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Developmental Biology

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59359
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Life Science Frontiers, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University, 2Department of Clinical Application, Center for iPS Cells Research and Application, Kyoto University

Summary

हम यहां प्रत्येक कायखंड व्युत्पंन में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद (myotome, श्वेतकोष्ठिका, dermatome, और syndetome) में रासायनिक परिभाषित शर्तों, जो भविष्य रोग मॉडलिंग में आवेदन किया है और आर्थोपेडिक सर्जरी में कोशिका आधारित चिकित्सा ।

Abstract

इस तरह के संकेतों के जवाब में WNTs के रूप में, अस्थि मोर्फोजेनेटिक प्रोटीन (BMPs), और ध्वनि हाथी (SHH) आसपास के ऊतकों से स्रावित, somites (एसएमएस) एक से अधिक सेल प्रकार के लिए वृद्धि दे, myotome (MYO), स्कलेकोटोम (SCL), त्वचीय , जो बदले में कंकाल की मांसपेशी, अक्षीय कंकाल, पृष्ठीय डर्मिस, और अक्षीय कंडरा/स्नायु में क्रमशः विकसित होता है । इसलिए, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से एसएमएस और उनके डेरिवेटिव के उत्पादन पुनर्योजी चिकित्सा में आवेदन के लिए pluripotent स्टेम सेल (पीएससीएस) प्राप्त करने के लिए और आर्थोपेडिक सर्जरी के क्षेत्र में रोग अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण है । यद्यपि पीपीएससी से MYO और SCL के लिए प्रेरण प्रोटोकॉल पहले कई शोधकर्ताओं द्वारा सूचित किया गया है, कोई अध्ययन अभी तक iPSCs से SYN और डी की प्रेरण का प्रदर्शन किया है । इसलिए, पूर्णत सक्षम एसएमएस को प्रभावी रूप से शामिल करना एक बड़ी चुनौती बनी हुई है । यहां, हम मानव एस के साथ patterning पर कब्जा कर लेना विट्रो में चिकी के दौरान संकेतन वातावरण नकल द्वारा (), और एसएम डेरिवेटिव के व्यवस्थित प्रेरण के तरीकों पर रिपोर्ट (MYO, SCL, डी, और SYN) मानव iPSCs से रासायनिक के तहत presomitic मध्यजनस्तर (पीएसएम) और एसएम राज्यों के माध्यम से परिभाषित शर्तों । मानव आईपीएससी के साथ एसएमएस को शामिल करने के लिए चिक/माउस के संबंध में ज्ञान का सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया । इस विधि भ्रूण के उपयोग के बिना और कोशिका आधारित चिकित्सा और रोग मॉडलिंग के लिए मानव somitogenesis और patterning के अध्ययन के लिए एक उपंयास उपकरण हो सकता है ।

Introduction

पीएससी से वांछित कोशिका प्रकार के लिए एक निर्देशित विभेदन विधि का विकास करना एक आवश्यक कदम है, जो पी एस सी-व्युत्पन्न कोशिकाओं के अध्ययन को नैदानिक अनुप्रयोगों में अनुवाद करने के लिए है । मुख्य जीनों की जबरिया अभिव्यक्ति के लिए एक आशाजनक रणनीति अंग-कोशिका विभेदन पीएससीज से और कोशिका भाग्य निर्धारण के आनुवंशिक विनियमन के बारे में हमारी समझ में सुधार हुआ है, अंग की उत्पत्ति, और भ्रूणोद्भव के दौरान संगठन1. इसके अतिरिक्त, अंतर्जात संकेतन वातावरणों को पुनर्पूंजीकरण, एक रोडमैप के रूप में माउस और चिक भ्रूणों के विकास का उपयोग करते हुए, पीएससीज के निर्देशित विभेदन के लिए आवश्यक माना जाता है । तथापि, नैदानिक अध्ययनों में पीएससी द्वारा व्युत्पन्न प्रकोष्ठों जैसे कि कोशिका आधारित चिकित्सा के अनुप्रयोग को देखते हुए बाद की कार्यनीति अधिक उपयुक्त है क्योंकि इसमें जीन हेरफेर की आवश्यकता नहीं है ।

अनेक अध्ययनों में रासायनिक रूप से परिभाषित दशाओं में मानव और मूषक पीएससीज से मध्यजनस्तर की प्रेरण की सूचना दी गई है । आम तौर पर, इन तरीकों activin पर भरोसा किया है/नोडल/बदलने विकास कारक β (tgfβ) सिग्नलिंग और अस्थि संरचनाआनुवंशिक प्रोटीन (BMP) संकेतन, meso-endoderm और मध्यजनस्तर भेदभाव करने के लिए माना जाता है, एक कम प्रेरण दक्षता में जिसके परिणामस्वरूप पैराअक्षीय मध्यजनस्तर (लगभग 20%)2 दूसरे शब्दों में, इन सिग्नलिंग पथों से उत्पन्न पीएससी-व्युत्पन्न मध्यजनस्तर मुख्य रूप से पार्श्व प्लेट मध्यजनस्तर था, न कि पैराअक्षीय मध्यजनस्तर । हाल ही में, कुछ अध्ययनों ने विभिन्न रणनीतियों के आधार पर पीएससी के कुशल उत्पादन-पार्क्षीय मध्यजनस्तर का प्रदर्शन किया है3,4,5,6,7,8 . इन अध्ययनों में, पीएससी को ग्लाइकोजन सिंथेज़ काइनेज 3 (GSK3) अवरोधकों (wnt सिग्नलिंग एक्टिवेटर्स) की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता के साथ सुसंस्कृत किया गया था, फलस्वरूप परअक्षीय मध्यस्तर की प्रेरण दक्षता 70% – 95%6,7 तक पहुंच गई । .

सोमैटोजेनेसिस में पैराअक्षीय मध्यजनस्तर पहले से ही अग्रवर्ती मध्यजनस्तर (पीएसएम) का रूप दिया जाता है और उसके बाद मध्यभाग में मेजेन्काइम-से-उपकला संक्रमण9,10के माध्यम से सोमिटीज (एसएमएस) बनाता है । पायदान लिगामेंट डेल्टा-1 की तरह (DLL1) somitogenesis के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका के लिए जाना जाता है, के रूप में DLL1 अभिव्यक्ति के दोलनी नियंत्रण, दोनों mrna और प्रोटीन स्तर में, SM segmentation को नियंत्रित करता है. एसएमएस अंततः दो भागों में विभाजित, dermomyotome (डीएम) डोरसैली और स्कलेरटोम (एससीएल) ventrally11को जंम दे रही है । बाद में, डीएम डर्मिस (डी), dermis के एक अग्रदूत, और myotome (MYO), कंकाल की मांसपेशी का एक अग्रदूत के रूप में अंतर करता है; इसके अतिरिक्त, SCL का एक अधर भाग syndetome (SYN), tendons और स्नायुबंधन के अग्रदूत (1 चित्रा) रूपों । कुछ शोधकर्ताओं ने इस तरह के myo4,13 और एससीएल14के रूप में पीएससी व्युत्पंन SM डेरिवेटिव के प्रेरण की सूचना दी है; हालांकि, इन अध्ययनों में कई सीमाएं हैं । विशेष रूप से, डी और SYN के संकेतन वातावरण के बारे में हमारी जानकारी खंडित है, डी और SYN के लिए प्रेरण प्रोटोकॉल अभी तक व्यवस्थित रूप से स्थापित नहीं किया गया है । पीएससीज से पे्ररित एसएमएस की पूर्ण क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए सभी चार व्युत्पन्नों (डी, माइयो, एससीएल और सिन) में प्रेरित एसएमएस की बहु-विभेदन क्षमता को दर्शाना आवश्यक है, जबकि पिछले अध्ययनों में केवल विशिष्ट एसएम व्युत्पन्नों पर ही ध्यान केन्द्रित किया गया है । यहां, हम कैसे डी और SYN सहित सभी चार sm डेरिवेटिव, उत्पंन करने पर रिपोर्ट psm और sm फैट्स के माध्यम से मानव ipscs15। हमारा मानना है कि एक इन विट्रो पदश: विधि की स्थापना है कि मॉडल sm विकास प्रक्रिया कैसे मानव SM embryogenesis के दौरान विकसित का अध्ययन करने के लिए योगदान सकता है, भ्रूण का उपयोग कर के बिना ।

Protocol

मानव आईपीएससी को शामिल करने वाले सभी प्रायोगिक प्रोटोकॉलों को क्योटो विश्वविद्यालय के मेडिसिन विभाग और गे्रजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. मानव iPSCs तैयारी प्रेरण से पहले

नोट: एसएनएल फीडर सेल पर संस्कृति मानव iPSCs (201B7-PAX3-GFP)16 रहनुमा ES सेल माध्यम के साथ पूरक 4 एनजी/एमएल पुनः संयोजक मानव मूल फाइकोब्लास्ट विकास कारक (FGF2) और ०.५% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन (इसके बाद hesc माध्यम के रूप में संदर्भित करने के लिए, देखें तालिका 1) । जब संगम का अनुपात 70% – 80% तक पहुंचता है, तो कक्षों को पहले17वर्णित के रूप में पारित करते हैं ।

  1. SNL फीडर कोशिकाओं पर मानव iPSCs की पासएजिंग17
    1. Passaging के लिए, सेल संवर्धन डिश और कुल्ला कोशिकाओं में pbs जोड़ें । फिर, PBS (बाद में, इस प्रक्रिया को PBS के साथ धोने के रूप में संदर्भित किया जाएगा) को हटा दें ।
    2. कक्ष तापमान (RT) पर CTK समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( तालिका 1देखें) और जब तक कि SNL फीडर कोशिकाओं डिश के नीचे से detaching शुरू रुको ।
    3. CTK समाधान निकालें और फिर PBS के साथ दो बार धो ।
    4. इस डिश में hESC मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( तालिका 1देखें), तो एक खुनी का उपयोग कर कोशिकाओं परिमार्जन और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा ।
    5. धीरे से सामग्री पांच बार एक १,००० μl टिप का उपयोग पिपेट, और फिर एक नई hesc माध्यम से भरे पकवान को हस्तांतरण । 1:4 से 1:10 के विभाजन अनुपात का उपयोग करें, जो passaging से पहले संगम अनुपात पर निर्भर करता है । इसके अलावा, डिश के पैमाने के आधार पर hESC माध्यम की मात्रा में भिंनता (उदाहरण के लिए, एक 6 सेमी डिश के लिए 3 मिलीलीटर, एक 10 सेमी पकवान के लिए 8 मिलीलीटर) ।
    6. मानव iPSCs ३७ ° c और 5% CO2पर सेते ।
    7. परिवर्तन मध्यम हर रोज (दिन के लिए छोड़कर passaging के बाद) और संस्कृति अगले passaging प्रक्रिया तक कोशिकाओं ।
  2. पीएसएम प्रेरण से पहले मानव ipscs के फीडर-नि: शुल्क संवर्धन
    नोट:     SNL फीडर कोशिकाओं से स्रावित विकास कारकों के प्रभाव को कम करने के लिए, एक फीडर मुक्त सेल संस्कृति मध्यम के साथ फीडर मुक्त शर्तों के तहत मानव iPSCs संस्कृति (देखें तालिका 1) पर extracellular मैट्रिक्स (ecm) समाधान ( तालिका 1देखें) पीएसएम प्रेरण से पहले 3 दिनों के लिए लेपित पकवान ।
    1. दिन-4 (PSM प्रेरण शुरू करने के लिए 4 दिन पहले)
      1. ECM समाधान-लेपित पकवान तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस रात में एक 10 सेमी डिश पर ECM समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें ।
        नोट: तैयारी करते समय ईसीएम सॉल्यूशन को बर्फ पर रखें ।
    2. दिन-3
      1. सबसे पहले डिश से ईसीएम सॉल्यूशन निकालें और 8 एमएल फीडर फ्री सेल कल्चर मीडियम डालें ।
      2. फीडर-मुक्त culturing शुरू करने के लिए, PBS के साथ एक बार धोने के लिए सभ्य कोशिकाओं कुल्ला ।
      3. RT पर CTK समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें जब तक SNL फीडर कोशिकाओं डिश के नीचे से detaching शुरू करते हैं ।
        नोट: सभी फीडर कोशिकाओं नीचे से अलग कर रहे हैं की पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें.
      4. CTK समाधान निकालें और पीबीएस के साथ दो बार धोएं ताकि सभी SNL फीडर सेल पूरी तरह से हट जाएं ।
      5. डिश में फीडर मुक्त सेल संस्कृति मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें, तो एक खुम्बन का उपयोग कर कोशिकाओं को कुरेदना और उन्हें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा ।
      6. धीरे से सामग्री तीन बार एक १,००० μl टिप का उपयोग कर पिपेट, तो एक नए ecm समाधान के लिए स्थानांतरण-लेपित 10 सेमी पकवान (1.2.1 कदम के दौरान तैयार) । लगभग 1:2 से 1:4 के विभाजन अनुपात का उपयोग करें, फीडर-मुक्त culturing से पहले संगम अनुपात पर निर्भर करता है ।
      7. मानव iPSCs ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5%2 सह 3 दिनों के लिए, दिन-1 पर माध्यम बदलने के लिए इनक्यूबेट ।

2. PSM विभेदन और प्रतिदीप्ति द्वारा आइसोलेशन-सक्रिय सेल छंटाई (FACS)

  1. PSM विभेदन (0 दिन-4 दिन)
    1. फीडर-मुक्त सेल संस्कृति मध्यम महाप्राण और PSM प्रेरण माध्यम के 8 मिलीलीटर जोड़ें (सीडीएम बेसल मध्यम पूरक 10 μM SB431542, 10 μM CHIR99021, 2 μM DMH1, और 20 एनजी/एमएल FGF2 के साथ, तालिका 1देखें) ।
      नोट: पीएसएम विभेदन की दीक्षा पर कोशिका संगम प्रेरण दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है । का प्रयोग करें माइक्रोस्कोपी संवर्ती अनुपात की पुष्टि के लिए लगभग 30% है ।
    2. 5% CO2, 4 दिनों के लिए, 3 दिन पर मध्यम बदलने के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेने ।
    3. 4 दिन पर FACS के लिए हार्वेस्ट सेल (धारा २.२, नीचे) ।
  2. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS) द्वारा DLL1 धनात्मक पीएसएम कोशिकाओं का पृथक्करण
    नोट:     नीचे DLL1 सकारात्मक कोशिकाओं की छंटाई FACS से पहले सेल तैयारी के लिए एक प्रक्रिया है । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर छंटाई FACS प्रदर्शन ।
    1. मध्यम महाप्राण, तो PBS के साथ धोने । बाद में, सेल वियोजन अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें और आरटी में 3 मिनट के लिए छोड़ दें ।
    2. सीडीएम बेसल मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें, एक खुरपका का उपयोग कर कोशिकाओं परिमार्जन, और उंहें एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा ।
    3. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या की गणना, तो 3 मिनट के लिए २८० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र ।
    4. सावधानीपूर्वक supernatant को आकांक्षा द्वारा निकालें और FACS बफ़र में कक्षों को पुन: निलंबित करें ( तालिका 1देखें) १.० x 107 कक्षों/एमएल की एकाग्रता पर । एक नकारात्मक नियंत्रण नमूने के लिए (isotype नियंत्रण, या एंटीबॉडी के बिना कन्वेंशन में), एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ५० μL हस्तांतरण और फिर ४५० μL FACS बफ़र के साथ निलंबित ।
    5. 1/200 के अनुपात में DLL1 एंटीबॉडी ( सामग्री तालिकादेखें) जोड़ें । प्रकाश से ट्यूब की रक्षा और 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के लिए ।
    6. 3 मिनट के लिए २८० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    7. सावधानीपूर्वक महाप्राण और FACS बफर में resuspend (१.० x 107 सेल/एमएल) 1 मिलीग्राम/एमएल dapi के साथ पूरक.
    8. एक संग्रह ट्यूब, छानने के लिए टोपी में एक ३५ μm नायलॉन जाल के साथ शामिल में स्थानांतरण, तो जब तक छंटाई पूरा हो गया है बर्फ पर ट्यूब जगह है । नकारात्मक नियंत्रण नमूना (चरण 2.2.4) के साथ एक ही कार्यविधि निष्पादित करें ।
    9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर छंटाई करते हैं ।
    10. छांटे DLL1 सकारात्मक कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में लीजिए, जिसमें सीडीएम बेसल मीडियम के 4 मिलीलीटर Y27632 के 10 μM के साथ पूरक हैं । कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए, 3 मिनट के लिए २८० एक्स जी पर अपकेंद्रित्र फिर आरएनए lysis बफर और दुकान में-30 डिग्री सेल्सियस पर resuspend । अधिक विस्तृत जानकारी के लिए आरएनए निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और RT-qPCR प्रक्रियाओं (धारा ५.१) देखें ।
    11. नीचे दिए गए प्रोटोकॉल (धारा 3) के अनुसार छांटे गए कक्षों का उपयोग करते हुए SM विभेदन करें ।

3. एसएम से भेदभाव PSM

  1. SM विभेदन से हल DLL1 सकारात्मक PSM कोशिकाओं (4 दिन-8 दिन)
    नोटः     FACS सॉर्टिंग से पहले ईसीएम सॉल्यूशन-कोटेड 12-वेल प्लेट्स को दिन में तैयार करें । एक ECM समाधान-लेपित 12-कूप प्लेट तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर ईटीएम समाधान जोड़ें और रातोंरात छोड़ दें । तैयारी करते समय ईसीएम सॉल्यूशन को बर्फ पर रखें ।
    1. नीचे दिए गए कदम 2.2.10, 3 मिनट के लिए २८० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    2. ध्यान से supernatant और resuspend एएसएम प्रेरण माध्यम के 1 मिलीलीटर में (सीडीएम बेसल मध्यम पूरक 10 μM SB431542 और 5 μM CHIR99021 के साथ, तालिका 1देखें) ।
    3. किसी स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की संख्या गिनना ।
    4. बीज १.० एक्स 105 कोशिकाओं के प्रत्येक पर अच्छी तरह से ecm समाधान-लेपित 12-अच्छी प्लेटों के साथ SM प्रेरण मध्यम के 1 मिलीलीटर युक्त 10 Μm Y27632 के साथ ।
    5. 8 दिन तक 4 दिनों के लिए 5% CO2 के साथ ३७ ° c पर इनक्यूबेट । 5 दिन (FACS छंटाई के बाद दिन) और 7 दिन पर नहीं Y27632 युक्त माध्यम बदलें ।
    6. नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार प्रेरित SM कोशिकाओं का उपयोग कर एसएम डेरिवेटिव विभेदन प्रदर्शन । प्रेरित एसएम कोशिकाओं से कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में २८० x g पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा, तो आरएनए lysis बफर और दुकान में-30 डिग्री सेल्सियस पर resuspend ।

4. एसएम डेरिवेटिव (डीएम, MYO, डी, SCL, SYN) SM से भेदभाव

नोट: SM कोशिकाओं की पूर्ण क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, पहले डीएम (dermomyotome) और SCL (स्कलेरटोम) प्रेरण तदनुसार iPSC-प्राप्त SM कोशिकाओं का उपयोग कर । बाद में, माइओ (myotome) और डी (dermatome) प्रेरण डीएम कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, और संचालन SYN (syndetome) प्रेरण SCL कोशिकाओं का उपयोग कर । नीचे विट्रो में प्रेरित एसएम कोशिकाओं से प्रत्येक व्युत्पंन (डीएम, MYO, डी, SCL, और SYN) के प्रेरण के लिए प्रोटोकॉल हैं ।

  1. डीएम अंतर SM कोशिकाओं से (8 दिन-11 दिन)
    1. मध्यम महाप्राण, तो डीएम प्रेरण मध्यम (सीडीएम बेसल मध्यम के साथ पूरक 5 μM CHIR99021 और 10 एनजी/एमएल BMP4, तालिका 1देखें) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. 5% CO2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते, 11 दिन तक 3 दिनों के लिए । 10 दिन (डीएम प्रेरण के दिन 2) पर माध्यम बदलें ।
    3. MYO और D विभेदन नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार प्रेरित डीएम कोशिकाओं का उपयोग करते हैं ।
  2. डीएम कोशिकाओं से MYO विभेदन (11 दिन-४१ दिन)
    1. मध्यम महाप्राण, तो MYO प्रेरण मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें (सीडीएम बेसल मध्यम पूरक 5 μM CHIR99021 के साथ, तालिका 1देखें) ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते, 5% CO2के साथ, 30 दिन के लिए ४१ दिन तक । हर 3 दिन में माध्यम बदलें ।
  3. डी डीएम कोशिकाओं से विभेदन (11 दिन-20 दिन)
    1. मध्यम महाप्राण, तो D प्रेरण मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें (सीडीएम बेसल मध्यम पूरक 5 μM CHIR99021 और 10 एनजी/एमएल BMP4 के साथ, तालिका 1देखें) ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते, 5% CO2के साथ, 9 दिनों के लिए 20 दिन तक । हर 3 दिन में माध्यम बदलें ।
  4. SCL SM कोशिकाओं से भिंनता (8 दिन-11 दिन)
    1. महाप्राण माध्यम, तो SCL प्रेरण मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें (सीडीएम बेसल मध्यम १०० एनएम शिथिलता और ०.६ μM LDN193189 के साथ पूरक, सारणी 1देखें)14।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते, 5%2CO के साथ, 3 दिनों के लिए । 10 दिन (SCL प्रेरण के दिन 2) पर मध्यम बदलें ।
    3. नीचे दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार प्रेरित SCL कोशिकाओं का उपयोग कर SYN विभेदन करते हैं ।
  5. एससीएल कोशिकाओं से SYN विभेदन (11 दिन-३२ दिन)
    नोट:     ईसीएम समाधान-लेपित 24-कूप प्लेटों के दिन SYN प्रेरण शुरू करने से पहले तैयार । एक ECM समाधान-लेपित 24-कूप प्लेट तैयार करने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अच्छी तरह से में ECM समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और रातोंरात छोड़ दें । तैयारी करते समय ईसीएम सॉल्यूशन को बर्फ पर रखें ।
    1. महाप्राण इसके बाद PBS के साथ धोने, तो एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल वियोजन अभिकर्मक के ०.२ मिलीलीटर जोड़ने और आरटी में 3 मिनट के लिए छोड़ दें ।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से कुरेदना और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए CDM बेसल मध्यम के ०.८ मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. 3 मिनट के लिए २८० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    4. ध्यान से supernatant और resuspend के 1 मिलीलीटर में SYN प्रेरण माध्यम-1 (सीडीएम बेसल मध्यम 20 एनजी/एमएल FGF8 के साथ पूरक, तालिका 1देखें), तो एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की संख्या की गणना ।
    5. बीज ५.० एक्स 104 कोशिकाओं के प्रत्येक में अच्छी तरह से ecm समाधान-लेपित 24-कूप प्लेटों की 1 एमएल युक्त SYN प्रेरण माध्यम-1 ।
    6. 5% CO2, 3 दिनों के लिए के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    7. 14 दिन (SYN प्रेरण के 3 दिन), के माध्यम से की जगह SYN प्रेरण मध्यम-2 (सीडीएम बेसल मध्यम 10 एनजी/एमएल BMP7 और 10 एनजी/एमएल TGFβ3 के साथ पूरक, तालिका 1देखें) ।
    8. ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% CO2के साथ, 18 दिनों के लिए ३२ दिन तक । हर 3 दिन में माध्यम बदलें ।

5. iPSC-व्युत्पन्न उत्पादों के लक्षण वर्णन

नोट: भिंनता पर, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर मानव ipscs डेरिवेटिव विशेषताएं (आरटी-qpcr), immunocytochemistry (आईसीसी), एंजाइम से जुड़े immunosorbent assays हैं (एलिसा), और यांत्रिक खिंचाव उत्तेजना assays हैं, तदनुसार ।

  1. सेल हार्वेस्ट, कुल आरएनए निष्कर्षण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (आरटी-qPCR) विश्लेषण
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सेल नमूने (प्रक्रियाओं 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) ले लीजिए, तो 3 मिनट के लिए २८० एक्स जी पर केंद्रागत्र ।
    2. Supernatant निकालें, तो एक उचित कुल आरएनए निष्कर्षण किट द्वारा प्रदान की गई आरएनए lysis बफर, ३५० μL में resuspend ।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किट का उपयोग करके टोटल आरएनए निकालें ।
    4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, कुल आर. एन. ए. के अलग 1 माइक्रोग्राम को सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसिप करें ।
    5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त एंजाइमों, अभिकर्मकों और प्राइमर्स का उपयोग करके RT-qPCR निष्पादित करें । इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमर दृश्यों को सारणी 2में सूचीबद्ध किया गया है ।
  2. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री (आईसीसी)
    1. एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रदर्शन करने से पहले, 2% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें, और PBS के साथ दो बार धोएं ।
    2. Permeabilization के लिए, ०.२% मेथनॉल या ०.२% polysorbate 20 के साथ सेबेट (बाद में PBS-टी के रूप में संदर्भित) 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ।
    3. Permeabilization अभिकर्मकों निकालें और एक उपयुक्त ब्लॉकिंग बफर के साथ कक्षों का इलाज या 1% गोजातीय सीरम albumin/PBS 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए.
    4. 4 में एक मिलाते हुए मशीन पर पीबीएस-टी और जगह में 10% ब्लॉकिंग बफर के साथ पहली एंटीबॉडी पतला जोड़ें ° c रातोंरात ।
    5. PBS-T (आर टी में मिलाते हुए मशीन पर 10 मिनट के लिए पीबीएस-टी और जगह जोड़ें) के साथ तीन बार धो लें ।
    6. दूसरी एंटीबॉडी जोड़ें, 10% से पतला PBS-T और जगह में मिलाते हुए मशीन पर ६० मिनट के लिए आर टी में ब्लॉकिंग बफर । आईसीसी के लिए पहली और दूसरी एंटीबॉडी इस अध्ययन में इस्तेमाल की गई तालिका 3में सूचीबद्ध हैं ।
      नोट: इस कदम से आगे की थाली/डिश को पन्नी में लपेटकर प्रकाश से सुरक्षित रखें ।
    7. पीबीएस-टी से दो बार धोएं ।
    8. काउंटर धुंधला के लिए, जोड़ने 1/5000 DAPI 5 मिनट के लिए आर टी पर मिलाते हुए मशीन पर PBS और जगह के साथ पतला ।
    9. DAPI समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से PBS जोड़ें ।
    10. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिका अभिरंजक का प्रेक्षण कीजिए । वैकल्पिक रूप से, प्लेट/डिश को 1 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित करें ।
  3. IPSC-व्युत्पंन डी के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एंजाइम से जुड़े Immunosorbent परख (ELISA)
    नोट:     मानव चमड़े का फाइकोब्लास्ट कोशिकाओं (HDF) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । संस्कृति HDF DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ( तालिका 1देखें) ।
    1. बीज १.० x 10 iPSC के5 कोशिकाओं-डी और hdf व्युत्पंन 24 पर अच्छी तरह से प्रत्येक संस्कृति माध्यम से 1 मिलीलीटर युक्त प्लेटों (डी: डी प्रेरण माध्यम, HDF: dmem 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक) ।
    2. सेल कल्टरिंग के 3 दिनों के बाद, प्रत्येक माध्यम के १०० μL एकत्रित करें, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में रखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
    3. प्रक्रियाओं की श्रृंखला, जैसे कि पता लगाने एंटीबॉडी और द्वितीयक एंटीबॉडी के अलावा, निर्माता के अनुदेश के अनुसार प्रदर्शन, और नियंत्रण की एकाग्रता के खिलाफ एक मानक वक्र पैदा करके लक्ष्यों की संख्या मात्रा ठहराना विश्लेषण नमूने ।
  4. यांत्रिक खिंचाव उत्तेजना iPSC-व्युत्पंन SYN के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए परख
    नोट:     वयस्क मानव tenocytes व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ( सामग्री की तालिकादेखें) । संस्कृति मानव ipsc-एक सेल पर SYN और वयस्क मानव tenocytes व्युत्पंन यांत्रिक खिंचाव उत्तेजना परख के लिए डिवाइस खींच के रूप में18,19के नीचे वर्णित है । का प्रयोग करें syn प्रेरण मध्यम-2 और tenocytes विकास माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक ipsc-व्युत्पंन SYN और वयस्क मानव tenocytes, क्रमशः के लिए एक संवर्धन माध्यम के रूप में ।
    1. 24 h खींच से पहले, प्लेट १.० x 105 कोशिकाओं के ipsc-व्युत्पन्न और मानव tenocytes पर ecm समाधान लेपित बहु प्रकार सिलिकॉन रबर कक्षों, प्रत्येक १.५ सेमी x १.५ सेमी की एक संस्कृति की सतह के साथ ( सामग्री तालिकादेखें).
    2. सेल खींच के लिए डिवाइस पर कक्षों सेट, और बल मोनोएक्सल चक्रीय तनाव (०.५ हर्ट्ज, 5%) 12 ज के लिए ।
    3. कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए, आरएनए lysis बफर के ३५० μL जोड़ें, तो परिमार्जन और कुल शाही सेना निष्कर्षण और क्रमिक आरटी-qPCR विश्लेषण के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा (प्रक्रिया ५.१ देखें) ।

Representative Results

इस रिपोर्ट में सभी आंकड़े 201b7-PAX3-gfp ipscs के साथ प्राप्त किए गए थे, जिसमें egfp एक विकल्पी के PAX3 कोडिंग अनुक्रम को एक्ट्रेस 1 में बदलता है । 201B7-PAX3-GFP iPSCs की स्थापना का वर्णन अन्यत्र किया जाएगा (ज. सकुराई, व्यक्तिगत संचार) । सांख्यिकीय महत्व को सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर के उपयोग से मूल्यांकित किया गया था । P-मान ०.०५ से कम महत्वपूर्ण माने गए थे ।

मानव iPSC के लक्षण वर्णन-PSM और एसएम कोशिकाओं व्युत्पंन
पीएसएम राज्य के माध्यम से एसएम की ओर मानव iPSCs के अंतर का आकलन करने के लिए (चित्रा 2a), facs विश्लेषण, आईसीसी विश्लेषण, और आरटी-qpcr विश्लेषण किया गया । के रूप में चित्र 2bमें दिखाया गया है, कोशिकाओं के ८५% से अधिक DLL1, psm के एक मार्कर के लिए सकारात्मक थे, लेकिन PAX3, एसएम के एक मार्कर के लिए नकारात्मक, मानव ipscs के साथ psm प्रेरण के 4 दिनों के बाद । बाद में, यह जनसंख्या SM प्रेरण के 4 दिनों के बाद PAX3 सकारात्मक SM कोशिकाओं बन गया । PSM-SM संक्रमण की पुष्टि ICC (चित्र 2c) और RT-Qpcr (चित्र 2d) द्वारा भी की गई थी । TBX6, MSGN1, और WNT3A, PSM मार्कर PSM राज्य में व्यक्त किए गए (4 दिन), लेकिन SM राज्य में व्यक्त नहीं (8 दिन) । PARAXIS, MEOX1, और PAX3, SM मार्कर, एसएम में व्यक्त किए गए, लेकिन PSM में व्यक्त नहीं किया गया । इसके अलावा, CDH11 के धुंधला, उपकला SM का एक मार्कर, केवल कक्ष-कोशिका जंक्शन पर संचित, CHIR99021 के साथ SB431542 के अतिरिक्त निंनलिखित (चित्र 2E) ।

मानव iPSC-प्राप्त SM कोशिकाओं से प्रेरित एसएम डेरिवेटिव के लक्षण वर्णन
मानव iPSC-व्युत्पंन एसएम की भिंनता शक्ति का मूल्यांकन, डीएम की ओर भिंनता, MYO, डी, SCL, और SYN (चित्रा 3a) आईसीसी विश्लेषण और PAX3 (gfp)-प्रतिदीप्ति द्वारा मूल्यांकन किया गया था । के रूप में चित्र 3बीमें दिखाया गया है, डीएम भेदभाव ALX4 और EN1 staining द्वारा पुष्टि की थी, और PAX3 (gfp)-प्रतिदीप्ति; MYO, MYOG, और मायोसिन भारी श्रृंखला (MHC) धुंधला द्वारा म्यो विभेदन की पुष्टि की गई; D विभेदन EN1 द्वारा पुष्टि की गई थी और PDGFRa धुंधला; SCL विभेदन PAX1 द्वारा पुष्टि की गई थी, PAX9, और NKX 3.2 धुंधला; और SYN विभेदन SCX, MKX, COL1A1, और COL1A2 staining द्वारा की पुष्टि की थी ।

प्रेरित डी और SYN के लक्षण वर्णन
1. iPSC-व्युत्पंन डी के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (ELISA)
मानव शरीर में, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के प्राथमिक कार्यों में से एक ऐसे कोलेजन और hyaluronic एसिड के रूप में extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रोटीन, छिपाना है कि त्वचा हाइड्रेट और मदद त्वचा संरचना को बनाए रखने । यह प्रदर्शित करने के लिए कि कोलेजन-प्रकार 1 और hyaluronic एसिड प्रोटीन की एक तुलनीय राशि ipsc के संस्कृति माध्यम-डी और hdf व्युत्पंन में स्रावित थे, elisa प्रदर्शन किया गया था, के रूप में चित्र 4aमें दिखाया गया है ।

2. यांत्रिक खिंचाव उत्तेजना iPSC के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए परख-SYN व्युत्पंन
के रूप में कई अध्ययनों से पहले ही सूचित किया है, यांत्रिक उत्तेजना से पहले और जन्म के बाद पट्टा विकास को प्रभावित करता है, और अग्रदूत कोशिकाओं से tenocytes के भेदभाव को बढ़ावा देता है18,19. इसलिए, यह सर्वविदित है कि यांत्रिक तनाव को अभिक्रियाशीलता tenocytes की विशेषताओं में से एक है । मानव iPSC-SYN व्युत्पन्न और मानव वयस्क tenocytes के तुलनीय जेट प्रदर्शित करने के लिए, एक यांत्रिक खिंचाव उत्तेजना परख के रूप में चित्र 4Bमें दिखाया प्रदर्शन किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: परिक्षीय मध्यजनस्तर के पदानुक्रमित विभेदन के योजनाबद्ध दृश्य. Presomitic मध्यजनस्तर एक कोशिका आबादी है कि transiently जल्दी भ्रूणोद्भव के दौरान उभर रहे है और विभाजन के लिए somites फार्म का है । सोमिटीज एक क्षणिक स्टेम सेल आबादी है जो कई प्रकार के कोशिका प्रकारों को जन्म देती है, जैसे कि स्कलेलटोम, डर्मोयोटोम, सिन्डेटाम, डर्माटोम, और मायोटाम कोशिकाएं, जो अंततः कण्डरा/स्नायु, अस्थि/उपास्थि, कंकाल की मांसपेशी और डर्मिस में अंतर करती हैं । कक्षों. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: FACS, आरटी-qPCR, और आईसीसी विश्लेषण मानव iPSC-PSM और SM व्युत्पंन । (क) पी एस एम के माध्यम से एसएम विभेदन के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध दृश्य । (ख) प्रतिनिधि डॉट DLL1 का प्लॉट और PAX3 (जीएफपी)-प्रतिदीप्ति पीएसएम प्रेरण और 4 दिन (आईपीएससी से 8 दिन) एसएम प्रेरण के 4 दिन । (ग) प्रतिनिधि इम्यूनोसाइटोकेमिकल छवियां और PAX3 (जीएफपी)-प्रतिदीप्ति पीएसएम प्रेरण और 4 दिन (आईपीएससी से 8 दिन) एसएम प्रेरण के 4 दिन । प्रतिदीप्ति (हरा)-कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग थे TBX6, पैराअक्ष, और MEOX1 एंटीबॉडी (लाल) और सह DAPI के साथ दाग (नीला) या PAX3 (GFP) के साथ का पता लगाया । (घ) आईपीएससी, पीएसएम और एसएम में पीएसएम और एसएम के लिए मार्कर्स का आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण । प्रयोगों के तीन समुच्चयों से ± मानक त्रुटि (एसई) का अर्थ दर्शाया गया है । (ई) के दिन पर प्रतिनिधि immunocytochemical छवियों (8 दिवस आईएससी से) एसएम, सभ्य S10I10 में (SB431542 और IWR1, wnt संकेतन की एक निरोधक), S10 (SB431542), और S10C5 (SB431542 और CHIR99021 के संयोजन) की स्थिति का संयोजन । कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग थे CDH11 एंटीबॉडी (लाल) और सह के साथ दाग DAPI (नीला) । आईपीएस, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल; पीएसएम, presomitic mesoderm; एसएम, somite; S10, SB431542 10 μM; C5, CHIR99021 5 μM; आई10, IWR1 10 μM; स्केल पट्टियां = ५० μm । इस आंकड़े को नक्शामा एट अल (२०१८)15से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: आईसीसी डीएम, MYO, डी, SCL, और SYN मानव iPSC से विभेदित-SM व्युत्पंन का विश्लेषण । (क) एसएम डेरिवेटिव विभेदन के लिए प्रोटोकॉलों का योजनाबद्ध दृश्य । (ख) प्रतिनिधिक इम्यूनोसाइटोकेमिकल छवियां और PAX3 (जीएफपी)-प्रतिदीप्ति 3 दिन (ipsc से 11 दिन) डीएम प्रेरण के दिन 30 (ipsc से दिवस ४१) myo प्रेरण, 9 दिवस (ipsc से दिन 20) D प्रेरण की, दिन 3 (ipsc से दिन 11) SCL प्रेरण के, और 21 दिन (दिन ३२ आईएससी से) SYN प्रेरण की । डीएम, कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग थे ALX4 और EN1 एंटीबॉडी (लाल) और सह के साथ दाग DAPI (नीला) या PAX3 (GFP)-प्रतिदीप्ति (हरी) के साथ का पता लगाया; MYO, कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग थे MYO, MYOG (लाल), और MHC (सिअन) एंटीबॉडी, भी सह DAPI (नीला) के साथ दाग; डी, कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग थे EN1 (लाल) और PDGFRa (सिवन) एंटीबॉडी और सह के साथ दाग DAPI (नीला); SCL, कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग थे PAX1, PAX9, और NKX 3.2 (लाल) एंटीबॉडी, और सह के साथ दाग DAPI (नीला); SYN, कोशिकाओं विरोधी के साथ दाग-SCX थे, MKX, COL1A1, और COL1A2 (लाल) एंटीबॉडी, और सह के साथ दाग DAPI (नीला) । डीएम, dermomyotome; MYO, myotome; डी, त्वचीय; SCL, स्कलेलोटोम; SYN, syndetome; स्केल पट्टियां = ५० μm । इस आंकड़े को नक्शामा एट अल (२०१८)15से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रेरित डी और SYN के कार्यात्मक परख । (क) संस्कृति माध्यम में कोलेजन-टाइप-1 और hyaluronic एसिड प्रोटीन की मात्रा का विश्लेषण एलिसा द्वारा किया गया । (ख) आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा प्रेरित सिन और ह्यूमन एडल्ट टेनोसाइट्स पर यांत्रिक खिंचाव उद्दीपन के प्रभाव का आकलन किया गया था । प्रयोगों के तीन समुच्चयों से ± मानक त्रुटि (एसई) का अर्थ दर्शाया गया है । * पी < ०.०५; * * p < ०.०१; पी < ०.००१ द्वारा dunnett एकाधिक तुलना टी परीक्षण खिंचाव की तुलना में (-); एन एस, महत्वपूर्ण नहीं HDF, मानव वयस्क चमड़े का फाइकोब्लास्ट । इस आंकड़े को नक्शामा एट अल (२०१८)15से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

मध्यम/समाधान Reagant एकाग्रता
सीडीएम बेसल मध्यम है iscove संशोधित Dulbecco मध्यम/ 1:1
पेनिसिलिन/ ०.५%
रासायनिक परिभाषित लिपिड सांद्रण 1
एपीओ-transferrin 15 मिलीग्राम/एमएल
मोनोथीओग्लाइसेरॉल ४५० मिमी
गोजातीय सीरम ऐल्बूमिन 5 मिलीग्राम/एमएल
इंसुलिन 7 मिलीग्राम/एमएल
CTK समाधान पानी -
ट्रिपसिन ०.२५%
Collagenase चतुर्थ ०.१ मिलीग्राम/एमएल
कैल्शियम क्लोराइड 1 मिमी
नॉकआउट एसआर 20
डी प्रेरण माध्यम सीडीएम बेसल मध्यम -
CHIR99021 5 μM
BMP4 10 एनजी/एमएल
डीएम प्रेरण माध्यम सीडीएम बेसल मध्यम -
CHIR99021 5 μM
BMP4 10 एनजी/एमएल
ECM समाधान कृत्रिम कोशिकाबाह्य मैट्रिक्स ०.३ मिलीग्राम/एमएल
DMEM/F12 -
FACS बफर Pbs -
गोजातीय सीरम ऐल्बूमिन ०.१%
फीडर-नि: शुल्क सेल संस्कृति मध्यम mTeSR1 -
पेनिसिलिन/ ०.५%
HDF संस्कृति मध्यम DMEM -
भ्रूण गोजातीय सीरम 10
हेसी माध्यम रहनुमा ES सेल मध्यम -
पेनिसिलिन/ ०.५%
FGF2 4 एनजी/एमएल
माइयो प्रेरण माध्यम सीडीएम बेसल मध्यम -
CHIR99021 5 μM
पीएसएम प्रेरण माध्यम सीडीएम बेसल मध्यम -
SB431542 10 μM
CHIR99021 10 μM
DMH1 2 μM
FGF2 20 एनजी/एमएल
एससीएल प्रेरण माध्यम सीडीएम बेसल मध्यम -
शिथिलता १०० एनएम
LDN193189 ०.६ μM
एसएम प्रेरण माध्यम सीडीएम बेसल मध्यम -
SB431542 10 μM
CHIR99021 5 μM
SYN प्रेरण माध्यम-1 सीडीएम बेसल मध्यम -
FGF8 20 एनजी/एमएल
SYN प्रेरण माध्यम-2 सीडीएम बेसल मध्यम -
BMP7 10 एनजी/एमएल
TGFβ3 10 एनजी/एमएल

तालिका 1: मीडिया और समाधान रेसिपी ।

नाम आगे उल्टा
एसीटीबी कैच्चॉग्काटगाग्गटीसी AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
COL1A1 GGACAGGTTTCAGTGGT GCACCATCATTTCCACGAGC
MEOX1 गट्टेग्ग्टकक्टकेग्ग्गा गट्टुग्गग्जीग्ग्गा
MSGN1 GGAGAAGCTCAGGATGAGGA GTCTGTGAGTTCCGATGT
पैराअक्ष TCCTGGAGCTGTGAGGAT CACACCCTGTCACCAACAGT
PAX3 एगगाग्गागाग CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG
Scx सीसीसीएएगाटसीटीजीसीएसीटीसी GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC
TBX6 AGCCTGTGTCTTTCCATCGT एग्जीसीटीटीसीएग्गाटगॉट
टीएनएमडी CCCTTCATGCTGAAGCCACTT CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG
WNT3A CAAGATTGGCATCCAGGAGT ATGAGCGTCACTGCAAAG

तालिका 2: आरटी-qPCR विश्लेषण के लिए प्राइमर दृश्यों ।

एकाग्रता
प्रथम
एंटीबॉडी		 ALX4_Goat 1/50
CDH11_Mouse 1/1000
COL1A1_Rabbit 1/100
COL2A1_Mouse 1-2 μg/एमएल
EN1_Rabbit 1/50
MEOX1_Rabbit 1/50
MHC_Rabbit 1/200
MKX_Rabbit 1/50
MYOD_Rabbit 1/500
MYOG_Mouse 1/400
NKX 3.2 _ Rabbit 1/50
PARAXIS_Rabbit 1/50
PAX1_Rabbit 1/50
PAX9_Rabbit 1/50
PDGFRa_Goat 1/100
SCX_Rabbit 1/50
TBX6_Goat 1/50
2
एंटीबॉडी		 गधा विरोधी बकरी IgG (एच + एल) माध्यमिक antibody555 1/500
गधा विरोधी बकरी IgG (एच + एल) माध्यमिक antibody647 1/500
बकरी विरोधी माउस IgG (एच + एल) माध्यमिक antibody555 1/500
बकरी विरोधी खरगोश IgG (एच + एल) माध्यमिक antibody555 1/500
बकरी विरोधी खरगोश IgG (एच + एल) माध्यमिक antibody647 1/500

3 तालिका: आईसीसी के लिए पहली और दूसरी एंटीबॉडी ।

Discussion

पीएसएम के माध्यम से पीएससी-व्युत्पन्न एसएम को शामिल करने की एक सुविदित विधि पीएससी से पीएसएम प्रेरण के दौरान CHIR99021 + A83-01 (TGFβ inhibitor) का संयोजन है, लेकिन पीएसएम परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान नहीं। वर्तमान अध्ययन में, WNT/बीटा-catenin संकेतन को C59 का उपयोग करके PSM से SM को प्रेरित करने में हिचकते थे । हालांकि, हम CHIR99021 का उपयोग शुरू करने के लिए SM भिंनता के दौरान WNT मार्ग को सक्रिय करें । यह निर्णय इस निष्कर्ष पर आधारित था कि कई WNTs एसएम के आसपास के ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं और इस तथ्य को देखते हुए कि डब्ल्यूएनटी रिपोर्टर्स एसएम20में सक्रिय हैं । एक परिणाम के रूप में, हम CHIR99021 के साथ शर्त के तहत, केवल सेल-सेल जंक्शनों में CDH11 के संचय पर आधारित, vivo में SM की एक विशेषता उपकला, मनाया (चित्रा 2E) । यह प्रेक्षण पीएसएम विभेदन और एसएम उपकला के दौरान डब्ल्यूएनटी संकेतन की महत्वपूर्ण भागीदारी को इंगित करता है, इसलिए हमारा प्रोटोकॉल अंतर्जात संकेतन वातावरण को बेहतर रूप से पुनर्ग्रहण कर सकता है । हालांकि, यह भी भेदभाव के दौरान WNT/बीटा-catenin संकेतन मार्ग ट्यूनिंग ठीक की एक और संभावना का तात्पर्य है, क्योंकि मजबूती और भेदभाव की क्षमता काफी सेल प्रकार, सेल लाइनों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, और विभिन्न प्रत्येक शोधकर्ता द्वारा इस्तेमाल किए जाने वाले WNT-inducers के रासायनिक यौगिकों ।

इस विधि भी हम सभी चार SM डेरिवेटिव, MYO, डी, SCL, और SYN, मानव iPSCs से उत्पंन करने के लिए अनुमति देता है । हमारे पदश: प्रोटोकॉल cdm का उपयोग कर मानव somitogenesis के दौरान संकेतन आवश्यकताओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता/ उदाहरण के लिए, हमारे तरीकों विभाजन घड़ी तंत्र का अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकता है, एक आणविक दोलन प्रणाली है कि एसएम के गठन को नियंत्रित करता है । यह अच्छी तरह से चूहों, लड़कियों, और zebrafish में जांच की गई है, लेकिन उचित प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी के कारण मनुष्यों में नहीं ।

इसके अलावा, हमारी विधि भविष्य नैदानिक कोशिका आधारित चिकित्सा के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, मानव iPSC-डी या SYN व्युत्पंन गंभीर रूप से घायल त्वचा या उत्थान और उपचार के लिए उठी tendons में प्रत्यारोपित किया जा सकता है । हालांकि, इस विधि व्यावहारिक रूप से लागू किया जा सकता से पहले कई सीमाएं हल करने की आवश्यकता है । हालांकि वर्तमान अध्ययन में, हम ipsc रखरखाव और ecm समाधान है, जो engelbreth से निकाला जाता है के लिए SNL फीडर कोशिकाओं का इस्तेमाल किया-holm-झुंड माउस सारकोमा, प्रेरण के दौरान पकवान पर एक सतह कोट के रूप में, इन गैर मानव पशु व्युत्पंन अभिकर्मकों होना चाहिए नैदानिक गुणवत्ता में सुधार करने के लिए हटा दिया । इसके अलावा, सेल मात्रा और गुणवत्ता, जो शुद्धता और वांछित कोशिकाओं की परिपक्वता शामिल है, भी सुधार किया जाना चाहिए । इसके अलावा, न केवल सेल संख्या लेकिन यह भी कोशिका शक्ति कण्डरा के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है/ इसके अतिरिक्त, शुद्धि के लिए सतह मार्कर और 3 डी पुनर्गठन के लिए एक उपंयास विधि के विकास के लिए नैदानिक सेल आधारित चिकित्सा के लिए हमारे प्रोटोकॉल अग्रिम करने के लिए अपरिहार्य हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । परियोजना प्रशासन और धन अधिग्रहण के साथ उनकी मदद के लिए, श्री मित्सुकी Shibata (cira) और सुश्री मेई Terashima (सीआईआरए) उनकी तकनीकी सहायता के लिए, डॉ Yayoi Toguchida (सीआईआरए) और डॉ दैसूक कामिया (cira) के लिए जून्या Toguchida पांडुलिपि के अपने प्रूफरीडिंग, और श्री मकाया Todani (CiRA) एक उदाहरण प्रदान करने के लिए (चित्रा 1) । हम भी इस अध्ययन के दौरान उनके समर्थन के लिए Ikeya और Toguchida प्रयोगशालाओं (CiRA) के सभी सदस्यों को धन्यवाद. यह काम जापान सोसायटी (JSPS) (२६६७०६६१), असभ्य रोगों अनुसंधान के लिए कार्यक्रम जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी से रोग विशिष्ट आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करने से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता द्वारा समर्थित किया गया था एजेंसी (JST) और चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी (AMED), प्रमुख पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क के आईपीएस सेल अनुसंधान के लिए केंद्र (JST/ जुन्या तोगुचिडा) । Makoto Ikeya भी सहायता अनुदान द्वारा वैज्ञानिक अनुसंधान (JSPS) (16H05447) और असभ्य रोगों अनुसंधान के लिए रोग विशिष्ट आईपी कोशिकाओं (AMED) का उपयोग करने के लिए त्वरण कार्यक्रम के लिए समर्थन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ALX4_Goat antibody Santacruz sc-22066
Apo-transferrin Sigma T1147
BMP4 R&D 314-BP-010
BMP7 R&D 354-BP-010
Bovine serum albumin Sigma A8806
Calcium chloride Nacalai tesque 067730-15
CDH11_Mouse antibody Cell signaling 13577
Cell streching device Strex STB-140
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905-031
CHIR99021 Axon 1386
COL1A1_Rabbit antibody Abcam ab34710
COL2A1_Mouse antibody Thermo scientific MS-235
Collagenase IV Thermofisher 17104019
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody R&D FAB1818A For FACS
DMEM Sigma D6046
DMEM/F12 Gibco 11320-082
DMH1 Tocris 4126
EN1_Rabbit antibody Abcam ab70993
Fetal bovine serum Nichirei 171012
FGF2 Wako 060-04543
FGF8 Peprotech 100-25
Human dermal fibroblast Cell applications 160-05a
Human tenocyte Angio proteomie cAP-0041
Insulin Wako 090-06474
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 Gibco 21056023
Knockout SR Gibco 10828028
LDN193189 Axon 1509
Matrigel BD bioscience 354230 Artificial extracellular matrix
MEOX1_Rabbit antibody Abcam ab75895
MHC_Rabbit antibody Santacruz sc-20641
MKX_Rabbit antibody Atlas antibodies A83377
Monothioglycerol Sigma M6145
mTeSR1 Stemcell tech 85850
Multi well-type silicon rubber chamber Strex STB-CH-4W
MYOD_Rabbit antibody Abcam ab133627
MYOG_Mouse antibody Santacruz sc-12732
NKX3.2_Rabbit antibody Sigma HPA027564
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 Invitrogen A21432
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 Invitrogen A21447
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 Invitrogen A21422
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 Invitrogen A21428
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 Invitrogen A21245
PARAXIS_Rabbit antibody Santacruz sc-98796
PAX1_Rabbit antibody Abcam ab95227
PAX9_Rabbit antibody Gene tex GTX104454
PBS - -
PDGFRa_Goat R&D AF307
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Primate ES cell medium Reprocell RCHEMD001
SAG Calbiochem 566661
SB431542 Selleckchem SEL-S1067-10
SCX_Rabbit antibody Abcam ab58655
TBX6_Goat antibody R&D AF4744
Tendon cell growth medium Angio-proteomie cAP-40 Tenocytes growth medium
TGFβ3 R&D 243-B3-200
Trypsin Gibco 15090046

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान मुद्दा १४६ प्रेरित pluripotent स्टेम सेल विभेदन पैराअक्षीय mesoderm somite myotome स्कलेरोटोम त्वचीय syndetome
मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में
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Nakajima, T., Sakurai, H., Ikeya, M. … More

Nakajima, T., Sakurai, H., Ikeya, M. In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59359, doi:10.3791/59359 (2019).

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