Summary
Vi præsenterer her, en protokol til kultur menneskelige enteroid eller colonoid encellelag, som har intakte barriere funktion at studere epitelial mikrobiota værtssammenspil på det cellulære og biokemiske niveau.
Abstract
Menneskelige 3-dimensionelle (3D) enteroid eller colonoid kulturer stammer fra krypten base stamceller er i øjeblikket den mest avancerede ex vivo -model af den intestinale epitel. På grund af deres lukkede strukturer og betydelig støtte ekstracellulære matrix er 3D kulturer ikke ideel til vært-patogen undersøgelser. Enteroids eller colonoids kan dyrkes som epitelial encellelag på gennemtrængelig vævskultur membraner til at tillade manipulation af både luminale og basolateral celle overflader og ledsagende væsker. Denne forbedrede luminale overflade tilgængelighed letter modellering bakteriel-epitelial værtssammenspil såsom muligheden for Slim-nedværdigende af enterohemorrhagic E. coli (EHEC) på Colon epitel. En metode til 3D kultur fragmentering, éncellelag såning og transepithelial elektrisk modstand (TER) målinger til at overvåge fremskridt hen imod confluency og differentiering er beskrevet. Colonoid éncellelag differentiering udbytter udskilles slim, der kan studeres ved immunofluorescens eller immunoblotting teknikker. Mere generelt, enteroid eller colonoid encellelag aktiverer en fysiologisk relevante platform til at evaluere bestemte cellepopulationer, der kan blive ramt af patogene eller commensal mikrobiota.
Introduction
Tarm organoids, enteroids og colonoids har ført til mange fremskridt i forståelsen af stamceller adfærd, intestinal udvikling, Barriere/transport funktion og Celledifferentiering. 1 dog 3D kultur begrænser undersøgelse af vært epitel-patogen interaktion, fordi lumen er ikke direkte tilgængelige for bakterier eller virulens faktorer medmindre de lukkede strukturer udsættes for mikroinjektion. 2 , 3 udskilles desuden materialer såsom små molekyler, proteiner, eller slim nemt kan ikke udtages fra 3D kultur til downstream analyse. Virkningen af patogener på epitel barriere funktion4 og ion transport5 er blevet evalueret i 3D kultur med fluorescerende farvestoffer og time-lapse mikroskopi, men encellelag dyrkes på gennemtrængelig vævskultur understøtter er indstillet til supplerende teknikker som TER måling og Ussing kammer/spænding klemme optagelse. 6 , 7
Talrige publikationer har beskrevet protokoller for 2D eller éncellelag kultur af enteroids/colonoids. Materialer fundet for at fremme epitelcelle udlæg omfatter kollagen hydrogels,8,9 0,1% gelatine,10 tynde lag murine sarkom-afledte basalmembranen matrix (BMM),11,12, 13 og human kollagen IV. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 , 17 forhåndsudfyldning tilgange omfatter mekaniske fragmentering af pipettering6,14,15 og/eller dissociation af celle vedhæftning faktorer ved hjælp af trypsin,10,11 dispase,13 eller EDTA. 9 nogle protokoller bruge ikke-porøse væv kultur plasticware for såning, men dette begrænser basolateral adgang, så de fleste programmer afhænger gennemtrængelig vævskultur skær. Dokumentation for stabil sammenflydende éncellelag dannelsen og vedligeholdelse varierer meget blandt publikationerne. Derudover vækst og differentiering media kompositioner for menneskelige kulturer adskiller sig blandt forskellige grupper og fortsætte med at udvikle sig som flere forskere vedtage og justere metoden, der passer til deres anvendelse og tilgængelige ressourcer.
For at løse begrænsningerne af 3D intestinale epitel kultur i vært-patogen interaktion undersøgelser, præsenterer vi en modificeret protokol til konvertering af 3D menneskelige enteroids eller colonoids til en éncellelag. Efter at opnå confluency i en krypt-lignende umoden tilstand, fører tilbagetrækning af vækstfaktorer WNT3A, RSPO1 og hæmmere A-83-01 og SB 202190 til differentiering repræsentant for lille tarm villus eller overflade Colon epitel. Vi beskrive ideelle matrix, human kollagen type IV, at pels indsætter og opnå ensartede enteroid eller colonoid fragmenter for plating. Vi demonstrere, at denne protokol producerer en sammenflydende éncellelag med en høj TER. Colonoid encellelag udskiller en tyk apikale mukuslagets, giver mulighed for ex vivo studier af patogen-Slim interaktion via immunoblotting eller immunfarvning. En modificeret fiksering procedure at bevare Colon mukuslagets for immunfarvning er også beskrevet. Denne metode tager sigte på at give en tractable model for at studere de tidligste intestinal vært-patogen interaktioner ved infektion.
Protocol
Denne protokol er baseret på undersøgelser tidligere udgivet af forfatterne. 6 , 7 , 14 , 15 , 16 følgende trin bør der foretages i et sterilt biosikkerhed kabinettet ved hjælp af ordentlig aseptisk teknik. Alle metoder der involverer menneskelige prøver er blevet godkendt af den institutionelle Review Board af Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).
1. coat celle kultur skær med ekstracellulære matrix
- Forberede 5 mL stock kollagen IV opløsning (1 mg/mL) i 100 mM eddikesyre. Lad det stå ved 4 ° C i ca 4 h til fuldt hydrat/opløses.
- Alikvot kollagen IV materiel løsning og opbevares ved 4 ° C (≤ 1 måned) eller -20 ° C (> 1 måned).
- Umiddelbart inden belægning, fortyndes kollagen IV stamopløsning i sterile vævskultur kvalitet vand til en endelig koncentration på 34 μg/mL. For 24-godt plade indsætter cellekultur, pelsen hver sæt med 100 μL af løsningen, som svarer til 10 μg/cm2.
- Inkuber plade i standard CO2 vævskultur inkubator ved 37 ° C for ≥ 2 h, eller for bekvemmelighed, forsegle pladen kanterne med paraffin film og inkuberes ved 4 ° C natten over eller op til 1 uge.
2. Isoler enteroids/colonoids fra 3D kultur
Bemærk: Enteroids eller colonoids er etableret fra donor biopsier og bevaret i 3D kultur ifølge standardprotokoller tidligere beskrevet. 14 , 18 kort, Krypter er høstet fra tarm biopsier eller resektion via Chelat og mekaniske agitation. Krypter er vasket, høstet og forgyldt i BMM. Ekspansion medier (beskrevet taktfast 4.2) er føjet til kulturen og erstattet hver 2 dage. 3D kultur dannelse er synlige inden for timer efter plating.
- Opsug næringssubstratet fra 24-godt plade og erstatte med 1 mL iskold høst løsning (Se Tabel af materialer) pr. brønd.
- Bruge en mini celle skraber til at løsne og break-up basalmembranen matrix pellet, særlig opmærksomhed til materiale, i nærheden af godt kanter.
- Agitere plade på en orbitalryster på ca 200 rpm, 4 ° C i 30-45 min.
3. adskille 3D enteroids/colonoids
- Bruge P200 single channel-pipette eller en multi-kanal pipette monteret med steril filter tips til hakkede cellesuspension.
- Pool celle suspension(s) i en 15 mL konisk hætteglas. Bruge flere hætteglas, hvis samlede suspension volumen er > 6 mL.
- Tilføje et lige saa stort volumen af avanceret DMEM/F12 medium indeholdende 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptid (1 x) og penicillin-streptomycin (1 x) (vask medium). Vend røret 3 - 4 gange at blande. Der centrifugeres ved 300 x g, 10 min, 4 ° C.
- Eventuelt Aspirér vask medium og erstatte med 0,5 mL/hul trypsin (Se Tabel af materialer). Resuspend colonoids med P200 pipette, cap røret og placere i et 37 ° C vandbad til ca. 2 min. straks fjerne røret, tilføje vask medium til en endelige mængden af 10 mL, og Gentag centrifugering som i trin 3.3.
Bemærk: Dette trin kan være at foretrække, hvis ændring ikke resulterer i ensartet størrelse fragmenter.
- Eventuelt Aspirér vask medium og erstatte med 0,5 mL/hul trypsin (Se Tabel af materialer). Resuspend colonoids med P200 pipette, cap røret og placere i et 37 ° C vandbad til ca. 2 min. straks fjerne røret, tilføje vask medium til en endelige mængden af 10 mL, og Gentag centrifugering som i trin 3.3.
4. plating enteroid/colonoid suspension
- Hvis belagte skær var opbevares ved 4 ° C, reagensglasset i en 37 °C/5% CO2 vævskultur inkubator i mindst 30 min før celle plating.
- For hver insert for at være forgyldt, forberede 1 mL varm (mellem 25-37 ° C) ekspansion medium (EM) og tilføje 10 μM Y-27632 og 10 μM CHIR 99021.
Bemærk: EM er sammensat af avanceret DMEM/F12 indeholdende B27 (1 x), 50% WNT3A aircondition medium, 15% RSPO1 aircondition medium, 10% Noggin aircondition medium, 50 ng/mL menneskelige EGF, 500 nM AV-83-01, 10 μM SB 202190, antibiotika/antimykotikum cocktail (1 x), 10 mM HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptid (1 x) og penicillin-streptomycin (1 x) (Se Tabel af materialer). - Opsug vask medium fra røret indeholder celle pellet og resuspend i et volumen på EM tilstrækkeligt til at give mindst 100 μL/Indsæt.
- Opsug kollagen IV løsningen fra hver Indsæt og vaskes to gange med 150 μl af vask medium pr. Indsæt.
- Med pipette overfoeres 600 μl af EM i rummet under hver Indsæt.
- Afpipetteres 100 μl af cellesuspension til hver Indsæt.
- Returnere pladen til vævskultur inkubator og forlade uforstyrret i mindst 12 timer.
Bemærk: Undgå at ryste eller skarpt vippe plade for at undgå ulige fordeling af colonoid fragmenter på Indsæt membran. - Overvåge celle vedhæftet fil og spredning for at danne en sammenflydende éncellelag ved at placere pladen på en fase-kontrast lysmikroskop under en 2.5 x-10 x mål linse.
- Efter 1-2 dage, bør de fleste fragmenter overholde kollagen matrix. Opdater næringssubstratet og ophøre med behandling med Y-27632 og CHIR 99021. Fortsætte med at opdatere mediet hver 2-3 dage indtil sammenflydende. Confluency er generelt nåede i 7-10 dage.
5. foranstaltning transepithelial elektrisk modstand
- Vedhæfte den elektrode kundeemner og magt på den epitel voltohmmeter (EVOM). Kontroller, at funktionen måling er angivet til ohm.
- Dyp elektrode tips kort i 70% ethanol og tør efter med en laboratorium væv. Reagensglasset elektrode i 5 mL af vask medium for ca 5 min.
- Fordybe den kortere elektrode tip i Indsæt medium og orientere den længere elektrode spids i den nederste godt plade. Vedligeholde elektrode i en fuld vertikal orientering indtil EVOM læsning er relativt stabil eller længere end 60 s.
Bemærk: Hvis elektrode samling vippes langt fra lodret, eller tip højde justeres forkert, kan den kortere tip kommer i kontakt med og forstyrre celle éncellelag. - Sammenlign EVOM målinger til den værdi fra en celle-fri indsætte neddykket i dyrkningsmediet at evaluere fremskridt i retning af confluency eller differentiering.
6. differentiering af Konfluerende monolag af enteroid/colonoid
- Udveksle EM for differentiering medium (DM), og fortsætte med at opdatere media hver to dage indtil dag 5. DM er EM, der mangler WNT3A, RSPO1, A-83-01 og SB 202190.
- Fortsætte med at overvåge TER for at kontrollere, at differentiering forløber som forventet. TER fortsat vil stige i løbet af dage 1-5 af differentiering. Encellelag kan fortsætte med at øge TER og bevare levedygtighed ud over dag 5-6 men udviser maksimal og mest reproducerbare resultater når det bruges på dag 5-6.
7. bakteriel infektion med commensal eller sygdomsfremkaldende E. coli
- En dag i udførelsen af infektionen, vaske og feed encellelag med antibiotika-gratis EM eller DM.
- Bruge en steril Mikrobiologi loop til forsigtigt skrabe overfladen af en frossen bakteriel glycerol bestand og podes 2 mL af LB bouillon. Overføre røret til en standard ryster inkubator ved 37 ° C i 12-16 h.
- Fortyndet 50 μL af starteren kultur i 5 mL frisk LB bouillon (1: 100) og fortsætte inkubering med ryster i 90 min. Dette vil give en log fase kultur med en massefylde på 105-106 kolonidannende enheder (cfu) / mL.
- Eventuelt bekræfte den bakterielle koncentration af optisk tæthed måling på 600 nm (OD600) i et spektrofotometer.
- Spin ned bakteriekulturen på 12.000 x g i 10 min. og Fjern supernatanten resuspend bakterier i antibiotikum-gratis EM eller DM til en slutkoncentration på 107 cfu/mL.
- Tilføje 10 μL af bakteriel suspension til Indsæt (slutkoncentration 106 cfu/mL). Med pipette overfoeres langsomt at blande og undgå at forstyrre den ekstracellulære mukuslagets.
- Returnere pladen til en vævskultur inkubator for perioden ønskede infektion.
8. fiksering til at bevare og immunostain slim
- Lift cellekultur indsætter fra 24-godt plade, invertere omhyggeligt på et laboratorium silkepapir at fjerne den apikale medium, og tørre væk eksterne væske klamrer sig til indsatsen.
- I en ny 24-godt plade, fordybe Indsæt i en 1:3 opløsning af iseddikesyre i absolut ethanol (Clarkes løsning) i 10 min ved stuetemperatur.
- Invertere Indsæt for at fjerne fiksativ og rehydrere celler i 1 x PBS for 10 min. Fortsæt med standard immunfarvning protokoller.
- Brug et barberblad til at skære langs kanten af Indsæt membran. Overføre membranen til et glas objektglas med pincet og anbringer et daekglas med montering medium.
9. forberedelse af cellelysater for immunoblotting
Bemærk: Udfør følgende trin på is eller i et koldt rum.
- Aspirat medium og vask indsætte en gang med PBS.
- Tilføj 150 μL lysis buffer indeholdende proteasehæmmere (se tabel af materialer) til at indsætte og lad stå 5-10 min. lysisbuffer indeholder 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,5% natrium deoxycholate, 0,1% SDS, 1: 100 protease hæmmer cocktail.
- Bruge en mini celle skraber til at fjerne cellerne fra skæret, derefter bruge P200 pipette til kortvarigt hakkede suspension og overførsel til et microcentrifuge rør.
- Der sonikeres suspension med 5 x 1 s pulser på 20% amplitude ved hjælp af en microtip sonde (Se Tabel af materialer).
- Tilføje SDS-PAGE loading bufferen hvis straks udfører elektroforese, eller delprøve og gemme lysates på-20 ° C.
Representative Results
Menneskelige enteroid og colonoid kulturer er vokset som 3D strukturer, derefter dissocieres og fragmenteret for plating på human kollagen IV-belagt celle kultur skær. Forløbet af éncellelag dannelse er let overvåges dagligt via lysfelt mikroskopi, immunofluorescens farvning (figur 1), og af en støt stigning i transepithelial elektrisk modstand (TER) (figur 2), som afspejler permeabilitet af stram vejkryds ioner og korrelerer med éncellelag confluency. TER af en tom 24-godt Indsæt er ca 50-100 Ω·cm2, og ved ankomsten til confluency stiger til omkring 400-500 Ω·cm2. Alle epitelceller i Konfluerende monolag er forbundet med junctional komplekser detekteres af F-actin ring på celle perimeter (figur 1). Encellelag i fuld vækst faktor media repræsenterer den proliferative krypt-lignende epitel sammensat primært af aktivt dividere celler, indarbejde nucleoside analog EdU (figur 2). Tilbagetrækning af vækstfaktorer, WNT3A og RSPO1 fremmer differentiering, fører til villus-lignende kulturer, der mangler prolifererende celler. Differentierede encellelag indeholder enterocytes (enteroids) eller colonocytes (colonoids) og udvikle specialiserede intestinale epitel celler, som har været vist i 3D kulturer,18 herunder Pokal og enteroendocrine celler. 15 opdelte encellelag også viser en betydelig stigning i TER (> 1000 Ω·cm2) (figur 2), der angiver modne stramme kryds.
I normal human fysiologi adskiller den intestinale epitel lag næringsstoffer og mikrobe-beriget luminale rummet fra det sterile serosal miljø. Epitel regulerer stramt cross-talk mellem disse to rum. Enteroid og colonoid encellelag bevare denne vigtige opdelingen egenskab som vist af proteom-analyse i tabel 1. Der er betydelige forskelle mellem protein sammensætning i apikale og basolateral aircondition media indsamlet fra differentierede enteroid monolag. Adgang til både de apikale og basolateral sider giver mulighed for samling af både analysere på et tidspunkt afhængige måde for måling af differential sekretion af andre molekyler såsom cytokiner og kemokiner. 15 , 17
Encellelag er praktisk og meget reproducerbare modeller til at opdage ændringerne i protein udtryk ved hjælp af både immunoblotting og immunfarvning. Således ændres i mucin 2 (MUC2) udtryk af shRNA knockdown (KD) kan påvises ved hjælp af begge teknikker (figur 3). ShRNA transduktion blev udført på 3D colonoids og vedligeholdes i antibiotisk udvalg medier. Efter at have kontrolleret KD, colonoids kan være løbende vedligeholdes som 3D kulturer og/eller forgyldt som encellelag til forsøgsformål. Desuden påvirker MUC2 KD ikke effektiviteten af éncellelag dannelse i forhold til vildtype parental colonoid linje. Samling af encellelag for immunoblotting er enkel og lignende til de protokoller er beskrevet for menneskelige epitelial adenocarcinom-afledte cellelinjer. Typisk, ca 50 µg eller mere af total protein kan udvindes fra en enkelt 0,33 cm2 Indsæt-vokset éncellelag. Som vist i figur 3, MUC2 er knap påviselig i udifferentierede (UD) WT colonoid encellelag men er stærkt udtrykt i differentieret (DF) WT monolag. MUC2 er under niveauet for opdagelse i både UD og DF colonoid encellelag transduced med MUC2 shRNA.
Vigtigere, er encellelag en velegnet model til at studere vært-mikrobielle interaktioner på den apikale overflade af epitheler. Colonoid encellelag danner en tyk vedlagte MUC2-positive Slim lag på differentiering, der ikke er let gennemsyret af kommensale E. coli HS bakterier (figur 4), svarende til hvad er blevet foreslået i den normale menneskelige kolon. 19 dog enterohemorrhagic E. coli (EHEC), en menneskelig Colon patogen, er påvist at have evnen til at ødelægge MUC2-beriget vedlagte Slim lag for at nå den apikale overflade af epitel (figur 4). 14 , 20 resterende MUC2 er kun til stede inde i Flammernes cellerne.
Figur 1: Etablering af menneskelige enteroid/colonoid monolag. (A) eksempel på colonoid fragmenter efter opløsningen af BMM og ændring. (B) eksempel på Indsæt straks efter plating colonoid fragmenter. Skalere bar (A-B) = 200 μm. Repræsentant (C) maksimale intensitet projektion og (D) Konfokal optisk Z-sektion for med de tilsvarende retvinklede projektioner viser at colonoid fragmenter seedede på human kollagen IV-belagt filtre form flere éncellelag øer 2-4 dage efter såning. Celle-fri områder (asterisk) kan identificeres ved fravær af både nukleare (Hoechst 33342, blå) og apikale F-actin (phalloidin, grønne) farvning i både C og D. repræsentative (E) maksimale intensitet projektion og F Konfokal optisk afsnit med de tilsvarende retvinklede projektioner viser en sammenflydende colonoid éncellelag med kontinuerlig apikale overflade opdaget af F-actin immunfarvning ca 1 uge efter såning. (G) høj forstørrelse af en repræsentativ maksimal intensitet projektion og (H) Konfokal optisk sektion med de tilsvarende retvinklede projektioner viser at celler i sammenflydende colonoid encellelag danner F-actin perijunctional ringe (hvid pilespids) og en umodne apikale pensel grænse (gul pilespidser). Skalere bar (C-H) = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: evaluering af enteroid/colonoid éncellelag differentiering. (A) EdU (rød) iblanding viser et fremadskridende tab af spredning under jejunal éncellelag differentiering. (B) gennemsnitlige TER målinger i sammenflydende jejunal encellelag i ekspansion eller differentiering medium. Fejllinjer udgør SEM. UD, udifferentierede; DF, differentieret. Tal svarer til dage under den angivne betingelse; UD1 var den første dag i confluency, ca. 1 uge efter såning. (C) UD jejunal encellelag har bred, kortere celler og en mindre-modne apikale actin-baserede pensel grænse end DF dag 5 jejunal monolag. Skalere bar (A, C) = 50 μm. Alle encellelag blev afbildet på mindst 1 uge efter såning og var sammenflydende forud for begyndelsen differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Wild type colonoids og shRNA transduced knockdown (KD) colonoids hver form Konfluerende monolag. (A) repræsentative billeder af vildtype (WT) menneskelige sammenflydende colonoid éncellelag differentieret i 5 dage og (B) ligeledes vokset encellelag afledt af MUC2 KD colonoid kulturer. Skalere bar (A-B) = 50 μm (C) repræsentant immunblot colonoid kulturer transduced med røræg shRNA eller MUC2 shRNA viser, at ændringer i protein udtryk på grund af KD kan være quantitated af immunblot. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Enteroid/colonoid encellelag er passende modeller at studere luminale mikrobe-værtssammenspil. (A) repræsentative maksimal intensitet projektion og ortogonale optisk sektion af en colonoid éncellelag viser den tykke apikale MUC2-positive mukuslagets, der ikke er gennemtrængelig for E. coli HS (sort pilespidser) sidder på den apikale slim overflade. Éncellelag var smittet i 6 timer med 106 cfu/mL HS. (B) repræsentative maksimal intensitet projektion af menneskelige colonoid éncellelag apikalt inficeret med EHEC (106 cfu/mL, 6 timer). Skalere bar (A-B) = 50 μm. (C) MUC2 immunofluorescens intensitet målinger viser et betydeligt fald i MUC2 i EHEC-inficeret colonoid encellelag i forhold til ikke-inficerede objekter. Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein | Stammesamlingsnummer | Peptid overflod |
| Basolateral medier | ||
| fedtsyre-bindende protein, leveren [Homo sapiens] | NP_001434.1 | 1299 |
| profilin-1 [Homo sapiens] | NP_005013.1 | 797 |
| apolipoprotein IV A forløber [Homo sapiens] | NP_000473.2 | 744 |
| ecto-ADP-ribosyltransferase 4 forløber [Homo sapiens] | NP_066549.2 | 633 |
| glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase isoform 1 [Homo sapiens] | NP_002037.2 (+ 1) | 616 |
| serotransferrin forløber [Homo sapiens] | NP_001054.1 (+ 1) | 572 |
| D-vitamin-bindende protein isoform 3 forløber [Homo sapiens] | NP_001191236.1 (+ 2) | 567 |
| katalase [Homo sapiens] | NP_001743.1 | 427 |
| agrin isoform 1 forløber [Homo sapiens] | NP_940978.2 (+ 1) | 377 |
| lactotransferrin isoform 1 forløber [Homo sapiens] | NP_002334.2 (+ 1) | 262 |
| Apikale medier | ||
| kløverblad faktor 3 forløber [Homo sapiens] | NP_003217.3 | 326 |
| kløverblad faktor 1 forløber [Homo sapiens] | NP_003216.1 | 304 |
| basalmembranen-specifikke heparan sulfat proteoglycan core protein isoform en forløber [Homo sapiens] | NP_001278789.1 (+ 3) | 303 |
| filamin-B isoform 1 [Homo sapiens] | NP_001157789.1 (+ 2) | 240 |
| kløverblad faktor 2 forløber [Homo sapiens] | NP_005414.1 | 182 |
| slettet i maligne hjerne tumorer 1 protein isoform b forløber [Homo sapiens] | NP_015568.2 (+ 3) | 169 |
| Keratin, type II cytoskeletal 1 [Homo sapiens] | NP_006112.3 | 157 |
| myosin-9 [Homo sapiens] | NP_002464.1 | 150 |
| aminopeptidase N forløber [Homo sapiens] | NP_001141.2 (+ 1) | 24V |
| agrin forløber [Homo sapiens] | NP_940978.2 (+ 1) | 112 |
Tabel 1. En delvis liste over peptider identificeret af liquid chromatography/tandem massespektrometri i apikale og basolateral væsker stikprøven fra differentierede jejunal monolag.
Discussion
Kritiske parametre for vellykket dannelsen af enteroid/colonoid encellelag omfatter 1) sund, prolifererende 3D kulturer som råvare; 2) belægning celle kultur Indsæt overflade med human kollagen IV inden éncellelag såning; 3) opsplitning af 3D kulturer enten mekanisk eller enzymatisk, men ikke til det enkelte celle niveau.
Under isolation af 3D enteroids/colonoids, kan den optimale ryster hastighed variere afhængigt af den roterende diameter af en given shaker model. Hensigten er at ikke kun agitere plade for en effektiv blanding men også undgå sprøjt cellesuspension på dækslet til pladen eller i tilstødende brønd. Inkubation perioder på < 30 min. kan give resterende BMM klamrer sig til celler, der kan hindre vedhæftet fil og dannelsen af ensartet celle encellelag når belagt på skær. Omfattende inkubation (≥ 1 h) vil give væsentligt nedsat cellernes levedygtighed.
Omfanget af ændring skal adskille 3D enteroids/colonoids kan variere med stempel stivhed og bruger fingerfærdighed. Periodisk gennemgang af godt indholdet på en fase-kontrast lysmikroskop anbefales at bestemme fragment ensartethed under ændring, med et mål på ca. 30 celler pr. fragment. I stedet for eller ud over ændring, kan suspension fordøjes kort med trypsin at opnå mindre ensartet fragmenter. Trypsin digest kan være ønskeligt hvis encellelag indeholder en stor del af 3D-lignende strukturer blandt et ellers enkelt epitel lag. Dissociation til enkelt celler er imidlertid ikke ønskeligt, da dette falder betydeligt cellernes levedygtighed. Et godt af enteroids/colonoids kulturperler i en 35 μL BMM droplet vil generelt være nok til at udfylde 2-3 skær, men denne faktor kan variere afhængigt af antallet og gennemsnitsstørrelsen på enteroids/colonoids.
Colonoid encellelag kan absorbere en betydelig mængde af den apikale medium, som de differentiere. Dette kan omgås ved at anvende yderligere DM øverste Indsæt kammer (150-200 μl), selv om delvis tørring af den øverste kammer ikke synes at påvirke éncellelag levedygtighed eller funktion i downstream assays. Efter ca. 4-5 dage med differentiering udvikle colonoid encellelag ekstracellulære slim, der kan ses som tyk/gelatineagtig materiale på cellens overflade efter grundig aspiration af DM.
Til EHEC samspil med den ydre mukuslagets bruger vi rutinemæssigt bakteriel titer og inkubering perioden som anført i protokollen. Unikke bakteriestammer bør dog i første omgang analyseres på flere koncentrationer og inkubation perioder at fastslå de relevante parametre for den ønskede effekt.
Under Slim fiksering, vil sugning den apikale medium sandsynligvis fjerne de fleste af ekstracellulære løstliggende mukuslagets. Det er derfor vigtigt at omhyggeligt udøse medium. Hvis mediet opbevares i skæret af overfladespænding, bruge hjørne af et foldet laboratorium væv til at bryde overfladespænding og vægen væk de fleste af medium. Efter fiksering og farvning, kan mukuslagets utilsigtet forskubbet eller fladtrykt mens montering et daekglas over Indsæt filter. For at bevare Slim højde, Placer filteret på en dråbe montering medier og omhyggeligt placere daekglas på filteret. Ikke tryk eller tryk ned på daekglas som dette kan betydeligt flade mukuslagets.
For at danne et polariseret éncellelag fra celler i 3D kultur, er det nødvendigt at reproducere samspillet mellem basolateral membran integriner af intestinal epitelceller og ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Laminin, kollagen IV, fibronektin, og en bred vifte af proteoglycaner udgør den intestinale epitel ECM. 21 , 22 vi sammenlignede humane celle-afledte laminin, fibronektin, kollagen IV og murine-afledte BMM som Indsæt belægninger. Kun kollagen IV understøttes oprettelsen af stabile, langsigtede (op til 4 uger) enteroid/colonoid Konfluerende monolag (tallene 1-2). Små lapper af éncellelag-lignende vækst blev indhentet på hver af de øvrige testede matricer, men disse regioner har kunnet udvikle sig til confluency. Brug af human kollagen IV som ECM surrogat har en række fordele. BMM stammer fra Engelbreth-Holm-sværm (EHS) murine sarkom celler ikke der er af menneskelig oprindelse, human kollagen IV er kommercielt tilgængelige og generelt mere omkostningseffektive. Derudover BMM er en kompleks blanding af proteiner med iboende variabilitet, og kan indeholde vækstfaktorer udskilles af sarkom, der påvirker genekspression. 23
Interaktioner mellem tarm epitelceller og den underliggende ECM i tarm epitel tilbagelevering er stadig utilstrækkeligt forstået. Betydningen af kollagen IV, men ikke laminin, som en vedhæftning ligand for menneskelige colonocytes24 og forstærker af intestinal krypt epitelcelle tilbagelevering25 er blevet foreslået af antistoffer mod kollagen IV, der forhindrede vedhæftet fil . Epiteltransport-udtrykt B1-integrin synes at være vigtig for ECM interaktion, et antistof, der er specifikke for B1-integrin betydeligt blokeret vedhæftning af colonocytes til type IV-kollagen. 24 mens kollagen IV giver en pålidelig ECM for enteroid/colonoid éncellelag dannelse på skær, epithelial remodellering af ECM over tid har ikke endnu blevet evalueret i denne model, og heller ikke har indflydelse på mere komplekse og definerede ECM blandinger af kollagen IV, laminin og fibronektin.
Menneskelige enteroids/colonoids i éncellelag format (tallene 1-4) aktiverer manipulationer og prøveudtagning, ville være besværligt eller umuligt at opnå ved hjælp af 3D matrix-embedded kulturer. 3D enteroids/colonoids varierer i størrelse, strukturel kompleksitet og luminale volumen, og dermed mikroinjektion af mikrober eller små molekyler er vanskelige at nøjagtigt kvantificere. Desuden, i modsætning til encellelag (tabel 1) forhindre 3D kulturer direkte adgang til både de luminale og basolateral overflader til at måle ioner, næringsstoffer, cytokiner eller udskilles faktorer i forbindelse med fysiologisk eller patofysiologiske processer . Confluency (tal 1-2) er en af de vigtigste egenskaber af enteroid/colonoid éncellelag nødvendige for oprettelse af ikke blot de fysiologisk forløb af næringsstoffer, ioner, og andre makromolekyler,16 , men også at skabe den rette barriere mellem luminale mikrobiota og sterile mesenchymale/immun celle-befolket serosal miljøer. Disse facetter er vigtigt at overveje for fremtidige undersøgelser, at indarbejde enteroid/colonoid encellelag med mesenchymale, immun eller neuronal celletyper til at bygge mere komplicerede fysiologiske modeller.
Noterede begrænsninger af celle kultur insert model beskrevet her omfatter manglende fysiske kræfter som væske shear stress og mekanisk stræk/kompression (peristaltik), og fraværet af en anaerob apikale miljø normalt opleves af tarm epitheler in vivo. Disse elementer har potentiale til at blive behandlet med mere avancerede microphysiological platforme,26 men de kræver også ekstra udgift, udstyr og ekspertise til at gennemføre. Både 3D og éncellelag kulturer er også uden interaktioner med eller bidrag fra den intestinale microbiome, stromale cellepopulationer og immunsystemet medmindre disse komponenter er målrettet tilføjet.
Fremtidige anvendelser af enteroid/colonoid éncellelag på kollagen IV-belagt celle kultur skær kan omfatte andre undersøgelser af patogene eller commensal mikrobielle interaktion, stof eller næringsstof optagelse, toksicitet, metabolisme, barriere funktion, og funktionelle ekstraudstyr katalyseret af fælles kultur med yderligere intestinal celletyper. Evalueringer kan gøres ikke kun inden for mekanisk påvirkning af raske donorer, men også fra personer med genetiske mutationer eller tarm sygdomme, forudsat den in vivo fænotyper er etableret skal bevares i ex vivo enteroid/colonoid kultur.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) og K01 DK113043 (JFA). Vi takke James Kaper (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) for at give E. coli stamme HS og EHEC. Vi anerkender også integreret fysiologi og Imaging kerner af Hopkins Conte mave sygdom grundlæggende og Translational forskning Core Center (P30 DK089502) og Johns Hopkins massespektrometri og proteomanalyse kerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Sigma | T4661 | Tris base, Component of lysis buffer |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | ALK4/5/7 inhibitor |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Component of growth medium |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | Fluorescent probe for F-actin |
| Antibiotic/antimycotic cocktail | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
| B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Component of growth medium |
| Cell culture inserts | Corning | 3470 | Transwell, PET membrane, 0.4 μm pore, 24-well plate |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | GSK3β inhibitor |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | |
| Collagen IV, from human placenta | Sigma | C5533 | |
| Cultrex Organoid Harvesting Solution | Trevigen | 3700-100-01 | Depolymerizes basement membrane matrix |
| Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Epithelial voltohmmeter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Epithelial voltohmmeter electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Escherichia coli strain HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Ethanol, absolute | Pharmco | 111000200 | |
| FluorSave mounting medium | Millipore | 345789 | For mounting insert membrane on microscope slide |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, 200 mM |
| HEK293T/Noggin-Fc cell line | van den Brink lab, Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research | For production of Noggin conditioned medium | |
| HEK293T/RSPO1-Fc-HA cell line | Trevigen | 3710-001-K | For production of Rspondin-1 conditioned medium |
| HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Component of growth medium |
| Heraeus Multifuge X1R Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescent nuclear dye |
| Human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-01M | Component of growth medium |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Component of lysis buffer |
| Inverted cell culture light microscope | Olympus | CKX51 | |
| LB broth | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| L-WNT3A cell line | ATCC | CRL-2647 | For production of Wnt3a conditioned medium |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356231 | Basement membrane matrix for 3D culture |
| Mini cell scraper | United BioSystems | MCS-200 | |
| MUC2 antibody, mouse monoclonal | Abcam | ab11197 | Use at 1:100 for immunostaining, 1:500 for immunoblotting |
| MUC2 shRNA lentiviral particles | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiviral shRNA, ID: 4583 |
| Orbital shaker | Grant Instruments | PSU-10i | |
| Penicillin-streptomycin, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Component of growth medium |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-031 | |
| Probe sonicator with microtip | Branson Ultrasonics | 450 | |
| Protease inhibitor cocktail for mammalian cells | Sigma | P8340 | Component of lysis buffer |
| SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 MAPK inhibitor |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | Component of lysis buffer |
| Sodium dexoycholate | Sigma | D6750 | Component of lysis buffer |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L3771 | Component of lysis buffer |
| TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsin, for digesting enteroid/colonoid fragments |
| Vinculin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab129002 | Use at 1:1000 for immunoblotting |
| Water, tissue culture grade, sterile filtered | Corning | 25-055 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | RhoA/ROCK inhibitor |
References
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, e29132 (2017).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function. Infection and Immunity. 83, 138 (2015).
- Foulke-Abel, J., et al. Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology. Gastroenterology. 150, 638-649.e638 (2016).
- Yin, J., et al. Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).
- Tse, C., et al. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers. Toxins. 10, 351 (2018).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).
- Wang, Y., et al. Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64, 911 (2015).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids. Science. 353, 1387 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- In, J., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270 (2017).
- Vernetti, L., et al. Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle. Scientific Reports. 7, 42296 (2017).
- Noel, G., et al. Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut. Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. The gastrointestinal mucus system in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).
- Hews, C. L., et al. The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo. Cellular Microbiology. 19, e12717 (2017).
- Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes. The Journal of Cell Biology. 95, 340 (1982).
- Timpl, R. Macromolecular organization of basement membranes. Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).
- Ishii, S., et al. Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen. Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).
- Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium. Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).
- Bein, A., et al. Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).
