Summary
Här presenterar vi ett protokoll till kultur mänskliga enteroid eller colonoid enskiktslager som har intakt barriär-funktion att studera värd epitelial-bakterieflora interaktioner på cell- och biokemisk nivå.
Abstract
Mänskliga 3-dimensionell (3D) enteroid eller colonoid kulturer härstammar från crypt bas stamceller är för närvarande den mest avancerade ex vivo -modellen av intestinal epitel. På grund av deras slutna strukturer och betydande stödjande extracellulärmatrix är 3D kulturer inte idealiska för värd-patogen studier. Enteroids eller colonoids kan odlas som epitelial enskiktslager på genomsläppliga vävnadsodling membran att möjliggöra manipulation av både luminala och basolateral cellytan och medföljande vätskor. Detta förbättrade luminala ytan hjälpmedel underlättar modellering bakteriell-host epitelial interaktioner såsom slem-nedbrytande förmåga av entrohemoragiska E. coli (EHEC) på colonic epitel. En metod för 3D kultur fragmentering, enskiktslager sådd och transepithelial elektriska motstånd (TER) mätningar att övervaka framstegen mot konfluens och differentiering beskrivs. Colonoid enskiktslager differentiering ger utsöndrade slem som kan studeras genom immunofluorescens eller immunoblotting tekniker. Mer allmänt, enteroid eller colonoid enskiktslager aktivera en fysiologiskt relevant plattform att utvärdera specifika cellpopulationer som kan riktas av patogena eller kommensaler bakterieflora.
Introduction
Intestinal organoids, enteroids och colonoids har lett till många framsteg i förståelsen stamceller beteende, intestinal utveckling, barriär/transport funktion och celldifferentiering. 1 men 3D kultur begränsar studiet av värd epitelial-patogen interaktion eftersom lumen inte är direkt tillgängliga för bakterier eller virulens faktorer såvida de slutna strukturerna utsätts för Mikroskop. 2 , 3 utsöndras dessutom material såsom små molekyler, proteiner, eller slem inte kan provtas enkelt från 3D kultur för efterföljande analys. Effekterna av patogener på epiteliala barriären funktion4 och ion transport5 har utvärderats i 3D kultur med hjälp av fluorescerande färgämnen och time-lapse mikroskopi, men enskiktslager odlas på genomsläppliga vävnadsodling stöder är mottagliga för ytterligare tekniker såsom TER mätning och Ussing kammare/spänningen klämman inspelning. 6 , 7
Talrika publikationer har beskrivit protokoll för 2D eller enskiktslager kultur av enteroids/colonoids. Material som finns för att främja epitelial cell fastsättning inkluderar kollagen hydrogels,8,9 0,1% gelatin,10 tunt skikt murina sarkom-derived basalmembranet matrix (BMM),11,12, 13 och mänskligt kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 Seeding metoder inkluderar mekanisk fragmentering genom pipettering6,14,15 eller dissociation av cell adhesion faktorer med hjälp av trypsin,10,11 dispase,13 eller EDTA. 9 några protokoll används icke-porös vävnadskultur plasticware för seedning, men detta begränsar basolateral tillgång, så de flesta program beror på genomsläppliga vävnadsodling skär. Dokumentation av stabil konfluenta enskiktslager bildandet och underhållet varierar kraftigt bland publikationerna. Dessutom tillväxt och differentiering media kompositioner för mänskliga kulturer skiljer sig åt mellan olika grupper och fortsätta att utvecklas när fler forskare anta och anpassa metoden för att passa deras ansökan och tillgängliga resurser.
För att hantera begränsningar i 3D intestinal epitelial kultur i värd-patogen interaktionsstudier, presenterar vi ett modifierat protokoll för att konvertera 3D mänskliga enteroids eller colonoids till en enskiktslager. Efter att uppnå konfluens i en krypta-liknande omogna tillstånd, leder tillbakadragande av tillväxtfaktorerna WNT3A, RSPO1 och hämmare A-83-01 och SB 202190 till differentiering representativa för små intestinal villus eller surface colonic epitel. Vi beskriva ideala matris, mänskligt kollagen typ IV, för att bestryka skären och skaffa enhetliga enteroid eller colonoid fragment för plätering. Vi visar att detta protokoll ger en konfluenta enskiktslager med hög likväl Colonoid enskiktslager utsöndrar ett tjockt apikala slem skikt, vilket möjliggör ex vivo studier av patogen-slem interaktion via immunoblotting eller immunfärgning. En modifierad fixering att bevara colonic slem lagret för immunfärgning också beskrivs. Denna metod syftar till att ge en lätthanterlig modell för att studera de tidigaste intestinal värd-patogen interaktionerna vid infektion.
Protocol
Detta protokoll baseras på studier som tidigare publicerats av författarna. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 följande steg bör utföras i ett sterilt biosäkerhet skåp med korrekt aseptisk teknik. Alla metoder som involverar mänskliga prover har godkänts av den institutionella i styrelsen av Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).
1. coat cell kultur skär med extracellulära matrix
- Förbereda 5 mL lager kollagen IV lösning (1 mg/mL) i 100 mM ättiksyra. Låt stå vid 4 ° C i ca 4 h att helt hydrat/lös.
- Alikvotens kollagen IV stamlösningen och förvaras vid 4 ° C (≤ 1 månad) eller -20 ° C (> 1 månad).
- Omedelbart före beläggning, späd stamlösningen kollagen IV i sterila vävnadsodling grade vatten till en slutlig koncentration på 34 μg/mL. För 24-well plate infogar cellkultur, coat varje infoga med 100 μL av lösning, vilket motsvarar 10 μg/cm2.
- Inkubera plattan i en standard CO2 vävnadsodling inkubator vid 37 ° C för ≥ 2 h, eller för bekvämlighet, försegla platta kanterna med paraffin film och inkubera vid 4 ° C över natten eller upp till 1 vecka.
2. isolera enteroids/colonoids från 3D kultur
Obs: Enteroids eller colonoids skapas från givare biopsier och bevaras i 3D kultur enligt standardprotokoll som tidigare beskrivits. 14 , 18 i korthet kryptor skördas från intestinal biopsier eller resektioner via kelering och mekaniska agitation. Kryptor tvättas, skördas och klädd i BMM. Expansion media (som beskrivs i steg 4,2) läggs till kulturen och ersättas varje 2 dagar. 3D kultur bildandet är synliga inom timmar efter bordläggningen.
- Aspirera odlingssubstratet från 24-väl plattan och ersätta med 1 mL iskallt skörd lösning (se Tabell för material) per brunn.
- Använd en mini cell skrapa till att rubba och uppbrott basalmembranet matrix pelleten, särskilt uppmärksamma material nära väl Kanterna.
- Agitera plattan i orbitalskak på ca 200 rpm, 4 ° C i 30-45 min.
3. separera 3D enteroids/colonoids
- Använda P200 enda kanal pipett eller en flerkanalig pipett försedd med sterila filter tips för att pulverisera cellsuspension.
- Pool i cell suspension(s) i en 15 mL koniska injektionsflaska. Använda flera injektionsflaskor om total befrielse är > 6 mL.
- Tillsätt en motsvarande volym av avancerade DMEM/F12 medium innehållande 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin Dipeptid (1 x) och penicillin-streptomycin (1 x) (tvätta medium). Vänd röret 3 - 4 gånger att blanda. Centrifugera vid 300 x g, 10 min, 4 ° C.
- Alternativt aspirera tvätta medium och ersätta med 0,5 mL per brunn trypsin (se Tabell för material). Återsuspendera colonoids med P200 pipett, förslut röret och plats i 37 ° C vattenbad för cirka 2 min. omedelbart bort röret, lägga tvätta medium till en slutlig volym av 10 mL och upprepa centrifugeringen som i steg 3.3.
Obs: Detta steg kan vara att föredra om trituration inte leder till enhetlig storlek fragment.
- Alternativt aspirera tvätta medium och ersätta med 0,5 mL per brunn trypsin (se Tabell för material). Återsuspendera colonoids med P200 pipett, förslut röret och plats i 37 ° C vattenbad för cirka 2 min. omedelbart bort röret, lägga tvätta medium till en slutlig volym av 10 mL och upprepa centrifugeringen som i steg 3.3.
4. plätering enteroid/colonoid suspensionen
- Om belagda skär var lagras vid 4 ° C, låt jämvikta i en 37 °C/5% CO2 vävnadsodling inkubator för minst 30 min före cellen plätering.
- För varje insats att beläggas, Förbered 1 mL varm (mellan 25-37 ° C) expansion medium (EM) och tillsätt 10 μM Y-27632 och 10 μM CHIR 99021.
Obs: EM består av avancerade DMEM/F12 som innehåller B27 (1 x), 50% WNT3A luftkonditionerade medium, 15% RSPO1 luftkonditionerade medium, 10% skalle luftkonditionerade medium, 50 ng/mL mänskliga EGF, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, antibiotikum/antimycotic cocktail (1 x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin Dipeptid (1 x) och penicillin-streptomycin (1 x) (se Tabell för material). - Aspirera tvätta mediet från röret som innehåller cellpelleten och återsuspendera i en volym av EM tillräcklig för att ge minst 100 μL/infoga.
- Aspirera kollagen IV lösningen från varje insats och tvätta två gånger med 150 μl av tvätta medium per skär.
- Pipettera 600 μL av EM i utrymmet under varje insats.
- Pipettera 100 μl cellsuspension till varje insats.
- Tillbaka plattan till vävnadsodling inkubatorn och lämna orörd i minst 12 h.
Obs: Undvik att skaka eller kraftigt luta plattan för att förhindra ojämn fördelning av colonoid fragment på Infoga membranet. - Övervaka cell fastsättning och sprida för att bilda en konfluenta enskiktslager genom att placera plattan på ett ljus faskontrastmikroskop enligt en 2.5 x-10 x objektiv.
- Efter 1-2 dagar, ska de flesta fragment följa kollagenmatrisen. Uppdatera odlingsmediet och avbryta behandlingen med Y-27632 och CHIR 99021. Fortsätta att uppdatera mediet varje 2-3 dagar tills konfluenta. Konfluens uppnås vanligtvis inom 7-10 dagar.
5. åtgärd transepithelial elektriskt motstånd
- Bifoga den elektrod leder och makt på de epiteliala voltohmmeter (EVOM). Kontrollera att funktionen mätning är ohm.
- Doppa den elektrod tipsen kort i 70% etanol och torka torrt med en laboratorium vävnad. Temperera elektroden i 5 mL tvätta medium under cirka 5 minuter.
- Fördjupa kortare elektrod spetsen på Infoga medellång och orientera längre elektroden spetsen i lägre väl plattan. Upprätthålla elektroden i en helt lodrät orientering tills den EVOM behandlingen är relativt stabil, eller för längre än 60 s.
Obs: Om elektroden församlingen lutas långt från vertikal, eller tip höjden justeras felaktigt, kan kortare spets kommer i kontakt med och störa den cell enskiktslager. - Jämför EVOM mätningar till det värde som erhållits från en cellfria infoga nedsänkt i odlingsmedium för att utvärdera framsteg mot konfluens eller differentiering.
6. differentiering av konfluenta enteroid/colonoid enskiktslager
- Utbyta EM för differentiering medium (DM), och fortsätta att uppdatera media varje två dagar tills dag 5. DM är EM som saknar WNT3A, RSPO1, A-83-01 och SB 202190.
- Fortsätta att övervaka TER för att verifiera att differentiering fortlöper som förväntat. TER kommer att fortsätta öka under dagarna 1-5 av differentiering. Enskiktslager får fortsätta att öka TER och behåller sin lönsamhet utöver dag 5-6 men uppvisar maximal och mest reproducerbara resultat när den används vid dag 5-6.
7. bakteriell infektion med kommensaler eller patogena E. coli
- En dag före utförandet av infektionen, tvätta och mata enskiktslager med antibiotikum-fri EM eller DM.
- Använd en steril mikrobiologi-slinga för att försiktigt skrapa på ytan av ett fryst bakteriell glycerol bestånd och Inokulera 2 mL LB buljong. Överföra röret till en standard som skakar inkubator vid 37 ° C i 12-16 h.
- Späd 50 μL av förrätt kultur i 5 mL färsk LB buljong (1: 100) och fortsätta inkubation med skakningar i 90 min. Detta kommer att ge en logg fas kultur med en densitet på 105-106 kolonibildande enheter (cfu) / mL.
- Du kan också bekräfta bakteriell koncentrationen av optisk densitet mätning på 600 nm (OD600) i en spektrofotometer.
- Snurra ner bakteriella kulturen på 12 000 x g i 10 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera bakterier i antibiotikum-fri EM eller DM till en slutlig koncentration av 107 cfu/mL.
- Tillsätt 10 μL av bakteriesuspensionen till Infoga (slutlig koncentration 106 cfu/mL). Pipettera långsamt att blanda och undvika att störa det extracellulära slem lagret.
- Tillbaka plattan till en vävnadskultur inkubator för perioden önskad infektion.
8. fixering att bevara och immunostain slem
- Lift cellkulturen infogar från 24-väl plattan, Invertera noggrant på ett laboratorium mjukpapper ta bort det apikala mediet och torka bort externa vätska klängande till infoga.
- I en ny 24-well platta, fördjupa skäret i en 1:3 lösning av ättiksyra i absolut etanol (Clarkes lösning) under 10 minuter vid rumstemperatur.
- Invertera skäret för att ta bort fixativ och rehydrera cellerna i 1 x PBS för 10 min. Fortsätt med standard immunfärgning protokoll.
- Använd ett rakblad för att skära runt omkretsen av Infoga membranet. Överföra membranet till ett glas objektglas med pincett och anbringa ett täckglas med monteringsmedium.
9. beredning av cell lysates för immunoblotting
Obs: Utför följande steg på is eller i ett kallt rum.
- Aspirera medellång och tvätta infoga en gång med PBS.
- Tillsätt 150 μl lysis buffert innehållande proteashämmare (se tabell för material) till infoga och låt stå 5-10 min. lyseringsbuffert innehåller 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS, 1: 100 proteashämmare cocktail.
- Använd en mini cell skrapa bort cellerna infoga och sedan använda P200 pipett till kort pulverisera indragning och överföring till en mikrocentrifug rör.
- Sonikera fjädringen med 5 x 1 s pulser på 20% amplitud med hjälp av en microtip sond (se Tabell för material).
- Lägg till SDS-PAGE lastning buffert om omedelbart utför elektrofores eller alikvot och lagra lysates vid-20 ° C.
Representative Results
Mänskliga enteroid och colonoid kulturer odlas som 3D-strukturer, och sedan skiljas och fragmenterad för plätering på mänskligt kollagen IV-belagd cell kultur skär. Enskiktslager bildandet är enkelt övervakas dagligen via ljusa fält mikroskopi, immunofluorescens färgning (figur 1), och av en stadig ökning i transepithelial elektriska motstånd (TER) (figur 2), vilket återspeglar permeabiliteten i åtsittande föreningspunkter till joner och korrelerar med enskiktslager konfluens. TER av en tom 24-väl infoga är cirka 50-100 Ω·cm2, och när den når konfluens ökar till cirka 400-500 Ω·cm2. Alla epitelceller i konfluenta enskiktslager förbinds av Junktional komplex upptäcks av F-aktin ringen i cell perimetern (figur 1). Enskiktslager i full tillväxtfaktor media representerar proliferativ crypt-liknande epitel består främst av aktivt delande celler som införlivar nucleoside analog EdU (figur 2). Återkallande av tillväxtfaktorer WNT3A och RSPO1 främjar differentiering, leder till villus-liknande kulturer som saknar prolifererande celler. Differentierade enskiktslager innehålla enterocyter (enteroids) eller colonocytes (colonoids) och utveckla specialiserade tarmepitelceller som har visats i 3D kulturer,18 inklusive pokal och enteroendokrina celler. 15 differentierade enskiktslager visar också en betydande ökning av TER (> 1000 Ω·cm2) (figur 2), som anger mogen åtsittande föreningspunkter.
Normala humanfysiologi separerar intestinal epitelskiktet näringsämnen och mikrob-berikad luminala utrymmet från steril serös miljön. Epitelet reglerar tätt överhörning mellan dessa två avdelningar. Enteroid och colonoid enskiktslager bevara detta viktiga uppdelning boende som visas av proteomiska analysen i tabell 1. Det finns betydande skillnader mellan protein sammansättningen i apikala och basolateral luftkonditionerade media samlas in från differentierade enteroid enskiktslager. Tillgång till både de apikala och basolateral sidorna möjliggör insamling av båda supernatanterna en tid koncentrationsberoende sätt för mätning av differentiell utsöndringen av andra molekyler som cytokiner och chemokiner. 15 , 17
Enskiktslager är bekväm och mycket reproducerbara modeller att upptäcka förändringar i proteinuttryck med både immunoblotting och immunfärgning. Således, ändrar i mucin 2 (MUC2) uttryck av shRNA knockdown (KD) kan upptäckas med hjälp av båda teknikerna (figur 3). Den shRNA transduktion utfördes på 3D colonoids och underhålls i antibiotiska urval media. Efter att ha kontrollerat KD, kan colonoids kontinuerligt underhålls som 3D kulturer eller pläterade som enskiktslager i experimentsyfte. Dessutom påverkar MUC2 KD inte effektiviteten i enskiktslager bildandet jämfört med vildtyp parental colonoid linjen. Samling av enskiktslager för immunoblotting är enkel och liknar de protokoll som beskrivs för mänskliga epitelceller som adenocarcinom-derived linjer. Vanligtvis cirka 50 µg eller mer av totalprotein kan extraheras från en enda 0,33 cm2 infoga odlade enskiktslager. Som visas i figur 3, MUC2 är knappt detekterbar i odifferentierade (UD) WT colonoid enskiktslager men uttrycks mycket i differentierade (DF) WT enskiktslager. MUC2 är under nivån för detektion i både UD och DF colonoid enskiktslager sensorik med MUC2 shRNA.
Huvudsakligen, är enskiktslager en lämplig modell för att studera värd-mikrobiella interaktioner vid apikala ytan av epitel. Colonoid enskiktslager bildar en tjock bifogade MUC2-positiv slem lager på differentiering som inte genomsyras enkelt av kommensala bakterier E. coli HS (figur 4), liknar vad har föreslagits i normala mänskliga kolon. 19 dock entrohemoragiska E. coli (EHEC), en mänsklig colonic patogen, har visat sig ha förmågan att förstöra det MUC2-berikad bifogade slem lagret för att nå den apikala ytan av epitel (figur 4). 14 , 20 återstående MUC2 är endast närvarande inuti bägarceller.
Figur 1: Inrättandet av mänskliga enteroid/colonoid enskiktslager. (A) exempel på colonoid fragment efter upplösningen av BMM och sönderdelning. (B) exempel på Infoga omedelbart efter plätering colonoid fragment. Skala bar (A-B) = 200 μm. Representativa (C) maximal intensitet projektion och (D) confocal optiska Z-avsnitt med de motsvarande ortogonala projektionerna visar att colonoid fragment seedade mänskligt kollagen IV-belagd filter formuläret flera enskiktslager öar 2-4 dagar efter sådd. Cell-fria områden (asterisk) kan identifieras genom avsaknad av både kärnkraft (Hoechst 33342, blå) och apikala F-aktin (phalloidin, grön) färgning i både C och D. representant (E) maximal intensitet projektion och F confocal optiska avsnitt med de motsvarande ortogonala projektionerna visar en konfluenta colonoid enskiktslager med kontinuerlig apikala ytan upptäcks av F-aktin immunfärgning cirka 1 vecka efter sådd. (G) hög förstoring av en representativ maximalstyrkan projektion och (H) confocal optisk avsnitt med de motsvarande ortogonala projektionerna visar att celler i konfluenta colonoid enskiktslager bildar den F-aktin perijunctional ringar (vit pil) och en omogen apikala borste gränsen (gula pilen huvuden). Skala bar (C-H) = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utvärdering av enteroid/colonoid enskiktslager differentiering. (A) EdU (röd) införlivande visar en progressiv förlust av spridning under jejunal enskiktslager differentiering. (B) genomsnittliga TER mätningar i konfluenta jejunal enskiktslager i expansion eller differentiering medium. Felstaplar representera SEM. UD, odifferentierade; DF, differentierade. Numren motsvarar dagar under det angivna villkoret; UD1 var den första dagen av konfluens, cirka 1 vecka efter sådd. (C) UD jejunal enskiktslager har bred, kortare celler och en mindre-mogna apikala aktin-baserade borste gränsen än DF dag 5 jejunal enskiktslager. Skala bar (A, C) = 50 μm. Alla enskiktslager var avbildad på minst 1 vecka efter sådd och var konfluenta före början differentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Wild type colonoids och shRNA sensorik knockdown (KD) colonoids varje form konfluenta enskiktslager. (A) representativa bilder av vildtyp (WT) mänskliga konfluenta colonoid enskiktslager differentierade i 5 dagar och (B) på samma sätt vuxit enskiktslager härrör från MUC2 KD colonoid kulturer. Skala bar (A-B) = 50 μm (C) representant immunoblot colonoid kulturer sensorik med kodade shRNA eller MUC2 shRNA visar att förändringarna i proteinuttryck på grund av KD kan vara quantitated av immunoblot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Enteroid/colonoid enskiktslager är lämpliga modeller att studera luminala mikrob-host interaktioner. (A) representativa maximalstyrkan projektion och ortogonala optiska avsnitt av en colonoid enskiktslager visar tjock apikala MUC2-positiv slem lagret som inte är genomsläppliga för E. coli HS (svart pilspetsar) sitter vid apikala slem yta. Enskiktslager var infekterad i 6 timmar med 106 cfu/mL HS. (B) representativa maximalstyrkan projektion av mänskliga colonoid enskiktslager apikalt smittad med EHEC (106 cfu/mL, 6 timmar). Skala bar (A-B) = 50 μm. (C) MUC2 immunofluorescens intensitet mätningar visar en signifikant minskning av MUC2 i EHEC-smittade colonoid enskiktslager jämfört med icke-infekterade kontroller. Felstaplar representera SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Protein | Anslutningen nummer | Peptid överflöd |
| Basolateral Media | ||
| fettsyra-bindande protein, levern [Homo sapiens] | NP_001434.1 | 1299 |
| profilin-1 [Homo sapiens] | NP_005013.1 | 797 |
| apolipoprotein A-IV föregångare [Homo sapiens] | NP_000473.2 | 744 |
| EKTO-ADP-ribosyltransferase 4 föregångare [Homo sapiens] | NP_066549.2 | 633 |
| glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas isoform 1 [Homo sapiens] | NP_002037.2 (+ 1) | 616 |
| serotransferrin föregångare [Homo sapiens] | NP_001054.1 (+ 1) | 572 |
| vitamin D-bindande protein isoform 3 föregångare [Homo sapiens] | NP_001191236.1 (+ 2) | 567 |
| katalas [Homo sapiens] | NP_001743.1 | 427 |
| agrin isoform 1 föregångare [Homo sapiens] | NP_940978.2 (+ 1) | 377 |
| lactotransferrin isoform 1 föregångare [Homo sapiens] | NP_002334.2 (+ 1) | 262 |
| Apikala Media | ||
| Trefoil faktor 3 föregångare [Homo sapiens] | NP_003217.3 | 326 |
| Trefoil faktor 1 föregångare [Homo sapiens] | NP_003216.1 | 304 |
| basalmembranet-specifika heparansulfat sulfat proteoglykan core protein isoform en föregångare [Homo sapiens] | NP_001278789.1 (+ 3) | 303 |
| filamin-B isoform 1 [Homo sapiens] | NP_001157789.1 (+ 2) | 240 |
| Trefoil faktor 2 föregångare [Homo sapiens] | NP_005414.1 | 182 |
| bort i maligna hjärnan tumörer 1 protein isoform b föregångare [Homo sapiens] | NP_015568.2 (+ 3) | 169 |
| keratin, typ II cytoskeletal 1 [Homo sapiens] | NP_006112.3 | 157 |
| myosin-9 [Homo sapiens] | NP_002464.1 | 150 |
| aminopeptidase N föregångare [Homo sapiens] | NP_001141.2 (+ 1) | 145 |
| agrin föregångare [Homo sapiens] | NP_940978.2 (+ 1) | 112 |
Tabell 1. En ofullständig lista av peptider som identifierats av liquid chromatography/tandem mass spectrometry i apikala och basolateral vätskor från differentierade jejunal enskiktslager.
Discussion
Kritiska parametrar för framgångsrika bildandet av enteroid/colonoid enskiktslager inkluderar 1) friska, frodas 3D kulturer som utgångsmaterial; (2) beläggning infoga cellytan kultur med mänskligt kollagen IV före enskiktslager sådd; (3) fragmentering av 3D kulturer antingen mekaniskt eller enzymatiskt, men inte till den enda cell-nivån.
Under isolering av 3D enteroids/colonoids, kan optimal skakningar hastigheten variera beroende på en viss shaker modell roterande diameter. Avsikten är att inte bara skaka plattan för en effektiv blandning, men att också undvika stänk cellsuspension på omslagets plattan eller i närliggande brunnar. Inkubation perioder av < 30 min kan ge kvarstående BMM klängande cellerna, vilket kan hindra fastsättning och bildandet av enhetliga cell enskiktslager när pläterade på skären. Omfattande inkubation (≥ 1 h) kommer att ge signifikant minskade cellernas viabilitet.
Omfattningen av trituration krävs att sära på 3D enteroids/colonoids kan variera med kolv styvhet och användaren fingerfärdighet. Periodisk kontroll av väl innehållet på en ljus faskontrastmikroskop rekommenderas att bestämma fragment enhetlighet under sönderdelning, med ett mål av ungefärligt 30 celler per fragment. I stället för, eller utöver sönderdelning, kan suspensionen smältas kort med trypsin att erhålla mindre enhetlig fragment. Trypsin digest kan vara önskvärt om enskiktslager innehåller en stor andel av 3D-liknande strukturer bland en annars enda epitelskiktet. Dissociation att enstaka celler är dock inte önskvärt eftersom detta avsevärt minskar cellernas viabilitet. En väl av enteroids/colonoids odlade i en 35 μl BMM droplet kommer generellt att vara tillräckligt för att fylla 2-3 skär, men denna faktor kan variera beroende på antal och genomsnittliga storleken på de enteroids/colonoids.
Colonoid enskiktslager kan absorbera en betydande volym av apikala medium som de gör åtskillnad mellan. Detta kan kringgås genom att tillämpa ytterligare DM övre infoga kammaren (150-200 μl), trots delvis torkning av den övre kammaren inte verkar påverka negativt enskiktslager livskraft eller funktion i nedströms analyser. Efter cirka 4-5 dagar av differentiering utveckla colonoid enskiktslager extracellulära slem som kanske syns som tjock/geléartad material på cellytan efter noggrann aspiration av DM.
För EHEC växelverkan med lagrets yttre slem använder vi rutinmässigt bakteriell titer och inkubation perioden anges i protokollet. Unika bakteriestammar bör dock inledningsvis analyseras på flera koncentrationer och inkubation perioder att avgöra lämpliga parametrar för önskad effekt.
Under slem fixering, aspirera apikala medium kommer sannolikt ta bort de flesta av lagrets extracellulära okopplade slem. Det är därför viktigt att försiktigt hälla ut medlet. Om mediet behålls i Infoga av ytspänning, använda i hörnet av en vikta laboratorium vävnad att bryta ytspänningen och transportera bort de flesta av mediet. Efter fixering och färgning, kan slem lagret vara oavsiktligt rubbas eller tillplattad medan montering ett täckglas över filtret infoga. För att bevara slem höjd, placera filtret på en droppe montering media och försiktigt placera täckglas på filtret. Tryck på eller tryck ned täckglas som detta kan avsevärt förenkla slem lagret inte.
För att bilda en polariserad enskiktslager från celler i 3D kultur, är det nödvändigt att återge samspelet mellan basolateral membran integriner av tarmepitelceller och extracellulär matrix (ECM) proteiner. Laminin, kollagen IV, Fibronektin och en matris av proteoglykaner utgör intestinal epitelial ECM. 21 , 22 vi jämförde mänsklig cell-derived laminin, Fibronektin, kollagen IV och murint-derived BMM som infoga beläggningar. Endast kollagen IV stöder bildandet av stabila, långsiktiga (upp till 4 veckor) konfluenta enteroid/colonoid enskiktslager (siffrorna 1-2). Små fläckar av enskiktslager-liknande tillväxt erhölls på varje andra testade matriserna, men dessa regioner misslyckades att gå vidare till konfluens. Användning av humant kollagen IV som ECM surrogat har ett antal fördelar. BMM härrör från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murina sarkom celler inte är av mänskligt ursprung, medan mänskligt kollagen IV är kommersiellt tillgängliga och allmänt mer kostnadseffektivt. Dessutom BMM är en komplex blandning av proteiner med inneboende variabilitet, och kan innehålla tillväxtfaktorer som utsöndras av sarkom som påverkar genuttryck. 23
Interaktioner mellan tarmepitelceller och underliggande ECM i tarmens epitelceller restitution är fortfarande ofullständigt klarlagd. Betydelsen av kollagen IV, men inte laminin, som en vidhäftning ligand för mänskliga colonocytes24 och förstärkare av intestinal crypt epitelial cell återlämnande25 har föreslagits med antikroppar mot kollagen IV som förhindrade fastsättning . Epitelial uttryckta β1-integrin verkar vara viktigt för ECM interaktion, en antikropp som är specifik för β1-integrin betydligt blockeras vidhäftning av colonocytes till typ IV kollagen. 24 medan kollagen IV ger en tillförlitlig ECM för enteroid/colonoid enskiktslager bildandet på skären, epitelial omdaning av ECM över tiden har ännu inte utvärderats i denna modell, inte heller har påverkan av mer komplexa och definierade ECM blandningar av kollagen IV, Fibronektin och laminin.
Mänskliga enteroids/colonoids i enskiktslager format (siffrorna 1-4) aktivera manipulationer och provtagning som skulle vara besvärliga eller omöjligt att uppnå med 3D matrix-embedded kulturer. 3D enteroids/colonoids varierar i storlek, strukturella komplexitet och luminala volym, och därmed Mikroskop mikrober eller små molekyler är svåra att exakt kvantifiera. Dessutom, i motsats till enskiktslager (tabell 1) förhindra 3D kulturer direkt tillgång till både luminala och basolateral ytor att mäta joner, näringsämnen, cytokiner eller utsöndras faktorer associerade med fysiologiska och patofysiologiska processer . Konfluens (siffrorna 1-2) är en av de viktigaste egenskaperna för de enteroid/colonoid enskiktslager nödvändigt för att fastställa inte bara de fysiologiska lutningarna av näringsämnen, joner, och andra makromolekyler,16 men också skapa korrekt barriären mellan luminala bakterieflora och sterila mesenkymala/immun cell-befolkade serös miljöer. Dessa aspekter är viktiga att tänka på för framtida studier att införliva enteroid/colonoid enskiktslager med mesenkymala, immun eller neuronala celltyper att bygga mer komplexa fysiologiska modeller.
Noterade begränsningar av cell kultur infoga modellen beskrivs här är avsaknaden av fysiska krafter såsom vätska skjuvspänningen och mekanisk stretch/komprimering (peristaltiken) och avsaknad av en anaerob apikala miljö som normalt upplevs av intestinala epitel Invivo. Dessa element har potential att ta itu med mer sofistikerade microphysiological plattformar,26 , men de kräver också extra utgift, utrustning och kompetens att genomföra. Både 3D och enskiktslager kulturer är också utan interaktioner med eller bidrag från den intestinala microbiom, stromal cellpopulationer och immunförsvaret såvida dessa komponenter läggs purposefully.
Framtida tillämpningar av den enteroid/colonoid enskiktslager på kollagen IV-belagd cell kultur skär kan omfatta andra studier av drog- eller näringsämnen upptag, metabolism, toxicitet, patogena eller kommensaler mikrobiell interaktion, barriärfunktion, och funktionella Enhancement katalyseras av samtidig kultur med ytterligare intestinal celltyper. Utvärderingar kan göras inte bara inom epitel av friska givare men också från personer med genetiska mutationer eller tarm, förutsatt de Invivo fenotyperna är etablerade för att bevaras i ex vivo enteroid/colonoid kultur.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH grants P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) och K01 DK113043 (JFA). Vi tackar James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) för att tillhandahålla E. coli stam HS och EHEC. Vi erkänner också de integrerade fysiologi och Imaging kärnor den Hopkins Conte mag sjukdom grundläggande Translational Research Core Center (P30 DK089502) och Johns Hopkins masspektrometri och proteomik Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
| Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
| B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
| Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
| Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
| Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
| FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
| HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
| HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
| HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
| Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
| Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
| Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
| Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
| MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
| MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
| Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
| Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
| Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
| SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
| Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
| TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
| Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
| Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |
References
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, e29132 (2017).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function. Infection and Immunity. 83, 138 (2015).
- Foulke-Abel, J., et al. Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology. Gastroenterology. 150, 638-649.e638 (2016).
- Yin, J., et al. Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).
- Tse, C., et al. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers. Toxins. 10, 351 (2018).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).
- Wang, Y., et al. Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64, 911 (2015).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids. Science. 353, 1387 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- In, J., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Vernetti, L., et al. Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle. Scientific Reports. 7, 42296 (2017).
- Noel, G., et al. Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut. Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. The gastrointestinal mucus system in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).
- Hews, C. L., et al. The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo. Cellular Microbiology. 19, e12717 (2017).
- Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes. The Journal of Cell Biology. 95, 340 (1982).
- Timpl, R. Macromolecular organization of basement membranes. Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).
- Ishii, S., et al. Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen. Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).
- Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium. Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).
- Bein, A., et al. Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).
