Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59359
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Life Science Frontiers, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University, 2Department of Clinical Application, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University

Summary

Vi præsenterer her en protokol for differentiering af menneskelige inducerede pluripotente stamceller i hver somite derivat (myotome, sclerotome, dermatome og syndetome) i kemisk definerede betingelser, som har applikationer i fremtidige sygdom modellering og celle-baserede behandlinger i ortopædisk kirurgi.

Abstract

Som reaktion på signaler såsom WNTs, ben morfogenetiske proteiner (BMP), og sonic hedgehog (SHH) udskilles fra de omkringliggende væv, somites (SMs) give anledning til flere celletyper, herunder myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D) og syndetome (SYN) , som igen udvikler sig til skeletmuskulatur, aksiale skelet, dorsale dermis og aksial senen/ligament, henholdsvis. Generation af SMs og deres derivater fra menneskelige inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er derfor afgørende at få pluripotente stamceller (PSC) til anvendelse i regenerativ medicin og sygdom forskning inden for ortopædisk kirurgi. Selv om protokollerne induktion til MYO og SCL fra kvikskrankerne har tidligere rapporteret af flere forskere, har ingen undersøgelse endnu vist induktion af SYN og D fra iPSCs. Derfor, effektive induktion af fuldt kompetente SMs fortsat en stor udfordring. Her, sammenfatte vi menneskelige SM mønstre med human iPSCs in vitro-ved at efterligne signaling miljøet under chick/mus SM udvikling, og rapporten om metoder til systematisk induktion af SM derivater (MYO, SCL, D og SYN) fra menneskelige iPSCs under kemisk definerede betingelser gennem presomitic mesoderm (PSM) og SM stater. Viden om chick/mus SM udvikling blev anvendt til induktion af SMs med menneskelige iPSCs. Denne metode kan være en roman værktøj for at studere menneskers somitogenesis og mønster uden brug af embryoner og cellebaseret terapi og sygdom modellering.

Introduction

Udvikle en styret differentiering metode til en ønskede celletype fra kvikskranker er et nødvendigt skridt for at oversætte studiet af PSC-afledte celler til kliniske anvendelser. Tvungen udtryk for centrale gener er en lovende strategi for orgel-celle differentiering fra PSC'er og har forbedret vores forståelse af den genetiske regulering af celle skæbne beslutsomhed, orgel morfogenese og organisation under embryogenese1. Desuden betragtes recapitulating de endogene signaling miljøer, ved hjælp af udviklingen af mus og chick embryoner som en køreplan, som afgørende for styret differentiering af PSC'er. Da anvendelsen af PSC-afledte celler i kliniske undersøgelser såsom celle-baserede behandlinger, er den sidstnævnte strategi imidlertid mere egnet fordi det ikke kræver genmanipulation.

Flere undersøgelser har rapporteret induktion af mesoderm fra mennesker og mus PSC'er i kemisk definerede betingelser. Typisk, disse metoder har påberåbt sig activin/nodal/omdanne vækst faktor β (TGFβ) signalering og ben morfogenetiske proteiner (BMP) signalering, menes at udføre meso-endoderm og mesoderm differentiering, hvilket resulterer i en lav induktion effektivitet de paraksiale mesoderm (ca 20%)2. Med andre ord, var PSC-afledte mesoderm induceret af disse signaling veje hovedsagelig laterale plade mesoderm og ikke paraksiale mesoderm. For nylig, et par undersøgelser har vist den effektive produktion af PSC-afledte paraksiale mesoderm baseret på forskellige strategier3,4,5,6,7,8 . I disse undersøgelser, kvikskrankerne var kulturperler med relativt høje koncentrationer af glykogen syntase kinase 3 (GSK3)-hæmmere (WNT signaling aktivatorer), derfor induktion effektiviteten af paraksiale mesoderm nået 70% – 95%6,7 .

I somitogenesis, de paraksiale mesoderm først danner presomitic mesoderm (PSM) posteriort, og derefter danner somites (SMs) i den forreste del gennem udkom til epitelial overgang9,10. Notch ligand Delta-lignende 1 (DLL1) er kendt for at have en central rolle under somitogenesis, som vakler kontrol af DLL1 udtryk, begge i mRNA og protein niveau, regulerer SM segmentering. SMs til sidst opdele i to dele, hvilket giver anledning til dermomyotome (DM) dorsalt og sclerotome (SCL) ventrally11. Efterfølgende differentierer DM til dermatome (D), en forløber for den dermis, og myotome (MYO), en forløber for skeletmuskulaturen; Derudover danner en ventrale del af SCL syndetome (SYN), en forløber for sener og ledbånd12 (figur 1). Nogle forskere har rapporteret induktion af PSC-afledte SM derivater som MYO4,13 og SCL14; der er dog flere begrænsninger i disse undersøgelser. Især, da vores viden om de signaling miljøer af D og SYN er fragmentarisk, blevet induktion protokoller for D og SYN endnu ikke systematisk fastsat. For at demonstrere fuld-kompetence af SMs induceret fra PSC'er, er det vigtigt at vise multi differentieringen kapacitet af inducerede SMs til alle fire derivater (D, MYO, SCL og SYN), mens tidligere undersøgelser har kun fokuseret på specifikke SM derivater. Her, rapport vi om hvordan man kan generere alle fire SM derivater, herunder D og SYN, gennem PSM og SM skæbner fra menneskelige iPSCs15. Vi mener, at etablering af en in vitro-trinvis metode at modeller udviklingsprocessen SM kunne bidrage til studiet af hvordan menneskelige SM udvikler under embryogenese, uden brug af embryoner.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller der involverer menneskelige iPSCs blev godkendt af den etiske komité i Institut for medicin og Graduate School of Medicine, Kyoto University.

1. menneskets iPSCs forberedelse før induktion

Bemærk: Kultur menneskelige iPSCs (201B7-PAX3-NGL) på SNL feeder celler16 med primat ES celle medium suppleret med 4 ng/mL rekombinant humant basic fibroblast vækstfaktor (FGF2) og 0,5% penicillin og streptomycin (herefter som menneskelige stamceller medium, se Tabel 1). Når sammenløbet forholdet når 70%-80%, passage cellerne som tidligere beskrevet17.

  1. Passaging af menneskelige iPSCs på SNL feeder celler17
    1. Passaging, tilføje PBS i celle dyrkningsbaserede skål og skyl celler. Fjern derefter PBS (, denne proces vil blive benævnt vask med PBS).
    2. Der tilsættes 1 mL af CTK løsning (Se tabel 1) ved stuetemperatur (RT) og vent indtil SNL feeder celler begynder at løsrive fra bunden af skålen.
    3. Fjerne CTK løsning og derefter vaskes to gange med PBS.
    4. Der tilsættes 1 mL af menneskelige stamceller medium (Se tabel 1) i skålen, derefter skrabe celler ved hjælp af en skraber og indsamle i en 15 mL konisk slange.
    5. Forsigtigt afpipetteres indholdet fem gange ved hjælp af en 1.000 µL tip, og derefter overføre til en ny parabol fyldt med menneskelige stamceller medium. Bruge en split forholdet 1:4 til 1:10, afhængigt af sammenløbet forholdet før passaging. Også variere mængden af menneskelige stamceller medium afhængigt af omfanget af parabol (f.eks. 3 mL til en 6 cm parabol, 8 mL for en 10 cm parabol).
    6. Inkuber den menneskelige iPSCs ved 37 ° C og 5% CO2.
    7. Ændre medium hverdagen (undtagen dagen efter passaging) og kultur cellerne indtil den næste passaging procedure.
  2. Feeder-fri dyrkning af menneskelige iPSCs før PSM induktion
    Bemærk:     for at minimere effekten af vækstfaktorer udskilles fra SNL feeder celler, kultur menneskelige iPSCs under feeder-fri betingelser med et feeder-fri cellekulturmedium (Se tabel 1) på ekstracellulære matrix (ECM) løsninger (Se tabel 1) belagte fad i 3 dage før PSM induktion.
    1. Dag -4 (4 dage før du starter PSM induktion)
      1. For at forberede ECM løsning-belagte fad, tilsættes 4 mL af ECM-løsningen på en 10 cm parabol ved 4 ° C natten over.
        Bemærk: Placer ECM-løsningen på is samtidig med at forberede.
    2. Dag -3
      1. Første, Fjern ECM-løsningen fra fadet og tilsæt 8 mL af feeder-fri cellekulturmedium.
      2. For at starte feeder-fri dyrkning, vask en gang med PBS til at skylle de dyrkede celler.
      3. Der tilsættes 1 mL af CTK løsning på RT indtil SNL feeder celler begynder at løsrive fra bunden af skålen.
        Bemærk: Brug mikroskopi til at bekræfte alle feeder celler er løsrevet fra bunden.
      4. Fjerne CTK løsning og vask med PBS to gange, således at alle SNL feeder celler er helt fjernet.
      5. Der tilsættes 1 mL af feeder-fri cellekulturmedium i skålen så skrabe celler ved hjælp af en skraber og samle dem i en 15 mL konisk slange.
      6. Forsigtigt med pipette overfoeres indholdet tre gange ved hjælp af en 1.000 µL spids og derefter overføre til en ny ECM løsning-belagt 10 cm parabol (forberedt under trin 1.2.1). Bruge en delingsforholdet af ca. 1:2 til 1:4, alt efter sammenløbet forholdet før feeder-fri dyrkning.
      7. Inkuber den menneskelige iPSCs ved 37 ° C og 5% CO2 i 3 dage, ændring af mediet på dag -1.

2. PSM differentiering og Isolation af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)

  1. PSM differentiering (dag 0-dag 4)
    1. Opsug feeder-fri cellekulturmedium og tilsæt 8 mL af PSM induktion medium (CDM basal medium suppleret med 10 µM SB431542, 10 µM CHIR99021, 2 µM DMH1 og 20 ng/mL FGF2, se tabel 1).
      Bemærk: Celle sammenløbet ved indledningen af PSM differentiering er kritisk for induktion effektivitet. Bruge mikroskopi til at bekræfte sammenflydende forholdet er ca 30%.
    2. Inkuber celler ved 37 ° C, med 5% CO2, for 4 dage, ændring af mediet på dag 3.
    3. Høst celler til FACS på dag 4 (afsnit 2.2, nedenfor).
  2. Isolering af DLL1 positive PSM celler ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS)
    Bemærk:     nedenfor er en procedure for celle forberedelse før FACS sortering af DLL1 positive celler. Udføre FACS sortering ved hjælp af en flow forskellige, efter producentens protokol.
    1. Opsug mediet, så vask med PBS. Efterfølgende tilsættes 1 mL af celle dissociation reagens og forlade for 3 min på RT.
    2. Der tilsættes 4 mL af CDM basal medium, skrabe celler ved hjælp af en skraber og samle dem i en 15 mL konisk slange.
    3. Tæller antallet af celler ved hjælp af en automatiseret celle counter, derefter centrifugeres ved 280 x g i 3 min.
    4. Omhyggeligt Fjern supernatanten ved aspiration og resuspend celler i FACS buffer (Se tabel 1) i en koncentration på 1,0 x 107 celler/mL. For en negativ kontrolprøve (isotype kontrol, eller i konventionen uden antistof), overføre 50 µL ind i en 15 mL konisk rør og derefter suspendere med 450 µL af FACS buffer.
    5. Tilføj DLL1 antistof (Se Tabel af materialer) i et forhold på 1/200. Beskytte røret fra lys og holder på is i 30 min.
    6. Der centrifugeres ved 280 x g i 3 min.
    7. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og resuspend i FACS buffer (1,0 x 107 celler/mL) suppleret med 1 mg/mL DAPI.
    8. Overførsel i en collection tube, indarbejdet med en 35 µm nylon mesh i fælles landbrugspolitik til filtrering, derefter placere røret på is, indtil sortering er fuldført. Udføre den samme procedure med negativ kontrolprøve (trin 2.2.4).
    9. Udføre sortering ved hjælp af en flow forskellige efter producentens protokol.
    10. Indsamle de sorterede DLL1 positive celler ind i en 15 mL konisk rør, der indeholder 4 mL af CDM basal medium suppleret med 10 µM af Y27632. For total RNA udvinding, centrifugeres ved 280 x g i 3 min og derefter resuspend i RNA lysisbuffer og opbevar ved-30 ° C. Se RNA udvinding, reverse transkription og RT-qPCR procedurer (afsnit 5.1) for mere detaljerede oplysninger.
    11. Udføre SM differentiering ved hjælp af de sorterede celler i henhold til den nedenfor protokol (afsnit 3).

3. SM differentiering fra PSM

  1. SM differentiering fra sorterede DLL1 positive PSM celler (dag 4 – dag 8)
    Bemærk:     forberede ECM løsning-belagt 12-godt plader dagen før FACS sortering. At forberede en ECM løsning-belagt 12-godt tallerken, tilsættes 1 mL af ECM-løsningen i hver brønd ved 4 ° C og lad natten. Holde ECM-løsningen på is samtidig med at forberede.
    1. Følgende trin 2.2.10, centrifuge på 280 x g i 3 min.
    2. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og resuspend i 1 mL af SM induktion medium (CDM basal medium suppleret med 10 µM SB431542 og 5 µM CHIR99021, se tabel 1).
    3. Tæl antallet af celler ved hjælp af en automatiseret celle counter.
    4. Frø 1,0 x 105 celler på hver brønd af ECM løsning-belagt 12-godt pladerne indeholdende 1 mL af SM induktion medium suppleret med 10 µM af Y27632.
    5. Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2 i 4 dage indtil dag 8. Ændre det medium, der ikke indeholder Y27632 på dag 5 (dagen efter FACS sortering) og dag 7.
    6. Udføre SM derivater differentiering ved hjælp af inducerede SM celler efter protokollerne nedenfor. For total RNA udvinding fra induceret SM celler, indsamle cellerne i en 15 mL konisk rør og centrifugeres ved 280 x g i 3 min, så resuspend i RNA lysisbuffer og opbevar ved-30 ° C.

4. SM derivater (DM, MYO, D, SCL, SYN) differentiering fra SM

Bemærk: For at demonstrere fuld-kompetence af SM celler, udføre første DM (dermomyotome) og SCL (sclerotome) induktion i overensstemmelse hermed ved hjælp af iPSC-afledte SM celler. Efterfølgende udfører MYO (myotome) og D (dermatome) induktion ved hjælp af DM celler, og foretage SYN (syndetome) induktion ved hjælp af SCL celler. Nedenfor er protokollerne til induktion af hver derivat (DM, MYO, D, SCL og SYN) fra induceret SM celler in vitro.

  1. DM differentiering fra SM celler (dag 8-dag 11)
    1. Opsug mediet, hvorefter der tilsættes 1 mL af DM induktion medium (CDM basal medium suppleret med 5 µM CHIR99021 og 10 ng/mL BMP4, se tabel 1).
    2. Inkuber celler ved 37 ° C, med 5% CO2, i 3 dage indtil dag 11. Ændre mediet på dag 10 (dag 2 af DM induktion).
    3. Udføre MYO og D differentiering ved hjælp af induceret DM celler efter protokollerne nedenfor.
  2. MYO differentiering fra DM celler (dag 11 – dag 41)
    1. Opsug mediet, hvorefter der tilsættes 1 mL af MYO induktion medium (CDM basal medium suppleret med 5 µM CHIR99021, se tabel 1).
    2. Inkuber celler ved 37 ° C, med 5% CO2, nemlig 30 dage indtil dag 41. Ændre medium hver 3 dage.
  3. D differentiering fra DM celler (dag 11-dag 20)
    1. Opsug mediet, hvorefter der tilsættes 1 mL af D induktion medium (CDM basal medium suppleret med 5 µM CHIR99021 og 10 ng/mL BMP4, se tabel 1).
    2. Inkuber celler ved 37 ° C, med 5% CO2, 9 dage indtil dag 20. Ændre medium hver 3 dage.
  4. SCL differentiering fra SM celler (dag 8-dag 11)
    1. Opsug mediet, hvorefter der tilsættes 1 mL af SCL induktion medium (CDM basal medium suppleret med 100 nM SAG og 0,6 µM LDN193189, se tabel 1)14.
    2. Inkuber celler ved 37 ° C, med 5% CO2, i 3 dage. Ændre mediet på dag 10 (dag 2 af SCL induktion).
    3. Udføre SYN differentiering ved hjælp af inducerede SCL celler efter protokol nedenfor.
  5. SYN differentiering fra SCL celler (dag 11 – dag 32)
    Bemærk:     forberede ECM løsning-belagt 24-godt plader dagen før indlede SYN induktion. At forberede en ECM løsning-belagt 24-godt plade, der tilsættes 0,5 mL ECM-løsningen i hver brønd ved 4 ° C og lad natten. Holde ECM-løsningen på is samtidig med at forberede.
    1. Opsug mediet og derefter vaske med PBS, så tilsættes 0,2 mL af celle dissociation reagens til hver brønd og forlade for 3 min på RT.
    2. Tilføje 0,8 mL af CDM basal medium til hver brønd så skrabe og indsamle alle celler i en 15 mL konisk slange.
    3. Der centrifugeres ved 280 x g i 3 min.
    4. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og resuspend i 1 mL SYN induktion medium-1 (CDM basal medium suppleret med 20 ng/mL FGF8, se tabel 1), så tæller antallet celler ved hjælp af en automatiseret celle counter.
    5. Frø 5,0 x 104 celler i hver brønd af ECM løsning-belagt 24-godt pladerne indeholdende 1 mL SYN induktion medium-1.
    6. Der inkuberes ved 37 ° C, med 5% CO2, i 3 dage.
    7. På dag 14 (dag 3 af SYN induktion), erstatte mediet med SYN induktion medium-2 (CDM basal medium suppleret med 10 ng/mL BMP7 og 10 ng/mL TGFβ3, se tabel 1).
    8. Der inkuberes ved 37 ° C, med 5% CO2, 18 dage indtil dag 32. Ændre medium hver 3 dage.

5. karakterisering af iPSC-afledte produkter

Bemærk: Ved differentiering, karakterisere menneskelig iPSCs derivater ved hjælp af kvantitative real-time PCR (RT-qPCR), immuncytokemi (ICC), enzym-forbundet immunosorbent assays (ELISA) og mekanisk stræk stimulation assays, i overensstemmelse hermed.

  1. Celle høst, samlede RNA udvinding, reverse transkription og kvantitative real-time PCR (RT-qPCR) analyse
    1. Indsamle celle prøver (procedurer 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) i en 1,5 mL tube, derefter centrifugeres ved 280 x g i 3 min.
    2. Fjern supernatanten, derefter resuspend i 350 µL af RNA lysisbuffer, leveret af en passende total RNA udvinding kit.
    3. Uddrag total RNA ved hjælp af kit efter producentens protokol.
    4. Omvendt transskriberer den isolerede 1 µg af total RNA til cDNA, efter producentens protokol.
    5. Udføre RT-qPCR ved hjælp af egnede enzymer, reagenser og primere efter producentens protokol. Primer sekvenser anvendes i denne undersøgelse er angivet i tabel 2.
  2. Immuncytokemi (ICC)
    1. Inden du udfører immuncytokemi med antistoffer, fix cellerne med 2% PARAFORMALDEHYD ved 4 ° C i 10 minutter og vaskes to gange med PBS.
    2. For permeabilization, inkuberes med 0,2% methanol eller 0,2% Polysorbat 20/PBS (i det følgende benævnt PBS-T) ved 4 ° C i 15 min.
    3. Fjerne permeabilization reagenser og behandle celler med en passende blokerende buffer eller 1% bovin serum albumin/PBS ved 4 ° C i 60 min.
    4. Tilføj den første antistof fortyndet med 10% blokerende buffer i PBS-T og sted på en ryster maskine ved 4 ° C natten over.
    5. Vaskes tre gange med PBS-T (tilføje PBS-T og placerer på den ryster maskine på RT for 10 min).
    6. Tilføje det andet antistof, fortyndet med 10% blokerende buffer i PBS-T og sted på den ryster maskine på RT for 60 min. De første og anden antistoffer for ICC anvendes i denne undersøgelse er angivet i tabel 3.
      Bemærk: Fra dette trin og fremefter, skal du beskytte tallerken/fad fra lys af indpakning det i folie.
    7. Vaskes to gange med PBS-T.
    8. Counter farvning, tilføje 1/5000 DAPI fortyndet med PBS og sted på den ryster maskine på RT for 5 min.
    9. Fjerne DAPI løsning og tilføje PBS i hvert hul.
    10. Observere celle farvning ved hjælp af et fluorescens mikroskop. Alternativt kan du gemme tallerken/fad ved 4 ° C i op til 1 måned.
  3. Enzym-forbundet Immunosorbent assay (ELISA) for funktionel analyse af iPSC-afledte D
    Bemærk:     Human dermal fibroblastceller (HDF) er kommercielt tilgængelige. Kultur HDF i DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum (Se tabel 1).
    1. Frø 1,0 x 105 celler af iPSC-afledte D og HDF på 24-godt plader der indeholder 1 mL af hver næringssubstratet (D: D induktion medium, HDF: DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum).
    2. Efter 3 dage i celle dyrkning, indsamle 100 µL af hvert medium, placere i en 1,5 mL tube, og opbevares ved 4 ° C.
    3. Udføre en række procedurer, såsom tilføjelsen af afsløring antistoffer og sekundære antistoffer, ifølge fabrikantens anvisninger, og kvantificere antallet af mål ved at generere en standardkurve mod koncentrationen af kontrol analysandens prøver.
  4. Mekanisk stræk stimulation assay for funktionel analyse af iPSC-afledte SYN
    Bemærk:     voksne menneskers tenocytes er kommercielt tilgængelige (Se Tabel af materialer). Kultur menneskelige iPSC-afledte SYN og voksne menneskers tenocytes på en celle, stretching anordning for mekanisk stræk stimulation assay som beskrevet under18,19. Brug SYN induktion medium-2 og tenocytes vækstmedium (Se Tabel af materialer) en dyrkningsbaserede middel for hver iPSC-afledte SYN og voksne menneskers tenocytes, henholdsvis.
    1. På 24 timer før stretching, plade 1,0 x 105 celler af iPSC-afledte SYN og menneskelige tenocytes på ECM løsning-belagte multi godt-type silicium gummi kamre, hver med en kultur overflade af 1,5 cm x 1,5 cm (Se Tabel af materialer).
    2. Afdelingerne på enheden til celle stretching, og tvinge monoaxial cykliske stamme (0,5 Hz, 5%) i 12 timer.
    3. For total RNA udvinding, tilføje 350 µL af RNA lysisbuffer, så skrabe og indsamle cellerne i en 1,5 mL tube for total RNA ekstraktion og efterfølgende RT-qPCR analyse (Se fremgangsmåden 5.1).

Representative Results

Alle tal i denne rapport blev opnået med 201B7-PAX3-NGL iPSCs, hvor EGFP erstatter en allel af PAX3 kodende sekvens i exon 1. Oprettelsen af 201B7-PAX3-NGL iPSCs bliver beskrevet andetsteds (H. Sakurai, personlig meddelelse). Den statistiske signifikans blev evalueret ved hjælp af statistisk software. P-værdier lavere end 0,05 ansås for betydelig.

Karakterisering af menneskelige iPSC-afledte PSM og SM celler
For at vurdere differentiering af menneskelige iPSCs mod SM gennem PSM stat (figur 2A), FACS analyse, blev ICC analyse og RT-qPCR analyse udført. Som vist i figur 2B, var over 85% af cellerne positiv for DLL1, en markør af PSM, men negative for PAX3, en markør af SM, efter 4 dage af PSM induktion med menneskelige iPSCs. Denne befolkning blev senere, PAX3 positive SM celler efter 4 dage af SM induktion. PSM-SM overgangen blev også bekræftet af ICC (figur 2 c) og RT-qPCR (figur 2D). TBX6, MSGN1 og WNT3A, PSM markører blev udtrykt på tilstanden PSM (dag 4), men ikke udtrykt på SM state (dag 8). PARAXIS, MEOX1 og PAX3, SM markører, blev udtrykt på SM, men ikke udtrykt på PSM. Derudover farvning af CDH11, en markør for epithelialized SM, kun akkumuleret i celle-celle krydset, efter tilføjelsen af SB431542 med CHIR99021 (figur 2E).

Karakterisering af SM derivater induceret fra menneskelige iPSC-afledte SM celler
For at evaluere differentiering styrken af menneskelige iPSC-afledte SM, differentiering mod DM, MYO, D, SCL og SYN (figur 3A) blev vurderet af ICC analyse og PAX3 (normal god landbrugspraksis)-fluorescens. Som vist i figur 3B, DM differentiering blev bekræftet af ALX4 og EN1 farvning, og PAX3 (normal god landbrugspraksis)-Fluorescens; MYO differentiering blev bekræftet af MYOD, MYOG og Myosin heavy chain (MHC) farvning; D differentiering blev bekræftet af EN1 og PDGFRa farvning; SCL differentiering blev bekræftet af PAX1, PAX9 og NKX3.2 farvning; og SYN differentiering blev bekræftet af SCX, MKX, COL1A1 og COL1A2 farvning.

Karakterisering af inducerede D og SYN
1. enzymmaerket assay (ELISA) for funktionel analyse af iPSC-afledte D
I den menneskelige krop er en af de primære funktioner i dermal fibroblaster udskiller ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, kollagen og hyaluronsyre at fugte huden og hjælpe med at opretholde hudens struktur. For at demonstrere, at en tilsvarende mængde af kollagen type 1 og hyaluronsyre proteiner var udskilles i dyrkningsmediet iPSC-afledte D og HDF, blev ELISA udført, som vist i figur 4A.

2. mekanisk stræk stimulation assay for funktionel analyse af iPSC-afledte SYN
Som flere undersøgelser har allerede rapporteret, mekanisk stimulering påvirker senen udvikling før og efter fødslen, og fremmer differentiering af tenocytes fra forløber celler18,19. Derfor er det velkendt, at reaktivitet til mekanisk stress er en af de særlige kendetegn ved tenocytes. For at vise sammenlignelige reaktiviteten af menneskelige iPSC-afledte SYN og menneskelige voksen tenocytes, var en mekanisk stræk stimulation assay udføres som vist i figur 4B.

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over hierarkisk differentiering af paraksiale mesoderm. Presomitic mesoderm er en celle population, der forbigående kommer under tidlige embryogenese og gennemgår segmentering til form somites. Somites er en forbigående stamcelle befolkning, der giver anledning til flere celletyper, såsom sclerotome, dermomyotome, syndetome, dermatome og myotome celler, som i sidste ende udvikle sig til senen/Ligament, ben/brusk, skeletmuskulatur og dermis celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: FACS, RT-qPCR og ICC analyse af menneskers iPSC-afledte PSM og SM. (A) skematisk oversigt over en protokol for SM differentiering gennem PSM. (B) repræsentative dot plot af DLL1 farvning og PAX3 (normal god landbrugspraksis)-Fluorescens på dag 4 af PSM induktion og 4 (dag 8 fra iPSC) i SM induktion. (C) repræsentant andre billeder og PAX3 (normal god landbrugspraksis)-Fluorescens på dag 4 af PSM induktion og 4 (dag 8 fra iPSC) i SM induktion. Celler var plettet med anti-TBX6, PARAXIS og MEOX1 antistoffer (rød) og co farves med DAPI (blå) eller opdaget med PAX3 (normal god landbrugspraksis)-Fluorescens (grøn). (D) RT-qPCR analyse af markører for PSM og SM på iPSC, PSM og SM. Middel ± standardfejl (S.E.) fra tre sæt af forsøg er vist. (E) repræsentant andre billeder på dag 4 (dag 8 fra iPSC) af SM, kulturperler i S10I10 (kombination af SB431542 og IWR1, en hæmmer af WNT signalering), S10 (SB431542), og S10C5 (kombination af SB431542 og CHIR99021) betingelser. Celler var plettet med anti-CDH11 antistof (rød) og co farves med DAPI (blå). iPS, inducerede pluripotente stamceller; PSM, presomitic mesoderm; SM, somite; S10, SB431542 10 ΜM; C5, CHIR99021 5 ΜM; I10, IWR1 10 ΜM; Skalere barer = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Nakajima et al. (2018)15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: ICC analyse af DM, MYO, D, SCL og SYN differentieret fra menneskelige iPSC-afledte SM. (A) skematisk oversigt over protokoller for SM derivater differentiering. (B) repræsentant andre billeder og PAX3 (normal god landbrugspraksis)-Fluorescens på dag 3 (dag 11 fra iPSC) af DM induktion, dag 30 (dag 41 fra iPSC) i MYO induktion, dag 9 (dag 20 fra iPSC) af D induktion, dag 3 (dag 11 fra iPSC) af SCL induktion og dag 21 (dag 32 fra iPSC) af SYN induktion. DM, celler var plettet med anti-ALX4 og EN1 antistoffer (rød) og co farves med DAPI (blå) eller opdaget med PAX3 (normal god landbrugspraksis)-Fluorescens (grøn); MYO, celler var plettet med anti-MYOD, MYOG (rød) og MHC (cyan) antistoffer, også co farves med DAPI (blå); D, celler var plettet med anti-EN1 (rød) og PDGFRa (cyan) antistoffer og co farves med DAPI (blå); SCL, celler var plettet med anti-PAX1, PAX9 og NKX3.2 (rød) antistoffer, og co farves med DAPI (blå); SYN, celler var plettet med anti-SCX, MKX, COL1A1 og COL1A2 (rød) antistoffer, og co farves med DAPI (blå). DM, dermomyotome; MYO, myotome; D, dermatome; SCL, sclerotome; SYN, syndetome; Skalere barer = 50 μm. Dette tal er blevet ændret fra Nakajima et al. (2018)15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: funktionel analyse af inducerede D og SYN. (A) mængden af kollagen type 1 og hyaluronic syre proteiner i dyrkningsmediet blev analyseret ved ELISA. (B) effekten af mekanisk stræk stimulering induceret SYN og menneskelige voksen tenocytes blev vurderet af RT-qPCR. Middel ± standardfejl (S.E.) fra tre sæt af forsøg er vist. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001 af Dunnetts flere sammenligninger t-testen sammenlignet med Stretch (-); Nielsen, ikke signifikant, HDF, menneskelige voksen dermal fibroblast. Dette tal er blevet ændret fra Nakajima et al. (2018)15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Medium/løsning Reagant Koncentration
CDM basal medium Iscoves modificerede Dulbecco's medium/skinke F12 1:1
Penicillin/Streptomycin 0,5%
Kemisk definerede lipid koncentrat 1%
APO-transferrin 15 mg/mL
Monothioglycerol 450 mM
Bovint serumalbumin 5 mg/mL
Insulin 7 mg/mL
CTK løsning Vand -
Trypsin 0,25%
Collagenase IV 0,1 mg/mL
Calcium chloride 1 mM
Knockout SR 20%
D induktion medium CDM basal medium -
CHIR99021 5 ΜM
BMP4 10 ng/mL
DM induktion medium CDM basal medium -
CHIR99021 5 ΜM
BMP4 10 ng/mL
ECM-løsningen Kunstige ekstracellulære matrix 0,3 mg/mL
DMEM/F12 -
FACS buffer PBS -
Bovint serumalbumin 0,1%
Feeder-fri cellekulturmedium mTeSR1 -
Penicillin/Streptomycin 0,5%
HDF næringssubstratet DMEM -
Føtal bovint serum 10%
menneskelige stamceller medium Primat ES celle medium -
Penicillin/Streptomycin 0,5%
FGF2 4 ng/mL
MYO induktion medium CDM basal medium -
CHIR99021 5 ΜM
PSM induktion medium CDM basal medium -
SB431542 10 ΜM
CHIR99021 10 ΜM
DMH1 2 ΜM
FGF2 20 ng/mL
SCL induktion medium CDM basal medium -
SAG 100 nM
LDN193189 0,6 ΜM
SM induktion medium CDM basal medium -
SB431542 10 ΜM
CHIR99021 5 ΜM
SYN induktion medium-1 CDM basal medium -
FGF8 20 ng/mL
SYN induktion medium-2 CDM basal medium -
BMP7 10 ng/mL
TGFΒ3 10 ng/mL

Tabel 1: Medier og løsning opskrifter.

Navn Fremad Omvendt
ACTB CACCATTGGCAATGAGCGGTTC AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
COL1A1 GGACACAGAGGTTTCAGTGGT GCACCATCATTTCCACGAGC
MEOX1 GAGATTGCGGTAAACCTGGA GAACTTGGAGAGGCTGTGGA
MSGN1 GGAGAAGCTCAGGATGAGGA GTCTGTGAGTTCCCCGATGT
PARAXIS TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT CACACCCTGTCACCAACAGT
PAX3 AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG
SCX CCCAAACAGATCTGCACCTTC GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC
TBX6 AGCCTGTGTCTTTCCATCGT AGGCTGTCACGGAGATGAAT
TNMD CCCTTCATGCTGAAGCCACTT CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG
WNT3A CAAGATTGGCATCCAGGAGT ATGAGCGTGTCACTGCAAAG

Tabel 2: Primer sekvenser for RT-qPCR analyse.

Koncentration
1.
Antistof		 ALX4_Goat 1/50
CDH11_Mouse 1/1000
COL1A1_Rabbit 1/100
COL2A1_Mouse 1-2 μg/mL
EN1_Rabbit 1/50
MEOX1_Rabbit 1/50
MHC_Rabbit 1/200
MKX_Rabbit 1/50
MYOD_Rabbit 1/500
MYOG_Mouse 1/400
NKX3.2_Rabbit 1/50
PARAXIS_Rabbit 1/50
PAX1_Rabbit 1/50
PAX9_Rabbit 1/50
PDGFRa_Goat 1/100
SCX_Rabbit 1/50
TBX6_Goat 1/50
2.
Antistof		 Æsel anti ged IgG(H+L) sekundære antibody555 1/500
Æsel anti ged IgG(H+L) sekundære antibody647 1/500
Ged anti mus IgG(H+L) sekundære antibody555 1/500
Ged anti-kanin IgG(H+L) sekundære antibody555 1/500
Ged anti-kanin IgG(H+L) sekundære antibody647 1/500

Tabel 3: Første og anden antistoffer for ICC.

Discussion

En velkendt metode til induktion af PSC-afledte SM gennem PSM er en kombination af CHIR99021 + A83-01 (TGFβ-hæmmer) under PSM induktion fra PSC, men ikke under PSM modning processen6. I den foreliggende undersøgelse, blev WNT/beta-catenin signalering hæmmet ved hjælp af C59 for at fremkalde SM fra PSM. Men vi indførte brugen af CHIR99021 til at aktivere WNT pathway under SM differentiering. Denne beslutning blev foretaget på grundlag af den konstatering, at flere WNTs er udtrykt i det omgivende væv af SM og i betragtning af, at WNT reportere er aktive i SM20. Som et resultat, observeret vi epithelialization, en karakteristisk for SM in vivo, kun under betingelsen med CHIR99021, baseret på akkumulering af CDH11 i celle-celle vejkryds (figur 2E). Denne observation angiver den kritiske inddragelse af WNT signalering under PSM differentiering og SM epithelialization, derfor vores protokol kan bedre sammenfatte den endogene signaling miljø. Det indebærer imidlertid også en yderligere mulighed for at finjustere WNT/beta-catenin signalering pathway under differentiering, fordi robustheden og effektiviteten af differentiering kan variere betydeligt afhængigt af celletyper, cellelinjer og forskellige kemiske forbindelser af WNT-induktorer bruges af hver forsker.

Denne metode også giver os mulighed at generere alle fire SM derivater, MYO, D, SCL og SYN, fra menneskelig iPSCs. Vores trinvis protokoller ved hjælp af CDM kan bruges til at identificere de signaling krav under menneskelige somitogenesis/somite mønster, og give vigtig indsigt i menneskelige SM udvikling. For eksempel, kan vores metoder være nyttigt for at studere segmentering ur mekanismer, en molekylær oscillation system, der regulerer dannelsen af SM. Det er blevet grundigt undersøgt i mus, kyllinger og zebrafisk, men ikke hos mennesker på grund af manglende relevante eksperimentelle værktøjer.

Derudover kan vores metode gælde for fremtidige kliniske celle-baserede behandlinger. For eksempel, menneskelige iPSC-afledte D eller SYN kan transplanteres ind alvorligt skadede huden eller bristede sener til regenerering og behandling. Flere begrænsninger skal dog løses før metoden kan anvendes praktisk. Selv i den nuværende undersøgelse, brugte vi SNL feeder celler til iPSC vedligeholdelse og ECM-løsningen, som er udvundet af Engelbreth-Holm-sværm mus sarkom, som en overflade frakke på fadet under induktion, skal disse ikke-menneskelige dyr-afledte reagenser være fjernet for at forbedre klinisk kvalitet. Derudover skal celle mængde og kvalitet, som omfatter renhed og modningen af de ønskede celler, også forbedres. Ikke kun celle nummer, men også celle styrken er endvidere et vigtigt kendetegn for senen/ligament regenerering. Derudover, udviklingen af overflade markører for rensning og en ny metode til 3D rekonstitution er uundværlig for at fremme vores protokoller til klinisk celle-baserede behandlinger.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Junya Toguchida (CiRA) for hans hjælp med projekt administration og finansiering erhvervelse, Mr. Mitsuaki Shibata (CiRA) og Ms. Mei Terashima (CiRA) for deres tekniske bistand, Dr. Yayoi Toyooka (CiRA) og Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) for deres korrekturlæsning af håndskriftet, og Mr. Masaya Todani (CiRA) for at give en illustration (figur 1). Vi takker også alle medlemmerne af Ikeya og Toguchida laboratorier (CiRA) for deres støtte i løbet af denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af Grants-in-aid for videnskabelig forskning fra Japan samfund for at fremme af videnskab (JSP'ER) (26670661), programmet for genstridig sygdomme forskning udnytte sygdoms-specifikke IP'er celler fra Japan videnskab og teknologi Agenturet (JSO) og Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED), Core Center for iPS Cell Research Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin (JST/AMED) og iPS celle forskningsfond (delvis til Makoto Ikeya og Junya Toguchida). Makoto Ikeya blev også støttet af Grants-in-aid for videnskabelig forskning (JSP'ER) (16H 05447) og den Acceleration Program for genstridig sygdomme forskning udnytte sygdoms-specifikke IP'er celler (AMED).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALX4_Goat antibody Santacruz sc-22066
Apo-transferrin Sigma T1147
BMP4 R&D 314-BP-010
BMP7 R&D 354-BP-010
Bovine serum albumin Sigma A8806
Calcium chloride Nacalai tesque 067730-15
CDH11_Mouse antibody Cell signaling 13577
Cell streching device Strex STB-140
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905-031
CHIR99021 Axon 1386
COL1A1_Rabbit antibody Abcam ab34710
COL2A1_Mouse antibody Thermo scientific MS-235
Collagenase IV Thermofisher 17104019
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody R&D FAB1818A For FACS
DMEM Sigma D6046
DMEM/F12 Gibco 11320-082
DMH1 Tocris 4126
EN1_Rabbit antibody Abcam ab70993
Fetal bovine serum Nichirei 171012
FGF2 Wako 060-04543
FGF8 Peprotech 100-25
Human dermal fibroblast Cell applications 160-05a
Human tenocyte Angio proteomie cAP-0041
Insulin Wako 090-06474
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 Gibco 21056023
Knockout SR Gibco 10828028
LDN193189 Axon 1509
Matrigel BD bioscience 354230 Artificial extracellular matrix
MEOX1_Rabbit antibody Abcam ab75895
MHC_Rabbit antibody Santacruz sc-20641
MKX_Rabbit antibody Atlas antibodies A83377
Monothioglycerol Sigma M6145
mTeSR1 Stemcell tech 85850
Multi well-type silicon rubber chamber Strex STB-CH-4W
MYOD_Rabbit antibody Abcam ab133627
MYOG_Mouse antibody Santacruz sc-12732
NKX3.2_Rabbit antibody Sigma HPA027564
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 Invitrogen A21432
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 Invitrogen A21447
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 Invitrogen A21422
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 Invitrogen A21428
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 Invitrogen A21245
PARAXIS_Rabbit antibody Santacruz sc-98796
PAX1_Rabbit antibody Abcam ab95227
PAX9_Rabbit antibody Gene tex GTX104454
PBS - -
PDGFRa_Goat R&D AF307
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Primate ES cell medium Reprocell RCHEMD001
SAG Calbiochem 566661
SB431542 Selleckchem SEL-S1067-10
SCX_Rabbit antibody Abcam ab58655
TBX6_Goat antibody R&D AF4744
Tendon cell growth medium Angio-proteomie cAP-40 Tenocytes growth medium
TGFβ3 R&D 243-B3-200
Trypsin Gibco 15090046

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), e61540 (2013).
  2. Sakurai, H., et al. In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), e47078 (2012).
  3. Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocl. 11 (10), 1833-1850 (2016).
  4. Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
  5. Umeda, K., et al. Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 2, 455 (2012).
  6. Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
  7. Xi, H., et al. In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Reports. 18 (6), 1573-1585 (2017).
  8. Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
  9. Tam, P. P., Beddington, R. S. The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development. 99 (1), 109-126 (1987).
  10. Aulehla, A., Pourquie, O. Signaling gradients during paraxial mesoderm development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a000869 (2010).
  11. Christ, B., Scaal, M. Formation and differentiation of avian somite derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 638, 1-41 (2008).
  12. Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
  13. Sakurai, H., et al. Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium. Stem Cell Research. 3 (2-3), 157-169 (2009).
  14. Zhao, J., et al. Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells. Development. 141 (20), 3848-3858 (2014).
  15. Nakajima, T., et al. Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells. Development. 145 (16), (2018).
  16. McMahon, A. P., Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell. 62 (6), 1073-1085 (1990).
  17. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  18. Suzuki, H., et al. targeting of the transcription factor Mohawk in rats causes heterotopic ossification of Achilles tendon via failed tenogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7840-7845 (2016).
  19. Marturano, J. E., Arena, J. D., Schiller, Z. A., Georgakoudi, I., Kuo, C. K. Characterization of mechanical and biochemical properties of developing embryonic tendon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6370-6375 (2013).
  20. Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 146 induceret pluripotente stamceller differentiering paraksiale mesoderm somite myotome sclerotome dermatome syndetome
I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakajima, T., Sakurai, H., Ikeya, M. … More

Nakajima, T., Sakurai, H., Ikeya, M. In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59359, doi:10.3791/59359 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter