Summary
Vi presenterar här ett protokoll för differentiering av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller i varje somite derivat (myotome, sclerotome, Dermatom och syndetome) i kemiskt definierade förhållanden, som har tillämpningar inom framtida sjukdom modellering och cellbaserade terapier i ortopedisk kirurgi.
Abstract
Svar till signaler såsom WNTs bone morphogenetic proteiner (bmp), och sonic hedgehog (SHH) utsöndras från omgivande vävnader, thoraxsegmenten (SMs) ge upphov till flera celltyper, inklusive myotome (MYO), sclerotome (SCL), Dermatom (D) och syndetome (SYN) , vilket i sin tur utvecklas till skelettmuskulaturen, axiella skelettet, dorsala dermis och axiell senor/ligament, respektive. Generering av SMs och deras derivat från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är därför avgörande för att erhålla pluripotenta stamceller (PSC) för tillämpning inom regenerativ medicin och Sjukdomforskning inom ortopedisk kirurgi. Även om induktion protokollen för MYO och SCL från PSC har tidigare rapporterats av flera forskare, har ingen studie ännu visat induktion av SYN och D från iPSCs. Effektiv induktion av fullt kompetenta SMs förblir därför en stor utmaning. Här, sammanfatta vi mänskliga SM mönster med mänskliga iPSCs in vitro-genom att härma signalering miljön under chick/mus SM utveckling och rapport om metoder för systematisk induktion av SM derivat (MYO, SCL, D och SYN) från mänskliga iPSCs under kemiskt definierade villkor genom presomitic mesoderm (PSM) och SM stater. Kunskap om chick/mus SM utveckling tillämpades till induktion av SMs med mänskliga iPSCs. Denna metod skulle kunna vara ett nytt verktyg för att studera mänskliga somitogenesis och mönstring utan användning av embryon och för cell-baserad terapi och sjukdom modellering.
Introduction
Utveckla en riktad differentiering metod för en önskad celltyp från PSC är ett nödvändigt steg för att omsätta studiet av PSC-derived celler i kliniska tillämpningar. Tvingad uttryck av viktiga gener är en lovande strategi för orgel-celldifferentiering från PSC och har förbättrat vår förståelse av den genetiska regleringen av cell öde bestämning, orgel morfogenes och organisation under embryogenes1. Dessutom anses går igenom de endogena signalering miljöer, med utvecklingen av mus och chick embryon som en färdplan, viktigt för riktad differentiering av PSC. Men är med tanke på tillämpningen av PSC-derived celler i kliniska studier såsom cellbaserade terapier, den sistnämnda strategin mer lämplig eftersom det inte kräver gen manipulation.
Flera studier har rapporterat induktion av mesoderm från människa och mus PSC i kemiskt definierade villkor. Vanligtvis, dessa metoder har förlitat sig på activin/nodal/omvandling tillväxtfaktor β (TGFβ) signalering och bone morphogenetic protein (BMP) signalering, tros utföra meso-endoderm och mesoderm differentiering, vilket resulterar i en låg induktion effektivitet det paraxiala mesoderm (ca 20%)2. Med andra ord, var PSC-derived mesoderm induceras av dessa signalvägar främst laterala plattan mesoderm och inte paraxiala mesoderm. Nyligen, några studier har visat effektiv produktion av PSC-derived paraxiala mesoderm baserat på olika strategier3,4,5,6,7,8 . I dessa studier PSC odlades med relativt höga koncentrationer av glykogen syntetas kinase 3 (GSK3)-hämmare (WNT signalering aktivatorer), följaktligen induktion effektivitet paraxiala mesoderm nådde 70% – 95%6,7 .
I somitogenesis, paraxiala mesoderm första bildar presomitic mesoderm (PSM) posteriort, och sedan thoraxsegmenten (SMs) i den främre delen genom mesenchyme-till-epitelial övergången9,10. Notch ligand Delta-liknande 1 (DLL1) är känd att ha en nyckelroll under somitogenesis, som oscillerande kontroll av DLL1 uttryck, både i mRNA och protein nivå reglerar SM segmentering. SMs så småningom dela upp i två delar, vilket ger upphov till dermomyotome (DM) dorsalt och sclerotome (SCL) ventralt11. Därefter DM gör åtskillnad mellan in i Dermatom (D), en föregångare av dermis och myotome (MYO), en föregångare av skelettmuskulaturen; Dessutom bildar en ventrala delen av SCL syndetome (SYN), en föregångare av senor och ligament12 (figur 1). Vissa forskare har rapporterat induktion av PSC-derived SM derivat såsom MYO4,13 och SCL14; men finns det flera begränsningar i dessa studier. Särskilt, eftersom vår kunskap om signalering miljöer av D och SYN är fragmentariska, har induktion protokoll för D och SYN ännu inte systematiskt fastställts. För att visa full-behörighet SMs inducerad från PSC, är det viktigt att visa flera differentieringen kapacitet av inducerad SMs till alla fyra derivat (D, MYO, SCL och SYN), medan tidigare studier har bara fokuserat på specifika SM derivat. Här rapporterar vi om hur du genererar alla fyra SM-derivat, inbegripet D och SYN, genom PSM och SM öden från iPSCs mänskliga15. Vi tror att upprätta en in vitro-stegvis metod att modeller som SM utvecklingsprocessen kan bidra till studiet av hur människans SM utvecklas under embryogenes, utan att använda embryon.
Protocol
Alla experimentella protokoll som omfattar mänskliga iPSCs godkändes av den etiska kommittén vid institutionen för medicin och Graduate School of Medicine, Kyoto University.
1. mänskliga iPSCs förberedelse före induktion
Obs: Kultur mänskliga iPSCs (201B7-PAX3-GFP) på SNL feeder celler16 med primate ES cell medium kompletteras med 4 ng/mL rekombinant humant basic fibroblast tillväxtfaktor (FGF2) och 0,5% penicillin och streptomycin (hädanefter som hESC medium, se (Se tabell 1). När når sammanflödet förhållandet 70% – 80%, passage cellerna som tidigare beskrivna17.
-
Passaging av mänskliga iPSCs på SNL feeder celler17
- För passaging, lägga till PBS i cell culturing skålen och skölj celler. Ta sedan bort PBS (, denna process kommer att vara hädanefter tvätta med PBS).
- Tillsätt 1 mL CTK lösning (se tabell 1) vid rumstemperatur (RT) och vänta tills SNL feeder cellerna börjar lossa från botten av skålen.
- Ta bort CTK lösningen och sedan tvätta två gånger med PBS.
- Tillsätt 1 mL av hESC medium (se tabell 1) i skålen, sedan skrapa cellerna med hjälp av en skrapa och samla in i en 15 mL koniska rör.
- Pipettera försiktigt innehållet fem gånger med en 1000 µL spets, och sedan överföra till en ny maträtt fylld med hESC medium. Använd ett split 1:4 till 1:10, beroende på confluencen förhållandet innan passaging. Också, variera volymen av hESC mellan beroende på omfattningen av skålen (t.ex. 3 mL för 6 cm fat, 8 mL för en 10 cm maträtt).
- Inkubera i mänskliga iPSCs vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ändra det medelstora vardagliga (förutom dagen efter passaging) och odla cellerna tills nästa passaging procedur.
-
Feeder-fritt odling av mänskliga iPSCs innan PSM induktion
Obs: för att minimera effekten av tillväxtfaktorer som utsöndras från SNL feeder celler, kultur den mänskliga iPSCs feeder-fria villkor med en feeder-fri cellodlingsmedium (se tabell 1) på extracellulär matrix (ECM) lösningar (se tabell 1) belagda maträtt i 3 dagar före PSM induktion.- Dag -4 (4 dagar före start PSM induktion)
- För att förbereda ECM lösningen-belagd skålen, tillsätt 4 mL av ECM-lösning på en 10 cm skålen vid 4 ° C över natten.
Obs: Placera ECM-lösning på is medan du förbereder.
- För att förbereda ECM lösningen-belagd skålen, tillsätt 4 mL av ECM-lösning på en 10 cm skålen vid 4 ° C över natten.
- Dag -3
- Ta först bort den ECM-lösningen från skålen och tillsätt 8 mL feeder-fri cellodlingsmedium.
- För att starta feeder-fritt odling, tvätta en gång med PBS att skölja de odlade cellerna.
- Tillsätt 1 mL CTK lösning på RT tills SNL feeder cellerna börjar lossa från botten av skålen.
Obs: Använda mikroskopi för att bekräfta alla matare celler är fristående från botten. - Ta bort CTK lösningen och tvätta med PBS två gånger, så att alla SNL feeder celler avlägsnas helt.
- Tillsätt 1 mL feeder-fri cellodlingsmedium i skålen, och sedan skrapa cellerna med hjälp av en skrapa och samla dem i en 15 mL koniska rör.
- Försiktigt Pipettera innehållet tre gånger med en 1000 µL spets, sedan överföra till en ny ECM lösningen-belagd 10 cm maträtt (beredd under steg 1.2.1). Använd en delningsfaktorn ungefär 1:2 till 1:4, beroende på confluencen förhållandet innan feeder-fritt odling.
- Inkubera i mänskliga iPSCs vid 37 ° C och 5% CO2 i 3 dagar, ändra mediet på dag -1.
- Dag -4 (4 dagar före start PSM induktion)
2. PSM differentiering och isolering av fluorescens-aktiverad Cell sortering (FACS)
-
PSM differentiering (dag 0 – dag 4)
- Aspirera på feeder-fri cellodlingsmedium och tillsätt 8 mL PSM induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 10 µM SB431542, 10 µM CHIR99021, 2 µM DMH1 och 20 ng/mL FGF2, se tabell 1).
Obs: Cell sammanflödet vid inledningen av PSM differentiering är kritisk för induktion effektivitet. Använda mikroskopi för att bekräfta konfluenta förhållandet är cirka 30%. - Inkubera cellerna vid 37 ° C, med 5% CO2, i 4 dagar, ändra mediet på dag 3.
- Skörden celler för FACS på dag 4 (avsnitt 2.2, nedan).
- Aspirera på feeder-fri cellodlingsmedium och tillsätt 8 mL PSM induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 10 µM SB431542, 10 µM CHIR99021, 2 µM DMH1 och 20 ng/mL FGF2, se tabell 1).
-
Isolering av DLL1 positiva PSM celler av fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS)
Obs: nedan är ett förfarande för cell förberedelser innan FACS sortering av DLL1 positiva celler. Utföra FACS sortering använder en flödescytometer, enligt tillverkarens protokollet.- Aspirera mediet och sedan tvätta med PBS. Därefter tillsätt 1 mL av cell dissociation reagens och låt verka i 3 minuter vid RT.
- Tillsätt 4 mL av CDM basala medium, skrapa cellerna med hjälp av en skrapa och samla dem i en 15 mL koniska rör.
- Räkna antalet celler med en automatisk cell räknare, sedan Centrifugera vid 280 x g i 3 min.
- Ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration och resuspendera cellerna i FACS buffert (se tabell 1) vid en koncentration på 1,0 x 107 celler/mL. För negativa kontrollprov (isotyp kontroll, eller i konventionen utan antikropp), överföra 50 µL i en 15 mL koniska rör och sedan avbryta med 450 µL av FACS buffert.
- Lägg till DLL1 antikropp (se Tabell för material) i förhållandet 1/200. Ljuskänsligt röret och hålla på is i 30 min.
- Centrifugera vid 280 x g under 3 minuter.
- Försiktigt aspirera supernatanten och återsuspendera i FACS buffert (1,0 x 107 celler/mL) kompletteras med 1 mg/mL DAPI.
- Överföring till en samling tube, införlivas med en 35 µm nylon mesh i hatten för filtrering, placera sedan tuben på is tills sortering är klar. Utför samma procedur med det negativa kontrollprovet (steg 2.2.4).
- Utföra sortering använder en flödescytometer enligt tillverkarens protokollet.
- Samla in de sorterade DLL1 positiva cellerna i en 15 mL koniska rör, som innehåller 4 mL CDM basala medium kompletteras med 10 µM av Y27632. För total RNA-extraktion, Centrifugera vid 280 x g i 3 min sedan Återsuspendera i RNA lyseringsbuffert och förvaras vid-30 ° C. Se RNA-extraktion, omvänd transkription och RT-qPCR förfaranden (se avsnitt 5.1) för mer detaljerad information.
- Utföra SM differentiering genom sorterade cellerna enligt de nedan protokoll (avsnitt 3).
3. SM differentiering från PSM
-
SM differentiering från sorterade DLL1 positiva PSM celler (dag 4 – dag 8)
Obs: förbereda ECM lösningen-belagd 12-väl plattorna dagen innan FACS sortering. Att förbereda en ECM lösningen-belagd 12-väl plattan, tillsätt 1 mL av ECM-lösning i varje brunn vid 4 ° C och lämna över natten. Förvara ECM lösningen på is medan du förbereder.- Följande steg 2.2.10, Centrifugera vid 280 x g i 3 min.
- Noggrant aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 mL SM induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 10 µM SB431542 och 5 µM CHIR99021, se tabell 1).
- Räkna antalet celler med en automatisk cell räknare.
- Utsäde 1,0 x 105 celler till varje brunn av ECM lösningen-belagd 12-väl pläterar innehållande 1 mL SM induktion medium kompletteras med 10 µM av Y27632.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 i 4 dagar till dag 8. Ändra det medium som inte innehåller Y27632 på dag 5 (dagen efter FACS sortering) och dag 7.
- Utföra SM derivat differentiering genom inducerad SM celler enligt protokollen nedan. För total RNA-extraktion från inducerade SM celler, samla in cellerna i ett 15-mL koniska rör och centrifugera vid 280 x g under 3 minuter, sedan Återsuspendera i RNA lyseringsbuffert och förvaras vid-30 ° C.
4. SM derivat (DM, MYO, D, SCL, SYN) differentiering från SM
Obs: För att visa full-behörighet SM celler, utför först DM (dermomyotome) och SCL (sclerotome) induktion med detta använda iPSC-derived SM celler. Därefter utför MYO (myotome) och D (Dermatom) induktion med DM cellerna och genomför SYN (syndetome) induktion använder SCL cellerna. Nedan finns protokollen för induktion av varje derivata (DM, MYO, D, SCL och SYN) från inducerade SM celler in vitro.
-
DM differentiering från SM celler (dag 8 – dag 11)
- Aspirera på medellång och tillsätt 1 mL av DM induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 5 µM CHIR99021 och 10 ng/mL BMP4, se tabell 1).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, med 5% CO2, i 3 dagar tills dag 11. Ändra mediet på dag 10 (dag 2 av DM induktion).
- Utföra MYO och D differentiering med inducerad DM celler enligt protokollen nedan.
-
MYO differentiering från DM celler (dag 11 – dag 41)
- Aspirera på medellång och tillsätt 1 mL av MYO induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 5 µM CHIR99021, se tabell 1).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, med 5% CO2, i 30 dagar till dag 41. Ändra mediet efter 3 dagar.
-
D differentiering från DM celler (dag 11 – dag 20)
- Aspirera på medellång och tillsätt 1 mL D induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 5 µM CHIR99021 och 10 ng/mL BMP4, se tabell 1).
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, med 5% CO2, för 9 dagar tills dag 20. Ändra mediet efter 3 dagar.
-
SCL differentiering från SM celler (dag 8 – dag 11)
- Aspirera på medellång och tillsätt 1 mL av SCL Induktion medium (CDM basala medium kompletteras med 100 nM SAG och 0,6 µM LDN193189, se tabell 1)14.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C, med 5% CO2, i 3 dagar. Ändra mediet på dag 10 (dag 2 av SCL Induktion).
- Utföra SYN differentiering genom inducerad SCL celler enligt protokoll nedan.
-
SYN differentiering från SCL celler (dag 11 – dag 32)
Obs: förbereda ECM lösningen-belagd 24-väl plattorna dagen innan SYN induktion. Att förbereda en ECM lösningen-belagd 24-väl plattan, tillsätt 0,5 mL av ECM-lösning i varje brunn vid 4 ° C och lämna över natten. Förvara ECM lösningen på is medan du förbereder.- Aspirera på medellång och sedan tvätta med PBS, sedan Tillsätt 0,2 mL cell dissociation reagensmedel till varje brunn och lämna för 3 min vid RT.
- Tillsätt 0,8 mL CDM basala medium till varje brunn och sedan skrapa och samla in alla celler i en 15 mL koniska rör.
- Centrifugera vid 280 x g under 3 minuter.
- Noggrant aspirera supernatanten och återsuspendera i 1 mL SYN induktion medium-1 (CDM basala medium kompletteras med 20 ng/mL FGF8, se tabell 1), sedan räkna antalet celler med en automatisk cell räknare.
- Utsäde 5.0 x 104 celler i varje brunn av ECM lösningen-belagd 24-väl pläterar innehållande 1 mL SYN induktion medium-1.
- Inkubera vid 37 ° C, med 5% CO2, i 3 dagar.
- På dag 14 (dag 3 av SYN induktion), ersätta mediet med SYN induktion medium-2 (CDM basala medium kompletteras med 10 ng/mL BMP7 och 10 ng/mL TGFβ3, se tabell 1).
- Inkubera vid 37 ° C, med 5% CO2, i 18 dagar tills dag 32. Ändra mediet efter 3 dagar.
5. karakterisering av iPSC-härledda produkter
Obs: Vid differentiering, prägla människors iPSCs derivat med kvantitativ realtids-PCR (RT-qPCR), immuncytokemi (ICC), enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) och mekanisk stretch stimulering analyser, med detta.
-
Cellen skörd, totalt RNA-extraktion, omvänd transkription och kvantitativ realtids PCR (RT-qPCR) analys
- Samla cell proverna (förfaranden 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) i ett 1,5 mL rör och centrifugera vid 280 x g i 3 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera i 350 μl lyseringsbuffert RNA, som tillhandahålls av ett lämpligt totala RNA extraktion kit.
- Extrahera total-RNA med hjälp av kit enligt tillverkarens protokollet.
- Omvänd transkribera den isolerade 1 µg totalt RNA till cDNA, enligt tillverkarens protokollet.
- Utföra RT-qPCR med lämpliga enzymer, reagenser och primers enligt tillverkarens protokollet. De primer-sekvenser som används i denna studie visas i tabell 2.
-
Immuncytokemi (ICC)
- Innan du utför immuncytokemi med antikroppar, fixa cellerna med 2% paraformaldehyd vid 4 ° C i 10 min och tvätta två gånger med PBS.
- För permeabilisering, Inkubera med 0,2% metanol eller 0,2% polysorbat 20/PBS (nedan kallad PBS-T) vid 4 ° C under 15 minuter.
- Ta bort de permeabilisering reagenserna och behandla cellerna med en lämplig blockerande buffert eller 1% bovint serumalbumin/PBS vid 4 ° C i 60 min.
- Lägg den första antikroppen utspädd med 10% blockerande buffert i PBS-T och plats på en skakande maskin vid 4 ° C över natten.
- Tvätta tre gånger med PBS-T (lägga till PBS-T och placera på RT skakar maskinen i 10 min).
- Lägg den andra antikropp, utspädd med 10% blockerande buffert i PBS-T och plats på skakar maskinen på RT för 60 min. De första och andra antikropparna för ICC som används i denna studie visas i tabell 3.
Obs: Från detta steg framåt, skydda plattan/skålen från ljus genom att Linda den i folie. - Tvätta två gånger med PBS-T.
- För räknaren färgning, lägga till 1: 5000 DAPI spädas med PBS och plats på skakar maskinen på RT för 5 min.
- Ta bort DAPI lösningen och lägga till PBS i varje brunn.
- Iaktta cell färgningen med fluorescens Mikroskop. Alternativt, förvara plattan/skålen vid 4 ° C i upp till 1 månad.
-
Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) för funktionell analys av iPSC-derived D
Obs: mänskliga dermal fibroblast celler (HDF) är kommersiellt tillgängliga. Kultur HDF i DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum (se tabell 1).- Utsäde 1,0 x 105 celler av iPSC-derived D och HDF på 24 brunnar innehållande 1 mL varje odlingsmedium (D: D induktion medium, HDF: DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum).
- Efter 3 dagar av cell odling, samla 100 µL av varje medium, placera i en 1,5 mL tub och förvaras vid 4 ° C.
- Utför serien av procedurer, till exempel tillägg av identifiering av antikroppar och sekundära antikroppar, enligt tillverkarens anvisning och kvantifiera antalet mål genom att generera en standardkurva mot koncentrationen av kontrollen analyt prover.
-
Mekanisk stretch stimulering assay för funktionell analys av iPSC-derived SYN
Obs: vuxen människa tenocytes finns kommersiellt tillgänglig (se Tabell för material). Kultur mänskliga iPSC-derived SYN och vuxna människors tenocytes på en cell som stretching anordning för mekanisk stretch stimulering analysen som beskrivs under18,19. Användning SYN induktion medium-2 och tenocytes odlingsmedium (se Tabell för material) som culturing medium för varje iPSC-derived SYN och vuxen människa tenocytes, respektive.- På 24 h före stretching, plattan 1,0 x 105 celler av iPSC-derived SYN och mänskliga tenocytes på ECM lösningen-belagd multi väl typ kisel gummi kammare, med en kultur yta 1,5 cm x 1,5 cm (se Tabell för material).
- Avdelningar på enheten för cell stretching, och tvinga monoaxial cyklisk belastning (0,5 Hz, 5%) för 12 h.
- För total RNA-extraktion, tillsätt 350 μl lyseringsbuffert RNA, och sedan skrapa och samla in cellerna i ett 1,5 mL rör för total RNA-extraktion och efterföljande RT-qPCR-analys (se förfarande 5.1).
Representative Results
Alla siffror i detta betänkande erhölls med 201B7-PAX3-GFP iPSCs, där andra ersätter en allel av PAX3 kodande sekvens i exon 1. Etablering av 201B7-PAX3-GFP iPSCs blir beskrivs på andra ställen (H. Sakurai, personlig kommunikation). Den statistiska signifikansen utvärderades med hjälp av statistisk programvara. P-värden lägre än 0,05 ansågs betydande.
Karakterisering av mänskliga iPSC-derived PSM och SM celler
För att bedöma differentiering av mänskliga iPSCs mot SM via PSM staten (figur 2A), FACS analys, utfördes ICC analys och RT-qPCR-analys. Som visas i figur 2B, var över 85% av cellerna positiva för DLL1, en markör för PSM, men negativ för PAX3, en markör för SM, efter 4 dagar av PSM induktion med mänskliga iPSCs. Denna population blev därefter, PAX3 positiva SM celler efter 4 dagar med SM induktion. PSM-SM övergången bekräftades också av ICC (figur 2 c) och RT-qPCR (figur 2D). TBX6, MSGN1 och WNT3A, PSM markörer var uttryckt på PSM staten (dag 4), men inte uttryckt på SM staten (dag 8). PARAXIS, MEOX1 och PAX3, SM markörer, var uttryckt på SM, men inte uttryckt på PSM. Dessutom färgning av CDH11, en markör för epithelialized SM, bara samlat på cell-cell korsningen, efter tillägg av SB431542 med CHIR99021 (figur 2E).
Karakterisering av SM derivat inducerad från mänskliga iPSC-derived SM celler
Utvärdera differentiering styrkan av mänskliga iPSC-derived SM, differentiering mot DM, MYO, D, SCL och SYN (figur 3A) bedömdes genom ICC analys och PAX3 (GFP)-fluorescens. Som visas i figur 3B, DM differentiering bekräftades av ALX4 och EN1 färgning och PAX3 (GFP)-fluorescens; MYO differentiering bekräftades av MYOD, MYOG och Myosin heavy chain (MHC) färgning; D differentiering bekräftades av EN1 och PDGFRa färgning; SCL differentiering bekräftades av PAX1, PAX9 och NKX3.2 färgning; SYN differentiering bekräftades av SCX, MKX och COL1A1, COL1A2 färgning.
Karakterisering av inducerad D och SYN
1. enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) för funktionell analys av iPSC-derived D
I den mänskliga kroppen är en av de primära funktionerna för dermal fibroblaster att utsöndra extracellulär matrix (ECM) proteiner, såsom kollagen och hyaluronsyra som återfuktar huden och hjälper till att upprätthålla hudens struktur. För att demonstrera att en jämförbar mängd kollagen-typ 1 och hyaluronsyra proteiner var utsöndras i odlingsmediet iPSC-derived D och HDF, utfördes ELISA, som visas i figur 4A.
2. mekanisk stretch stimulering assay för funktionell analys av iPSC-derived SYN
Flera studier har redan rapporterat, mekanisk stimulering påverkar senan utveckling före och efter födseln och främjar differentiering av tenocytes från föregångare celler18,19. Därför är det väl känt att reaktivitet mot mekanisk stress är en av egenskaperna hos tenocytes. För att demonstrera jämförbara Reaktiviteten hos mänskliga iPSC-derived SYN och mänskliga vuxen tenocytes, utfördes en mekanisk stretch stimulering analysen som visas i figur 4B.
Figur 1: Schematisk vy av hierarkisk differentiering av paraxiala mesoderm. Presomitic mesoderm är en cell befolkningen som övergående framträder under tidig embryogenes och genomgår segmentering till formuläret thoraxsegmenten. Thoraxsegmenten är en övergående stamceller befolkning som ger upphov till flera celltyper, såsom sclerotome, dermomyotome, syndetome, Dermatom och myotome celler, vilket så småningom differentieras till senor/Ligament, ben/brosk, skelettmuskel och dermis celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FACS, RT-qPCR och ICC analys av mänskliga iPSC-derived PSM och SM. (A) Schematisk vy av ett protokoll för SM differentiering genom PSM. (B) representativa dot tomt på DLL1 färgning och PAX3 (GFP)-fluorescens på dag 4 av PSM induktion och dag 4 (dag 8 från iPSC) SM induktion. (C) representant immunocytochemical bilder och PAX3 (GFP)-fluorescens på dag 4 av PSM induktion och dag 4 (dag 8 från iPSC) SM induktion. Cellerna var fläckade av anti-TBX6, PARAXIS och MEOX1 antikroppar (röd) och samtidig fläckade DAPI (blå) eller upptäckas med PAX3 (GFP)-fluorescens (grön). (D) RT-qPCR-analys av markörer för PSM och SM i iPSC, PSM och SM. Medel ± medelfel (S.E.) från tre uppsättningar av experiment visas. (E) representant immunocytochemical bilder på dag 4 (dag 8 från iPSC) av SM, odlade i S10I10 (kombination av SB431542 och IWR1, en hämmare av WNT-signalering), S10 (SB431542), och S10C5 (kombination av SB431542 och CHIR99021) villkor. Cellerna var målat med anti-CDH11 antikropp (röd) och samtidig fläckade DAPI (blå). iPS, inducerade pluripotenta stamceller; PSM, presomitic mesoderm; SM, somite; S10, SB431542 10 ΜM. C5, CHIR99021 5 ΜM. I10, IWR1 10 ΜM. Skala barer = 50 μm. Denna siffra har ändrats från Nakajima et al. (2018)15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: ICC analys av DM, MYO, D, SCL och SYN åtskilt från mänskliga iPSC-derived SM. (A) Schematisk vy av protokoll för SM derivat differentiering. (B) representant immunocytochemical bilder och PAX3 (GFP)-fluorescens på dag 3 (dag 11 från iPSC) DM induktion dag 30 (dag 41 från iPSC) av MYO induktion, dag 9 (dag 20 från iPSC) D induktion, dag 3 (dag 11 från iPSC) SCL Induktion och dag 21 (dag 32 från iPSC) SYN induktion. DM, celler var fläckade av anti-ALX4 och EN1 antikroppar (röd) och samtidig fläckade DAPI (blå) eller upptäckas med PAX3 (GFP)-fluorescens (grön); MYO, celler var fläckade av anti-MYOD, MYOG (röd) och MHC (cyan) antikroppar, även co fläckade av DAPI (blå); D, celler var fläckade av anti-EN1 (röd) och PDGFRa (cyan) antikroppar och samtidig fläckade DAPI (blå); SCL, celler var fläckade av anti-PAX1, PAX9 och NKX3.2 (röd) antikroppar och samtidig fläckade DAPI (blå); SYN, celler var målat med anti-SCX, MKX, COL1A1, COL1A2 (röd) antikroppar och samtidig fläckade DAPI (blå). DM, dermomyotome; MYO, myotome; D, Dermatom; SCL, sclerotome; SYN, syndetome; Skala barer = 50 μm. Denna siffra har ändrats från Nakajima et al. (2018)15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: funktionell analys av inducerad D och SYN. (A) mängden kollagen-typ 1 och hyaluronic syra proteiner i odlingsmediet analyserades av ELISA. (B), effekten av mekanisk stretch stimulering på inducerade SYN och mänskliga vuxen tenocytes bedömdes av RT-qPCR. Medel ± medelfel (S.E.) från tre uppsättningar av experiment visas. * p < 0,05; ** p < 0,01; p < 0,001 av Dunnetts flera jämförelser t-test jämfört med Stretch (-); Norberg, inte betydande, HDF, mänskliga vuxen dermal fibroblast. Denna siffra har ändrats från Nakajima et al. (2018)15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Medium/lösning | Reagant | Koncentration |
| CDM basala medium | Iscove's modified Dulbecco's medium/Hams F12 | 1:1 |
| Penicillin/Streptomycin | 0,5% | |
| Kemiskt definierade lipid koncentrat | 1% | |
| APO-transferrin | 15 mg/mL | |
| Monothioglycerol | 450 mM | |
| Bovint serum albumin | 5 mg/mL | |
| Insulin | 7 mg/mL | |
| CTK lösning | Vatten | - |
| Trypsin | 0,25% | |
| Kollagenas IV | 0,1 mg/mL | |
| Kalciumklorid | 1 mM | |
| Knockout SR | 20% | |
| D induktion medium | CDM basala medium | - |
| CHIR99021 | 5 ΜM | |
| BMP4 | 10 ng/mL | |
| DM induktion medium | CDM basala medium | - |
| CHIR99021 | 5 ΜM | |
| BMP4 | 10 ng/mL | |
| ECM-lösning | Konstgjorda extracellulär matrix | 0,3 mg/mL |
| DMEM/F12 | - | |
| FACS buffert | PBS | - |
| Bovint serum albumin | 0,1% | |
| Feeder-fri cellodlingsmedium | mTeSR1 | - |
| Penicillin/Streptomycin | 0,5% | |
| HDF odlingsmedium | DMEM | - |
| Fetalt bovint serum | 10% | |
| hESC medium | Primate ES cell medium | - |
| Penicillin/Streptomycin | 0,5% | |
| FGF2 | 4 ng/mL | |
| MYO induktion medium | CDM basala medium | - |
| CHIR99021 | 5 ΜM | |
| PSM induktion medium | CDM basala medium | - |
| SB431542 | 10 ΜM | |
| CHIR99021 | 10 ΜM | |
| DMH1 | 2 ΜM | |
| FGF2 | 20 ng/mL | |
| SCL Induktion medium | CDM basala medium | - |
| SAG | 100 nM | |
| LDN193189 | 0,6 ΜM | |
| SM induktion medium | CDM basala medium | - |
| SB431542 | 10 ΜM | |
| CHIR99021 | 5 ΜM | |
| SYN induktion medium-1 | CDM basala medium | - |
| FGF8 | 20 ng/mL | |
| SYN induktion medium-2 | CDM basala medium | - |
| BMP7 | 10 ng/mL | |
| TGFΒ3 | 10 ng/mL |
Tabell 1: Media och lösning recept.
| Namn | Framåt | Omvänd |
| ACTB | CACCATTGGCAATGAGCGGTTC | AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT |
| COL1A1 | GGACACAGAGGTTTCAGTGGT | GCACCATCATTTCCACGAGC |
| MEOX1 | GAGATTGCGGTAAACCTGGA | GAACTTGGAGAGGCTGTGGA |
| MSGN1 | GGAGAAGCTCAGGATGAGGA | GTCTGTGAGTTCCCCGATGT |
| PARAXIS | TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT | CACACCCTGTCACCAACAGT |
| PAX3 | AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG | CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG |
| SCX | CCCAAACAGATCTGCACCTTC | GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC |
| TBX6 | AGCCTGTGTCTTTCCATCGT | AGGCTGTCACGGAGATGAAT |
| TNMD | CCCTTCATGCTGAAGCCACTT | CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG |
| WNT3A | CAAGATTGGCATCCAGGAGT | ATGAGCGTGTCACTGCAAAG |
Tabell 2: Primer sekvenser för RT-qPCR-analys.
| Koncentration | ||
| 1. Antikropp |
ALX4_Goat | 1/50 |
| CDH11_Mouse | 1/1000 | |
| COL1A1_Rabbit | 1/100 | |
| COL2A1_Mouse | 1-2 mikrog/mL | |
| EN1_Rabbit | 1/50 | |
| MEOX1_Rabbit | 1/50 | |
| MHC_Rabbit | 1/200 | |
| MKX_Rabbit | 1/50 | |
| MYOD_Rabbit | 1/500 | |
| MYOG_Mouse | 1/400 | |
| NKX3.2_Rabbit | 1/50 | |
| PARAXIS_Rabbit | 1/50 | |
| PAX1_Rabbit | 1/50 | |
| PAX9_Rabbit | 1/50 | |
| PDGFRa_Goat | 1/100 | |
| SCX_Rabbit | 1/50 | |
| TBX6_Goat | 1/50 | |
| 2. Antikropp |
Åsnan anti get IgG(H+L) sekundära antibody555 | 1/500 |
| Åsnan anti get IgG(H+L) sekundära antibody647 | 1/500 | |
| Geten anti mus IgG(H+L) sekundära antibody555 | 1/500 | |
| Geten anti kanin IgG(H+L) sekundära antibody555 | 1/500 | |
| Geten anti kanin IgG(H+L) sekundära antibody647 | 1/500 |
Tabell 3: Första och andra antikroppar för ICC.
Discussion
En välkänd metod för induktion av PSC-derived SM genom PSM är kombinationen CHIR99021 + A83-01 (TGFβ hämmare) under PSM induktion från PSC, men inte under de PSM mognad process6. I den aktuella studien hämmades WNT/beta-catenin signalering använder C59 inducera SM från PSM. Vi införde dock användningen av CHIR99021 aktivera WNT vägen under SM differentiering. Detta beslut gjordes baserad på konstaterandet att flera WNTs uttrycks i omgivande vävnader i SM och med tanke på att WNT reportrar är aktiva i SM20. Vi observerade därför epithelialization, kännetecknande för SM in vivo endast under villkora med CHIR99021, baserat på ansamling av CDH11 i cell cell korsningar (figur 2E). Denna observation visar kritiska medverkan av WNT signalering under PSM differentiering och SM epithelialization, därför våra protokoll kan bättre recapitulate endogena signalering miljön. Men innebär det även en möjlighet att finjustera den WNT/beta-catenin signalering utbildningsavsnitt under differentiering, eftersom robusthet och effektivitet av differentiering kan variera avsevärt beroende på celltyper, cellinjer och olika kemiska föreningar av WNT-inducerare används av varje forskare.
Denna metod också tillåter oss att generera alla fyra SM derivat, MYO, D, SCL och SYN, från iPSCs mänskliga. Vår stegvis protokoll använder CDM kan användas för att identifiera signalering kraven under mänskliga somitogenesis/somite mönstring och ge viktiga insikter i människans SM utveckling. Till exempel kan våra metoder vara användbara för att studera mekanismer för segmentering klocka, en molekylär svängning-systemet som reglerar bildandet av SM. Det har undersökts grundligt i möss, kycklingar och Zebrafiskar, men inte hos människor på grund av bristen på lämpliga experimentella verktyg.
Dessutom kan vår metod tillämpas på framtida kliniska cellbaserade terapier. Till exempel mänskliga iPSC-derived D eller SYN kan transplanteras in i allvarligt skadad hud eller spruckit senor för regenerering och behandling. Flera begränsningar måste dock lösas innan denna metod kan tillämpas praktiskt. Även om i den aktuella studien, vi använde SNL feeder celler för iPSC underhåll och ECM-lösning, som utvinns ur Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom, som en surface pälsen på skålen under induktion, skall dessa icke-mänskliga animaliska reagens vara bort för att förbättra kliniska kvalitet. Dessutom måste cell kvantitet och kvalitet, som omfattar renhet och mognaden av de önskade cellerna, också förbättras. Dessutom är inte bara antalet cell utan även cell styrka en viktig egenskap för senor/ligament regenerering. Dessutom utveckling av yta markörer för rening och en ny metod för 3D beredning är nödvändig för att avancera våra protokoll till kliniska cellbaserade terapier.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Junya Toguchida (CiRA) för hans hjälp med projektadministration och finansiering förvärv, Mr Mitsuaki Shibata (CiRA) och Ms. Mei Terashima (CiRA) för deras tekniskt bistånd, Dr Yayoi Toyooka (CiRA) och Dr. Daisuke Kamiya (CiRA) för deras korrekturläsning av manuskript, och Mr Masaya Todani (CiRA) för att tillhandahålla en illustration (figur 1). Vi tackar också alla medlemmar i de Ikeya och Toguchida laboratorierna (CiRA) för deras stöd under denna studie. Detta arbete stöds av Grants-in-aid för vetenskaplig forskning från Japan Society för att främjande av vetenskap (JSPS) (26670661), programmet för svårbehandlade sjukdomar forskning utnyttja sjukdomsspecifika iPS-celler från Japan Science and Technology Byrå (JST) och Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling (AMED), Core Center för iPS cellforskning Research Center Network för förverkligandet av regenerativ medicin (JST/AMED) och iPS Cell forskningsfond (delvis till Makoto Ikeya och Junya Toguchida). Makoto Ikeya stöddes också av Grants-in-aid för vetenskaplig forskning (JSPS) (16H 05447) och programmet Acceleration för svårbehandlade sjukdomar forskning utnyttja sjukdomsspecifika iPS-celler (AMED).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ALX4_Goat antibody | Santacruz | sc-22066 | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| BMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
| BMP7 | R&D | 354-BP-010 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A8806 | |
| Calcium chloride | Nacalai tesque | 067730-15 | |
| CDH11_Mouse antibody | Cell signaling | 13577 | |
| Cell streching device | Strex | STB-140 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905-031 | |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | |
| COL1A1_Rabbit antibody | Abcam | ab34710 | |
| COL2A1_Mouse antibody | Thermo scientific | MS-235 | |
| Collagenase IV | Thermofisher | 17104019 | |
| DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody | R&D | FAB1818A | For FACS |
| DMEM | Sigma | D6046 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-082 | |
| DMH1 | Tocris | 4126 | |
| EN1_Rabbit antibody | Abcam | ab70993 | |
| Fetal bovine serum | Nichirei | 171012 | |
| FGF2 | Wako | 060-04543 | |
| FGF8 | Peprotech | 100-25 | |
| Human dermal fibroblast | Cell applications | 160-05a | |
| Human tenocyte | Angio proteomie | cAP-0041 | |
| Insulin | Wako | 090-06474 | |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12 | Gibco | 21056023 | |
| Knockout SR | Gibco | 10828028 | |
| LDN193189 | Axon | 1509 | |
| Matrigel | BD bioscience | 354230 | Artificial extracellular matrix |
| MEOX1_Rabbit antibody | Abcam | ab75895 | |
| MHC_Rabbit antibody | Santacruz | sc-20641 | |
| MKX_Rabbit antibody | Atlas antibodies | A83377 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR1 | Stemcell tech | 85850 | |
| Multi well-type silicon rubber chamber | Strex | STB-CH-4W | |
| MYOD_Rabbit antibody | Abcam | ab133627 | |
| MYOG_Mouse antibody | Santacruz | sc-12732 | |
| NKX3.2_Rabbit antibody | Sigma | HPA027564 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21432 | |
| Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21447 | |
| Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21422 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555 | Invitrogen | A21428 | |
| Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647 | Invitrogen | A21245 | |
| PARAXIS_Rabbit antibody | Santacruz | sc-98796 | |
| PAX1_Rabbit antibody | Abcam | ab95227 | |
| PAX9_Rabbit antibody | Gene tex | GTX104454 | |
| PBS | - | - | |
| PDGFRa_Goat | R&D | AF307 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Primate ES cell medium | Reprocell | RCHEMD001 | |
| SAG | Calbiochem | 566661 | |
| SB431542 | Selleckchem | SEL-S1067-10 | |
| SCX_Rabbit antibody | Abcam | ab58655 | |
| TBX6_Goat antibody | R&D | AF4744 | |
| Tendon cell growth medium | Angio-proteomie | cAP-40 | Tenocytes growth medium |
| TGFβ3 | R&D | 243-B3-200 | |
| Trypsin | Gibco | 15090046 |
References
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), e61540 (2013).
- Sakurai, H., et al. In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), e47078 (2012).
- Chal, J., et al. Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocl. 11 (10), 1833-1850 (2016).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
- Umeda, K., et al. Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 2, 455 (2012).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. 166 (2), 451-467 (2016).
- Xi, H., et al. In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Reports. 18 (6), 1573-1585 (2017).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Tam, P. P., Beddington, R. S. The formation of mesodermal tissues in the mouse embryo during gastrulation and early organogenesis. Development. 99 (1), 109-126 (1987).
- Aulehla, A., Pourquie, O. Signaling gradients during paraxial mesoderm development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), a000869 (2010).
- Christ, B., Scaal, M. Formation and differentiation of avian somite derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 638, 1-41 (2008).
- Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
- Sakurai, H., et al. Bidirectional induction toward paraxial mesodermal derivatives from mouse ES cells in chemically defined medium. Stem Cell Research. 3 (2-3), 157-169 (2009).
- Zhao, J., et al. Small molecule-directed specification of sclerotome-like chondroprogenitors and induction of a somitic chondrogenesis program from embryonic stem cells. Development. 141 (20), 3848-3858 (2014).
- Nakajima, T., et al. Modeling human somite development and fibrodysplasia ossificans progressiva with induced pluripotent stem cells. Development. 145 (16), (2018).
- McMahon, A. P., Bradley, A. The Wnt-1 (int-1) proto-oncogene is required for development of a large region of the mouse brain. Cell. 62 (6), 1073-1085 (1990).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Suzuki, H., et al. targeting of the transcription factor Mohawk in rats causes heterotopic ossification of Achilles tendon via failed tenogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7840-7845 (2016).
- Marturano, J. E., Arena, J. D., Schiller, Z. A., Georgakoudi, I., Kuo, C. K. Characterization of mechanical and biochemical properties of developing embryonic tendon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6370-6375 (2013).
- Maretto, S., et al. Mapping Wnt/beta-catenin signaling during mouse development and in colorectal tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (6), 3299-3304 (2003).
