます。DM は RSPO1、WNT3A を欠いている EM A-83-01 ・ SB 202190。
- 期待どおりに分化が進んでいることを確認するテルを監視し続けます。テルは、分化の 1 ~ 5 日の間に増加していきます。単分子膜は、テルの増加し一日 5-6 を超えて生存を保持するが、一日 5-6 で使用した場合の最大、最も再現性のある結果を展示し続けるかもしれません。
7. 細菌感染共生または病原性大腸菌
- 1 日感染を行う前に洗浄し、抗生物質無料 EM または DM 単分子膜をフィードします。
- 滅菌微生物ループを使用して、軽く冷凍細菌のグリセロール ストックの表面をこすり、流体培養基 LB の 2 mL を接種します。標準的な 12-16 h の 37 ° C でインキュベーターを揺れにチューブを転送します。
- 流体培養基 LB 新鮮な 5 mL (1: 100) にスターター文化の 50 μ L を希釈し、90 分間振とう培養を続けます。105-106コロニー形成単位 (cfu) の密度でログ相培養が得られる/mL。
- 必要に応じて、600 で光学密度計測による細菌濃度を確認 nm (OD600) 分光光度計。
- 10 分間 12,000 × g で細菌培養のスピンダウン、上澄みを除去し、抗生物質無料 EM または DM 最終濃度 107 cfu/mL の細菌を再懸濁します。
- 細菌懸濁液の 10 μ L を挿入 (最終濃度 106 cfu/mL) に追加します。ゆっくりとミックスして細胞外粘液層を妨害しないピペットで移しなさい。
- 目的感染期間培養孵卵器にプレートを戻ります。
8. 保存や immunostain 粘液への固定
- リフト 24 ウェル プレートから細胞培養を挿入しますを頂培地を取り除き、挿入にしがみついて離れて外部液体を拭く所ティッシュ ペーパーで慎重に反転します。
- 新しい 24 ウェル プレート氷酢酸無水エタノール (クラークのソリューション) 室温で 10 分間の 1:3 溶液に挿入を浸します。
- 固定を外し、10 分進む免疫染色標準プロトコルの 1x PBS のセルを水分補給に挿入を反転します。
- かみそりの刃を使用して、挿入膜の周囲をカットします。鉗子を用いたガラス顕微鏡スライドに膜を転送し、メディアをマウントを coverglass を押さなければ。
9. 免疫ブロットのセル lysates の準備
注: は、氷や冷たい部屋で次の手順を実行します。
- 吸引中、洗浄を PBS で一度挿入します。
- 追加 150 μ L 換散バッファー含むプロテアーゼ阻害剤 (材料の表を参照してください)、挿入して 5 ~ 10 分放置の換散バッファーを含む 50 mM Tris pH 8、150 mM の NaCl, 1% IGEPAL CA 630, 0.1 %sds、デオキシ コール酸ナトリウム 0.5 %1: 100 プロテアーゼ抑制剤のカクテル。
- 挿入からセルを削除するミニ細胞スクレーパーを使用し、懸濁液および微量遠心チューブへの転送を簡単にカップ刻んだ P200 ピペットを使用します。
- 5 x 1 の懸濁液を超音波、陰極を使用して 20% 振幅のパルス プローブ (材料の表を参照してください)。
- 電気泳動または因数をすぐに実行する場合、SDS ページの読み込みバッファーを追加し、-20 ° C での溶解液を保存
Representative Results
Enteroid と colonoid の人間の文化、3 D 構造体として成長し、解離し、人間のコラーゲン IV 被覆細胞培養インサートめっきの断片化します。単分子膜形成の進行状況が簡単に上皮電気抵抗 (テル) (図 2) を反映する明視野顕微鏡、蛍光染色 (図 1) を経由し着実な増加によって日常的に監視します。イオンと分子密度と相関するタイトな接合の透磁率。空 24 ウェル挿入のテルは約 50-100 Ω·cm2、約 400-500 Ω·cm2に増加する密度に到達すると。合流単分子膜におけるすべての上皮細胞は、セル境界で F アクチン リングによって検出された複合体によって接続される(図 1)。膜における成長因子メディアのヌクレオシドが組み込まれた細胞を積極的に分裂から主に成る増殖のクリプトのような上皮を表すアナログ教育 (図 2)。WNT3A と RSPO1 の成長因子の撤退は、細胞の増殖を欠いている絨毛のような文化につながる分化を促進します。差別化された単分子膜上皮細胞 (enteroids) またはイムノビーズ (colonoids) を含み、18杯と enteroendocrine 細胞を含む 3 D 文化で示されている特殊な腸上皮細胞を開発します。15差別化された単分子膜はまたテル (> 1000 Ω·cm2) の大幅な増加を示す (図 2)、成熟したタイトな接合を示します。
通常の人間の生理学、腸上皮層は、漿膜無菌から栄養素と微生物濃縮内腔領域を分離します。上皮は、しっかりとこれらの 2 つのコンパートメント間のクロストークを調節します。Enteroid と colonoid の単分子膜のプロテオーム解析によって示すように、この重要な区画プロパティの保持表 1.頂タンパク質組成の間の相当な相違がある、基底条件差別化 enteroid 単分子膜から収集されたメディア。樹状突起と基底の両側へのアクセスは、両方の培養上清のコレクション、差分分泌サイトカイン、ケモカインなど他の分子の測定のための時間依存的に15,17
単分子膜は、イムノブロットおよび免疫染色を使用して蛋白質の表現の変更を検出する便利な再現性の高いモデルです。したがって、変更両方のテクニック (図 3) ムチン 2 (muc 2) shRNA ノックダウン (KD) によって表現することができます検出します。ShRNA 伝達は 3 D colonoids 上で実行され、抗生物質選択のメディアに維持します。KD を確認した後 colonoids することができます継続的に 3 D 文化として維持するまたは、実験用として単分子膜メッキします。また、muc 2 KD は、野生型親 colonoid ラインと比較して単分子膜形成の効率に影響を与えません。単分子膜免疫ブロットのコレクションは、シンプルでひと上皮腺癌由来細胞株で説明されているプロトコルと同様です。通常、総蛋白質の約 50 μ g 以上は 0.33 cm2挿入成長膜から抽出できます。図 3に示すように、MUC2 は未分化 (UD) WT colonoid 単分子膜でかろうじて検出可能、高度に差別化された (DF) WT 単分子膜における発現します。MUC2 は、MUC2 shRNA 増殖型 UD と DF の colonoid 膜における検出レベル以下です。
重要なは、単分子膜は、上皮細胞の頂端表面でホスト微生物相互作用の研究に適したモデルです。Colonoid 単分子膜は共生によって簡単に行き渡ってはいないの分化時に厚い添付 MUC2 陽性粘液層を形成細菌エシェリヒア属大腸菌HS (図 4)、何が通常の人間のコロンの示唆されているようです。19しかし、腸管出血性大腸菌(EHEC)、人間の大腸病原体、示されている (図 4) 上皮の根尖部の表面に到達する MUC2 濃縮添付粘液層を破壊する能力を持っています。14,20残り MUC2 は杯細胞の内部に存在のみです。
図 1:人間 enteroid/colonoid 単分子膜の確立します。(A) colonoid の例は、BMM、製粉の分解の後フラグメントします。(B)例めっき colonoid フラグメントの直後に挿入します。スケール バーの (B) = 200 μ m。代表的な(C)最大強度投影および(D)共焦点光学 Z-セクション対応する直交投影で表示 colonoid フラグメントが複数の単分子膜の島の人間のコラーゲン IV コーティング フィルター フォーム上にシード播種後 2-4 日。携帯無料エリア (アスタリスク) が (ヘキスト 33342、青) 両方の核の有無によって識別できる頂 F アクチン (ファロイジン、緑) は共焦点(F)と C および D. 代表(E)最大強度投影で染色と光対応する射影を持つセクション F アクチン染色約 1 週間後を播くことによって検出された連続の頂端表面と合流 colonoid 単分子膜を表示します。(G)代表的な最大強度投影と対応する射影と(H)共焦点光学セクションの高倍率表示 F アクチン perijunctional を合流 colonoid 単分子膜における細胞に形成リング (白い矢印) と未熟な頂ブラシ境界線 (黄色の矢印)。スケール バーの (C H) = 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: enteroid/colonoid 単分子膜の分化の評価。(A)エドゥ (赤) 定款空腸膜分化増殖の進歩的な損失を示します。(B)平均テル合流空腸膜拡張または分化中の単位誤差範囲を表す SEM. UD、未分化;DF は、区別されます。番号は、指定された条件の下で日に対応します。UD1 は播種後、約 1 週間の confluency の最初の日だった(C) UD 空腸膜がある広い、短い細胞と DF 5 日目空腸単分子膜と比べて頂アクチンによるブラシの成熟度の低い境界線。スケール バーの (A, C) 50 μ m を =。すべて単分子膜が、少なくとも 1 週間後播種描かれ、分化を開始する前にされました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:野生型 colonoids と shRNA 導入ノックダウン (KD) colonoids 各フォームの合流単分子膜。(A)野生型 (WT) 人間の合流 colonoid 単分子膜の代表的なイメージは 5 日間の区別および muc 2 KD colonoid 文化から派生した(B)同様に単分子膜を成長しました。スケール バーの (B) = 50 μ m (C)代表イムノブロット スクランブル shRNA または MUC2 shRNA 増殖型 colonoid 文化の KD のため蛋白質発現の変化がイムノブロットによって量的に表わされることができることを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Enteroid/colonoid 単分子膜が内腔微生物 - 宿主を勉強する最適モデル。(A)代表的な最大強度投影と colonoid の単分子膜の直交光学セクションを示します大腸菌HS (黒矢印) に防水性のある厚い頂 MUC2 陽性粘液層頂粘液に座って表面。単層 106 cfu/mL HS で 6 時間の感染していた。頂角 EHEC (106 cfu/mL、6 時間) に感染した人間の colonoid 単分子膜の(B)代表的な最大強度投影。スケール バーの (B) = 50 μ m。(C) MUC2 蛍光強度測定は、感染していないコントロールに比べて EHEC 感染 colonoid 単分子膜における MUC2 が大幅に低下を示します。誤差範囲を表す SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| タンパク質 | 受入番号 | ペプチド豊富 |
| 基底メディア | ||
| 脂肪酸結合タンパク質、肝臓 [ホモ ・ サピエンス] | NP_001434.1 | 1299 |
| プロフィリン 1 [ホモ ・ サピエンス] | NP_005013.1 | 797 |
| アポリポ蛋白 A IV 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_000473.2 | 744 |
| ecto ADP 修飾 4 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_066549.2 | 633 |
| グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素アイソ フォーム 1 [ホモ ・ サピエンス] | NP_002037.2 (+1) | 616 |
| セロトランスフェリン前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_001054.1 (+1) | 572 |
| ビタミン D 結合タンパク質アイソ フォーム 3 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_001191236.1 (+2) | 567 |
| カタラーゼ [ホモ ・ サピエンス] | NP_001743.1 | 427 |
| ニヤリと笑ってアイソ フォーム 1 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_940978.2 (+1) | 377 |
| lactotransferrin アイソ フォーム 1 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_002334.2 (+1) | 262 |
| 頂メディア | ||
| トレフォイル因子 3 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_003217.3 | 326 |
| トレフォイル因子 1 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_003216.1 | 304 |
| 特定の基底膜ヘパラン硫酸プロテオグリカン核タンパク質アイソ フォーム [ホモ ・ サピエンス] 前駆体 | NP_001278789.1 (+3) | 303 |
| フィラミン-b アイソ フォーム 1 [ホモ ・ サピエンス] | NP_001157789.1 (+2) | 240 |
| トレフォイル因子 2 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_005414.1 | 182 |
| 悪性脳腫瘍 1 タンパク質アイソ フォーム b 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] の削除 | NP_015568.2 (+3) | 169 |
| ケラチン、タイプ II 細胞骨格 1 [ホモ ・ サピエンス] | NP_006112.3 | 157 |
| ミオシン-9 [ホモ ・ サピエンス] | NP_002464.1 | 150 |
| アミノペプチダーゼ N 前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_001141.2 (+1) | 145 |
| ニヤリと笑って前駆体 [ホモ ・ サピエンス] | NP_940978.2 (+1) | 112 |
表 1。根尖部の液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法によってペプチドと基底液からサンプリングの部分的なリストは、空腸膜を区別されます。
Discussion
Enteroid/colonoid 単分子膜が正常に形成の重要なパラメーターを含む 1) 健康、増殖 3 D 文化として原料;2) 細胞文化挿入表面単分子膜の播種の前に人間のコラーゲン IV のコーティング3) 3 D の断片化文化機械的または酵素によって、単一セルのレベルではなく。
3 D enteroids/colonoids の分離中に最適な振動速度与えられたシェーカー モデルの回転径によって異なります。目的は、だけでなく、隣接する井戸に効率的な混合がまたプレートの表紙や細胞懸濁液の飛散を避けるためにプレートを揺り動かしなさい。< 30 分の平均潜伏期は、添付ファイルと均一なセル膜挿入メッキ時の形成を妨げることができる細胞に付着残留 BMM をもたらす可能性があります。豊富なインキュベーション (≥ 1 h) 有意に減少した細胞の生存率が得られます。
3 D enteroids/colonoids を分離するに必要な製粉の程度ピストンの剛性とユーザーの器用さによって異なります。位相差光学顕微鏡でよく内容の定期的な検査は製粉、フラグメントあたり約 30 セルの目標の中にフラグメントの均一性を決定するためお勧めします。代わりに、または製粉に加えて、懸濁液はより小さい制服フラグメントを取得するトリプシンと簡単に消化されることができます。トリプシン ダイジェストは、単分子膜にそれ以外の場合単一の上皮層の間で 3 D のような構造の大部分が含まれている場合は望ましいかもしれません。しかし、細胞生存率を大幅に減少これとして、単一のセルに解離は望ましくありません。Enteroids/colonoids 35 μ L BMM 液滴の培養のよく一般的に 2-3 挿入を作成するのに十分になりますが、この要因数と enteroids/colonoids の平均のサイズによって異なります。
Colonoid 単分子膜が彼らを区別するため、頂中の膨大な量を吸収します。これは、単層生存率や下流の試金の機能に悪影響を及ぼす表示されません参院の部分的な乾燥が追加 DM を上挿入商工会議所 (150-200 μ L) に適用することで回避できます。分化の約 4-5 日後 colonoid 単分子膜は、DM の注意吸引後細胞表面に厚い/ゼラチン状材料として表示ことがあります細胞外粘液を開発します。
EHEC 外側の粘液層との相互作用、我々 は日常的にプロトコルで指定された細菌の力価や潜伏期間を使用します。ただし、ユニークな菌株は、複数の濃度と潜伏期間望ましい効果のための適切なパラメーターを決定するために試金する必要があります最初。
粘液固定中に頂の培地を吸引可能性が削除されます未接続の細胞外粘液層の大部分。したがって、慎重に媒体を注ぐことが重要です。媒体は表面張力によって挿入の保持、表面張力を破ると媒体のほとんどを離れて芯折られた研究所組織のコーナーを使用します。固定および汚損後、粘液層が意図せず剥がれするまたは、挿入フィルターの上、coverglass のマウントを平面します。粘液の高さを維持するためにメディアをマウントのドロップに、フィルターを配置、フィルター、coverglass を慎重に配置。タップや大幅粘液層を平らにすることがありますこれで、こした押ししません。
3 D 培養細胞からの偏光膜を形成するには、腸管上皮細胞の基底膜インテグリンと細胞外マトリックス (ECM) 蛋白質間相互作用を再現する必要は。ラミニン、IV 型コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカンの配列は、腸の上皮の ECM を構成します。21,22私たち人間の細胞由来のラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン IV、およびマウス由来 BMM として比較挿入コーティング。安定した、長期 (4 週間) の形成をサポートしているコラーゲン IV 合流 enteroid/colonoid 単分子膜 (図 1-2)。小型の単分子膜のような成長のパッチは、他のテスト行列のそれぞれに得られたが、これらの地域の confluency に進むことができなかった。ECM 代理多くの利点があり、人間のコラーゲン IV の使用します。BMM は人間のコラーゲン IV は市販で、一般的に費用から Engelbreth ・ ホルム群れ (EHS) マウス肉腫細胞は人間の起源を派生します。また、BMM は固有の変動を蛋白質の複雑な混合物は、遺伝子発現に影響を与える肉腫によって分泌された成長因子を含めることができます。23
腸管上皮細胞、腸管上皮の反発で基になる ECM 間の相互作用はまだ不完全な理解されます。添付ファイルを防ぐ IV コラーゲンに対する抗体を用いて人間イムノビーズ24と腸陰窩上皮細胞反発25のエンハンサーのため密着性リガンドとしての IV 型コラーゲン、ラミニンないの意義が示唆されています。.上皮表現 β 1 インテグリン β 1 インテグリンの抗体は大幅タイプ IV コラーゲンにイムノビーズの付着をブロックとして ECM の相互作用のために重要であることが表示されます。24コラーゲン IV 提供信頼性の高い ECM enteroid/colonoid 単分子膜の挿入、時間をかけて改造する ECM の上皮の形成がまだ評価されていないこのモデルでもより複雑で定義された ECM 混合の影響を受けてIV コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン。
人間 enteroids/colonoids 単分子膜の形式 (図 1-4) では、操作を有効にして面倒や 3 D マトリックスに埋め込まれた文化を使用して達成することは不可能になるサンプリングします。3 D enteroids/colonoids サイズ、構造の複雑さ、および内腔のボリュームによって異なり、したがって微生物や小分子のマイクロインジェクション、正確に量的に困難であります。単分子膜 (表 1) と対照をなして直接アクセスを生理学的、病態生理学的プロセスに関連する分泌因子サイトカインや栄養素イオンを測定する内腔と基底の両方の表面に防止する 3 D の文化また、.(図 1-2) の confluency は enteroid/colonoid 膜だけでなく栄養素の生理学的なグラデーション、イオン、その他高分子、16を確立するが、また適切な障壁を作成するために必要な主な特性の 1 つ腔内細菌叢と滅菌/免疫間葉系細胞移入漿膜環境。Enteroid/colonoid 単分子膜より複雑な生理学的モデルを構築する間葉系、免疫や神経細胞の種類を組み込む未来の調査のために考慮することが重要であります。
ここで説明した細胞培養挿入モデルの制限事項など流体のせん断応力と機械的伸張/圧縮 (蠕動運動) などの物理的な力の不足腸によって経験される通常嫌気性頂環境の不在体内の上皮。高度な microphysiological プラットフォームでは、26で対処する可能性があるこれらの要素、追加費用、機材、および実装するための専門知識も必要があります。これらのコンポーネントは意図的に追加しない限り、3 D と単分子膜の両方の文化との相互作用や腸内マイクロバイ オーム、間質細胞集団および免疫システムからの貢献なしあります。
コラーゲン IV 被覆細胞培養インサートに enteroid/colonoid 単分子膜の将来のアプリケーションは、病原性や共生微生物の相互作用、薬物や栄養素の吸収、毒性、代謝、バリア機能の他の研究を含めることができます、機能触媒追加腸内細胞との共培養による強化。体内の表現型は ex vivo enteroid/colonoid 文化で保持する確立された提供だけでなく、健常者の遺伝子の突然変異や腸の障害を持つ個人からも上皮内を使用して評価を行うことができます。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH 助成金 P01 AI125181、K01 DK106323 (JGI) や K01 DK113043 (JFA) によって支えられました。エシェリヒア属大腸菌の提供ありがとう (メリーランド大学、ボルティモア、MD、米国) ジェームス ・ カパー HS、EHEC のひずみ。また、統合された生理学とイメージング コア ・ ホプキンス コンテ消化器疾患基礎と臨床研究コアセンター (P30 DK089502) とジョンズ ・ ホプキンス質量とプロテオミクス コアを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
| Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
| B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
| Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
| Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
| Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
| FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
| HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
| HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
| HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
| Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
| Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
| Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
| Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
| MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
| MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
| Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
| Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
| Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
| SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
| Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
| TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
| Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
| Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |
References
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